病毒感染的诊断、治疗及预防是很多医学研究者的主要研究方向。 尽管针对多种病毒的诊断、治疗及预防的组合物及方法已为人所熟知， 但仍有很多病毒在人体内难以被检测，而且就目前所知尚无有效的治 疗及预防接种方法。这些病毒中最引人注目的当然是HIV。
产生获得性免疫缺陷综合症(AIDS)及其前期、AIDS相关的综 合症(ARC)和淋巴结病综合症(LAS)的传染性物质为LAV、HTLV- III、ARV、以及最近被国际病毒分类委员会建议的HIV(参见299) 等嗜淋巴逆转录病毒。在此采用推荐术语标识AIDS相关病毒及其病 毒株。包括LAV及ARV-2病毒株在内的过去的术语，现分别被定名 为HIV1 LAI和HIV1SF2。
由于HIV的传播达到流行性的程度，对受感染个体的治疗以及防 止向可能接触病毒的未感染个体的传播最受世人所关注。已发展出多 种作用于病毒寿命周期不同阶段的治疗方案，这些方法在Mitsuya and Broder，1987，Nature 325：773中已被列举。其中一种方法是采用与病 毒结合并抑制病毒复制的抗体，其或者干扰病毒进入宿主细胞或采用 其它机制。一旦确定病毒成份易受抗体的影响，预计将产生足以中和 病毒感染性的抗体反应性，并可对HIV-感染者给药免疫球蛋白或纯 化的抗体，而且该被动免疫有可能改变或逆转HIV感染的进程。此外， 预计对未感染个体预防接种已被改良以促进MHC相互作用的抗原决定 簇后，可防止以后接触HIV时造成的感染。
一般认为大多数逆转录病毒的衣膜糖蛋白与易感细胞表面的受体 分子反应，从而决定了病毒对某些宿主的感染性。结合这些衣膜糖蛋 白的抗体可阻断病毒和细胞受体间的相互作用，中和病毒的感染性。 一般可参见“肿瘤病毒的分子生物学”(The Molecular Biology of Tumor Viruses)，534(J.Tooze，ed.，1973)；RNA Tumor Viruses，226，236(R. Weiss等人，eds.，1982)；Gonzalez-Scarano等人，1982，Virology 120：42 (La Crosse病毒)；Matsuno and Inouye，1983，Infect.Immun.39：155 (新生牛犊泻痢病毒)；以及Mathews等人，1982，J.Immunol.，129：2763 (脊髓炎病毒)。到目前为止，通过预防接种HIV蛋白/肽诱导人体保 护性免疫应答的治疗方案已经失败。此外，从HIV感染者体内回收的 高滴度中和抗体，以及从鼠中制得的单克隆抗体，都不能成功地改变 由HIV感染发展至艾滋病和死亡的疾病进程。本领域中需要确定其它 HIV的免疫学作用靶点，使得可诱导出改变HIV感染进程的免疫应答。
HIV的大体结构为一个核蛋白核心，其外周被一含脂质的衣膜所 包围，在病毒从受感染宿主细胞中出芽释放出的过程中病毒需要这一 衣膜。病毒编码的糖蛋白植于衣膜中并突出于其上。HIV的衣膜糖蛋 白在受感染细胞中首先被合成为分子量是150,000-160,000道尔顿 (gp160)的前体分子，接着在细胞中被处理成分子量为110,000- 120,000道尔顿(gp120)的N-端片断、和分子量为41,000-46,000 道尔顿(gp41)的C-端片断，前者产生侧糖蛋白，后者为跨膜糖蛋 白。
由于以上所讨论的原因，HIV的gp120糖蛋白作为一个干扰病毒 寿命周期的潜在作用靶点已受到了广泛的研究。已经证实从HIV感染 者体内提取出的血清在体外可中和HIV，而且在这些血清中存在结合 纯化gp120的抗体，(Robert-Guroff等人，1985，Nature 316：72；Weiss 等人，1985，Nature 316：69；以及Mathews等人，1986，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，83：9709)。用于免疫动物(Robey等人，1986，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，83：7023；Lasky等人，1986，Science，233：209)和人(Zagury 等人，1986，Nature 326：249)时，经纯化并重组的gp120刺激中和性 血清抗体的产生。同时已经证实gp120分子与CD4受体结合，而且识 别CD4受体某些抗原决定簇的单克隆抗体经证实可阻断HIV的结合、 合胞体的形成和感染性。采用含羧基末端的半个gp120分子制成的重 组融合蛋白进行免疫后，McDougal等人，(1986，Science 231：382)和 Putney等人(1986，Science，234：1392)在动物体内诱导出中和性血清 抗体，并进一步证实在中和性免疫应答中衣膜蛋白的糖化不是必需的。
HIV感染后人体免疫系统很快对病毒作出反应，产生抗体和细胞 介导的免疫应答。有关逆转录病毒免疫应答的综述已经出版(Norley，S.， 和Kurth R.，1994：The Retroviridae，Vol E，J.A.Levy，ed.，pp363-464， Plenum Press)。包括gp160、gp120、p66、p55、gp41、p32、p24和p17 在内的多种HIV蛋白的特异性人类抗体已被报道(Carlson，1988，J.Am， Med.Assoc.206：674)。人体中对HIV的最初免疫应答是针对p17和 p24的，接着是gp120/160，然后是gp41、p66/55，最后是p32(Lange 35等人1986，Br.Med.J.292：228)。随着HIV感染发展为艾滋病，p17 和p24的抗体浓度大大下降至不可检出的程度，并被p17和p24抗原 血症所代替。p32和p55的抗体滴度也下降，但其下降程度较小 (McDougal等人1987 J.Clin.Invest.80：316)。但在HIV感染的整个 病程中始终维持大量的gp160/120的抗体。HIV感染早期评价总免疫 球蛋白，结果发现所增加的抗体是针对HIV的并且主要针对gp120 (Amadori等人，1988 Clin.Immunol.Immunopathol.46：342；Amadori 等人，1989，J.Immunol 143：2146)。HIV专属的超γ球蛋白血的可能 机制于1995年已由Barker E.等人作了综述：The Retroviridae Vol 4，J.A. Levy，ed.pp1-96 Plenum Press。HIV感染期间所产生的这些抗体的功 能以及目标抗原决定簇已被描述，这其中也包括易受抗体介导中和的 抗原决定簇。这些主要的靶抗原决定簇主要位于衣膜蛋白gp160 (gp120/gp41)和gag蛋白p17之上；其综述参见Levy，1994 Am.Soc. Micro；Nixon等人，1992 Immunol 76：515。HIV衣膜蛋白的中和抗体 已被鉴定，它们结合于gp120的保守和非周期性区域。这其中包括结 合CD4结合区域的区域(Linsley等人，1988；以及Thali等人，1992)； 第二和第三易变环状区域(Fung等人，1992；以及Haigwood等人， 1990)；以及糖片断(Benjouad等人，1992；以及Feizi和Larkin，1990)。 其它的中和部位已被确定在gp41的外部和p17上的一个结合位点上 (Changh等人，1986)。早期的研究指出，中和抗体的存在导致更有利 的临床结果(Robert-Guroff等人，1985)。但这些研究采用经挑选的高 中和性血清作用于HIV的实验室培养株，而不是作用于自体同源的HIV 分离体(Homsy等人，1990；Tremblay和Wainberg，1990)。随后的研究 证明，自体同源的抗体对自体同源HIV分离体有很少或没有中和作用 (Homsy等人，1990)。在中和抗体存在下，抗体介导的中和作用敏感 度的缺乏被认为是血清转化后出现幸存突变体的缘故(Arendrup等人， 1992)，而且整个感染期中均存在这一情况，这是因为感染期中不断有 新的抗体特异性产生。HIV感染与产生中和抗体之间的临床相关性尚 不清楚。但有一点很清楚，尽管在HIV感染者体内对HIV的免疫应答 强烈，但也会发展成艾滋病并最终由于免疫机能障碍频发而死亡。因 此要寻找新的治疗方法。
发明目的
本发明的一个目的是确定病毒蛋白的中和区域，该区域在人体内 不能诱导免疫应答，但对于非人类哺乳动物则可诱导出免疫应答并产 生与这些区域反应的抗体。本发明的另一目的是在诊断、治疗和预防 由病毒造成的疾病中利用这些被确定的蛋白中和区域以及与它们反应 的抗体。在以下发明详述中，本发明的一些其它目的将被阐述。
发明简述
本发明提供治疗、诊断和预防病毒感染的方法和组合物，其中采 用与病毒蛋白中和区域相反应的抗体中和和阻断病毒寿命周期的关键 阶段。该抗体可识别某些病毒抗原决定簇，当遭到病毒感染或暴露于 病毒环境中时，这些抗原决定簇不能在人体中诱导出免疫应答，但可 在非人类哺乳动物中诱导出免疫应答。
所选定的可与非人类抗病毒抗体反应而不与人类抗病毒抗体反应 的抗原决定簇被鉴定出来。这些抗原决定簇通过分子模拟人类蛋白逃 避人类免疫系统的临控，而在某些情况中，这些抗原决定簇由易于在 抗原处置细胞中酶解的氨基酸组成。理想的抗原决定簇被人类酶酶解， 因而不能被加工成免疫呈递。
代表这些抗原决定簇的肽可被合成、任意地修饰、并与大分子载 体佐剂相连接，在非人类动物体内诱导免疫应答。优选的佐剂为包含 从Propionibacterium acini中提取的胞壁酰二肽多重重复体的微粒。
本发明的抗体和肽可在免疫测定构型中用于鉴别特异性抗原决定 簇并定量测定人体组织和体液中的病毒抗原。在一个优选实施方案中， 本发明提供适用于治疗及诊断病毒感染者的组合物和方法。
在一个优选实施方案中，目标病毒为HIV。
发明详述
本发明提供新型诊断和中和病毒感染的组合物和方法。本发明将 集中详细描述一个优选实施方案，其中目标病毒为HIV。但应认识到， 本发明的原理可用于鉴定其它病毒蛋白的中和区域并产生与这些蛋白 相反应的抗体，用于诊断、治疗和预防由这些其它病毒导致的感染。
现集中讨论HIV，本发明提供新型的组合物和方法，用于中和HIV 感染并预防或基本上抑制HIV感染、细胞至细胞的传递、以及被感染 宿主中的病毒生产。更具体而言，采用某些HIV蛋白序列按以下详述 的方法在非人类哺孔动物体内产生抗体，给药该抗体可中和HIV感染、 易化受感染的CD4淋巴细胞的杀灭、以及阻断HIV寿命周期中的关键 阶段，但上述HIV蛋白序列中所包含的抗原决定簇在通过感染或通过 环境接触而遭遇到HIV时不能在人体中诱导免疫应答，。术语“中和区 域”指HIV、特别是HIV蛋白的某些部分，其中包含构成一个或多个 可与抗体反应的抗原决定簇的氨基酸片断，所述抗体单独、或与本发 明其它抗体联合可中和HIV感染。适用的评价中和的实验已为人所熟 知，其中可包括测量T-细胞系中HIV感染减少、负载HIV衣膜糖蛋 白的VSV(HIV)假型的斑点形成单位减少的实验，合胞体抑制实验， 以及病毒粒子受体结合实验。术语“灭活区域”指那些其中包含一个 或多个当与单个或多个本发明抗体反应时可功能性阻断HIV寿命周期 的重要阶段的抗原决定簇的HIV蛋白片断。适用的评价抗体介导的毁 灭HIV感染淋巴细胞的实验已为人所熟知，其中可包括抗体依赖的细 胞介导的细胞毒性、补体介导的溶胞、和自然杀伤(NK)实验。测量 抗体介导的阻断HIV寿命周期关键阶段的适用实验包括测量逆转录酶 失活、或测量聚合酶和蛋白酶的活性的实验，或者用核苷酶降解病毒 RNA来评价抗体介导的补体依赖核壳渗透性改变的实验。如果需要， 可将免疫化学检测法如免疫荧光法、免疫印迹法、酶联免疫法、以及 放射免疫检测法中的抗体反应性比作中和性。
本发明的原理是基于以下发现：某些在HIV寿命周期中起重要作 用的抗原决定簇在人体内没有免疫原性，但采用所选的非人类哺乳动 物而产生的抗体可确定和指征这些抗原决定簇。此外，已经发现这些 区域在人体中的这种免疫不应答性是由于分子模拟及缺乏MHC相关作 用的缘故，其中MHC相关作用包括通过必须的MHC HLA类型1和 HLA类型2相关作用而产生的抗原呈递。利用分子模拟，这些抗原决 定簇被认为是自身的并在正常情况下不引起免疫应答。在抗原呈递中 缺乏MHC相关作用时，涉及几个步骤，而在任何一步中失败就可能导 致对抗原不产生免疫应答。
含多重交叠抗原决定簇的肽区域以及这些抗原决定簇的抗体已被 制出并在体外实验中可中和并阻断HIV寿命周期的关键步骤。此外， 患有艾滋病的HIV感染者已经接受了这些肽区域的抗体的治疗，结果 通过总可培养感染剂量(TCID)检测发现血液感染性很快下降。采用 这些抗体治疗慢性艾滋病患者也取得重大临床学进展，包括体重增加、 消除机会性感染、降低感染的发生率和严重性以及医生的救护率、消 除HIV相关的神经病。患者进一步显示免疫恢复，其特征为HIV-RNA 的减少、CD4数量增加、CD8数量增加以及由于改善了CD4和CD8 的数量及功能使得细胞因子系统恢复。
抗原决定簇的鉴定和抗体的产生
大部分免疫反应是针对优势免疫抗原决定簇的。通过多种免疫学 方法，其中包括采用抗血清作用于HIV、针对HIV抗原决定簇的细胞 毒性T淋巴细胞反应性以及HIV抗原决定簇的辅助性淋巴细胞抗原呈 递，已对HIV抗原决定簇进行了最为频繁的鉴定和描绘。采用已为人 所熟知的测试方法竞争性地或非竞争性地利用模拟HIV序列的已知序 列的合成肽可证实这些观察结果。应认识到对免疫系统的刺激可引起 免疫应答的加强或抑制。其支配因素包括：
A、被免疫原刺激的淋巴细胞的子群数量(抑制性细胞对辅助性细 胞)。
B、首先接触免疫原的微环境，包括驻留于其中的细胞数量。
C、当效应细胞接触免疫原时存在于微环境中的细胞因子的类型。
D、效应细胞与免疫原接触后诱发的细胞因子类型。
E、免疫原的结构组成及生化组成。
F、免疫原的氨基酸序列及其在微环境中受蛋白酶降解的难易程 度。
从初步实验中可见，在决定某些用于产生抗体的蛋白和肽的潜在 价值中，以下性质被确定为具有十分重要的地位，所产生的抗体被用 于被动免疫治疗中，以治疗或缓解人体疾病的进程，特别是包括艾滋 病在内的HIV感染的各阶段：
A、当用于产生适用于被动免疫疗法的抗体时，免疫原必须缺乏在 人体细胞和组织中表达的抗原决定簇，其中有以下例外：
1、抗原的分布被限制在与抗体隔绝和/或无法利用的位置。
2、当无抗原时，则在发育周期中在允许于特定时间利用抗体的发 育期中表达抗原。
3、位于宿主内部的抗原决定簇不与重要结构相邻。
4、抗原在宿主细胞上的分布密度低于造成伤害所需的量，但有利 于作用于目标靶点以形成选择性定位。
5、正常比率的靶点必须有足够的不同性并有助于抗体向目标靶点 传送。
B、输送至抗原呈递细胞上的重复肽段的数量直接影响免疫应答的 大小。
C、存在于体液中的抗原决定簇浓度应不能中和抗体并阻断抗体定 位。
到目前为止，疫苗的开发已集中在设计更好的技术，以放大人类 免疫系统所应答的靶的免疫应答，而且被动免疫疗法已得到不确定的 结果。本发明所公开的为其它之HIV在人体内不诱导免疫作用的作用 靶点，以及一种新的构型，用于传递导致前所未有的HIV免疫反应的 抗原。本发明所公开的方法的目的在于治疗HIV和艾滋病，但应认识 到本方法的药剂具有广泛的用途。通过HIV关键靶点的抗体产生，通 过改善艾滋病临床效果的治疗，在山羊体内的抗体应答证明了本发明 的效用。该技术在疫苗开发上具有广泛的应用。
针对抗原的刺激成功诱导出免疫力需要通过抗原呈递细胞(APC) 经MHC作用的多重抗原决定簇重复的呈递。最具有免疫原性的抗原决 定簇具有两亲性构型，其中一端为疏水的氨基酸，另一端为亲水的氨 基酸，所述抗原决定簇包含的氨基酸与构成两亲性螺旋是一致的，即 它们缺乏破坏螺旋结构的氨基酸如脯氨酸，并且缺乏碳水化合物。缺 少在微环境中易受蛋白酶降解的氨基酸的序列特别理想。
为确定HIV上具有最重要性的免疫靶点，确定动物而非人类中HIV 相关蛋白产生免疫性的区域。采用脱除或未脱除糖基的纯化HIV溶胞 产物免疫山羊。从HIV蛋白上除去糖残基对于蛋白的免疫应答没有什 么影响，并且也不能暴露出隐蔽的抗原决定簇。对商品HIV溶胞产物 作进一步的纯化以除去包括人类HLA类型1抗原、HLA类型2抗原、 和β-2-小球蛋白在内的组织培养蛋白。免疫后，采用竞争性免疫检测 法测定由山羊所得的抗血清以鉴定那些不被从HIV感染者体内采集的 抗体所识别的HIV肽。采用所选的具有高中和性和Western印迹活性 的患者血清制备人体HIV抗血清库，并作为标准竞争性免疫检测法中 的竞争性抗体。宽范围的山羊抗体被确定出来，它们可与不同于人类 抗HIV抗血清库所识别的HIV抗原决定簇反应。
本领域的技术人员认识到其它种动物可用于对这些抗原决定簇产 生抗体，并且这些抗体可在ADCC和补体介导的反应中起作用。其它 适用于产生抗体的动物种类包括但不限于：绵羊、兔、马、奶牛和老 鼠。
采用包括HIV1SF2线性氨基酸序列的12节(mer)的肽表征抗HIV 抗体的抗原决定簇反应性。这种大小的肽容易与抗体反应，易于合成 并易于制成高纯的形式。肽为合成并购自Purification System，Inc.。这 些合成肽与过氧化酶标记的山羊抗HIV抗体相结合，并各自与两套涂 布有HIV的微量测定板孔结合。其中一套被人抗HIV IgG封闭；而另 一套则没有被封闭。测量肽抑制山羊抗HIV结合被人抗HIV封闭的HIV 蛋白的百分比。
当观察到某一具体合成肽抑制结合时，合成覆盖此抑制性肽的氨 基酸序列的其它肽，以进一步确定抗原决定簇序列。
采用HIV肽-HRP复合物作鉴定标记物进一步评价和确定HIV 蛋白上被山羊抗HIV IgG识别而不被人抗HIV IgG识别的抗原决定簇 的位置。在该实验中，HIV蛋白被吸收于载体如微量滴定板孔或精密 聚苯乙烯球上。将包括HIV1SF2线性氨基酸序列的12节的肽与辣根过 氧化酶共价结合。利用人和山羊对吸收于载体上的原位抗原决定簇和 对与过氧化酶共价结合肽的抗HIV反应性，独立测量人和山羊的抗HIV 反应性。利用此方法，详情参见实施例8，仅有包含在合成肽中的抗原 决定簇被识别出来。
一旦鉴定出与人类蛋白有明显相似性的肽，即确定出对HIV寿命 周期具有十分重要作用的序列。与以下如实施例8所示，通过生产出 待选肽的抗体并接着测定这些抗体对于HIV感染性和病毒中和的作用 进行此项工作。
如上所述，已鉴别出多个特殊的抗原决定簇区域，除非作特殊声 明以下以HIV1SF2序列为参考详细描述其中九个。对以下所列并贯穿针 对HIV1SF2的本发明申请的氨基酸残基的指定来自Los Alamos Data Bank(AIDS Virus Sequence Data Base，Los Alamos National Laboratories， Theoretical Division，Los Alamos，N.M.87545)。对以下所列并贯穿针 对HIV 2 NZ的本发明申请的氨基酸残基的指定来自Ex Pasy World Wide Web Molecular Biology Server of the Geneva University Hospital and the University of Geneva，而BioAccelerator来自位于Weizman Institute， Israel的Copugen Ltd.、以及Akira Ohyama，Bioscience Systems Department，Mitsuey Knowledge Industry Co.，Ltd.，Tokoyo，Japan。本领 域技术人员应认识到，基于其在来自于多种分离体的相关蛋白中的位 置，来自其它HIV分离体的其它类似区域(类似物)也可被鉴别。实 际上，如下所述参考HIV1SF2序列可鉴别这些类似物：
(a)对比HIV分离体和HIV1SF2的氨基酸序列，在两序列间获得 最大的相似性，通常两序列间至少有约75％的相同性；
(b)一旦一个氨基酸序列被定位于HIV1SF2中的相应位置，将说 明免疫模拟、相似性、或由于对模拟或相似性序列保持抗体反应性而 等同与HIV1SF2。由此确定的来自其它HIV分离体的肽及其氨基酸序 列将免疫模拟HIV1SF2的相应区域。
该鉴别关键抗原决定簇的方法可用于尚未被发现的HIV株。例如， 一旦鉴别出一种新的HIV株，可将其衣膜和核心氨基酸序列与HIV1SF2 序列对比，以获得该菌株最大的相似性。这种对比序列的方法已为本 领域技术人员所熟知。在对比序列时，需要在半胱氨酸间构成尽可能 多的相似性。可合成并按本发明使用相对应于本发明详细公开的肽的 位置的新HIV株或种的氨基酸序列。
对于本发明，包含在这些序列中的抗原决定簇没有必要具有与HIV 所有病毒株或种的抗体的交叉反应性。包含可分辨一个种或血清群而 非其它的抗原决定簇的肽可用于鉴定特殊的种属或血清群，并有可能 有助于确定感染有一种或多种HIV种或血清群的患者。在治疗方案中， 它们还可与来自相似性区域或其它中和性区域的肽联合使用。
典型地，本发明的氨基酸序列包含约5至50个氨基酸，并包含位 于HIV蛋白上的一个或多个抗原决定簇，在通过感染或环境接触而遭 遇到这些抗原决定簇时，它们不能在人体内诱导出保护性免疫应答， 但在非人类哺乳动物体内则可诱导出免疫应答。优选地，该序列包含 约5至35个氨基酸。采用含有所需氨基酸序列的合成肽或经处理的天 然HIV蛋白的溶解产物免疫对它们有免疫应答的动物，并产生对HIV 感染有治疗价值的抗体。
通过模拟人类抗原决定簇或其它蛋白，这些目标氨基酸序列或肽 在人体中不能诱导出免疫应答。特别值得注意的是那些肽抗原决定簇， 在HIV蛋白和人类α-甲胎蛋白、天冬氨酰蛋白酶、脱氧尿苷5′-三磷 酸酯核苷酸水解酶、嗜曙红阳离子蛋白、嗜曙红衍生的神经毒素和核 糖核酸酶4前体之间共同的抗原决定簇，以及由来自Bungaris Naja、 Dendoaspis、Psudechis、或Androctonus Centruroides的神经毒素所模拟 的肽抗原决定簇。
在以下的讨论中，对于大量人类蛋白和神经毒素采用这些蛋白的 标准特征缩写形式进行表征。下表列出这些蛋白的缩写及全名：
序列与HIV蛋白相似的人类蛋白
Swiss Prot ID Xxxx-人 蛋白 ACE 血管紧张素转化酶前体 ACHE 乙酰胆碱受体蛋白 3BH1 3-β-羟基-5-烯-类固醇脱氢酶I 3BH2 3-β-羟基-5-烯-类固醇脱氢酶II 41BL 4-1BB配体 BLSA β-淋巴细胞抗原前体 CATD 组织蛋白酶D前体 CD69 早期活化抗原CD69 CD81 CD81抗原 CO02 肿瘤相关抗原CO-029 CP11 细胞色素P450IA1 CYRP 细胞因子受体普通β-链前体 CYPC 肽酰-脯氨酰顺-反异构酶C
DIAC 二-N-乙酰壳二糖酶前体 DUT 脱氧尿苷5′-三磷酸酯核苷酸水解酶 ECP 嗜曙红阳离子蛋白前体 EV2B 外弯的病毒整合位点2B蛋白 FETA α-甲胎蛋白 FOL1 叶酸受体α-前体 GSHR 谷胱甘肽还原酶 IL9 白介素9前体 IN19 干扰素可诱导蛋白9-27 INIU 干扰素可诱导蛋白I-8U INR2 干扰素α/β-受体β-链前体 KLTK 白细胞酪氨酸激酶受体前体 KPCL η-型蛋白激酶C LBP 脂多糖结合蛋白前体 LCAT 卵磷脂-胆固醇脂酰基转移酶 LECH 脱唾液酸糖蛋白受体1 LFA3 淋巴细胞功能相关抗原-3前体 LMA1 Lamaninα-1链前体 LONN 线粒体LON蛋白酶同源性前体 LONM 线粒体LON蛋白酶同源性前体 LYOX 蛋白-赖氨酸6-氧化酶前体 MAG1 黑素瘤相关抗原1 MAG2 黑素瘤相关抗原2 MAG3 黑素瘤相关抗原3
MC5R 黑肾上腺素(melanocortin)-5受体 MYSE 胚胎肌球蛋白重链 NOL1 增殖细胞核仁抗原P120 NRM1 自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1 NT3 神经亲合素-3前体 NTCR 依赖钠和氯离子的肌酸转运蛋白1 NXS1-NAJAT 眼镜蛇毒素 PA2M 膜相关磷脂酶A2前体 PIP5 磷酯酶C-γ-2 PGDS α-血小板衍生的生长因子前体 PLK 蛋白多糖连接蛋白前体 POL1 逆转录病毒相关pol多聚蛋白 PSS1 磷脂酰丝氨酸合成酶I RENI 血管紧张肽原酶前体 PNKD 非分泌型核糖核酸酶前体 S5A2 3-氧-5-α-类固醇-4-脱氢酶2 SDC1 多配体聚糖-1前体 SDC4 多配体聚糖-4前体 SEMI1 semenogelin 1蛋白前体 SON SON蛋白 SPCB 红血球收缩蛋白β-链 SRE1 固醇调节元素结合蛋白1 SYV 缬氨酰-tRNA合成酶 TCO2 transcobalin II前体
TGL3 蛋白-谷氨酰胺谷酰基转移酶E3前体 TFPI 组织因子通道抑制剂前体 TRFL 乳运铁蛋白前体 TYK2 非受体型酪氨酸-蛋白激酶 VPRT 逆转录病毒相关蛋白酶 WNT2 WNT-2蛋白前体 ZN45 锌指蛋白45
以下叙述上述9个高度保守抗原决定簇的氨基酸序列。这些区域 中的三个处于衣膜糖蛋白gp120(二个靶点)和gp41(一个靶点)上， 一个位于逆转录酶杂二聚体p66/55上，一个位于蛋白酶p10上。其它 靶点位于Gag前体(p55/Gag)上，位于p14(二个靶点)、p24和p7 上。
HIV1SF2 gp120上的一个抗原决定簇区域位于第4至27氨基酸残 基上，第二个位于HIV1的第54至76氨基酸残基上。位于gp120抗原 决定簇区域上的抗体协助gp120从gp41上的释放。gp120从gp41上 的释放是抗体剂量依赖的，并可用中和实验如测量HIV感染性的TCID 法证明。
HIV2NZ之gp120的中和或灭活区域的抗原决定簇区域也已被确 定。HIV2NZ衣膜糖蛋白gp120的序列已被描绘，第7至43氨基酸残基 为模拟HIV1SF2 gp120和某些人类蛋白序列的区域。作用于该区域的抗 体使得HIV2 gp120与gp41分裂，这与感染性的下降相关。
HIV1SF2的第三个HIV衣膜糖蛋白靶点位于跨膜糖蛋白gp41的502 至541氨基酸残基上。在补体存在下作用于此区域的抗体导致HIV衣 膜糖蛋白的抗体依赖补体介导的溶解，并明显降低HIV的感染性。
除衣膜糖蛋白抗原决定簇区域外，另一引人注目的HIV1抗原决 定簇区域包括逆转录酶杂二聚体p66/55的第254至295氨基酸残基。 作用于此区域的抗体导致抗体剂量依赖的逆转录酶活性的下降。另一 引人注目的抗原决定簇区域包含蛋白酶p10的第69-94氨基酸残基。 作用于此区域的抗体导致抗体剂量依赖的蛋白酶活性下降。
位于逆转录酶和蛋白酶上的靶点位于靠近酶活性位点的保守区域 中，有关酶活性位点变异以及针对竞争性抑制剂继发的抵抗力已为人 所熟知。抗体介导的灭活是由于酶立体或结构改变继而引起活性丧失 的结果。该灭活的方法独立地起作用，不受酶活性部位变异的影响并 且是不可逆的。
其它引入注目的是在Gag基因上的三个抗原决定簇区域。具体而 言，Gag基因蛋白p24的第166至181氨基酸残基，Gag基因蛋白p17 之第2至23氨基酸残基上的第一靶点和第89至122氨基酸残基上的 第二靶点，以及Gag基因蛋白p7的第390至410和第438至443氨基 酸残基在本发明中均有用。作用于这些区域的抗体在上述抗体造成HIV 衣膜溶化后导致核壳体瓦解。当HIV RNA暴露于血浆RNAse降解时， 这种受体的结合达到最大值。此外，出芽后p17上的靶点暴露于被感 染淋巴细胞的表面。这为感染淋巴细胞的ADCC溶胞作用提供了额外 的靶点。
含至少一个不能被HIV感染者的抗体所识别、但能被山羊抗HIV 抗体识别的抗原决定簇的上述列特异性肽之一为含HIV1SF2衣膜gp120 之第4至27氨基酸残基的肽，其包含抗原决定簇的线性序列为以下序 列：
KGTRRNYQHLWRWGTLLLGMLMIC
该肽模拟人类蛋白FOL1、NTCR、PIP5、PSS1、KLTK、MC5R、ECP、 INIU、INI9、VPRT、CD69、MYSE、RNKD、ACHE、TCO2、LCAT、 MAG1、MAG2、MAG3和LYOX。
HIV1SF2 gp120衣膜糖蛋白的第二个抗原决定簇区域在第54至76 氨基酸残基上，其序列为：
ASDARAYDTEVHNVWATHACVPT
该肽模拟蛋白CYRB和SKV。
在HIV1SF2衣膜上的第三个引人注目的抗原决定簇区域位于糖蛋白 gp41的第502至541氨基酸残基上。该肽具有以下氨基酸序列：
HIV1 Env 502
RVVQREKRAVGIVGAMFLGFLGAAGSTMGAVSLTLTVQAR 502 -541
该肽模拟人类蛋白CYPC、TYK2、ACHE、NTCF、NTCR、CD81、41BL、 NIDO、GSHR、CO02和TCO2。
在另一特殊实施方案中，引人注目的抗原决定簇区域位于HIV1SF2 Gag蛋白p17的第2至23氨基酸残基上。该肽具有序列：
GARASVLSGGELDRWEKIRLRP
该肽模拟人类蛋白TFPI、PA2M、BLSA、ECP和FETA以及某些神经 毒素，如NXS1和NAJAT。该肽具有一个结合和定位宿主细胞膜的疏 水性序列，其作用是模拟细胞翻译蛋白Src。
HIVSF2 p17上的第二个靶点位于第89至122氨基酸残基上。该肽 具有序列：
LYCVHQRIDVKDTKEALEKIEEEQNKSK
该肽模拟FETA和TRIC。
另一引人注目的肽为Gag基因蛋白p24和其中包含抗原决定簇的 子序列的第166至181氨基酸残基构成的肽。该肽具有序列：
PEVIPMFSALSEGATP
该肽模拟人类蛋白FETA和TRFL。
第三个引人注目的Gag基因蛋白抗原决定簇区域为Gag基因蛋白 p7和其中包含抗原决定簇的子序列的第390至410及438至443氨基 酸残基构成的肽。该肽具有序列：
KTVKCFNCGKEGHIAKNCRAP+KIWSSQ
该肽模拟人类FETA和RNA结合蛋白。该肽包含结合Zn的区域，用 于与病毒RNA相互作用和结合。该区域的抗体在已感染的CD4+淋巴 细胞溶胞后促进没有衣膜的早熟HIV的清除。
另一引人注目的抗原决定簇区域为蛋白酶p10和其中包含抗原决 定簇的子序列的第69至94氨基酸残基构成的肽。该肽具有序列：
RIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLP
该肽模拟人类蛋白RENI、BLSA、VPRT和CATD。该序列的抗体抑制 HIV蛋白酶的活性。
本发明中另一有用的特异性序列为包含HIV1逆转录酶杂二聚体 p66/55之第254至295氨基酸残基的序列。该肽具有序列：
GLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDKDFRKYTAFTIPSINNETP
该肽序列模拟人类蛋白POL1和ECP。
如上所述，依据本发明的方法也可用其它HIV株得到肽和抗体。 通过其它病毒株序列和HIVSF2或HIV2NZ序列间的比较和对比，并找出 与HIVSF2或HIV2NZ中确定的抗原决定簇相似的序列，从而可确定其它 HIV株中的有用的肽。
通过本发明的方法确定的HIV2NZ中引入注目的序列是在env gp120 的可读框上，包括第7至43氨基酸残基。该肽具有以下序列：
QLLIAIVLASAYLIHCKQFVTVFYGIPAWRNASIPLF
该肽模拟人类蛋白IL9、SRE1、NRM1、LBP、NOL1、S5A2、LMA1、 LECH、LFA3、KPLC、FETA、3BH2、3BH1、INR2和EV2B。
例如，一旦所需氨基酸序列被鉴定，将获得识别这些序列的抗体。 采用从HIV溶胞产物中提取并包含这些肽的蛋白、合成肽、细菌融合 蛋白以及来自种系发生无关且含所需抗原决定簇的源的蛋白/肽，可获 得这些抗体。
如果采用病毒溶胞产物，可采用单一HIV株的蛋白溶胞产物，或 两种或两种以上病毒株的混合溶胞产物。如果使用混合溶胞产物，混 合物可包含不同HIV1株的溶胞产物或至少一种HIV1株和至少一种 HIV2株的混合体。优选的混合物为HIV1BAL、HIV1MN和HIV2NZ溶胞 产物的混合物。
首先处理病毒溶胞产物除去HIV蛋白中的脂质和其它杂质。然后 处理该HIV蛋白质混合物，以除去来自细胞培养源的杂质，如人类白 细胞抗原(HLA)类型I和类型II抗原。除去这些抗原的方法在本领 域为人所熟知，包括采用单克隆抗HLA类型I和抗HLA类型II抗体 和免疫亲合法；在以下实施例3中详细描述了一种方法。
此外，已经发现HIV蛋白的糖必须被除去；当对动物给药HIV蛋 白时种系保守的糖抗原决定簇则可能刺激免疫应答，使得所生产出的 抗体可能对人类组织具有细胞毒性作用。采用本领域技术人员所熟知 的酶，其中包括PGN酶、neurominidase和葡糖苷酶脱去糖基，实施例 3中详细描述了一种这样的方法。
接着可将处理好的HIV蛋白混合物用于免疫动物，以产生目标肽 的抗体。理想地，混合物中包含大约等量的含目标肽或抗原决定簇区 域的蛋白。即理想状态下，它们间的比例约1∶1，并且任何两肽的摩 尔比不大于约10∶1，优选为3∶1。
此外，可采用合成肽作免疫原。如果采用合成肽，可通过如氨基 酸序列的取代或截短来修饰所需肽的氨基酸序列。
氨基酸取代可防止预计的酶断裂，抗原加工过程中该酶断裂可能 发生在某一特殊氨基酸片断上，迫使两亲性结构的形式满足所需的 MHC相关的抗原呈递的要求并提供足够供HLA呈递的长度，蛋白断 裂可发生在抗原决定簇的边缘上或其附近位置。选择截短序列使得所 述肽保持如MHC类型1和类型2抗原呈递机制所预计的抗原决定簇长 度要求。以下在合成肽部分给出理想氨基酸取代的更详细的原则。除 取代和截取序列，延长的肽序列也可被制备，其中附加氨基酸被加在 所选抗原决定簇的任一端，以有助于与固相载体和大分子载体结合。
例如，含上述HIVSF2 gp41的第502至541氨基酸残基的肽的有用 截短序列为包括含512-531氨基酸残基的肽：
GIVGAMFLGFLGAAGSTMGA
和含518至527氨基酸残基的序列：
FLGFLGAAGS
其它特别有用的截短肽为含HIVNZ gp120的第7至43氨基酸残基肽的 截短序列，其中包含序列：
LLIAIVLASAYLIHCKQ
该肽可采用多种方法进行制备。由于其相对较小，该肽可依据常 规方法在溶液中或在固相载体上合成。现在也有多种商品化的自动合 成器并可按已知的方案进行使用。参见，如Stewart and Young，Solid Phase Peptide sythesis，2nd ed.，Pierce Chemical Co.，1984；以及Tam等 人.，J.Am Chem.Soc.(1983)105：6442
此外，可采用杂交DNA技术，通过采用编码多肽的单链或与其基 本上互补的链制备合成基因，将单链搭接并可在退火介质中连接在一 起以构成杂化。杂化链可接着连接构成完整的基因，并通过选取适当 的末端，可将该基因插到表达载体中，现在很多表达载体均可容易地 得到。参见如Maniatis等人.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual， CSH，Cold Spring Harbor Laboratory，1982。或者可通过常规重组DNA 技术克隆编码该肽的病毒基因组的区域，并在原核细胞生物或真核细 胞的表达系统中表达以产生所需的肽。
优选地，免疫原富含所需抗原决定簇，产生抗体的B淋巴细胞应 答这些抗原决定簇，产生中和和灭活HIV感染寿命周期关键步骤的抗 体。此处所采用的术语“富含”指所需抗原决定簇至少占HIV蛋白的 25％，优选为至少50％，最优选为约95％。更具体而言，如果有必要， 需采用如聚丙烯酰胺凝胶电泳等纯化方法，纯化含瓦解病毒溶胞产物 或提取物的溶液、或者生物表达重组蛋白或瓦解的表达载体或含模拟 抗原决定簇的蛋白的上清液，以富集这些蛋白。对于含所需HIV抗原 决定簇的蛋白和肽的纯化，免疫亲和纯化法是一种优选的和便利的方 法，如采用经单一特异亲和性纯化的多克隆或单克隆抗体进行亲和纯 化。用作免疫原的肽从溶液中被纯化出来的程度可能变动很大，即约50 ％，典型为至少75％至95％，理想为95％至99％，最理想为完全均 一。
为获得所需抗原决定簇的抗体，采用目标肽或含有这些肽的HIV 蛋白免疫动物，其中如上所述HIV蛋白已被处理除去糖和HLA抗原。 免疫规程已为人所熟知并可在保持效果的前提下作很大变动。参见 Colco，Current Protocols in Immunology，John Willey and Sons，Inc. 1995。可将蛋白和/或肽悬浮或稀释于适当的生理性载体中进行免疫。 适用的载体为可传递和/或促进肽免疫原性的、有生物相容性的、无毒 的任意载体，其中包括无菌水和0.9％盐水。
此外，肽可在用作免疫原以前一载体分子结合。如以下更具体描 述的一种优选技术将蛋白及其片断与一种糖肽如胞壁酰二肽(MDP) 的多重重复体结合构成微球，其典型直径小于1μm，优选为小于0.2 μm。接着将该微球悬浮于药物载体中供注射用。该方法可获得高密度 的供诱导免疫应答的肽。根据给药及免疫应答的途径选择载体。采用 常规的、已为人所熟知的消毒技术对组合物进行消毒。通过口服或非 肠道途径给药这些肽，其中后一种方法为优选方法。
富含所需抗原决定簇的抗原制剂被注射的免疫剂量通常为1μg至 20mg/kg宿主体重。可通过注射，如肌肉、腹膜、皮下、静脉注射等 进行给药，可一次给药或多次给药，通常间隔一至四周。
监测免疫动物是否产生所需抗原决定簇的抗体。对于被动免疫治 疗，优选为高亲和力的补体结合的IgG抗体，可原样使用或使用其片 断如Fv、Fab、F(ab′)2。当需要更大组织穿透性时，优选使用抗体片断。 可单独给药抗体及其片断或给药抗体与毒性物质或抗原决定簇所构成 的复合物。一旦获得所需的免疫应答，采用如静脉穿刺、心脏穿刺、 或血浆除去法收集血液。依据常规方法，包括如盐沉淀、离子交换色 谱、粒径色谱、亲和色谱，将抗体从复杂的血清或血浆混合物中提纯 出来。常常要将多种方法联合使用。免疫亲合色谱为优选的方法。
为防止接受非人类动物衍生的抗体在人体内产生可能的免疫原 性，可构建重组抗体。重组抗体的一种类型是嵌合抗体，其中免疫球 蛋白分子的抗原结合片断(可变区)通过肽键连接至不被人类识别为 外源性的其它蛋白的至少一部分之上，如人免疫球蛋白的恒定区。这 可通过将动物可变区编码因子与人类κ或γ恒定区编码因子融合而完 成。对于技术人员来说已知有多种的方法，如PCT86/01533、EP171496、 以及EP173494中所描述的方法，这些专利公开在此被引用作为参考。 重组抗体的优选类型为CDR-移植抗体。
药物配方及其应用
中和感染性、杀伤已感染之CD4淋巴细胞和灭活HIV寿命周期关 键阶段的本发明抗体作为一成分复配入药物组合物中。该组合物包含 治疗及预防剂量的至少一种本发明抗体，理想的为一种抗体鸡尾酒， 以及药学可接受载体。药学可接受载体为任意适用于向患者传送抗体 的、有相容性的、无毒的物质。因此，本发明提供非肠道给药的组合 物，其包含溶于可接受性载体、优选为含水载体中的抗体的溶液。可 采用多种含水载体，如水、水缓冲液、0.4％盐水、0.9％盐水、0.3％氨 基乙酸溶液等。这些溶液为无菌的，通常其中不含颗粒状物质。组合 物中也可包含药学可接受的辅助性物质以满足近似生理条件的要求， 如pH调节及缓冲剂、毒性调节剂等。如可使用乙酸钠、氯化钠、氯化 钾、氯化钙、乳酸钠等。配方中抗体的浓度是可变的，通常从小于约0.1 mg/ml到高至150至200mg/ml，优选为约1mg/ml至20mg/ml，其主 要依赖于液体体积、粘度等进行选择，优选依赖于所选取给药途径的 特殊方式而作选择。本领域普通技术人员能够确定具体抗体或抗体鸡 尾酒的浓度。因此，典型的经静脉输注的药物组合物可由250ml无菌 Ringer′s溶液以及100-200mg抗体制成。经肌肉注射的组合物可由1ml 无菌水缓冲液和约20至50mg的抗体制成。制造非肠道给药组合物的 具体方法对于本领域技术人员来说是熟知或清楚的，如在Remington′s Pharmaceutical Science，15th Ed.，Mack Publishing Company Easton，Pa. (1980)中有更详细的描述，在此引用该文献作为参考。这些组合物 可包含单一的抗体，该抗体例如可特异性针对某些HIV株，或者针对 由大多数、优选为所有HIV株表达的蛋白或糖蛋白。此外，药物组合 物中可包含多于一种的抗体以构成“鸡尾酒”。例如，包含对抗多种HIV 蛋白和病毒株的抗体的鸡尾酒可作为一种通用产品，用于治疗和预防 绝大多数HIV的临床分离体。鸡尾酒中可包含与HIV蛋白或衣膜糖蛋 白上的抗原决定簇结合的抗体，例如，可包含由针对上述HIV1SF2 Env 蛋白gp160、gp120、和gp41；Gag蛋白p7、p17和p24；逆转录酶杂 二聚体p66/55和蛋白酶p10，或其子群上的抗原决定簇位点的抗体复 合物，从而中和一系列在HIV寿命周期中起重要作用的抗原决定簇。 当然，也可采用针对HIV蛋白其它中和或灭活区域抗原决定簇位点的 抗体。
例如，改变病毒附着、细胞进入、转录、翻译、组装、成熟病毒 粒子向血浆膜的定位和病毒粒子的释放的抗体将干扰HIV寿命周期。 为灭活多种重要的HIV蛋白，更经常采用的是抗体鸡尾酒。这针对某 些病毒粒子有特别的治疗作用，这些病毒粒子缺乏外衣膜但通过其它 机制如微胞饮作用或转染等进入细胞而有可能造成感染。各种抗体成 分间的摩尔比应不大于10，最好不大于5，一般一说各抗体成分间的 摩尔比约为1∶1-3。
对于上述九种特异性肽的抗体，理想的抗体鸡尾酒包含两个衣膜 gp120肽和gp41肽的抗体。更为理想地，鸡尾酒中包含以上三个抗原 决定簇区域的抗体再加上蛋白酶p10抗原决定簇区域的抗体。更为理 想地，鸡尾酒中包含以上四个抗原决定簇区域的抗体以及至少一种所 列举的其余五个抗原决定簇区域的抗体。在最优选的实施方案中，鸡 尾酒中包含所有九种抗原决定簇区域的抗体。
本发明的抗体和抗体鸡尾酒可单独给药或与其它抗逆转录病毒药 剂联合使用。其它抗逆转录病毒药剂，特别是抗HIV药剂的开发现状 在Mitsuya等人，Nature 325：773-778，1987中有综述。
本发明的抗体和肽可以液体制剂形式在多个已知能保持抗体活性 的温度下贮存，如-70℃、-40℃、-20℃、和0-4℃，或冻干贮存， 并在使用前用适当载体重新配制。对于常规免疫球蛋白、已纯化的抗 体、以及由蛋白、糖蛋白以及肽组成的免疫原，已证明这一技术是有 效的。可采用本领域已为人所知的冻干及重新配制的技术，本领域技 术人员已认识到冻干并重新配制可能会导致抗体活性不同程度的丧失 (如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体比IgG抗体更易丧失活性)，因此 不得不调整剂量以补偿这种活性的丧失。
包含本发明抗体及其鸡尾酒的组合物可用于治疗和/或预防HIV感 染。在治疗应用中，对已感染HIV的患者给药，其用量应足以治疗或 至少部分阻止感染及其并发症。适宜完成此治疗目的的用量被定义为 “治疗有效剂量”。治疗有效剂量的选取依赖于感染的严重程度以及患 者自身免疫系统总的状态，但一般为约0.1至约200mg抗体每公斤体 重，优选为0.5至约25mg抗体每公斤体重。在危及生命或潜在危及生 命的严重病态下也可采用本发明的组合物。在这些病例中，治疗医师 有可能并可能感到有必要超大剂量给药这些抗体。
在预防应用中，对尚未被HIV感染、但有可能近期接触或被认为 已经接触，或有接触病毒的可能(如HIV感染者的新生儿)，或刚刚接 触或怀疑接触了HIV的患者给药含本发明抗体及其鸡尾酒的组合物。 如果对被HIV感染的孕妇给药该组合物，在分娩前可一次或多次给药 以降低母体血液中HIV的感染性，从而降低了HIV传染给新生儿的可 能性。对于有可能被传染的新生儿也可进行治疗以进一步降低感染HIV 的可能性。依赖于患者的健康状态及免疫总水平，定义为“预防有效 剂量”的剂量一般在0.1mg至25mg每公斤体重。
此外，本发明的抗体可用作靶点特异性载体分子。抗体可与毒素 结合构成免疫毒素，或与放射性材料或药物结合构成放射性药物或药 物。制备免疫毒素和放射性药物的方法已为人所熟知(参见，如Cance Treatment Reports 68：317(1984))。由本发明的抗体和人类T细胞激 动剂，如CD3抗原或T细胞Fcγ受体的单克隆抗体，构成的杂聚体可 激动人类T细胞或携带Fcγ受体的细胞(如K细胞或嗜中性粒细胞)， 通过抗体依赖且细胞介导的细胞溶解(ADCC)杀伤HIV感染细胞。 例如可采用Karpowsky等人，J.Exp.Med.160：1686(1984)中描述 的杂双功能基剂N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯， 将抗HIV抗体和抗CD3抗体共价交联组成这样的杂聚体，所述文献在 此引用作为参考。
其它的抗HIV药剂也可包含在配方中，如3′-叠氮基-3′-脱氧 胸苷、2′，3′-双脱氧胞苷、2′，3′-双脱氧-2′，3′-双脱氢胞苷等。
除抗体组合物外，也可对HIV感染者给药含本发明肽的组合物供 治疗和预防接种用。对于治疗应用，对HIV感染者给药含肽的组合物， 其中肽可为上述任意修饰的纯化肽或为包含在上述被处理HIV蛋白中 的，优选与MDP微粒结合以进一步刺激抗原性的肽。选择肽的给药剂 量以刺激产生针对先前不被患者免疫系统识别的功能性HIV抗原决定 簇的抗体，使得这些受激产生的抗体可阻止感染。对于预防应用，对 于未感染HIV的患者给药包含结合MDP微粒的肽的组合物，以刺激 产生针对尚未被识别的抗原决定簇的抗体，为将来的感染提供保护性 措施。
抗体及抗原在诊断及病情预测中的应用
本发明所公开的抗体及被它们所识别的抗原决定簇也可用于HIV 感染的诊断及处理上。典型地，采用抗体和/或其相应抗原的诊断检测 要求检测抗原-抗体复合物的存在。已有很多免疫检测法被描述，它 们采用用于免疫检测的已标记或未标记的免疫化学物质。当未标记时， 抗体例如可用在凝集反应检测法、抗体依赖且补体介导的细胞溶解实 验、以及中和实验中。未标记抗体可与其它已标记之与第一抗体反应 的抗体(第二抗体)联合使用，如对免疫球蛋白有特异性的抗体。未 标记抗体可与已标记抗体联合使用，如用在夹心式免疫实验中，其中 所述已标记抗体可与相同抗原上的非竞争抗原决定簇反应，或与已标 记的抗原联合使用。此外，抗体可直接被标记并可用于竞争性或非竞 争性免疫实验中。这些实验的类型及其配置在本领域已为人所熟知。 可采用多种标记，如放射性同位素、荧光标记、酶、酶底物、酶辅助 因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。现有多种类型的现成的 免疫检测方法，例如在第3,817,827；3,850,752；3,901,654；3,935,074； 3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876号美国专利中所描述的 方法。
一般来说将本发明的抗体和肽用于酶法免疫检测中，其中例如将 目标抗体或其相应的抗原与酶结合，而且免疫实验被设计成具有最大 限度的灵敏度和特异性，供检测生物样品如人类血清、唾液、阴道分 泌物或病毒感染细胞培养悬浮液中的HIV抗原。
也可设计采用目标抗体的试剂盒，用于检测HIV感染或HIV抗原 的存在。试剂盒中包含其它与HIV抗原决定簇特异性结合的抗体以及 任意的本发明的抗体。这些抗体与缓冲剂如Tris、磷酸盐、碳酸盐等， 稳定剂，杀菌剂，惰性蛋白如牛血清球蛋白等一起包括在试剂盒中， 以活性抗体的用量计，通常这些材料的用量小于约5wt％，通常总量 至少为0.001wt％，而所述抗体与一种标记物结合，未结合或结合至固 相载体如微量测定板孔或聚苯乙烯球的表面上。通常需加入惰性混合 剂或赋形剂稀释活性成分，其中赋形剂可占总组合物的约1至99wt％。 当采用可与抗体结合的第二抗体时，通常将第二抗体置于一个独立的 小瓶中。典型地，第二抗体与一种标记物结合，并以与上述抗体配方 相同的方式进行复配。被抗体识别的目标抗原决定簇可为标记的或未 标记的，并可作为一种较大蛋白(合成，重组，或天然)的一部分， 可作修饰或不作修饰，如添加间隔臂、氨基、或半胱氨酸残基，用于 将肽连接至载体上，并使其在载体表面上伸展。采用这些修饰使得抗 原决定簇的位置最有利于与抗体间的免疫反应。这些肽按上述含抗原 决定簇的蛋白相同的方法进行配制。
在多种生物样品中检测HIV抗原或整个病毒，可用于诊断HIV流 行性感染，评价治疗效果，计数被感染细胞，HIV株(分化体)的血 清分型，与初期感染、发展和并发症如外周神经病、多病灶性脑白质 病和卡波济氏肉瘤相关的毒性因子的鉴定及定量。生物样品可包括但 不限于：血液、血清、唾液、精液、活组织检查样(脑、皮肤、淋巴 结、脾等)、细胞培养上清液、经破坏的真核或细胞表达系统等。在诱 导免疫复合物形成的条件下将抗体和生物样品温孵，然后检测免疫复 合物的生成，由此测试病毒、病毒抗原、毒性因子、和血清型抗原决 定簇的存在。在一个实施方案中，使用可与第一抗体结合并典型结合 有标记物的第二抗体检测复合物的生成。该第二抗体按与上述配制第 一抗体配方相同的方式进行配制。在另一实施方案中，抗体结合至固 相载体上，然后与生物样品接触。经过温孵阶段后，加入已标记的抗 体检测被结合的抗原。在另一实施方案中，抗体与一检测标记物结合， 经过与生物样品如细胞或组织切片温孵阶段后，通过流式细胞计数或 显微镜评价样品中的抗原。
合成肽的制备及应用
本发明的肽可通过在肽链中引入氨基酸取代进行修饰。理想的修 饰是当改变一个或多个特定氨基酸，以更有效地模拟不同逆转录病毒 株的抗原决定簇或促进免疫应答或MHC与抗原决定簇的相互作用，使 得用于免疫或预防接种时模拟肽产生更大免疫原性。此外，理想的修 饰还包括进行某种氨基酸取代而增加肽的化学稳定性。
更具体而言，本发明所采用的多肽并不一定与特定HIV多肽顺序 一致，只要相对于至少一种HIV株的蛋白提供免疫竞争性即可。因此， 不论是保守性或非保守性改变都可对目标多肽作多种改变，如插入、 删除、和取代，只要这种改变可增强所需的肽活性。保守性取代指采 用如中性，酸性，碱性和亲水性氨基酸组内的相似氨基酸进行的取代。 在这些组内取代的实施例可包括gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn， gln；ser，thr；lys，arg；phe，tyr；以及nor，met。以下显示针对HLA 同种免疫球蛋白数据库分类(DNA和血清学)应用分子模型软件获得 的其它氨基酸取代：
组，1字母代码  组，3字母代码 F，S  phe，ser Q，R  gln，arg K，N  lys，asn E.G  glu，gly G，R  gly，arg H，Q  his，gln I，T  ile，thr V，A  val，ala D，N  asp，asn Y，F  tyr，phe I，F  ile，phe K，E  lys，glu E，L，R  glu，leu，arg
Y，L  tyr，leu S，V  ser，val Y，N，F，D  tyr，asn，phe，asp D，R  asp，arg L，F  leu，phe
在本发明优选的实施方案中，进行氨基酸修饰以在目标肽更亲水 的一端取代亲水性残基，而在肽更疏水的一端取代疏水性残基。这种 取代导致两亲性螺旋形成，而在两取代间托住所需的抗原决定簇。用 D型氨基酸取代可托住需保护的抗原决定簇并稳定抗原决定簇，从而 促进抗原决定簇的免疫原性。由于D型氨基酸不被细胞内的酶切断， 当将它们插到适当的位置时这些部分为抗原决定簇提供了与MHC分子 相互作用的所需长度。在以下实施例8.5中将作详细描述。
通常情况下，经修饰的序列与人类免疫缺陷逆转录病毒的至少一 株的序列的不同点不大于20％，但为使本发明的肽可方便地固定化到 固相载体上、结合在大分子上，在肽的一端或两端上添加氨基酸以提 供供连接的“手”的修饰，或通过改变或促进MHC结合和呈递促进免 疫原性的修饰除外。供结合用的手可包含单个氨基酸或多至50或更多 的氨基酸，典型的长度为1至10个氨基酸。
氨基酸如酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等可引 入到肽或寡肽的C-或N-端，以提供供连接用的官能团。半胱氨酸 是特别优选的，有助于与其它肽共价偶联或通过氧化构成聚合物的氨 基酸。
此外，对序列未端NH2酰化(如乙酰化)、巯基乙酸酰胺化、或端 羧基酰胺化(如采用氨或甲胺)进行修饰使肽和寡肽序列与天然序列 不同，以提供稳定性，为与载体或其它分子的连接或结合、或聚合提 供更大的疏水性。
因此，如在本发明所公开的肽的优选实施方案中，可在肽的末端 添加一个或多个半胱氨酸残基，或添加一个或多个半胱氨酸残基和间 隔氨基酸的组合。当需要单个肽时，赖氨酸为特别优选的间隔物。当 需要肽的多重重复体时，已一个赖氨酸为核心合成肽的四重重复体。 以实施例显示这种结构。供氧化聚合的优选肽为目标肽末端至少被添 加两个半胱氨酸残基的肽。当两个半胱氨酸存在于同一末端时，当半 胱氨酸残基被一个至三个优选为甘氨酸的隔离氨基酸分离时构成了优 选实施方案。半胱氨酸残基的存在使得肽可能形成二聚体，和/或增加 所得肽的疏水性而有助于肽在固相上的固定化或在固定化实验体系中 的固定化。特别有意义的是利用半胱氨酸或用于酰化端氨基的巯基乙 酸上的巯基，或者用于构造多重肽重复体或其类似物的第一氨基酸是 通过二硫键或一种更长的连接形式连接两个肽或寡肽或其组合物，以 构成含数个抗原决定簇的聚合物。这样的聚合物的优点是增加了免疫 反应。当需要不同的肽进行免疫时，可将它们分别组装并复配成鸡尾 酒以提供诱导更多抗体的能力，其中抗体与不同HIV分离体中的几种 抗原决定簇反应。为构成抗原聚合物(合成多聚体)，化合物可具有双 一卤乙酰基、硝基芳基卤等，其中试剂对这些基团有特异性。肽或寡 肽的一个或两个巯基间的连接可为单键或含至少2个或更多碳原子的 连接。
肽与大分子载体的连接
可将目标肽连接至一个可溶性的大分子(如不大于5kDal)载体 上。简单地，载体可为合成或天然聚氨基酸，它在人类血清中不易遭 遇抗体。这样的载体的实例有聚L-赖氨酸、匙孔血蓝蛋白、甲状腺 球蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白、破伤风类毒素等。载体的选取主要 依赖抗原的最终用途以及方便和易得。在一个优选实施方案中，载体 包含糖肽的多重重复体，这种微粒可以合成或从某些细菌如 Proprionibacterium acini等中分离得到。这种微粒由多重交联构成多聚 结构的胞壁酰二肽构成。
当从Proprionibacterium acini及其相关细菌中提取胞壁酰二肽时， 菌株选择有助于提取工作的进行。选择的依据是对细菌细胞壁的化学 分析。优选的实施方案是与由L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺组成的二肽多 重交联的胞壁酰二肽。
初步实验已经确定不同菌种的二肽组成及肽长度不同。含高浓度 脂质A和O-酰化-β-肉豆蔻酸酯的提取物是细胞壁的成分。初步 实验证明这些不同点与增加毒性并降低佐剂作用相关。在以下实施例4 中讨论了优选实验方案的菌种选择和纯化。
采用本领域已知的方法可合成MDP微粒。已经发现MDP是强的 免疫增强剂，但具有明显的毒性。很多降低MDP毒性的尝试采用了延 缓其释放的方法，如将MDP与脂质体或其它相关化合物结合或对其末 端进行修饰。化学修饰使得所需的辅助性能大大降低，而改变转运速 度的设计难于被控制。例如以下给出了MDP微粒的组成、大小、以及 转运抗原的结合方法。从微粒组成中除去脂质有助于通过抗原呈递细 胞(APC)使MDP迅速内在化。抗原呈递细胞主要是单核系细胞，包 括单核细胞、巨噬细胞、组织细胞、Kuffer细胞、Dendritic细胞、 Langerhans细胞等，并通过MHC相关作用参与抗原处置和抗原呈递。 有助于对外源性蛋白产生免疫应答的因素部分地可由在微环境中易受 蛋白酶切断的氨基酸序列和序列决定。对于构成两亲螺旋的肽，其中 疏水端优选位于氨基端，而亲水端基常位于羧基端，最经常诱导免疫 应答。对抗蛋白质降解并构成两亲性螺旋结构的序列常常为强免疫原。 序列中包含脯氨酸残基通常免疫原性差，因为阻碍了螺旋的形成，而 且糖基化位点不易接近，并经常阻断对肽抗原决定簇的应答。在宿主 动物体内引起成功免疫应答的抗原激发需要通过MHC相关作用的抗原 处置和抗原呈递。当内在化进入内涵体后，主要通过抗原呈递细胞 (APC)处置外源性抗原。经过酶进行蛋白水解后，如在酸性环境下 存在和反应的组织蛋白酶D，符合上述标准的肽片断被MHC类型II汇 集并呈递到细胞表面。当肽被呈递到足够的密度时即导致免疫的发生。 免疫应答的类型受以下因素驱动：每APC上肽密度、微环境、细胞因 子环境、以及被抗原呈递细胞首先激动的淋巴细胞类型。内在化后， 细胞因子的级联应答被诱导出，其改变微环境并建立诱导免疫作用的 条件。
例如，如以下实施例5所示采用单个MDP微粒(0.01-0.2μm) 运送免疫原至抗原呈递细胞，导致常规方法没有观测到的、针对差免 疫原性的抗原决定簇产生的免疫应答。对这些免疫应答进行定量证明 与其它佐剂相比抗体浓度增加了10至100倍。
用作免疫原的目标肽可采用目标肽的氨基或羧基端连接至胞壁酰 二肽氨基酸部分的羧基端，或如实施例所述将其连接于糖部分上的醛 氧化产物之上。每个MDP微粒上至少有一个目标肽分子，优选为每个 MDP微粒上有10-100个目标肽分子，最优选为每个MDP微粒上有 100-1000个目标肽分子。载体的大小及其可利用的连接基团数目将影 响每个载体上目标肽的个数。
通过影响优先细胞吸收、肽半衰期、和通过MHC免疫作用的抗 原呈递，大分子载体影响免疫原性。可将一种或多种不同目标肽连接 到同一大分子载体上，但优选将一种目标肽以一价或四价形式连接至 大分子载体上。当需要多于一种的目标肽进行免疫时，可通过混合各 目标肽大分子载体复合物制备复合物的鸡尾酒，其中混合比将最优化 引入到鸡尾酒中各目标肽的免疫原性。在这一配置中，每个大分子载 体复合物上具有足够的肽(100-1000个肽)，以促进单个抗原呈递细 胞的抗原呈递。通过调节每个大分子载体上目标肽的个数，或连接结 构，如氨基对羧基的连接、末端氨基酸的修饰、间隔臂的长度和组成， 可优化目标肽的免疫原性。在这一构型中，通过抗原呈递细胞的抗原 处置导致高密度，通常大于100，和最常见大于500个肽通过MHC相 互作用被呈递到抗原呈递细胞的细胞表面。如以下实施例所示，免疫 后这种构型产生足够更高浓度的抗体。
连接的方式是常规的，采用如试剂p-马来酰亚氨基苯甲酸、p- 甲基二硫代苯甲酸、马来酸酐、琥珀酸酐、戊二醛等进行连接。连接 可在分子的N-端、C-端或分子的中部。采用胞壁酰二肽多重重复体 时，通过对糖残基温和氧化，如采用高碘酸钠，产生醛基供与目标肽 的连接，然后用硼氢化钠等温和还原将希弗碱中间体转化成一种稳定 的共价连接。改变氧化条件可控制每个微粒上肽的数量，并可使用放 射性示踪剂进行定量。在本领域中这些方法已为人所熟知。为获得所 需的应答，不同肽可采用不同的连接方法和连接结构。
可采用多种本领域技术人员所熟悉的实验规程检测逆转录病毒蛋 白抗原决定簇的抗体的存在或检测复杂蛋白混合物中的逆转录病毒蛋 白。其中特别有意义的是一种本发明公开的新型检测法，其中将目标 肽与一种供检测用的标记物如辣根过氧化酶共价连接，并将天然HIV 蛋白表达的抗原决定簇或多个抗原决定簇直接或间接连接至固相载体 上。在这种构型中，识别肽抗原决定簇的抗体将使固相载体上的抗原 决定簇与标记物上的抗原决定簇相连。通过改变接在标记物上的肽， 采用这种方法可测量和定量出抗体对HIV抗原决定簇的反应性。例如， 通过本发明公开的一步竞争性免疫实验可对任何表达与HIV血清型、 毒性因子或其它HIV特征相关的肽抗原决定簇的样品中的抗原决定簇 进行鉴定和测量。
抗体及其相应抗原决定簇在免疫亲合纯化法中的应用
对包含在HIV蛋白中的抗原决定簇有特异性的抗体，以及含这些 抗原决定簇的纯化蛋白，特别适用于免疫亲合纯化含这些抗原决定簇 的蛋白以及与它们反应的抗体。通常抗体的亲合常数在108至1012M数 量级。可采用这种抗体纯化含目标抗原决定簇的蛋白和肽。通常可采 用经基因改造的细菌制造HIV蛋白，如果被表达蛋白被分泌出来，可 从重组表达系统的培养介质中提纯出目标重组融合蛋白，如果被表达 蛋白不被分泌出来，可从经破坏的生物表达体系中提纯出蛋白，或者 从蛋白的复杂生物混合物中提纯出蛋白，其中蛋白中的一些或一种成 份包含有模拟HIV抗原决定簇的抗原决定簇。通常将可与HIV抗原决 定簇反应的抗体结合或固定化至基体或载体上。接着在适用于抗体与 含抗原决定簇的蛋白相互反应构成免疫复合物的条件下，将含有抗原 决定簇的溶液与固定化的抗体接触。未结合材料从结合的免疫复合物 中被分离出去，然后结合蛋白从固定化抗体上被释放出来并回收至洗 脱液中。
类似地，含HIV抗原决定簇或模拟HIV的抗原决定簇的蛋白或肽 被结合或固定化至基体或载体上，用于从溶液中提取目标抗体。含有 抗体的溶液，如去除白蛋白的血浆，流经固定化肽或蛋白柱，其中肽 或蛋白中包含所需抗原决定簇，免疫复合物形成后，非反应性抗体从 结合免疫复合物中被分离出去，用洗脱缓冲液释放抗体并将其回收在 洗脱液中。对于包含模拟HIV的抗原决定簇但来源于与HIV无关种系 中的蛋白的纯化，这种方法具有特别重要的价值。
典型地，将抗体从超免疫血清中粗分出来。腹水液体或细胞培养 上清液以及包含模拟HIV抗原决定簇的蛋白或肽可从生物来源中粗 提，该生物来源例如但不限于：体液、血液、血液成份、细胞提取物、 成体或胚胎组织提取物、以及培养上清液、培养细胞提取物、毒液、 以及结合到载体前的重组融合产物。这些方法本领域技术人员很清楚， 可包括采用高浓度的中性盐分级。在用于免疫吸附前，也可采用其它 纯化方法，如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、制备型凝胶电泳、或亲 和色谱以增加制剂的纯度。有必要时将粗分的抗体制剂与支持基体反 应可制备亲合性纯化的抗体，其中支持基体上连接有反应性抗原决定 簇或含有这种抗原决定簇的蛋白。
特别有意义的是通过天然系统来模拟的HIV抗原决定簇的抗体。 由于可纯化HIV蛋白和描绘HIV蛋白序列的定位及功能，这种抗体适 用于作治疗药剂并适用于研究HIV。采用HIV衍生的蛋白/肽免疫可制 备这种抗体，并通过所得超免疫多克隆多价抗血清与上述由非HIV源 如胚胎蛋白、毒液、以及非HIV微生物/病毒成份衍生的、固定化于载 体上的蛋白/肽反应来进行免疫亲合纯化。所得之经免疫亲和纯化的抗 体对于HIV与用于免疫纯化的非种属相关蛋白所共享的抗原决定簇有 抗原决定簇特异性。这些抗原决定簇特异性抗体在HIV和非HIV衍生 蛋白和肽的免疫亲和纯化中具有特别重要的作用。这样的抗体可用于 描绘抗原决定簇在HIV上的位置以确定其序列，评价其在HIV寿命周 期中的作用，其在HIV进化株或其它逆转录病毒中的分布，其与HIV 毒性的相关性，以及如果其对人体无毒害作用，但可中和HIV寿命周 期的重要阶段，则可用于治疗HIV感染。
理想的用于固定化抗体或抗原决定簇的载体具有以下基本特性： (a)与蛋白间相互作用一般较弱，以最小化非特异性结合；(b)好的 流动性，允许高分子量材料流过，(c)具有经活化或修饰可与抗体或 抗原决定簇构成化学键连的基团，(d)在用于连接抗体的条件下具有 物理和化学稳定性，以及(e)对于抗原吸附和洗脱所需的条件及缓冲 液成份具有稳定性。常用的一些载体有琼脂糖、衍生化的聚苯乙烯、 多糖、聚丙烯酰胺小球、活化的纤维素、玻璃等。有多种将抗体和抗 原连接到载体上的化学方法。一般可参见Cuatrecasas，P.，Advances in Enzymology 36：29(1972)。本发明的抗体和抗原可直接或通过连接 剂或间隔臂间接连接至载体之上。将抗体和抗原固定化至色谱固定相 上所需的通用条件已为本领域所熟知。如可参见Tijssen，P.，1985， Practice and Theory of Enzyme Immunoassay，此处引用此文献作为参 考。具体的偶连条件部分地依赖于被偶联抗体或抗原的特性及类型。 典型通过共价键进行连接。
将一种富含抗体的免疫血清、腹水或培养上清液或HIV病毒的提 取物及溶胞产物、培养生物表达系统的上清液或提取物，经破坏的细 胞组织或血液成份(成体或胚胎)的悬浮物的上清液或提取物、或其 它复杂蛋白混合物，如含抗原决定簇的毒液、体液、或培养产物，加 到适当的分离基体中。在一定条件下温孵混合物并保持一定时间，以 足以产生抗原-抗体结合，通常至少30分钟，最好是2至24小时。 接着将含有特异性结合的抗体或抗原决定簇的固定化免疫复合物从该 复杂混合物中分离出来，采用吸收性缓冲液充分洗脱除去非结合杂质。 然后采用与具体载体、结合蛋白和洗脱蛋白有相容性的洗脱缓冲液， 将免疫复合物解离。可洗脱的蛋白、抗原或抗体被回收至洗脱液中。 洗脱缓冲液和技术已为本领域技术人员所熟知。包含被抗体识别之抗 原决定簇的肽可被用在洗脱缓冲液中，用于竞争性结合抗体结合位点， 洗脱可在一温和的洗脱条件下进行。通过改变缓冲液的pH和/或离子 强度，或添加离液序列高的试剂，可将被选择性吸附的蛋白从亲和吸 附剂上洗脱下来。洗脱缓冲液、其浓度以及其它洗脱条件的选择依赖 于抗体-抗原相互反应的特性，并且一经确定后就不可作太大的变动。
如果采用低或高pH或者低或高离子离度缓冲液或离液序列高的试 剂分解免疫复合物，需要将洗脱的蛋白调整至生理pH和离子强度。可 通过渗析或凝胶过滤色谱进行这种调整。这些方法也使得洗脱的蛋白 重新获得其天然构象。
上述的方法制得例如基本上纯化的、含有HIV抗原决定簇或模拟 抗原决定簇的蛋白，以及与这些抗原决定簇反应的抗体。典型地，经 纯化蛋白的纯度至少为50％，更常见地至少为75％，常常大于95％至 99％。
通过以下实施例描述本发明的实验可表明本发明其它的特征和优 点。实施例也进一步描述了本发明的方法，但不对本发明起界定作用。
实施例1
人类抗HIV抗体(IgG部分)库的制备，用于描绘人类和山羊免疫反 应间HIV抗原决定簇的不同之处
在经患者同意，患者签名同意，医生许可和当地IRB同意的前提 下，在一个社区诊所从HIV感染者体内获得人类血清。首先将所有血 清稀释10倍，采用购自Abbott Laboratories的试剂盒筛选所有血清的 HIV反应性。然后用Western印迹分析法对强反应性血清(通过实验， 随意地定为吸附率大于1)作进一步评价，以确定这些血清对大多数HIV 蛋白(env、gag和pol)的抗体反应性。如此被确定对大多数HIV蛋 白具有好的反应性的患者血清再通过小型培养中和试验评价确定血清 中含有的抗体的特异性，这种抗体特异性将中和小型培养试验中HIV 的感染性(总可培养感染剂量(TCID)中和反应)。共鉴别出29名患 者的血清与gp160、gp120、p66/55、gp41、p24和p17和p10反应具有 高抗体滴度，在小型培养中可中和HIV的感染性，并将这些血清集中 在一起(每个20-40ml)。对集中的抗人类HIV血清的进一步评价发 现对多株HIV具有广泛的中和作用，并对以上详述的九个抗原决定簇 区域具有高的抗体滴度(Western印迹法1∶100或更大时为阳性)。采 用常规方法从这一血清库中提取人类IgG。纯化后将总IgG浓度调整 至10mg/ml，用标准免疫检测法评价其组成和纯度。结果证明纯度大 于98％并且其组成为人类IgG。将纯化的人类抗-HIV分成几等分并 冷冻，供下述实验用。对于鉴别抗原和抗体库特异性的方法，本领域 技术人员是熟悉的。这种特异性可用在以后对抗未知抗体或抗原的测 定中作为比较。
如在以下实施例中所描述的那样，采用此人类抗-HIV去跟踪粗 病毒溶胞产物中之HIV蛋白的纯化，描述被人类免疫系统识别的HIV 抗原决定簇，并在竞争性EIA中鉴别被山羊而非人类抗体进攻的HIV 抗原决定簇。采用Western印迹分析法鉴定以含有目标肽的纯化HIV 蛋白或这些肽的合成体免疫的山羊体内的免疫应答，并评价设计用于 放大弱免疫原性肽的免疫反应的微粒载体复合物的功效。采用小型培 养法评价中和HIV感染性的抗体，该方法采用从外周血液单核细胞 (PBMC)中提取的纯化人类CD4淋巴细胞，其中利用标准技术，该 技术采用单克隆抗体结合的磁性颗粒除去不需要的细胞。用促细胞分 裂剂刺激CD4淋巴细胞，以增加其被HIV感染的可能性，除非特别声 明将用它作为HIV感染的宿主。除非特别声明，将用HIV1SF2作为参 比HIV株。采用本领域技术人员所熟悉的技术利用小型培养法确定抗 体对HIV感染性的作用。感染性以感染单元数(IU)表示。抗体介导 的IU下降与病毒感染性被中和相关联，并被表示为感染单元数的改 变。在所有本发明描述的需要人类抗-HIV抗体的实验中均使用人类 抗-HIV库。将该人类IgG抗-HIV库与几种商品人类抗-HIV制剂 作比较，发现它具有相等或更大的HIV中和活性，当采用Western印 迹分析法进行比较时发现它具有明显更强的反应性。
实施例2
本发明所采用商品HIV病毒溶胞产物的表征
预实验
从Advanced Bio-Technology，Inc.，Columbia，MD处以纯化病毒溶 胞产物形式购买HIV1MN、HIV1BAL、和HIVZNZ。对这些纯化病毒溶胞 产物的分析表明，批间总蛋白含量在0.8mg/ml至1.2mg/ml之间。利 用人类IgG抗-HIV通过SDS-PAGE和Western印迹法评价各HIV 溶胞产物的蛋白组成。用蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂(1.0％v/v) 如Nonidet P-40或Igepal CA 630处理HIV溶胞产物，以完全裂解HIV 蛋白和糖蛋白使其成为单体形式，并通过0.22μm过滤器过滤使之澄 清。采用标准方法利用SeroClear除去脂质。本领域技术人员已经熟知， 在出芽过程中HIV将人类蛋白组装进其衣膜中。一旦鉴定出这种杂质， 采用免疫亲和色谱将其除去。在初期纯化的步骤中，利用抗-正常人 类血清Sepharose CL6B(2-3mg抗体/g Sepharose)通过免疫亲和色 谱除去在有助于细胞生长的生长介质中存在的血清杂质和HIV溶胞产 物中的杂质。在基体与溶胞产物比例为1∶1v/v、流速10ml/h的条件 下，色谱分离HIV溶胞产物。在波长为280nm下分光光度监测色谱及 洗脱。将含有HIV相关蛋白并富含蛋白的非结合部分浓缩成1mg蛋白 /ml，然后在-70℃下贮存供将来需要时使用。用溶于0.9％NaCl中的 pH 2.2甘氨酸-HCl缓冲液将与亲和性基体结合的蛋白洗下。将洗脱 液中和，在含0.1％Igepal CA 630的pH 7.8 PBS中渗析，浓缩并于-70 ℃下贮存供随后分析。利用人类抗HIV IgG，采用SDS-PAGE及Western 印迹分析法分析纯化HIV制剂均证明gp160、gp120、p66/55、gp41、 p10、p24、p17和p7的存在。采用Western印迹分析法于甘氨酸-HCl 洗脱液中未检出HIV蛋白，但用使蛋白显现的考马斯良蓝染色的SDS -PAGE凝胶证明有2-3个弱染色带。
不完全纯化的HIV溶胞产物产生的抗HIV抗体的表征
用上述所得的纯化HIV蛋白免疫山羊(n＝2)，山羊体内发生免 疫应答，产生与HIV上免疫抗原决定簇起反应的抗体。对该抗血清的 进一步评价证明存在与HIV感染和非感染的CD4+淋巴细胞反应的细 胞毒性抗体的存在，并检测到红血球(RBC)凝集素。这些凝集素与 所有人类RBC血型以及兔和豚鼠的RBC血型反应。认为有两种可能 导致这种不需要的抗体特异性。一种可能性是HIV溶胞产物中沾染有 细胞培养引入的蛋白杂质，第二种可能是HIV蛋白/糖蛋白和人类或其 它种动物中糖蛋白之间的模拟。已经知道在HIV衣膜中常可鉴定出宿 主膜蛋白的存在。将宿主膜成份组装到HIV衣膜中的原因被认为是非 特异性的并与成熟病毒粒子的出芽相关。以前在成熟病毒粒子衣膜中 鉴别出的两种蛋白为人类HLA类型I和类型II抗原。采用酶联免疫实 验定量检测HLA类型I和类型II抗原，结果证明在这些HIV制剂中 存在HLA类型I和类型II抗原，其浓度与其非感染培养细胞衍生的细 胞膜制剂中所测的浓度不成比例。进一步研究证明在不同HIV病毒溶 胞产物制剂(n＝17)中有HLA类型I和类型II抗原的存在。这些制 剂中的实测浓度是不定的，但总的来说要比在未感染对照细胞的膜提 取物中浓度高10至100倍。采用Western印迹分析法检测山羊抗HIV 抗体与已知HLA类型I和类型II抗原提取物的反应性，证明其中含有 针对HLA类型I和类型II抗原(α和β链)和β-2-小球蛋白的抗体特 异性。评价该抗体对HLA同种异型的特异性。采用含有已知同种异型 抗免疫球蛋白的淋巴细胞的商品盘作为作用靶。在实验条件下，这种 抗体对所有淋巴细胞具有细胞毒性，而且这种细胞毒性以剂量依赖方 式部分地被可溶性HLA类型I和HLA类型II抑制(表2.1)。
表2.1
在纯化HIV溶胞产物产生的抗血清中HLA I对淋巴细胞毒性的抑制
  稀释  抗HIV     抗HIV&     HLAI&II     25μg     抗HIV&     HLAI&II     50μg     抗HIV&     HLAI&II     100μg    抗HIV&    HLAI&II    200μg   免疫前   的血清   u  8     8     8     8    8    0   1∶5  8     8     8     8    8    0   1∶10  8     8     4     4    4    0   1∶20  8     8     4     4    4    0   1∶40  8     8     4     4    4    0   1∶80  8     4     2     4    2    0   1∶160  8     4     0     2    0    0   1∶320  8     2     0     0    0    0   1∶640  8     0     0     0    0    0   1∶1280  4     0     0     0    0    0
将溶解性HLA类型I&II加至含抗HIV抗体的微量测量板孔中，4℃下温孵过夜。
溶解性HLA类型I&II降低了淋巴细胞毒性，但浓度大于50μg后不再起作用。
进一步研究表明存在一种抗体，它可与存在于gp120、人类红和 白血球、以及包括兔、鼠和豚鼠在内的不同动物血红细胞上的和种族 保守性糖抗原反应。经过S-HLAI&II吸附后，人和鼠血红细胞吸附 实验完全去除了RBC血型(表2.2)和淋巴细胞(表2.3)的剩余抗体 反应性。
表2.2
针对RBC凝集素细胞抗HIV抗体对抗RBC吸附的分析
 RBC  吸收#     抗*     HIV1     抗i*     HIV2     抗*     HIV1&2     AB+     O+     兔     AB+     O+     兔     AB+     O+     兔  0     256     256     256     256     128     128     128     256     128  1     128     128     128     128     64     128     64     128     128  2     32     32     32     32     32     64     32     32     32  3     8     4     4     4     4     4     8     4     4  4     2     --     --     --     --     --     2     --     --
*纯化HIV溶胞产物产生的抗血清导致免疫后在山羊体内产生RBC凝 集素。对于山羊(各2只)各采用HIV1MN、和HIV1BAL和/或HIV2NZ 免疫
表2.3
免疫过程中针对淋巴细胞毒性抗HIV抗体对抗RBC吸附的分析
  RBC   吸收(n)#     抗*     HIV1     抗*     HIV2     抗*     HIV1&2     AB+     O+     兔     AB+     O+     兔     AB+     O+     兔   0     512     512     256     1024     1024     1024     512     1024     1024   1     256     256     256     256     512     512     256     256     256   2     128     64     128     64     64     128     64     128     64   3     32     16     16     16     16     32     16     16     16   4     4     4     4     4     4     4     4     4     4   5     2     2     2     ±     2     2     2     2     2
*未作糖苷酶处理于20周收集血液产生针对HIV的抗血清，血红细胞 吸收0-5次，测试针对淋巴细胞的淋巴细胞毒性。
经过吸收和去除对HLA和血红素凝结素有特异性的抗体后，山羊 抗HIV抗体的测定结果表明包括与以前文献所类似的特异性。这一信 息说明需要对HIV蛋白进行修饰，以除去糖和HLA抗原，避免针对 人类抗原的细胞毒性抗体的产生。
实施例3
从HIV溶胞产物中提取的HIV蛋白的纯化及HLA类型I和类型II抗 原及糖的去除
从Advanced Biotechnologies，Columbia，MD购买HIV1MN、和 HIV1BAL和HIV2NZ溶胞产物。它们中含0.8-1.2mg蛋白/ml。加入蛋 白酶抑制剂以防止蛋白被降解，加入非离子表面活性剂(Igepal Ca-630、 或Nonidet p-40)裂解HIV蛋白。加入脱脂试剂将混合物悬浮于具塞 的提取管中，以除去脂质并澄清混合物。离心并除去水相后，脂类有 差别地溶在有机层中。
通过共价结合：免疫亲和纯化多克隆IgG抗体和人类血清蛋白， 单克隆IgG和HLA-1，单克隆IgG和HLA-2，单克隆体和β2-小 球蛋白，免疫亲和多克隆IgG抗体与淋巴细胞和血红细胞膜抗原，制 备5个分立的亲合基体，对这些亲和基体进行免疫亲合色谱分离，将 细胞培养引入的杂质，包括HLA，除去。每个基体中包含2-3mg抗 体/g Sepharose CL6B。柱子以串联形式安置，基体用含0.1％Igepal Ca-630、pH7.8的PBS冲洗并平衡。将体积等于柱床体积的溶胞产物 溶液以10ml/h的流速连续通过各柱进行色谱分离。在280nm波长下 分光光度检测色谱和洗脱。将含HIV相关蛋白并富含蛋白的未结合部 分浓缩为1mg蛋白/ml。
将SDS加到含目标HIV蛋白的免疫亲和纯化的混合物中，并将混 合物在70℃下加热10分钟。使用PGN酶对蛋白进行酶法脱糖。在采 用含0.1％非表面活性剂的盐水预平衡的Sepharose G50上，通过粒径 大小色谱分离蛋白混合物。收集蛋白部分，将含所需HIV蛋白的部分 分别集中。保存这三个分别富含gp160和gp120，p66/55和gp41，以 及p24、p17和p10的蛋白库。将蛋白部分于-70℃下贮存供以后使用。
在“Identification，Characterisation，and Quantitation of Soluble HLA Antigens in Circulation and Peritoneal Dialysate of Renal Patients”，F. Gelder，Annals of Surgery Vol.213，(1991)中公开有定量测量及去除 人类白血球抗原(HLA)的详细方法，此处引用作为参考。
表3.1显示纯化过程所得数据。
表3.1
HIV溶胞产物的纯化
分离步骤   蛋白   mg/ml   体积ml   总蛋白   HLAI   ng/ml   HLAII   ng/ml   ％   回收率 HIV溶胞产物   1.13   10   11.3   1833   692   100％ 除脂质后   0.96   10.3   9.8   1726   683   86.7 亲和色谱后   0.44   19.5   8.58   ＜10   ＜10   75.9 浓缩后   1.01   8.1   8.18   ＜10   ＜10   72.3
典型地，上述HIV制剂的纯化可除去包括HLA类型I和类型II 在内的杂质。利用人类IgG抗HIV库通过SDS-PAGE及Western印 迹分析法分析纯化HIV制剂，均证明gp160、gp120、p66/55、gp41、 p10、p24、p17和p7的存在。
实施例4
用纯化的HIV引发佐剂作用时MDP微粒生物化学和结构要求的表征及 其制备
从Propionibacterium acini中提取胞壁酰二肽(MDP)的多重重复 体，构成本实施例MDP微载体复合物的核心结构。单体子单元的化学 结构式为：

众所周知MDP具有增强免疫的作用，这一性质已受到了广泛地研 究，以确定其在增加免疫功能上的作用。本领域技术人员熟悉这一作 用。
到目前为止，当对哺乳动物给药时，不管天然提取的MDP或是合 成MDP均具有明显的毒性。这种毒性限制了MDP作为载体。
本发明提供了一种用于提取不含有毒成份的MDP的方法。采用处 于半稳定(mid-stationary)生长期的Propionibacterium acini，采用本 领域技术人员所熟知的方法冲洗除去来自细菌培养的杂质。在升高的 温度下用梯度浓度的乙醇/甲醇/水连续提取细胞壁和细胞质中的疏水成 份。将所得MDP微球悬浮于10％乙醇中，比较其在540nm处的吸收 与浊度标准液的吸收，由此测定其浓度。将MDP微粒的浓度调整至1 mg/ml，贮存供随后使用。
对这一制剂的分析表明胞壁酰二肽大量交联，粒径为0.1至0.2μ m。末端二肽氨基连接的L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺与上述单体结构一 致。已知该处在不同菌种间存在差别，这种差别导致在肽组成上的不 同，如含5个或更多氨基酸的末端肽，二肽组成的改变，特别是L-丙 氨酸-L-异谷氨酰胺，以及插入O-酰化β-肉豆蔻酸酯基的部位的 变化。这些变动是不理想的，导致天然提取的MDP具有毒性和差的佐 剂性能。在一个优选实施方案中，MDP微粒(0.01-0.2μm；优选为 0.05-0.1μm)具有氨基连接的L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺二肽。如上 所述，这种微粒可从天然中提取，或采用已为人所熟知的合成方法合 成。
实施例5
MDP-免疫原复合物的制备和初步评价
采用在巯基桥处缺少约22个氨基酸的弱免疫原性的单克隆人类λ 轻链片段(Mr～18,000)作为免疫原(I)，评价上述实施例的MDP微 粒(0.2μ)对抗体产生的辅助作用。制备两种复合物，其中一种通过 末端羧基将免疫原共价结合到MDP上，而另一种通过末端氨基进行结 合。以分步的形式组装MDP-免疫原复合物，每步反应后通过离心、 除去上清液并加入继续MDP-免疫原组装所需的其它试剂进行试剂交 换。每步反应所显示的摩尔比和每步反应后进行的试剂交换防止了由 预实验产生的、明显降低抗体免疫应答的抗原的多点连接。
合成MDP:NH2:免疫原:CO2H
采用EDC的两步高效偶联HIV蛋白和胞壁酰二肽的实验规程
以下的方法是对Grabarek，Z.And Gergely，J.，J.Anal.Biochem. 185：1311(1990)中所描述的方法改良，使得可连续将HIV蛋白和肽 偶联至MDP之上而不使HIV蛋白与1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基) 碳化二亚胺(EDC)接触从而影响HIV的羧基。该方法采用一含巯基 化合物中止第一反应。该反应在2-[N-吗啉代]乙烷磺酸(MES)(pH 4.5-5.0)中进行。
将从水中冻干的MDP(10mg)重新悬浮在MES(0.5ml)(pH4.5 -5.0)中，并加入溶于MES(pH4.5-5.0)中的0.5ml EDC(0.5mg ～2mM)，室温下反应15分钟。加入2-巯基乙醇(终浓度20mM) 破坏EDC并采用离心分离。反应混合物用MES洗一遍并重新悬浮于 0.5ml MES(pH4.5-5.0)中。以摩尔比约2∶1将溶解在MES中的 人类λ轻链片断加到活化的MDP中。通过加入MES(0.5M pH8.5) 使反应的pH经15分钟缓慢地变为8.5，并在室温下反应2小时。定量 测量MDP端羧基计算加到MDP上的λ轻链片断的浓度，并表示为摩 尔羧基每mg MDP。加入羟胺至终浓度为10mM终止反应。这种终止 反应的方法水解所有未反应的MDP活化位点并重新生成先前的羧基。 其它终止反应的方法包括加入20-50mM Tris、赖氨酸、甘氨酸、或 乙醇胺；但这些含一级氨基的化合物将产生修饰羧基的MDP。当MDP 与一种HIV合成肽反应并且需要对该肽进行修饰，如改变疏水基或连 接生物活性化合物时，在最终终止反应前加入所需化合物可进行这种 修饰。这使得HIV肽在最初偶联步骤完成后可连续加入所需化合物。 当需要更好地控制肽免疫原性时，也可一步将一定比例的生物活性肽 与HIV肽一起加入。已为本领域技术人员所熟知的生物免疫调节剂IL2 可用于此目的。
通过离心、清洗并重新悬浮于所选缓冲液中完成分离操作。
制备MDP-CO2H-免疫原-NH2
合成MDP:NH2CH2CH2NH2:CO2H:免疫原:NH2
采用EDC的三步高效偶联HIV蛋白和胞壁酰二肽的实验规程
该方法可将蛋白或肽连续偶联至MDP之上而不使蛋白与EDC接 触而影响蛋白的氨基。该方法采用了两个连续执行的中间步骤。在MES (pH 4.5-5.0)中进行第一反应。将从水中冻干的MDP(10mg)重 新悬浮在0.5ml MES(pH4.5)中，并加入溶于MES中的0.5ml EDC (0.5mg～2mM)，室温下反应15分钟。加入2-巯基乙醇(终浓度20 mM)破坏过量EDC，然后离心分离已纯化的MDP，用MES洗两遍 并重新悬浮于0.5ml MES(pH4.5)中。按摩尔比约10∶1将溶在MES (pH4.5)中的二氨基乙烷(NH2CH2CH2NH2)加到活化MDP中。通 过加入MES(0.5M pH8.5)使反应的pH经15分钟缓慢地变为8.5， 并在室温下反应1小时。离心分离MDP:NH2CH2CH2NH2，用MES 洗两遍并重新悬浮于0.5ml EMS(pH4.5)中。将λ轻链片断悬浮在 0.5ml MES(pH4.5)中，加入0.5ml溶在EMS中的EDC(0.5mg～2 mM)，并在室温下反应15分钟。加入2-巯基乙醇(终浓度20mM) 破坏过量的EDC，并采用适当尺寸的凝胶过滤柱将活化蛋白从过量还 原剂和非活化交联剂中分离出来。以摩尔比约5∶1将活化的蛋白加到 活化的MDP:NH2CH2CH2NH2中，并在室温下反应2小时。定量测 量MDP端羧基，计算加到MDP上的λ轻链片断的浓度，并表示为摩 尔羧基每mg MDP。加入羟胺至终浓度为10mM终止反应。这种终止 反应的方法水解所有未反应MDP活化位点，并重新生成先前的羧基。 当用HIV合成肽作为免疫原，并且需要对该肽进行修饰，如改变巯水 基或连接生物活性化合物时，可如上所述进行这种修饰。通过离心、 清洗并重新悬浮于所选缓冲液中，完成分离操作。
应注意的是当需要通过羧基进行连接时，添加生物活性化合物可 能需要上述的中间步骤。
实施例6
MDP免疫原复合物与商品佐剂的比较研究，包括Freunds Complete佐 剂、RIB、Titer Max和Alum
采用上述实施例中作为免疫原(I)的弱免疫原性单克隆人类λ 轻链片断(Mr～18.000)评价MDP微粒(0.1μ)对抗体产生的辅助作 用。制备两种复合物，其中一种通过末端羧基将免疫原共价结合到MDP 上，而另一种通过末端氨基进行结合。
用结合在约500微克MDP上并乳化在角鲨烯中的约100微克λ轻 链皮下免疫兔(每组5只)。每月免疫动物一次，并测试免疫前和免疫 后每两周的血液。比较MDP:NH2-I-CO2H和MDP:NH2CH2CH2NH2: HO2C-I-NH2的免疫应答的强度；通过竞争性EIA检测表明，NH2-I-CO2H 刺激的兔产生至少一种附加的抗体特异性。将所得抗体应答与通过常 规佐剂产生的抗体应答作比较，包括Freund′s Complete佐剂、RIB、 Titer Max和Alum(氢氧化铝)。在诱导抗体生成上，MDP:HO2C- I-NH2和MDP:NH2-I-CO2H均明显优于免疫原与常规佐剂所构成的复 合体。免疫原浓度(每次免疫100μg)和免疫方案每组均相同。表6.1 显示每两周所测的抗体滴度，并将滴度表示成如上所述产生正反应稀 释度的倒数。两种MDP复合物均优于常规已为人所熟知的佐剂。
表6.1
    星期    *MDP:I    CO2H    +MDP:I    NH2    Freund′s    Complete     Ribi     Titer     Max     Alum     T-0    ---    ---    ---     ---     ---     ---     2    ---    ---    ---     ---     ---     ---     4    2    ---    ---     ---     ---     ---     6    16    4    ---     ---     ---     ---     8    256    128    ---     ---     ---     ---     10    512    512    4     4     4     ---     12    1024    512    16     16     16     ---     14    4096    2048    32     32     64     4     16    4096    4096    64     128     256     8     18    8192    4096    256     512     1024     32     20    16384    8192    256     512     2048     32
T-0＝初次免疫并在免疫前采集血液。
MDP:I胞壁酰二肽：免疫原微粒(≤0.2m)。
*肽利用末端氨基与异谷氨酰胺暴露的末端羧基结合(MDP:I:CO2H) +通过中间步骤结合肽的羧基端，其中采用二氨基乙烷修饰MDP的末 端羧基。(MDP:I:NH2)
实施例7
由MDP:NH2:I:CO2H和MDP:NH2CH2CH2NH2:O2HC-I-NH2
免疫原诱导的外周血液单核细胞的细胞因子响应
为进一步评价MDP微粒-免疫原复合物增强免疫应答的机制，采 用一种测定细胞因子产生或外周血液单核细胞的体外方法，并与已知 细胞因子诱导剂比较。采用已知的细胞因子诱导剂脂多糖(LPS)以及 LPS加植物血球凝集素(PHA)。采用一种成熟的检测方法定量测定细 胞因子并表示为单位/ml。通过Ficol Hypague梯度离心分离外周血液单 核细胞并在组织培养介质中将浓度调为2×106/ml。将细胞(100μl) 加到微量测定板孔中。以不稀释或稀释1∶10和1∶25(10μl)形式 加入MDP:I:CO2H、MDP:I:NH2、PHA+LPS、LPS和单独的培 养介质。培养物在37℃、5％CO2氛中温孵48小时，除去上清液并用 标准生物检测法和/或EIA法检测。
表7.1
    IFNR     IL2     TNF     IL6  MDP:I:CO2H     550     510     152     62  MDP:I:NH2     520     495     176     73  LPS+PHA     340     320     495     450  LPS     210     150     325     310  介质     0     0     0     0  I:CO2H     496     398     68     25  NH2     23     410     72     21  LPS+PHA     205     165     210     152  LPS     175     90     135     140  I:CO2H     125     90     5     10  NH2     51     85     9     10  LPS+PHA     20     10     15     20  LPS     20     10     15     20
与LPS+PHA或单独使用LPS相比，MDP:I:CO2H、MDP:I: NH2均刺激出更强的类型I细胞因子响应。类型1细胞因子响应促进 免疫，而类型2细胞因子响应则通过IFN γ和IL2升高以及较低水平INF 和IL7来指征。
实施例8
未处理和除去糖基部分的HIV蛋白在山羊体内抗体应答的指征以及 MDP微粒与常规佐剂的佐剂性能的比较。
实施例8.1
从Advanced Biotechnologies Inc.，Columbia，MD.处购买HIV1MN、 HIV1BAL和HIV2NZ病毒溶胞产物，将每个制剂的一半通过酶法处理除 去糖基，并如上所述将所有制剂(含或不含糖)纯化。依据实施例5 中所述方法，将每个制剂中的一份通过末端氨基结合到MDP上，并分 别悬浮于角鲨烯中。为进行比较，同时也将那些未与MDP结合的蛋白 乳化在Freund′s Complete佐剂中。
组1-HIV1MN∶HIV1BAL，1∶1，未去糖；
组2-HIV1MN∶HIV1BAL，1∶1，去糖；
组3-HIV2NZ，未去糖；
组4-HIV2NZ，去糖；
组5-HIV1MN∶HIV1BAL∶HIV2NZ，1∶1∶1，未去糖；
组6-HIV1MN∶HIV1BAL∶HIV2NZ，1∶1∶1，去糖；
组7-HIV1MN∶HIV1BAL∶HIV2NZ，1∶1∶1，未去糖，未与MDP 结合，乳化在Frennd’s Complete佐剂中；
组8-HIV1MN∶HIV1BAL∶HIV2NZ，1∶1∶1，去糖，与MDP结合， 乳化在Frennd’s Complete佐剂中。
将山羊分成8个免疫组(每组n＝3)并按表8.1所示间隔每次用100 μg HIV进行免疫。免疫前和每两周采集血液。采用经FDA批准并购 自Abbott Laboratories的试剂盒通过EIA法定量测定抗体反应性。结果 表示为产生吸收值＞1.0时抗血清稀释度的倒数。整个免疫过程中每 两周测量一次抗体反应。EIA检测显示在采用MDP的各动物组(组 1&2，3&4，5&6)间抗体反应性无显著差别。除去糖基并不影响目标 抗HIV蛋白的抗体的产生。
表8.1
HIV蛋白的抗HIV抗体应答的分析
    星期     #     组1     抗HIV1     组2     抗HIV11     组3     抗HIV2     组4     抗HIV22     组5     抗HIV1&2     组6     抗HIV1&21     组7     抗HIV1&2     组8     抗HIV1&2     T-0*     0     0     0     0     0     0     0     0     2     0     0     0     0     0     0     0     0     4*     8     8     8     4     8     8     0     0     6     64     64     32     16     64     128     2     0     8*     64     128     32     32     64     128     4     2     10     512     512     64     128     256     512     16     8     12*     512     1024     128     256     512     1024     16     16     14     2048     2048     512     512     1024     2048     32     32     16*     4096     4096     256     512     4096     4096     64     32     18     4096     8192     512     1024     8192     8192     128     54     20     8192     16384     1024     1024     16384     16384     128     64
T-0＝初次免疫和采集免疫前血液
1-去糖
*-免疫或增强
实施例8.2
评价实施例8.1中所得抗血清的血细胞凝集抗体。从表8.2中可见 从HIV蛋白上除去糖基消除了血细胞凝集的反应。
去糖的HIV制剂组不产生凝集血红细胞的抗体反应性(表8.2A)。 而被未去糖之MDP-HIV复合物免疫的山羊以及被乳化于Freund′s Complete佐剂中且未去除糖的纯化HIV蛋白免疫的山羊都产生红细胞 凝集素。在MDP-HIV复合物或乳化于Freund′s Complete佐剂中的纯 化HIV蛋白免疫的山羊的抗血清中，红血球凝集素的滴度无可检出的 差别。此处所述的红血球凝集素与实施例2预试验中所述的基本一致。 这些凝集素具有细胞毒性(表8.2A)。但针对HLA类型I和类型II没 有可检出抗体反应性，而且经红血球吸收后完全消除了血细胞凝集和 细胞毒性抗体的反应性。
表8.2
红细胞的抗HIV抗体应答的分析
    星期     #     组1     抗HIV1     组2     抗HIV11     组3     抗HIV2     组4     抗HIV22   组5   抗HIV1&2     组6     抗HIV1&21   组7   抗HIV1&2   组8   抗HIV1&21     T-0*     --     --     --     --   --     --   --   --     2     --     --     --     --   --     --   --   --     4*     --     --     --     --   --     --   --   --     6     2     --     2     --   4     --   4   --     8*     4     --     4     --   4     --   8   --     10     16     --     8     --   8     --   16   --     12*     32     --     8     --   32     --   16   --     14     64     --     64     --   128     --   64   --     16*     64     --     64     --   64     --   128   --     18     128     --     128     --   128     --   256   --     20     256     --     256     --   128     --   256   --
T-0＝初次免疫和采集免疫前血液
1-去糖
*-免疫或增强
表8.2A
抗HIV抗体对淋巴细胞毒性的连续分析
    星期     #     组1     抗HIV1     组2     抗HIV11     组3     抗HIV2     组4     抗HIV22     组5     抗HIV1&2    组6    抗HIV1&21     组7     抗HIV1&2     组8     抗HIV1&21     T-0*     ±     ±     ±     ±     ±    ±     ±     --     2     ±     ±     ±     ±     ±    ±     ±     --     4*     +4     ±     +2     ±     +4    ±     ±     --     6     +8     ±     +2     ±     +8    ±     +2     --     8*     +8     ±     +4     ±     +16    ±     +4     --     10     +64     ±     +32     ±     +32    ±     +4     --     12*     +256     ±     +256     ±     +128    ±     +16     --     14     +256     ±     +512     ±     +256    ±     +32     --     16*     +512     ±     +512     ±     +512    ±     +64     --     18     +512     ±     +1024     ±     +512    ±     +128     --     20     +512     ±     +1024     ±     +1024    ±     +128     --
T-0＝初次免疫和采集免疫前血液
1-去糖
*-免疫和增强
为评价HIV和RBC糖基之间模拟的可能性，采用由提自人类血 红细胞的纯化和汇集的细胞膜组成的免疫原免疫山羊，产生另外一种 抗血清。Western印迹分析法证明这种抗血清与一种红血球糖蛋白(～Mr 35,000)以及HIV gp41和gp120有反应。但不与除去糖基的HIV gp41 和gp120反应。这些数据与HIV的糖抗原决定簇和血红细胞糖蛋白之 间的模拟相符。
Western印迹分析法证明与大多数HIV蛋白之间有强反应性，包 括gp160、gp120、gp41、p66/55、p10、p24、p17和p7。针对本发明 所公开的HIV抗原决定簇，这些抗体的反应性或特异性无明显差别。 这些抗体与所有被测试HIV分离体反应，包括那些已被证明具有对抗 逆转录酶和蛋白酶抑制剂者。
实施例8.3
糖贫化HIV产生的抗体对HIV感染性的中和
本实施例描述和指征了采用由上述贫化糖的HIV产生的抗体对 HIV感染性的中和。结果表明这些抗体具有强的中和活性并以剂量依 赖的方式保护CEM细胞免受感染。
中和实验：
采用一种敏感的中和实验定量检测山羊抗HIV对HIV感染性的作 用。选取极易受HIV感染的CEM CD4-细胞系作为靶细胞来测量抗体 对HIV感染性的作用。按照要求将抗体和稀释液加到含10％胎牛血清 的RPMI介质中。从培养约4天的处于log生长期的CEM中收集HIV1SF2 悬浮物，从0.2或0.45μm过滤器中过滤，分份并于-70℃下冷冻。将 其中一份解冻，滴定测量TCID50，在以下实验中采用刚解冻的病毒部 分，在培养介质中稀释1∶500使其浓度达到感染培养基中50％CEM 细胞所需量的约10倍(10TCID50)。将病毒悬浮液与等体积(250μl)的 1∶5至1∶9,765,625的抗体的5倍稀释液混合。将病毒/抗体混合物于 37℃下温孵60分钟。将200μl同样的样品加到含1.0ml之约2×105CEM 细胞/板孔的接种板孔中。培养体系于37℃、加湿的5％CO2氛的条件 下温孵14天。采集细胞，沉淀并用1％Triton X-100之PBS溶液溶解 约10分钟。采用商品p24试剂盒定量检测在溶解细胞中存在的病毒(或 病毒抗原)的量。测定中和活性的效价，并表示为，与无抗体或加入 以相似方式制得的免疫前IgG温孵的对照培养体系相比，抑制50％以 上p24抗原产生的抗体的稀释比的倒数。测量200微升的溶解细胞悬 浮液。
表8.3A
抗HIV抗体中和活性的分析
    星期     #     组1     抗HIV1     组2     抗HIV11     组3     抗HIV2     组4     抗HIV22     组5     抗HIV1&2     组6     抗HIV1&21     组7     抗HIV1&2   组8   抗HIV1&2     T-0*     --     --     --     --     --     --     --   --     2     --     --     --     --     --     --     --   --     4*     --     --     --     --     --     4     --   --     6     32     16     --     --     16     16     --   --     8*     256     32     4     --     64     128     2   --     10     1024     128     4     4     512     256     8   --     12*     1024     512     16     8     1048     1024     32   --     14     5096     1024     256     32     5096     2048     64   --     16*     10192     2048     512     64     10192     2048     128   --     18     20384     2048     1024     128     20384     5096     128   --     20**     20384/204     5096/5096     2048/256     256/256     40766/101     10192/101     256/12   --
T-0＝初次免疫和免疫前采集血液
1-去糖 *-免疫&增强
**＝20周血液制得的抗-HIV制剂被人血红细胞吸收，在同样条件下检测未吸收和吸收样品。结果表示为(未吸收/吸收)中 和效价。
未除去糖抗原决定簇的HIV-MDP复合物所产生的抗HIV制剂具 有最大的中和活性(表8.3A)。抗体的红细胞吸收对糖贫化HIV复合 物无效。但抗体的红细胞吸收对未除去糖的HIV复合物产生明显的中 和活性下降的作用，说明HIV和人之间存在同种系的糖片断(表8.3A 最后一行)。HIV-MDP复合物产生的所有抗HIV抗体制剂均明显强 于使用Freund′s Complete佐剂所产生的抗HIV。由于预计的HIV基因 变异的特性，使用HIVMN和四个HIV野生分离体，其中包括一个抗多 种药物的病毒株在上述相同条件下测试20周抗HIV制剂的中和活性。 在由去糖的HIV复合物产生的第20周抗制剂的抗HIV中和了所有病 毒株(表8.3B)。
本领域技术人员将看到由贫化HLA、贫化糖的HIV蛋白产生的中 和活性要比在典型人类抗HIV血清中观测到的中和活性明显更高。
表8.3B
抗HIV抗体对多种病毒株的中和活性的分析
  HIV病毒株/   分离体     抗HIV11     抗HIV21    抗HIV1&21     免疫前     IgG   HIVSF     10192     512    20384     0   HIVMN     5096     256    10192     0   野生#1     10192     512    20384     0   野生#2     2048     256    5096     0   野生#3     2048     128    5096     0
1＝去糖
实施例8.4
以抗体依赖补体介导的细胞毒性的方式抗HIV对HIV感染CD4淋巴细 胞的作用
对于富含感染或未感染HIV的CD4淋巴细胞的正常外周血单核细 胞，评价去糖和未去糖HIV复合物抗体之补体介导的细胞毒反应性。 提取正常外周血单核细胞，进行Ficol Hypaque梯度离心并富集CD4+ 淋巴细胞。在小型培养中用PHA刺激CD4+淋巴细胞并用HIVMN感染 7天。除去上清液并加入去糖基HIV制剂所产生的抗HIV，其中抗HIV 对正常细胞无细胞毒性。如表8.4所示，抗HIV以剂量依赖方式溶解 感染的CD4淋巴细胞。
表8.4
对感染CD4淋巴细胞抗HIV抗体介导的细胞毒性的分析
    星期     #     组1     抗HIV1     组2     抗HIV11     组3     抗HIV2     组4     抗HIV22     组5     抗HIV1&2    组6    抗HIV1&21     组7     抗HIV1&2    组8    抗HIV1&21     T-0*     ±     ±     ±     ±     ±    ±     ±    --     2     ±     ±     ±     ±     ±    ±     ±    --     4*     4     4     2     ±     4    4     ±    --     6     8     16     2     ±     32    32     ±    --     8*     32     32     4     4     256    256     2    --     10     128     64     32     32     512    512     8    --     12*     256     128     256     64     1024    1024     16    --     14     1024     512     512     256     2048    2048     16    2     16*     2048     1024     512     256     4096    4096     32    4     18     4096     2048     1024     512     8192    8192     64    8     20     8192     4096     1024     512     8192    8192     256    8
T-0＝初次免疫和采集免疫前血液
1-去糖
*-免疫和增强
实施例8.5
相应于HIV蛋白之氨基酸序列的肽的合成
合成肽被构建成模拟HIV1SF2之氨基酸序列的十二肽。依据gp120、 gp41、Vif、gag p17、gag p24、nef、Rev、整合酶、蛋白酶、Tat:HxB2 和逆转录酶的氨基酸序列，由Purification Systems Inc.采用固相法合成 覆盖6个氨基酸的肽，并从该处购得这些肽。
采用二环己基碳化酰亚胺和催化量的4-N，N-二甲氨基吡啶将 丁氧羰基-S-4-甲基苯基-L-半胱氨酸偶联于聚苯乙烯上，并将产 物作为合成的固相载体。用t-丁氧羰基(t-Boc)保护氨基，下列为侧 链保护基：苄醚保护丝氨酸的羟基，二氯苄醚保护酪氨酸的酚羟基，β -苄基酯用于保护谷氨酸和天冬氨酸的羧基。采用三氟乙酸(40％ CH2Cl2溶液)脱t-Boc，并将所得盐用N-二异丙基乙胺(10％ CH2Cl2 溶液)中和。采用二异丙基碳化酰亚胺偶联t-Boc氨基酸。脱去保护基， 然后在0℃下采用含作为清除剂的10％苯甲醚和1％乙二硫醇的无水氟 化氢将肽从树脂上裂解下来。在0℃下真空除去氟化氢试剂，然后用无 水乙醚沉淀和清洗肽。当用三氟乙酸从树脂上提取肽后，在15℃下蒸 去溶剂并用乙醚将肽重新沉淀。离心后倾去乙醚，将沉淀物溶于含6M 盐酸胍的5％乙酸溶液中。在用5％乙酸平衡的BioGel P2柱上将溶液 脱盐，收集含肽的部分并冻干。当需要巯基供EIA法或连接MDP(实 施例5)中将肽与载体蛋白或固相载体连接时，要在肽的羧基端加上一 个半胱氨酸。当需要肽的多重重复体时，首先将一个半胱氨酸残基连 接到树脂载体上进行合成。加上不同长度的碳间隔剂；间隔剂的长度 是可变的，并取决于应用、肽电荷和长度以及由肽连接载体所得的初 步数据所预计的立体影响。如以上实施例5所示利用二氨基乙烷但改 变保护基封闭的次序，在6碳的碳间隔剂如6-氨基己酸上加入赖氨酸 -(赖氨酸)2-(赖氨酸)4。保护氨基，然后脱保护使得两个赖氨 酸残基连于脱保护氨基上，脱保护然后加赖氨酸构建供肽合成的支链 结构。添加D-氨基酸可修饰具有特殊生物功能的肽或具有易于被酶 降解的序列的肽。特别有用的添加是添加L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺， 而目标肽从D-异谷氨酰胺的氨基端开始合成。在另一种设计中，按序 列L-赖氨酸-L-赖氨酸-肽-D-异谷氨酰胺合成肽。在微环境中羧端 赖氨酸基十分容易被多种酶酶解断裂，而D-谷氨酰胺使肽的半衰期加 长而且为组装肽提供了一个疏水位点，这种肽需要两亲性质以诱导如 受体结合和通过MHC相关作用诱导免疫等功能。在氨基端加酪氨酸残 基以用125I进行放射标记，用于检测肽与载体蛋白的偶联效率并在纯化 过程中鉴定肽。125I为跟踪肽在生物体系中的半衰期提供了一种示踪 剂，并在肽功能不受添加酪氨酸影响的条件下评价受体结合。
实施例8.6
模拟HIV和其它逆转录病毒肽序列的合成肽在鉴别病毒抗原决定簇中 应用
在本发明中公开了模拟HIV和其它逆转病毒中高度保守序列的合 成肽序列，并确定了在治疗病毒感染中其作为免疫作用靶点的重要功 能。这些肽还可用于诊断和治疗HIV微变种引起的感染，所述微变种 的序列通过非特异性下调免疫反应导致HIV的发病，诱导自动免疫， 并通过毒性作用导致HIV相关外周神经病。当这些症状的任何一种出 现在患者体内都导致HIV的发病并降低生活质量。确定和定量测量那 些诱发这些症状的HIV-肽区域所采用的合成肽可用于确定自动免疫 和外周神经病的风险因子。这些合成肽还可用于一种新型的检测法中 以监测疾病的进程以及治疗进程的改变。
在本发明的一个步骤中，设计酶免疫检测法(EIA)用于确定山羊 抗体对不被人类抗HIV识别的HIV的特异性识别。采用5μg/ml在磷 酸盐缓冲溶液(PBS＜pH7.8)中的HIV1 gp120和gp41纯化制剂，在 37℃温孵20小时，将其涂布在聚乙烯微量测量板孔中。板孔用含0.1 ％吐温20的PBS(PBS/吐温)冲洗，并用5％牛血清白蛋白于37℃ 温孵1小时饱和各板孔中的未结合位点。立即使用该测量板或在4℃贮 存。每个板孔中加入人类IgG抗-HIV(100μl)(实施例1)，4℃下 温孵25小时，然后用PBS/吐温冲洗板孔。将先前产生并通过标准方 法用HRP标记的山羊抗HIV加到板孔中，所采用的稀释度在测试条件 下获得1.0的吸收(1∶10000滴度)并在4℃下温孵24小时。冲洗板 孔并加入底物以测定山羊IgG的结合量。采用以下算式计算由于人类 抗HIV封闭HIV蛋白所诱导的结合抑制百分比。

山羊抗-HIV-HRR复合物被人类抗HIV封闭最少的事实说明山 羊抗HIV的结合与人类抗HIV不同。
在另一步骤中，设计EIA用于确定对山羊抗体有抗原性而对人类 抗体无抗原性的HIV蛋白抗原决定簇。采用5μg/ml在磷酸盐缓冲溶 液(PBS＜pH 7.8)中的HIV1 gp120和gp41纯化制剂，在37℃温孵20 小时，由此将其涂布在聚苯乙烯小珠上。小珠用含0.1％吐温20的PBS (PBS/吐温)冲洗，并用5％牛血清白蛋白于37℃温孵1小时饱和小 珠上的未结合位点。立即使用该小珠或在4℃贮存。在每个小珠上加入 人类IgG抗HIV(100μl)(实施例1)，4℃下温孵24小时，然后 用PBS/吐温冲洗小珠。将合成肽溶于含牛血清球蛋白(5mg/ml)和吐 温20(0.1％)的PBS中使浓度为0.1mg/ml。将肽(25μl)加到山羊 抗HIV IgG-HRP复合物溶液(100μl)中，并在4℃下温孵24小时。 然后将混合物加到两组涂布HIV的小珠上。其中一组被加到两组涂布 HIV的小珠中的人类抗HIV封闭。另一组在肽加到山羊抗HIV-HRP 复合物中的同时被人类抗HIV封闭。含反应试剂的小珠在4℃下温孵24 小时。温孵后，冲洗小球并如上所述测定过氧化酶活性。将活性对HIV 中肽位置画图。这些图显示出被山羊HIV免疫IgG识别而不被人类抗 体所识别的HIV蛋白区域。当采用某一特殊合成肽并发现结合抑制时， 合成另外的更长的肽以覆盖先前的肽。缺少合成肽的抑制被认为是表 示不被山羊免疫系统免疫识别。采用这一方法，得出供研究的线性肽 抗原决定簇。
在本发明的另一优选方法中，设计一种EIA，其中采用如下所述 制备的肽-过氧化酶，用于鉴定被山羊识别但不被人类免疫系统识别的 HIV蛋白的抗体反应性抗原决定簇。将模拟HIV序列的肽与HRP共价 连接制备一个酶标记的肽库，用于描绘抗体特异性。具体而言，以1 份HRP：10份肽的计算摩尔比将HRP悬浮于一反应管中。将用于偶 联的各个肽分别悬浮于微管中，浓度0.1-1μmol/ml，体积0.1-1ml， 其具体数量依所需复合物的量和肽的分子量而变化。4℃下HRP以1- 10μmol/ml的浓度溶于0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.8)中， 加入高碘酸钠使其终浓度为0.02M。混合物立即分配至含肽的微管中， 混合并反应30分钟。加入乙二醇(0.02M)破坏剩余高碘酸钠。在肽 的氨基和HRP糖部分经氧化形成的醛基之间构成的中间体希弗碱，通 过加入硼氢化钠水溶液(0.2M)使其还原。采用Sdephadex G25柱对 各肽-过氧化酶复合物色谱分离，除去反应试剂及过量肽。
在该优选的检测法中，采用抗体桥连由HIV病毒溶胞产物制得的 HIV蛋白上所确定的抗原决定簇和共价连于HRP上的合成HIV肽，因 为与含抗原结合位点的HIV抗原决定簇反应的抗体也可与连接于过氧 化酶的合成肽抗原决定簇反应。如上所述在小珠上涂布HIV蛋白。涂 好的小珠与山羊抗HIV IgG反应24小时，冲洗小珠并与底物反应以测 定过氧化酶活性以及因此而得到的肽结合。通过这一方法，仅有包含 在合成肽中的抗原决定簇被识别出。在这一检测法中，确定了全部的 山羊反应性。对人类抗HIV和山羊抗HIV反应性作对比，并将仅与山 羊抗HIV反应的肽选作候选抗原决定簇靶点。由于反应性的不同以及 HIV蛋白上氨基酸肽序列同源性间的漂移，可能导致遗漏抗原决定簇 反应性，以及合成肽的选取，故这些数据并不能全部概括人和山羊对 HIV蛋白的反应性的差别。
实施例9
作为治疗药剂的抗体的功效
采用一组免疫化学设计的抗体进行实验以确定作为治疗HIV/AIDS 药剂的抗体的功效。具体而言，按实施例3所述方法处理HIV1MN、 HIV1BAL和HIV2NZ的HIV分离体的溶胞产物混合物，以除去低分子量 杂质以及HLA类型I和类型II抗原，并对HIV蛋白脱去糖基。检测 蛋白混合物发现其中包含模拟HIV1SF2蛋白以下区域的肽：
gp120：一个抗原决定簇区域位于第4至27氨基酸残基上，第二 个位于第54至76氨基酸残基上；
gp41：一个抗原决定簇区域位于第502至541氨基酸残基上；
蛋白酶p10：一个抗原决定簇区域位于第69-94氨基酸残基上；
逆转录酶杂二聚体p66/55：一个抗原决定簇区域位于第254-295 氨基酸残基上；
Gag基因蛋白p24：一个抗原决定簇区域位于第166-181氨基酸 残基上；
Gag基因蛋白p17：一个抗原决定簇区域位于第2-23氨基酸残基 上，第二个抗原决定簇区域位于第89-122氨基酸残基上；以及
Gag基因蛋白p7：一个抗原决定簇区域位于第390-41和438-44 氨基酸残基上。
这些氨基酸序列在通过感染或通过自然环境接触时不能在人体内 诱导免疫应答，但可在其它哺乳动物种中诱导免疫应答。
富集被纯化和处理的蛋白并利用制备型SDS-PAGE电泳进一步 纯化，如果有必要有利用免疫亲和色谱进一步纯化，其中采用针对 gp120、gp41、p66/55、p24、p17和p10的(ICN Costa Mesa，CA和 Advanced Biotechnologies，Columbia，MD)商品单克隆抗体，通过本领 域已知的方法分别连接到Sepharose CL4B上。纯化后将各纯化HIV蛋 白分别按实施例4所述方法与MDP微粒偶联。用HIV-MDP微粒复 合物配成鸡尾酒，其中包含等摩尔浓度的各HIV蛋白/肽，在生理盐水 中的终浓度约1mg蛋白/ml。该HIV-DMP鸡尾酒(0.5μl)被乳化于 角鲨烯(1.5ml，含0.05％吐温80)中，并按每只山羊4至6个注射 点的方式皮下注射进60只山羊中。每月进行一次强化免疫以获得理想 的抗体应答。在每月强化免疫前抽取每只山羊每月的血清样品，并用 实施例8.6中所公开的Western印迹分析法、HIV中和实验以及酶免疫 检测法检测。一旦获得所需的抗体应答，采用Baxter A 201-A 401自动 血浆去除仪从山羊颈静脉中抽取血浆，将山羊血红细胞配在生理盐水 中再返还到山羊体内。每次血浆抽取操作从每只动物体内采集350ml± 5.0ml血浆。
用盐酸调pH为4.8后，用辛酸分级公山羊免疫血浆。混合物离心， 过滤并通过活性碳过滤器除去凝聚物，然后将辛酸浓度降低至小于0.05 ％。通过以下一系列柱进一步纯化包括免疫球蛋白(IgG)的部分：
1.Sephadex G25柱，用20mM磷酸盐缓冲液平衡
2.在磷酸盐缓冲液中平衡的Whatman DE 53离子交换柱
3.0.9％盐水平衡的Sephadex G25
将最终的柱滤液无菌过滤，然后浓缩或稀释制成具有理想生物活性的 10mg IgG/ml的终浓度。SDS-PAGE和Western印迹分析法证明在1∶100 稀释度下公山羊IgG免疫球蛋白与gp120、gp41、p66/55、p24、p17、 p7和p10等七种不同的病毒病蛋白有反应。HIV中和试验表明其对实 施例8.3中所述的实验室及野生病毒株具有广泛的中和作用。通过实施 例8.3中所公开的酶联免疫检测法分析证明，在1∶1000或更高的样品 稀释度下与九种目标抗原决定簇有阳性反应。对符合本发明所公开指 标的产品批次给出商品名HRG214，其中包含无菌且无热源的悬浮于0.9 ％NaCl中的公山羊IgG，浓度为10mg/ml，不含赋形剂。将各批产品 与本发明所公开的对照批产品作比较，以确定HRG214活性的均一性。 药效表示为mg等价物/ml。
在研究开始以前选择年龄为18的公山羊和未怀孕的母山羊，通过 Western印迹法血清学诊断证明它们感染有HIV，并符合界定AIDS的 标准，及其临床症状，而且实验前在30天内CD4 T淋巴细胞计数＜300 细胞/μl。采用临床和实验室参数评价功效。临床参数包括机会性感染 的改变，体重的改变，胃肠功能的改变，包括大便的粘稠度及频率、 精力水平的改变、食欲的改变、机体强度及耐力、以及生活质量的整 体变化。实验室参数包括CD4和CD8淋巴细胞数量，所选定的血液学、 血液化学和尿液分析指标的改变，以及如有可能通过PCR测量病毒 RNA确定病毒负载量的改变。
研究结果表明采用免疫化学设计的抗体时，患者在临床学上得以 改善，包括机会性感染的下降、体重增加、胃肠功能的改变，其中包 括更少次数的严重腹泻、精力水平的增加、食欲改善、机体强度和耐 力的改善、以及整个生活质量的改善。实验室参数也得以改善，包括 CD4和CD8淋巴细胞数目增加、血液学、血液化学及尿液分析指标的 改善、以及通过PCR测量病毒RNA证明病毒负载量下降、和TCID 检测表明感染力下降。
研究中具体的实验室结果列于附表9.1-9.13中。
实施例9.1
HIV感染者的治疗中HRG214毒性及功效的临床评价
采用HRG214治疗35名HIV感染者。评价HRG214在降低HIV 病毒负荷和改善病症进程和症状方面的功效。按CD4数目/mm3(＜200 和≥200)将患者分组，以下为治疗方案：
组1：HRG214，CD4＜200，n＝11；
组2：HRG214，并每月重复治疗，CD4＜200，n＝6；
组3：HRG214，并在发病时重复治疗，CD4＜200，n＝5；
组4：HRG214，CD4＞200，n＝7；
组5：HRG214并在发病时重复治疗(患者接受治疗癌症的化疗)， CD4＜200，n＝6；
组6：安慰剂对照组，CD4＞500，n＝19；
组7：安慰剂对照组，CD4＞200-500，n＝3。
治疗组按1-1.5mg/kg体重接受21-28天的HRG214输注。CD4＜200 的患者或者每月重复治疗3天(n＝6)或在出现HIV发展情况下重复 治疗(n＝11)。有害反应局限于＜2的低烧，发冷，头痛，和肌肉痛 等。在90天内治疗中和治疗后，临床化学和血液学分析表明所有患者 的指标保持不变或得以改善。对28名患者评价了营养状态的改变。24 名增重2-22磅。平均增长体重4.4磅(p＝0.0014)。同时接受治疗癌 症的系统化疗的6名患者中的4名体重保持(n＝2)  或降体重(各为 2和6磅)。体重增加与血清总蛋白和白蛋白的测量值的增加直接相关。 在所有治疗组中HIV-RNA数量均下降。
 G组号：给药后天数  总＝n，存活＝s     CD4#     前/后     CD8#     前/后     HIV RNA     ％变化  组1HRG214：  150天，n＝11，S＝4     153/156     601/699     -18％  组2HRG214：  345天，n＝6，S＝6     44/168     477/1143     -94％  组3HRG214+：  469天，n＝5，S＝3     25/67     705/856     -67％  组4HRG214：  405天，n＝7，S＝7     315/487     970/1164     -94％  组5HRG214：化疗  469天，n＝6，S＝2     43/41     476/592     -54％  组6对照：  469天，n＝19     909/628     NA     NA  组7对照：  469天，n＝3     315/177     NA     NA
与对照组6和7相比所有治疗组中CD4/mm3随时间的下降速度均 下降(p＜0.01)。在组2、3和4中观察到CD4的持续增加。通过小型 培养(TCID)测量感染性证明，治疗7-14天感染性降低两个数量级 (p＜0.001)而HIV-RNA定量测量结果无明显变化。临床学改变包括 食欲增加，并观察到在慢性疲劳综合症、腹泻、吸收不良、念珠菌病、 CMV(视网膜炎除外)、单纯疱疹和带状疱疹、皮肤传染性软疣、口腔 毛状粘膜白斑病、消瘦综合症、细胞性毛囊炎和肺炎及HIV相关的外 周神经病中的抵抗力明显增强。
HRG214为HIV感染的治疗提供了一种新型药剂。
以下更具体地表示了2-5患者组的数据。
患者组2
患者n＝6
初步目的：评价以日剂量1.5mg/kg/day给药28天并每月重复治疗 3次，采用HRG214治疗HIV感染的安全性和功效。临床跟踪将持续 3年。当复发时将对患者重新治疗。
目的：临床和实验室参数的正规化，其中包括机会性感染，感染 发生率，消瘦综合症，外周神经炎的改变，以及不正常血液化学和血 液学、CD4和CD8的改善以及通过PCR定量测定的HIV-RNA的减少。
安全性变量包括：血液化学和血液学和临床参数。
功效变量包括：PCR定量测定HIV-RNA，CD4和CD8细胞计数。
跟踪期＝3年
至今的跟踪期＝＞345天
研究中的患者统计：患者n＝6；开始日期10/23/95；390天时，存 活＝6；死亡＝0；错过跟踪的患者＝0。
患者统计：HIV阳性，AIDS界定指标为CD4数＜50/mm3。
治疗药剂：HRG-214-1.5mg/kg/day，每月重复治疗。
表9.2
患者组2
                                 PCR定量测定HIV-RN 测试     天数     1     天数     21-28     天数     60-90     天数     120-150     天数     330-390 平均值     4918.3     2092.5     1338     731.8     696.6 标准误差     2422.6     1222     927.2     433.1     331.2 最大值     10649     4880     3993     1825     1164 最小值     494     23     19     17     15 中间值     4265     1733.5     670     542.5     466
表9.3
患者组2
                               CD4/mm3定量 测试     天数     1     天数     21-28     天数     60-90     天数     120-150     天数     330-390 平均值     44     52.8     52.8     109.3     167.8 标准误差     14.2     19.1     16.8     33.2     41.7 最大值     72     96     82     154     189 最小值     5     4     5     11     23 中间值     49.5     55.5     62     136     139
表9.4
患者组2
                                 CD8/mm3定量 测试     天数     1     天数     21-28     天数     60-90     天数     120-150     天数     330-390 平均值     477.5     437     603.3     911.8     1143 标准误差     157.1     171.8     173.6     228.9     286.7 最大值     869     883     804     1376     1752 最小值     145     68     84     319     576 中间值     448     398.5     762.5     976     1293
患者组3
患者n＝5
初步目的：评价以日剂量1.5mg/kg/day给药28天，采用HRG214 治疗HIV感染的安全性和功效。临床跟踪将持续3年。当复发时将对 患者重复治疗。
目的：临床和实验室参数的正规化，其中包括机会性感染，感染 发生率，消瘦综合症，外周神经炎的改变，以及不正常血液化学和血 液学、CD4和CD8的改善以及通过PCR定量测定的HIV-RNA的减少。
安全性变量包括：血液化学和血液学和临床参数。
功效变量包括：PCR定量测定HIV-RNA，CD4和CD8细胞计数。
跟踪期＝3年
至今的跟踪期＝＞469天
开始日期6/13/95；380天时，存活＝3；死亡＝2；错过跟踪的患 者＝0。
患者统计：HIV阳性并符合AIDS界定的指标。5名患者中的5名 具有CD4＜50/mm3的血液。PCR定量分析HIV-RNA证明治疗7天(p ＝0.0179)和21-28天(p＝0.043)后发生统计学上的显著下降。60 -90天和120-150天的HIV-RNA测量证明已下降但又重新上升的HIV RNA值。对所有5名患者重复治疗(在120-150天期间每月连续3次 给药)。重复治疗后HIV RNA测量表明在＞250天内测量值统计学明 显下降(p＝0.0006)。
采用成对T检验、Wilcoxon Signed Rank检验和Mann-Whitney Rank Sum检验进行统计学分析。
起始日期：06/13/95
终止日期：未定
表9.5
患者组3
                                PCR定量测定HIV-RNA 测试 天数 1  天数   7   天数   21-28   天数   60-90   天数   180-210   天数   240-300  天数  ＞380 平均值 21911  10643.2  10962.6  15231.8  18424  9385.2  8217 标准误差 5003.7  3244.3  2222.5  7385.9  5473.5  5436.3  5135 最大值 41182  21223  17679  41922  35129  30412  36412 最小值 12292  4448  3790  2984  4017  1036  756 中间值 18976  6317  11570  6787  16854  4708  4926
表9.6
患者组3
                                     CD4/mm3定量 测试   天数   1   天数   7     天数     21-28    天数    60-90    天数    180-210   天数   240-300   天数   ＞380 平均值   25   30.8     13.8    35    40.4   59.6   67 标准误差   6.47   8.16     3.01    9.66    13.39   25.72   33.74 最大值   42   51     20    60    82   154   178 最小值   9   8     3    10    8   13   16.01 中间值   26   24     16    42    28   36   42.12
表9.7
患者组3
                                     CD8/mm3定量 测试   天数   1   天数   7     天数     21-28     天数     60-90   天数   180-210   天数   240-300   天数   ＞380 平均值   705.6   633.8     486.4     681.4   570.8   826.6   856.24 标准误差   137.8   168.2     86     229   120.6   200.9   226 最大值   1152   1037     700     1380   756   1320   1346 最小值   444   220     260     180   101   169   556 中间值   585   828     540     720   638   812   843
患者组4
患者n＝7
初步目的：评价以日剂量1.5mg/kg/day给药28天并在第1-7和 21-23天给药IFN诱导剂，采用HRG214治疗HIV感染的安全性和功 效。临床跟踪将持续3年。当复发时将对患者重复治疗。
目的：临床和实验室参数的正规化，其中包括机会性感染，感染 发生率，消瘦综合症，外周神经炎的改变，以及不正常血液化学和血 液学、CD4和CD8的改善以及通过PCR定量测定的HIV-RNA的减少。
跟踪期＝3年
至今的跟踪期＝＞405天
研究中的患者统计：患者n＝7；开始日期8/25/95；390天时，存 活＝7；死亡＝0；错过跟踪的患者＝0。
患者统计：HIV阳性，CD4数＞200，不符合AIDS界定的指标。
治疗药剂：1.5mg/kg/day共28天。当复发时对患者重复治疗。
表9.8
患者组4
                            PCR定量测定HIV-RNA 测试     天数     1     天数     21-28     天数     60-90     天数     120-150     天数     330-390 平均值     6078.7     964.3     899.7     658     386.2 标准误差     949.4     639.6     199.1     544     257 最大值     7936     2207     1257     1202     983 最小值     4808     80     569     114     54.1 中间值     5492     606     873     658     432
表9.9
患者组4
                                 CD4/mm3定量 测试     天数     1     天数     21-28     天数     60-90     天数     120-150     天数     330-390 平均值     315     302.7     361.3     409.3     486.5 标准误差     72.6     70.3     66.8     72.9     71.8 最大值     429     440     460     540     611 最小值     180     208     234     288     301 中间值     336     260     390     400     435
表9.10
患者组4
                                 CD8/mm3定量 测试     天数     1     天数     21-28     天数     60-90     天数     120-150     天数     330-390 平均值     970.7     867.7     1016     1094     1164 标准误差     247.7     158.7     378.8     229.5     235.2 最大值     1464     1180     1770     1550     1672 最小值     685     663     576     820     921 中间值     763     760     702     912     986
患者组5
患者n＝6
初步目的：采用HRG214治疗的毒性和功效。临床跟踪将持续3 年。当复发时将对患者重新治疗。
目的：临床和实验室参数的正规化，其中包括机会性感染，感染 发生率，消瘦综合症，以及不正常血液化学和血液学、CD4和CD8的 改善以及通过PCR定量测定的HIV-RNA的减少。
跟踪期＝3年
至今的跟踪期＝＞469天
开始日期6/13/95；270天时，存活＝2；死亡＝4；错过跟踪的患 者＝0。(180-210天时2名患者死亡，240-270天1名患者死亡，270 天后1名患者死亡)
患者人数：HIV阳性患者符合界定AIDS的指标，包括CD4＜ 200/mm3血液和合并卡波济氏肉瘤。患者用系统化疗治疗。在180-210 天时两名患者死亡，240天后两名患者死亡。PCR HIV-RNA定量检测 证明在60-90、120-150、180-210和240-270天时测量值下降(p ＝0.018)。
采用成对T检验、Wilcoxon Signed Rank检验和Mann-Whitney Rank Sum检验进行统计学分析。
表9.11
患者组5
                                PCR定量测定HIV-RNA 测试   天数   1   天数   21-28   天数   60-90   天数   120-150     天数     180-210   天数   240-270 平均值   12483.3   16973.7   8373.7   8237.8     8287   4717.5 标准误差   3159.1   6889.1   3081.8   2152.3     2466.6   3609.5 最大值   20233   46586   19514   15249     15570   8327 最小值   442   1242   490   1358     4708   1108 中间值   13682   14510   7027   7392     6435   4717.5
表9.12
患者组5
                                    CD4/mm3定量 测试     天数     1     天数     21-28     天数     60-90     天数     120-150    天数    180-210    天数    240-270 平均值     43.7     20.5     22.3     17.5    12.6    36 标准误差     31.46     12.04     8.45     6.76    4.12    未确定 最大值     200     80     48     48    24    36 最小值     4     4     2     2    4    36 中间值     12     9.5     17     11    8    36
表9.13
患者组5
                                     CD8/mm3定量 测试     天数     1     天数     21-28   天数   60-90   天数   120-150   天数   180-210   天数   240-270 平均值     476.3     303.5   415.8   371   326.4   676 标准误差     152.9     62.7   159.1   100.7   96.2   未确定 最大值     1170     540   1152   710   618   676 最小值     98     86   92   62   101   676 中间值     352     271.5   293.5   358   245   676
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