抗肿瘤药物PEG化及其在逆转肿瘤多药耐药上的应用
阅读：790发布：2023-02-25
专利汇可以提供抗肿瘤药物PEG化及其在逆转肿瘤多药耐药上的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种抗 肿瘤 药物PEG化及其在逆转肿瘤多药耐药上的应用；所述PEG化抗肿瘤药物是通过将活化的PEG偶联到抗肿瘤药物上制备而得的。该PEG化抗肿瘤药物可用于制备逆转肿瘤多药耐药的药物。本发明通过将含有 氨 基、羧基和羟基等可修饰基团的抗肿瘤药物(特别是 水 难溶性药物)经PEG化后，可提高 水溶性 ，具有能自组装形成胶束、制成隐形纳米粒或主动靶向肿瘤纳米粒，调控药物的释放行为，减轻系统毒性，提高 生物 半衰期 ，产生EPR效应和肿瘤被动、主动靶向性，以及逆转肿瘤多药耐药等优良特性，有良好的临床应用前景。，下面是抗肿瘤药物PEG化及其在逆转肿瘤多药耐药上的应用专利的具体信息内容。
1.一种PEG化抗肿瘤药物，其特征在于，所述PEG化抗肿瘤药物是通过将活化的PEG偶联到抗肿瘤药物上制备而得的。
2.如权利要求1所述的PEG化抗肿瘤药物，其特征在于，所述PEG的数均分子量为
0.1K～1000K。
3.如权利要求1所述的PEG化抗肿瘤药物，其特征在于，所述PEG化抗肿瘤药物可以连接靶头。
4.如权利要求3所述的PEG化抗肿瘤药物，其特征在于，所述靶头包括叶酸、生物素、RGD、抗体或核酸适配体。
5.一种如权利要求1～4中任一项所述的PEG化抗肿瘤药物在制备逆转肿瘤多药耐药的药物中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述PEG化抗肿瘤药物中的抗肿瘤药物包括细胞毒类的抗肿瘤药物。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述细胞毒类的抗肿瘤药物为作用于DNA化学结构的药物、影响核酸生物合成的药物、作用于核酸转录的药物、拓扑异构酶抑制药或干扰微管蛋白合成的药物。
8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为具有P-糖蛋白过度表达的内在多药耐药性肿瘤、获得多药耐药性实体肿瘤、血液系统肿瘤中的一种或几种。
9.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述PEG化抗肿瘤药物可自组装形成胶束、制成隐形纳米粒或制成主动靶向肿瘤纳米粒。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述胶束、隐形纳米粒或主动靶向肿瘤纳米粒的粒径范围为1～200nm。
抗肿瘤药物PEG化及其在逆转肿瘤多药耐药上的应用
技术领域
背景技术
[0002] 恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一。国际反癌症联盟宣称，每年因癌症而死亡的人数远远超过疟疾、艾滋病和结核病这三种疾病导致的死亡人数的总和。到2020年，全球每年可能新增癌症病人1500万人。目前我国肿瘤发病率约为200/10万，我国每年新发癌症病例约220万以上，每年在治患者达600万以上，医疗费用在1500亿以上，每年死于癌症人数超过160万。控制癌症己成为全球性卫生战略重点之一。
[0003] 目前，临床上癌症治疗手段主要包括外科手术治疗、放疗和化疗，其中化疗是癌症治疗的最主要手段。然而肿瘤细胞多药耐药(multidrug resistance，MDR)的产生是目前癌症化疗失败的主要原因。因此，克服肿瘤多药耐药已成为癌症治疗领域的热点和难点。
[0004] 肿瘤细胞多药耐药性的产生有多种机制，主要包括：多药耐药基因(MDR1基因)及其编码的P-糖蛋白的过度表达；谷胱甘肽及相关酶的活性增高；多药耐药相关蛋白表达增加等。针对以上机制的逆转肿瘤多药耐药的药物有很多，主要包括：环孢菌素A及其衍生物，黄体酮，奎宁等。但其在体内不稳定，肿瘤靶向性差且毒副作用过大。因此，低毒高效的逆转肿瘤多药耐药的药物研发依旧是人们关注的焦点。
[0006] 紫杉醇(PTX)对多种肿瘤均有良好的效果，然而其水溶性低、毒副作用强，这些都大大地限制了其在临床上的应用，并且长时间使用容易产生耐药现象。
[0007] 阿霉素(DOX)是迄今临床使用最多的抗肿瘤药物，但其有明显的蓄积性心脏毒性，有时不得不终止治疗，同时也很容易产生耐药性，导致化疗失败。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种抗肿瘤药物PEG化及其在逆转肿瘤多药耐药上的应用；本发明将含有氨基、羧基和羟基等可修饰基团的抗肿瘤药物(特别是水难溶性药物)经PEG化后，可提高水溶性，具有能自组装形成胶束、制成隐形纳米粒或主动靶向肿瘤纳米粒，调控药物的释放行为，减轻系统毒性，提高生物半衰期，产生EPR效应和肿瘤被动、主动靶向性，以及逆转肿瘤多药耐药等优良特性，有良好的临床应用前景。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0011] 第一方面，本发明涉及一种PEG化抗肿瘤药物，所述PEG化抗肿瘤药物是通过将活化的PEG偶联到抗肿瘤药物上制备而得的。
[0012] 优选的，所述PEG的数均分子量为0.1K～1000K。
[0013] 优选的，所述PEG化抗肿瘤药物可以连接靶头。
[0014] 更优选的，所述靶头包括叶酸、生物素、RGD、抗体或核酸适配体。
[0015] 第二方面，本发明涉及一种上述的PEG化抗肿瘤药物在制备逆转肿瘤多药耐药的药物中的用途。
[0016] 优选的，所述PEG化抗肿瘤药物中的抗肿瘤药物包括细胞毒类的抗肿瘤药物。
[0017] 更优选的，所述细胞毒类的抗肿瘤药物为作用于DNA化学结构的药物、影响核酸生物合成的药物、作用于核酸转录的药物、拓扑异构酶抑制药或干扰微管蛋白合成的药物。
[0018] 优选的，所述肿瘤为具有P-糖蛋白过度表达的内在多药耐药性肿瘤、获得多药耐药性实体肿瘤、血液系统肿瘤中的一种或几种。
[0019] 优选的，所述PEG化抗肿瘤药物可自组装形成胶束、制成隐形纳米粒或制成主动靶向肿瘤纳米粒。所制备的胶束、隐形纳米粒或主动靶向肿瘤纳米粒可以产生EPR效应。所制备的胶束和隐形纳米粒在体内有肿瘤被动靶向和长血循环作用。
[0020] 优选的，所述胶束、隐形纳米粒或主动靶向肿瘤纳米粒的粒径范围为1～200nm。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0022] 1、药物的PEG修饰是将活化的PEG通过化学方法偶联到药物上的过程，即PEG化；药物PEG化后与修饰前相比具有突出的优势：1)药物的溶解性提高，2)半衰期延长，3)药动学性质得到改善，4)蛋白药物的免疫原性和抗原性下降。
[0023] 2、抗肿瘤药物(如雷帕霉素、紫杉醇和阿霉素等)经PEG化后能自组装形成隐形纳米粒，产生EPR效应，有肿瘤被动靶向和长血循环作用。体外实验表明，其对MCF-7/ADR细胞有明显的逆转作用，逆转倍数分别为3.02、3.33和2.05，且系统毒性有所下降，相比原型药物而言，PEG化药物对MCF-7细胞的IC50值分别上升了5.1、13.0和6.4倍。这种良好的特性可用于肿瘤多药耐药的治疗。附图说明
[0024] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0025] 图1是PEG-RAPA的1H NMR谱图；
[0026] 图2是用不同浓度的雷帕霉素处理MCF-7细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0027] 图3是用不同浓度的雷帕霉素处理MCF-7/ADR细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0028] 图4是用不同浓度的PEG-RAPA处理MCF-7细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0029] 图5是用不同浓度的PEG-RAPA处理MCF-7/ADR细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0030] 图6是PEG-PTX的1H NMR谱图；
[0031] 图7是用不同浓度的紫杉醇处理MCF-7细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0032] 图8是用不同浓度的紫杉醇处理MCF-7/ADR细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0033] 图9是用不同浓度的PEG-PTX处理MCF-7细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0034] 图10是用不同浓度的PEG-PTX处理MCF-7/ADR细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0035] 图11是PEG-DOX的1H NMR谱图；
[0036] 图12是用不同浓度的阿霉素处理MCF-7细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0037] 图13是用不同浓度的阿霉素处理MCF-7/ADR细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0038] 图14是用不同浓度的PEG-DOX处理MCF-7细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率；
[0039] 图15是用不同浓度的PEG-DOX处理MCF-7/ADR细胞后，通过MTT比色法检测肿瘤细胞的存活率。
具体实施方式
[0040] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0041] 实施例1
[0042] 以PEG-RAPA为例说明其合成过程、理化性质的测定及其对MCF-7/ADR细胞的逆转作用：
[0043] PEG-RAPA的合成：取mPEG-COOH88mg溶于10mL冰的无水二氯甲烷中，然后加入107mg的雷帕霉素，30mg的DCC和15mg的DMAP。自然升温至室温，搅拌反应3d。反应完毕
1
后过滤，无水乙醚沉淀2次，然后将沉淀物真空干燥即得。PEG-RAPA(PEG化雷帕霉素)的 H NMR谱图如图1所示。
1
后过滤，无水乙醚沉淀2次，然后将沉淀物真空干燥即得。PEG-RAPA(PEG化雷帕霉素)的 H NMR谱图如图1所示。
[0044] PEG-RAPA胶束的制备及其粒径测定：PEG-RAPA胶束采用固体分散法制备。取1mg PEG-RAPA溶于100μL的乙腈，自然挥干后，溶于2ml超纯水中，涡旋3min，超声5min，
12000r/min离心10min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤即得。
12000r/min离心10min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤即得。
[0045] PEG-RAPA胶束的粒径是用动态光散射法(DLS)测定的：实验光源为4.0mWHe-Ne激光，激光波长633nm，测定角度173°。所有的测量温度都是25℃，重复测试三次，取平均值。实验结果见表1。
[0046] PEG-RAPA溶解度的测定：采用减重法测定。取一定量的PEG-RAPA溶于2mL的超纯水中，充分搅拌至达到溶解平衡，过滤，精确称量未溶解的干燥的PEG-RAPA。溶解度=(所取药物的总量-未溶解的量)/所加入的溶剂体积。以上实验是在25℃下测定的。实验结果见表1。
[0047] 表1PEG-RAPA的溶解度和PEG-RAPA胶束的粒径
[0048]PEG化药物 溶解度(mg/ml) 粒径(nm) PDI
PEG-RAPA 16.7 55.7±2.2 0.132±0.007
PEG-RAPA 16.7 55.7±2.2 0.132±0.007
[0049] 由表1可知雷帕霉索经PEG化后其水溶性大大增加，溶解度变为16.7mg/mL(折合成雷帕霉素的溶解度为5.01mg/mL)。同时其可在水中自组装形成胶束，粒径为55.7nm，且粒径均一，PDI为0.132。
[0050] MCF-7/ADR细胞对雷帕霉素的耐药倍数测定：MCF-7和MCF-7/ADR细胞分别以每孔4000个接种于96孔板中，每孔体积200μL。待细胞贴壁后，培养基替换为含有游离药物的培养基，继续培养48h。接着吸出培养基溶液，加入含有0.5mg/mL MTT的200μL的1640培养基(不含血清)。4h后，MTT溶液被吸去，加入200μL的DMSO溶液进行溶解。然后用酶标仪测定它们在490nm处的吸光值。每个浓度做5个平行。按公式(1)计算细胞增值抑制率，并按下述公式(2)计算药物的耐药倍数：
[0051] 细胞增值抑制率=(对照组A值-药物处理组A值)/对照组A值×100％ (1)[0052] 耐药倍数=IC50(MCF-7/ADR细胞)/IC50(MCF-7细胞) (2)
[0053] 结果如图2、图3和表2所示：
[0054] 表2雷帕霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的IC50值和耐药倍数
[0055]
[0056] 由表2可知MCF-7/ADR细胞对雷帕霉素有很强的耐药作用，可用于多药耐药的相关研究。
[0057] PEG-RAPA对MCF-7/ADR细胞的逆转指数和对MCF-7细胞的细胞毒性作用测定：将处于对数生长期的MCF-7/ADR、MCF-7细胞以4000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔体积200μL，置于培养箱中培养。待细胞贴壁后，培养基替换为含有PEG-RAPA的培养基，继续培养48h。接着吸出培养基溶液，加入含有0.5mg/mLMTT的200μL的1640培养基(不含血清)。4h后，MTT溶液被吸去，加入200μL的DMSO溶液进行溶解。然后用酶标仪测定它们在490nm处的吸光值。每个浓度做5个平行。按公式(1)计算细胞增值抑制率，并按下述公式(3)计算逆转指数。
[0058] 逆转指数=IC50(化疗药物)/IC50(PEG化药物) (3)
[0059] 实验结果如图4、图5和表3所示：
[0060] 表3PEG-RAPA对MCF-7/ADR、MCF-7细胞的IC50值和逆转指数
[0061]
[0062] 表3结果表明雷帕霉素经PEG化后对MCF-7/ADR细胞的毒性有所增强，逆转指数为3.02，具有较强的逆转效果，同时对MCF-7细胞的毒性有所下降，下降倍数为5.1。
[0063] 实施例2
[0064] 以PEG-PTX为例说明其合成过程、理化性质的测定及其对MCF-7/ADR细胞的逆转作用：
[0065] PEG-PTX的合成：取mPEG-COOH88mg，溶于10mL无水二氯甲烷，冰浴至0℃，然后加入100mg的紫杉醇，30mg的DCC，15mg的DMAP，搅拌反应，自然升温至室温，反应3d。反应1
完毕后过滤，并用冰乙醚沉淀，然后将沉淀物真空干燥即得。PEG-PTX(PEG化紫杉醇)的 H NMR谱图如图6所示。
完毕后过滤，并用冰乙醚沉淀，然后将沉淀物真空干燥即得。PEG-PTX(PEG化紫杉醇)的 H NMR谱图如图6所示。
[0066] PEG-PTX胶束的制备及其粒径测定：PEG-PTX胶束采用固体分散法制备。取1mg PEG-PTX溶于100μL的乙腈，自然挥干后，溶于2ml超纯水中，涡旋3min，超声5min，12000r/min离心10min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤即得。
[0067] PEG-PTX胶束的粒径是用动态光散射法(DLS)测定的：实验光源为4.0mWHe-Ne激光，激光波长633nm，测定角度173°。所有的测量温度都是25℃，重复测试三次，取平均值。实验结果见表4。
[0068] 表4PEG-PTX胶束的粒径及PDI
[0069]PEG化药物 粒径(nm) PDI
PEG-PTX 53.4±3.4 0.170±0.010
PEG-PTX 53.4±3.4 0.170±0.010
[0070] 由表4可知PEG-PTX可在水中自组装形成胶束，其粒径大小为53.4nm，PDI为0.170。
[0071] MCF-7/ADR细胞对紫杉醇的耐药倍数测定：MCF-7和MCF-7/ADR细胞分别以每孔4000个接种于96孔板中，每孔体积200μL。待细胞贴壁后，培养基替换为含有游离药物的培养基，继续培养48h。接着吸出培养基溶液，加入含有0.5mg/mL MTT的200μL的1640培养基(不含血清)。4h后，MTT溶液被吸去，加入200μL的DMSO溶液进行溶解。然后用酶标仪测定它们在490nm处的吸光值。每个浓度做5个平行。按公式(1)计算细胞增值抑制率，并按公式(2)计算药物的耐药倍数。
[0072] 实验结果如图7、图8和表5所示：
[0073] 表5紫杉醇对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的IC50值和耐药倍数
[0074]
[0075] 由表5可知MCF-7/ADR细胞对紫杉醇有很强的耐药作用，可用于多药耐药的相关研究。
[0076] PEG-PTX对MCF-7/ADR细胞的逆转指数和对MCF-7细胞的细胞毒性作用测定：将处于对数生长期的MCF-7/ADR、MCF-7细胞以4000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔体积200μL，置于培养箱中培养。待细胞贴壁后，培养基替换为含有PEG-PTX的培养基，继续培养48h。接着吸出培养基溶液，加入含有0.5mg/mLMTT的200μL的1640培养基(不含血清)。4h后，MTT溶液被吸去，加入200μL的DMSO溶液进行溶解。然后用酶标仪测定它们在490nm处的吸光值。每个浓度做5个平行。按公式(1)计算细胞增值抑制率，并按公式(3)计算逆转指数。
[0077] 实验结果如图9、图10和表6所示：
[0078] 表6PEG-PTX对MCF-7/ADR、MCF-7细胞的IC50值和逆转指数
[0079]
[0080] 表6结果表明紫杉醇经PEG化后对MCF-7/ADR细胞的毒性有所增强，逆转指数为3.33，具有较强的逆转效果，同时对MCF-7细胞的毒性有所下降，下降倍数为13.0。
[0081] 实施例3
[0082] 以PEG-DOX为例说明其合成过程、理化性质的测定及其对MCF-7/ADR细胞的逆转作用：
[0083] PEG-DOX的合成：取210mg mPEG-COOH，58mg盐酸阿霉素，23mgNHS，20mgDCC，12mgTEA于10ml无水二氯甲烷中，室温避光氮气下反应3d，过滤，透析，冷冻干燥即得。
1
PEG-DOX(PEG阿霉素)的 H NMR谱图如图11所示。
1
PEG-DOX(PEG阿霉素)的 H NMR谱图如图11所示。
[0084] PEG-DOX胶束的制备及其粒径测定：PEG-DOX胶束采用固体分散法制备。取1mg PEG-DOX溶于100μL的乙腈，自然挥干后，溶于2ml超纯水中，涡旋3min，超声5min，12000r/min离心10min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤即得。
[0085] PEG-DOX胶束的粒径是用动态光散射法(DLS)测定的：实验光源为4.0mWHe-Ne激光，激光波长633nm，测定角度173°。所有的测量温度都是25℃，重复测试三次，取平均值。实验结果见表7。
[0086] 表7PEG-DOX胶束的粒径及PDI
[0087]PEG化药物 粒径(nm) PDI
PEG-DOX 51.7±2.1 0.161±0.006
PEG-DOX 51.7±2.1 0.161±0.006
[0088] 由表7可知PEG-DOX可在水中自组装形成胶束，其粒径大小为51.7，PDI为0.161。
[0089] MCF-7/ADR细胞对阿霉素的耐药倍数测定：MCF-7和MCF-7/ADR细胞分别以每孔4000个接种于96孔板中，每孔体积200μL。待细胞贴壁后，培养基替换为含有游离药物的培养基，继续培养48h。接着吸出培养基溶液，加入含有0.5mg/mL MTT的200μL的1640培养基(不含血清)。4h后，MTT溶液被吸去，加入200μL的DMSO溶液进行溶解。然后用酶标仪测定它们在490nm处的吸光值。每个浓度做5个平行。按公式(1)计算细胞增值抑制率，并按公式(2)计算药物的耐药倍数。
[0090] 实验结果如图12、图13和表8所示：
[0091] 表8阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的IC50值和耐药倍数
[0092]
[0093] 由表8可知MCF-7/ADR细胞对阿霉索有很强的耐药作用，可用于多药耐药的相关研究。
[0094] PEG-DOX对MCF-7/ADR细胞的逆转指数和对MCF-7细胞的细胞毒性作用测定：将处于对数生长期的MCF-7/ADR、MCF-7细胞以4000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔体积200μL，置于培养箱中培养。待细胞贴壁后，培养基替换为含有PEG-DOX的培养基，继续培养48h。接着吸出培养基溶液，加入含有0.5mg/mLMTT的200μL的1640培养基(不含血清)。4h后，MTT溶液被吸去，加入200μL的DMSO溶液进行溶解。然后用酶标仪测定它们在490nm处的吸光值。每个浓度做5个平行。按公式(1)计算细胞增值抑制率，并按公式(3)计算逆转指数。
[0095] 实验结果如图14、图15和表9所示：
[0096] 表9PEG-DOX对MCF-7/ADR、MCF-7细胞的IC50值和逆转指数
[0097]
[0098] 表9结果表明阿霉素经PEG化后对MCF-7/ADR细胞的毒性有所增强，逆转指数为2.05，具有较强的逆转效果，同时对MCF-7细胞的毒性有所下降，下降倍数为6.4。
[0099] 综上所述，本发明的PEG化抗肿瘤药物有明显的逆转肿瘤多药耐药的作用。进一步对其原理阐述如下：多药耐药主要由P-gp糖蛋白介导产生，而雷帕霉素、紫杉醇和阿霉素都是P-gp的底物，上述抗肿瘤药物经PEG化后改变了其化学结构(变成了前药)，从而不是P-gp的底物，所以能逆转多药耐药。推而广之，那些能产生耐药性的药物经PEG化后也能逆转多药耐药。
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