使用三齿配体的成像技术
阅读：775发布：2020-06-02
专利汇可以提供使用三齿配体的成像技术专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种显微术，具体而言，涉及时间分辨发射成像显微术(TREM)。本发明涉及具有三齿配体的过渡金属络合物在成像技术中的应用。所述过渡金属优选是铂。，下面是使用三齿配体的成像技术专利的具体信息内容。
1.具有三齿配体的过渡金属络合物在成像技术中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述过渡金属络合物用作示踪剂。
3.如权利要求2所述的应用，其中，所述过渡金属络合物用作细胞中的示踪剂。
4.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物在体外或体内导入细胞中。
5.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物与导入细胞中的化学物种进行预结合。
6.如权利要求5所述的应用，其中，所述化学物种为蛋白质、抗体、DNA、RNA、抗原或病毒。
7.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物与细胞内的活性部位结合以标记出至少部分细胞结构。
8.如权利要求7所述的应用，其中，所述活性部位为细胞内的核酸活性部位，优选为RNA和/或DNA活性部位。
9.如权利要求7或8所述的应用，其中，所述活性部位位于细胞的细胞核或核仁内。
10.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物的荧光发射量子产率为0.6以上，更优选为0.65以上，最优选为0.7以上。
11.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属是正方平面配位。
12.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属是铂。
(II)
13.如权利要求12所述的应用，其中，所述铂络合物是Pt 络合物。
14.如权利要求12或13所述的应用，其中，所述铂络合物是电中性的。
15.如权利要求12～14中任一项所述的应用，其中，所述铂络合物具有式Pt[L]X，其中L是三齿配体，X为单齿配体。
16.如权利要求12～15中任一项所述的应用，其中，所述三齿配体(L)是环金属化配体。
17.如权利要求15或16所述的应用，其中，所述三齿配体(L)经由N^C^N配位点而与所述过渡金属配位。
18.如权利要求15～17中任一项所述的应用，其中，所述三齿配体(L)是1，3-二(2-吡啶基)苯或其衍生物。
19.如权利要求18所述的应用，其中，所述三齿配体(L)是在4′位上进行取代的1，
3-二(2-吡啶基)苯衍生物。
20.如权利要求15～19中任一项所述的应用，其中，所述三齿配体(L)取代有生物靶向官能团或适于反应性地连接所述衍生物与生物靶向官能团的连接基团，所述取代优选在
4′位上。
21.如权利要求20所述的应用，其中，所述连接基团是酰胺基或酯基。
22.如权利要求15～21中任一项所述的应用，其中，X是单齿π供体配体。
23.如权利要求15～22中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物具有下式：
其中R是-H、-C(O)OCH3、-CH3或-C6H4-N(CH3)2；且
其中X是单齿配体。
24.如权利要求23所述的应用，其中，X是Cl、Br、F或OH。
25.如权利要求24所述的应用，其中，X是Cl。
26.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述成像技术包括显微术。
27.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述成像技术包括光子成像。
28.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述成像技术包括荧光显微术。
29.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述成像技术包括荧光寿命成像显微术(FLIM)、时间分辨发射成像显微术(TREM)、多光子激发(MPE)、双光子激发显微术(TPE)、福斯特共振能量转移显微术(FRET)、落射荧光显微术或共焦稳态显微术、光激发激光显微术(PALM)、时间分辨各向异性成像显微术(TRAIM)或这些技术中两种以上的组合。
30.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述技术用来观测发射寿命。
31.如权利要求30所述的应用，其中，在至少100纳秒、更优选1微秒、最优选至多1000微秒的时间段内观测所述发射寿命。
32.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述技术用来对活细胞进行成像和/或编图，和/或原位标记RNA。
33.如前述权利要求中任一项所述的应用，所述应用还包括：
1)将所述络合物添加至细胞；
2)可选地对所述细胞进行温育；和
3)进行成像步骤以确定所述络合物在所述细胞中的位置。
34.如权利要求33所述的应用，其中，在将所述络合物添加至细胞的步骤之前，使所述络合物与化学物种连接。
35.如权利要求33或34所述的应用，其中，将所述络合物添加至细胞的所述步骤包括使所述络合物扩散入细胞中的步骤。
36.如权利要求33～35中任一项所述的应用，其中，所述可选的温育步骤进行1分钟～30分钟，更优选为2分钟～20分钟，最优选为约5分钟。
37.一种具有三齿配体的过渡金属络合物，所述过渡金属络合物与生物分子结合。
38.如权利要求37所述的过渡金属络合物，其中，所述络合物经由所述配体与生物分子结合。
39.如权利要求37或38所述的过渡金属络合物，其中，所述生物分子是蛋白质、抗原、病毒、DNA、RNA或抗体。
40.具有三齿配体的过渡金属络合物作为示踪剂的应用。
使用三齿配体的成像技术
[0001] 本发明主要涉及显微术领域，具体而言，涉及用于活细胞的非侵入式成像和编图(map)的时间分辨发射成像显微术(TREM)。
[0002] 认识支撑生物体系的化学过程依赖能够对生物过程进行实时非侵入式监测的技术和理念的发展。荧光显微术是生物科学中使用最为广泛的工具之一，其优点在于敏锐的灵敏度，优异的空间分辨率，以及出众的时间分辨率。该技术使得研究宽度可以从单分子的交互作用到整个有机体研究，并依赖从内源性荧光团或外部荧光探针发出的光来监测局部环境和其中的变化。在强度、波长和寿命这三个基本发射参数中，迄今为止绝大多数的荧光成像研究均基于发射强度的空间变化或基于波长变化。相反，基于寿命的方法仍然未得到充分地开发。然而基于寿命的传感和成像是对常用方法的有力补充。主要的优点是发射寿命通常不依赖于浓度并能够得到绝对校准，而不像强度测量会具有因光输送和探测的效率波动而造成的误差。
[0003] 近来在荧光寿命探测技术中的进展已经使得荧光寿命成像显微术(FLIM)成为现实。迄今为止，FLIM主要基于如芳族氨基酸色氨酸等内源性分子，以及基于包括GFP标记蛋白和荧光素衍生物在内的荧光染料，所有这些物质的寿命均为几纳秒。较短的寿命使亚纳秒光源和快速探测器成为必要，因为：(i)需要在亚纳秒时间尺度内分辨出相对较小的变化；和(ii)还必须以纳秒时间尺度从天然生物生色团发出的自体荧光中区分出试剂的荧光。
[0004] 使用较长时间尺度(即几百纳秒至微秒)的时间分辨发射成像显微术(TREM)的发展是一个重要的进展。较长的时间尺度通过较大的寿命变化并通过使时间门控(time-gated)实验能够区分出寿命较短的自体荧光来提供较高的辨识度。TREM不需要快速的激发或探测方法；相反，能够以纳秒激光器和慢速门控探测器执行该技术。迄今为止，阻碍实用性TREM发展的限制性因素已经是化学而非光学技术。主要的限制是缺乏这样的发光探针：其具细胞渗透性，无毒性，且于室温以上在加气水性介质中的寿命超过约100ns。大部分磷光有机分子由于其通常寿命较长的三重态的高效淬灭而在此种条件下不能使用。
[0005] 某些过渡金属络合物可以以超过100ns的寿命从三重激发态进行有效发射，因为从形式上，自旋禁阻S0←T1跃迁通过与重金属原子有关的自旋轨道耦合而得到促进。近来使用钌(II)和铼(I)络合物已经获得了稳态的细胞图像。然而还需要探查时间维度。虽然已经报道了采用电中性铂卟啉的成功的时间门控细胞成像，但是约100μs的较长激发态寿命导致严重的氧淬灭并因而导致细胞毒性。
[0006] 本发明旨在解决至少部分与现有技术有关的问题。
[0007] 因此，本发明提供了一种具有三齿配体的过渡金属络合物在成像技术中的应用。
[0008] 现将进一步描述本发明。下文中将更详细地限定本发明的不同方面/实施方式。除非清楚地做出相反的说明，否则如此限定的各方面/实施方式可以与任何其它(多个)方面/实施方式组合。特别是，描述为优选或有利的任何特征可以与描述为优选或有利的任何其它(多个)特征组合。
[0009] 所述过渡金属络合物可用作示踪剂，例如作为细胞内的示踪剂。
[0010] 所述过渡金属络合物可以在体内或体外导入细胞中。
[0012] 所述过渡金属络合物可以与细胞内的活性部位结合以标记出至少部分细胞结构。所述活性部位包括，例如细胞内的核酸活性部位，优选为RNA和/或DNA活性部位。该活性部位可位于细胞的细胞核内或核仁内，或位于其它亚细胞结构或膜内。该络合物不一定只用于细胞。其可用来与细胞外活性部位结合，如从细胞中提取的或合成的核酸、RNA和/或DNA。
[0013] 所述过渡金属络合物的发光量子产率优选为0.6以上，更优选为0.65以上，最优选为0.7以上。
[0014] 过渡金属优选是正方平面配位。
[0015] 三齿配体优选是指配体在三个配位点与过渡金属进行配位。
[0016] 所述过渡金属优选是铂。
[0017] 铂络合物优选是Pt(II)络合物。
[0018] 所述铂络合物优选是电中性的。
[0019] 有利的是，所述铂络合物具有式Pt[L]X，其中L是三齿配体而X为单齿配体。三齿配体(L)优选是环金属化配体。该三齿配体(L)优选经由N^C^N配位点而与过渡金属配位。
[0020] 在特别优选的实施方式中，三齿配体(L)是1，3-二(2-吡啶基)苯或其衍生物。三齿配体(L)优选是在4′位上进行取代的1，3-二(2-吡啶基)苯衍生物。
[0021] 可以使用已知技术，例如Williams JAG，Beeby A，Davies ES，Weinstein JA，WilsonC(2003)An alternative route to highly luminescent platinum(II)complexes：cyclometalation with N^C^N-coordinating dipyridylbenzene ligands.Inorg Chem42：
8609-8611中描述的技术来合成该络合物。
8609-8611中描述的技术来合成该络合物。
[0022] 论及三齿配体(L)，其优选取代有(最优选在4′位)生物靶向官能团(functionality)或适于反应性地连接该衍生物与生物靶向官能团的连接基团。例如，该连接基团可以是酰胺基或酯基。
[0023] 该络合物中的X优选是单齿π供体配体。
[0024] 在特别优选的实施方式中，所述过渡金属络合物具有下式：
[0025]
[0026] 其中R是-H、-C(O)OCH3、-CH3或-C6H4-N(CH3)2；且其中X是单齿配体。
[0027] X可以例如是Cl、Br、F或OH。优选的是Cl。
[0028] 如上所述，通过如Williams JAG，Beeby A，Davies ES，Weinstein JA，Wilson C(2003)An alternative route to highly luminescent platinum(II)complexes：cyclometalation withN^C^N-coordinating dipyridylbenzene ligands.Inorg Chem 42：
8609-8611中描述的常规技术可以合成所述络合物。
8609-8611中描述的常规技术可以合成所述络合物。
[0029] 本发明涉及成像技术，例如显微术。
[0030] 实例包括单光子或多光子成像以及荧光和发射显微术。具体而言，所述成像技术可包括荧光寿命成像显微术(FLIM)、时间分辨发射成像显微术(TREM)、多光子激发(MPE)、双光子激发显微术(TPE)、福斯特共振能量转移显微术(FRET)、落射荧光(epi-fluorescense)显微术或共焦稳态显微术、光激发激光显微术(PALM)、时间分辨各向异性成像显微术(TRAIM)或这些技术中两种以上的组合。本文中使用的发射是发光的同义词。因此，发射包括荧光和磷光。发射技术可依赖于这些技术的全部或组合。
[0031] 所述技术可用来观测发射寿命。可在至少10纳秒、更优选100纳秒、甚至更优选1微秒以及最优选至多1000微秒的时间段内观测发射寿命。
[0032] 本发明的技术可用来对活细胞进行成像和/或编图，和/或原位标记DNA和/或RNA。应理解的是，原位是指如本文披露的在活细胞内部或外部以及对其它样品(例如游离RNA)进行的行为。成像的类型包括稳态成像和时间分辨成像。
[0033] 本发明可还包括：
[0034] 1)将本文所述的络合物添加至细胞；
[0035] 2)可选地对细胞进行温育；和
[0036] 3)进行成像步骤以确定细胞内的络合物的位置。
[0037] 将络合物添加至细胞的步骤可包括使络合物与化学物种连接。
[0038] 将络合物添加至细胞的步骤可包括使络合物扩散入细胞中的步骤。
[0039] 可选的温育步骤可进行1分钟～30分钟，更优选为2分钟～20分钟，最优选为约5分钟的时间。
[0040] 本发明还提供一种具有三齿配体的过渡金属络合物，所述络合物与生物分子结合。所述络合物优选经由所述配体与生物分子结合。
[0041] 所述生物分子可包括，例如蛋白质、抗原、病毒、DNA、RNA或抗体。
[0042] 本发明还提供了具有三齿配体的过渡金属络合物作为示踪剂的应用。
[0043] 在一个优选的方面中，本发明依赖于具有高发射性、合成多样性和耐光性的铂(II)络合物，所述络合物使TREM现实可行。
[0044] 具体而言，本发明人发现[PtLCl]络合物{HL＝1，3-二(2-吡啶基)苯及衍生物}是电中性的小分子，其具有较低的细胞毒性并明显在扩散控制下于5分钟的极短温育时间内在细胞内积聚。其微秒寿命和高达70％的发射量子产率对过渡金属络合物而言极高，并使得TREM在活细胞类型的范围(如正常的人皮肤成纤维细胞、肿瘤C8161人黑素瘤细胞和中国仓鼠卵巢细胞)内的应用得以证实。[PtLCl]是适用于任何真核细胞类型的发射标记物。
[0045] [PtLCl]在长时间的强辐照下的高耐光性使得首次在活细胞中实现结合过渡金属络合物的组织友好型NIR双光子激发(TPE)。共焦单光子激发、非线性双光子激发和微秒时间分辨成像的结合已经揭示：i)络合物对细胞内的核酸结构、特别是核仁的优先定位；和ii)在微秒尺度测量细胞内发射寿命的可能性。因此，TREM、TPE和Pt(II)络合物的组合现在成为用于体内和/或体外研究细胞内过程的有力工具，因为较长的寿命使得能够与自体荧光区分。
[0046] 本发明人的研究提出了高发射电中性铂(II)络合物与时间分辨成像在TREM中的新型且有力的组合。开发出的Pt(II)络合物还满足TREM试剂的其它基本标准，包括化学和光化学稳定性、低细胞毒性和对潜在特定靶标的合成多样性。这在结合双光子激发(TPE)实施时对生物成像具直接重要性。TPE是用于活细胞和组织非侵入式成像的新兴多用途工具。其使用相对组织透明性的600nm～1100nm内低能光的双光子同步吸收来在可见区域内激发生色团。这使得z轴成像能够达到数百微米的深度。TPE中使用的高光子通量提供了本征空间分辨率，但需要所采用的生色团有杰出的耐光性。本发明使用的Pt(II)络合物对于活细胞中的多光子激发具有足够的耐光性。
[0047] 通过使用高发射性、光化学稳定的过渡金属络合物，本发明使得时间分辨发射成像显微术能够现实可行地用于活细胞成像和编图。
[0049] 图1：络合物[PtLnCl]的结构：n＝1～4，R＝H、-C(O)OCH3、-CH3和-C6H4-N(CH3)2。
[0050] 图2：通过MTT(OD)测定的CHO K1细胞的存活率。将细胞以不同浓度的[PtL1Cl]温育5分钟，用PBS进行清洗(3次)，然后用新鲜的培养基温育1小时。观察到测试条件和对照条件之间没有明显的差异(平均值±SEM，n＝3)。
[0051] 图3：[PtL1Cl]在水中的发射谱(---)，在充气的CH2Cl2溶液中的发射谱(----)以及从HDF细胞的细胞核中获得的发射谱(实线)。y轴上示出了发射强度(AU)，而x轴上示出了波长nm。
[0052] 图4：通过共染色实验进行细胞内定位测定。在培养基中将CHO-Kl细胞以100μM1
的[PtLCl]温育5分钟，并用4％(重量/体积)的多聚甲醛固定。使用DAPI(300nM)对细胞核进行双重标记。将样品设置于落射荧光显微镜，并使用100倍油浸物镜进行可视化。
1
a)使用FITC通道(λex＝485nm；λem＝520nm)鉴别出[PtLCl]定位。b)使用DAPI鉴别核酸(λex＝400nm；λem＝460nm)。c)叠加的FITC和DAPE图像。示出的图像是进行的三个实验的代表。比例条＝5μm。
的[PtLCl]温育5分钟，并用4％(重量/体积)的多聚甲醛固定。使用DAPI(300nM)对细胞核进行双重标记。将样品设置于落射荧光显微镜，并使用100倍油浸物镜进行可视化。
1
a)使用FITC通道(λex＝485nm；λem＝520nm)鉴别出[PtLCl]定位。b)使用DAPI鉴别核酸(λex＝400nm；λem＝460nm)。c)叠加的FITC和DAPE图像。示出的图像是进行的三个实验的代表。比例条＝5μm。
[0053] 图5：人皮肤成纤维细胞(第一行)、C8161人黑素瘤(第二行)和中国仓鼠卵巢细胞(第三行)的共焦显微图。细胞如图4中进行温育，用PBS清洗(5分钟)并使用488nm波1
长的激发来成像。成对图像分别显示出灰度(左)和彩色(右)强度，并鉴别出[PtL Cl]的积聚区。Z距离为15μm～30μm。比例条＝10μm。在右手侧按比例示出了相对强度，其顶端为高(+)强度。
长的激发来成像。成对图像分别显示出灰度(左)和彩色(右)强度，并鉴别出[PtL Cl]的积聚区。Z距离为15μm～30μm。比例条＝10μm。在右手侧按比例示出了相对强度，其顶端为高(+)强度。
[0054] 图6：时间门控的细胞成像：活CHO细胞用[PtL1Cl]进行预温育，在1M NaOH中的荧光素溶液的存在下成像。在355nm激光脉冲后0ns延迟(a，左)和10ns延迟(b，右)获取图像。比例条＝10μm。
[0055] 图7：用[PtL1Cl]温育的活CHO细胞的时间分辨门控发射图像。355nm激光激发后，从激光闪光起于100ns～2900ns的时间延迟记录图像。使用的时间门(time gate)为100ns，曝光时间0.02s，每个时间延迟进行5次积累。比例条＝50μm。
[0056] 图8：用100μM[PtL1Cl]溶液将活CHO细胞温育5分钟，由其细胞核获得发射动力学描绘图(小图，比例条＝10μm)。实线表示对数据的双指数拟合。显示的数据是至少三个独立区域的平均值。发射强度示于y轴。时间μs示于x轴。
[0057] 图9：在760nm、180fs激发下获得的以[PtL1Cl]温育的活CHO细胞的双光子激发高分辨发射图像。比例条＝10μm。实施例
[0058] 1.采用的化合物和光物理背景
[0059] 使用的成像剂为[PtLCl](图1)，其为环金属化、三齿、N^C^N配位配体1，3-二(2-吡啶基)苯及衍生物的Pt(II)络合物。这些化合物可以容易地以两步从简单的原料高产率地合成(例如见Williams JAG，Beeby A，Davies ES，Weinstein JA，Wilson C(2003)Analternative route to highly luminescent platinum(II)complexes：cyclometalation withN^C^N-coordinating dipyridylbenzene ligands.Inorg Chem 42：
8609-8611)。核心结构可在配体(R，图1)的中心位置容易地衍生，这使得能够在蓝绿色至橙色的宽谱线范围内对发射进行调谐。其还提供了一种简单地连接生物靶向官能团的方法；例如，已经制备出经由酰胺连接臂(R＝CH2NHCO)连接有生物素的络合物。特别是在与有机磷光探针相比时，这种简单的合成路线物能够前所未有地获得这类标记物。[PtLCl]
4 -1 3 -1
在UV区(350nm～380nm，ε～10mol dmcm ，其S→T带在490nm附近的可见光中较弱，-1 3 -1
ε～200mol dmcm )吸收较强，而室温下在480nm～600nm于流体溶液中强烈发光。发射量子产率(Φ1um)在脱气的二氯甲烷溶液中为0.6～0.7(对于铂生色团而言极高)，其中通常通过非辐射衰减经由低位、强反键d-d激发态来淬灭发射激发态。根据与刚性三齿环金属化配体有关的极强配体场，可对高发光效率进行合理化，所述配体提升了d-d激发态的能量，从而减少甚至消除该非辐射衰减的路径。[PtLCl]的发射可归因于主要的三重配体内π-π*特征的激发态，其中金属的作用足以实现数微秒的寿命。因此，从光物理的观点出发，该络合物满足了时间分辨成像在数百纳秒～微秒时间尺度上的要求。接下来的部
1
分将讨论对其细胞内应用的研究。这些实施例关注最简单的[PtLCl]络合物(R＝H)。在
4′位上带有-C(O)OCH3、-C6H4-N(CH3)2或-CH3基团的衍生物也获得了类似的结果。
8609-8611)。核心结构可在配体(R，图1)的中心位置容易地衍生，这使得能够在蓝绿色至橙色的宽谱线范围内对发射进行调谐。其还提供了一种简单地连接生物靶向官能团的方法；例如，已经制备出经由酰胺连接臂(R＝CH2NHCO)连接有生物素的络合物。特别是在与有机磷光探针相比时，这种简单的合成路线物能够前所未有地获得这类标记物。[PtLCl]
4 -1 3 -1
在UV区(350nm～380nm，ε～10mol dmcm ，其S→T带在490nm附近的可见光中较弱，-1 3 -1
ε～200mol dmcm )吸收较强，而室温下在480nm～600nm于流体溶液中强烈发光。发射量子产率(Φ1um)在脱气的二氯甲烷溶液中为0.6～0.7(对于铂生色团而言极高)，其中通常通过非辐射衰减经由低位、强反键d-d激发态来淬灭发射激发态。根据与刚性三齿环金属化配体有关的极强配体场，可对高发光效率进行合理化，所述配体提升了d-d激发态的能量，从而减少甚至消除该非辐射衰减的路径。[PtLCl]的发射可归因于主要的三重配体内π-π*特征的激发态，其中金属的作用足以实现数微秒的寿命。因此，从光物理的观点出发，该络合物满足了时间分辨成像在数百纳秒～微秒时间尺度上的要求。接下来的部
1
分将讨论对其细胞内应用的研究。这些实施例关注最简单的[PtLCl]络合物(R＝H)。在
4′位上带有-C(O)OCH3、-C6H4-N(CH3)2或-CH3基团的衍生物也获得了类似的结果。
[0060] 2.细胞在体外加载[PtL1Cl]络合物——细胞毒性、细胞存活率和耐光性[0061] 基于它们涵盖了多种表型，选择出三种细胞系，即(i)通常可培养至多8～9代的正常人细胞类型(皮肤成纤维细胞；HDF)；(ii)可无限期培养的肿瘤人细胞系(黑素瘤；C8161)；和(iii)可无限期培养的动物衍生细胞系(中国仓鼠卵巢细胞；CHO)。HDF细胞在常规手术中由健康患者的皮肤分离，C8161细胞得自高转印性次生侵袭性黑素瘤，而CHO系是许多实验室中用于基因转染和蛋白质表达研究的常用动物细胞类型。全部细胞均是单核的并具贴附性，在分裂周期(G1、S、G2和M期)的全部阶段对细胞进行实验。这为通过膜渗透性和相对生化亲和性鉴别全面的细胞内目标标记部位提供了基础。由于肿瘤性质或种类的不同，研究的三种细胞类型还使得能够鉴别潜在的标记差异。
[0062] 为了确定[PtL1Cl]是否具有潜在细胞毒性或改变细胞存活率，使用MTT(MTT＝3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)法检验接触该络合物后各细胞类型
1
的代谢活动。在温育时间为5分钟～24小时下对浓度为1μM～100μM的[PtLCl]进行
1
了研究。这些研究表明细胞在用100μM的[PtLCl]溶液进行1小时的温育后是存活的，其代谢活性没有明显的下降(图2)。接触100μM溶液24小时使得CHO细胞的存活率下降
90％，而HDF细胞的存活率下降70％。但是，接触10μM溶液甚至在24小时的时间段也不会引起细胞存活率的下降。
1
的代谢活动。在温育时间为5分钟～24小时下对浓度为1μM～100μM的[PtLCl]进行
1
了研究。这些研究表明细胞在用100μM的[PtLCl]溶液进行1小时的温育后是存活的，其代谢活性没有明显的下降(图2)。接触100μM溶液24小时使得CHO细胞的存活率下降
90％，而HDF细胞的存活率下降70％。但是，接触10μM溶液甚至在24小时的时间段也不会引起细胞存活率的下降。
[0063] 在流体有机溶剂中，该络合物在细胞内意外地表现出低毒性，使得[PtL1Cl]成为1
单线态氧的适度有效的感光剂(对 ΔgO2形成的量子产率为0.4)。这表明在细胞内，该络合物不受由氧引起的扩散控制淬灭的影响，这可能是由于结合至如蛋白质或核酸等大生物分子的疏水性环境；该观点得到了以下描述的共染色研究、高分辨率图像和光谱测量的支持。在平均功率为100mW的长时间NIR(780nm)和UV(390nm)激光辐照6小时下未观察到化合物在细胞内的光漂白。
单线态氧的适度有效的感光剂(对 ΔgO2形成的量子产率为0.4)。这表明在细胞内，该络合物不受由氧引起的扩散控制淬灭的影响，这可能是由于结合至如蛋白质或核酸等大生物分子的疏水性环境；该观点得到了以下描述的共染色研究、高分辨率图像和光谱测量的支持。在平均功率为100mW的长时间NIR(780nm)和UV(390nm)激光辐照6小时下未观察到化合物在细胞内的光漂白。
[0064] 3.落射荧光显微术和稳态光谱术
[0065] 细胞在100μM的[PtL1Cl]在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中的溶液中温育5分钟，该溶液中含有1体积％的DMSO来促进络合物的溶解。如MTT法(图2)所测量，对照实验确认此浓度的DMSO对细胞存活率没有不利影响。温育后，除去含有络合物的溶液，活细胞用PBS清洗，并在盖玻片上转移到显微镜台，从而在不固定的情况下直接成像。仅5分钟的温育时间足够实现[PtLCl]在细胞中的最大发射强度，这比先前已开发出的阳离子金属络1
合物的时间明显缩短。极短的温育时间意外地表明，[PtLCl]具有穿透所研究的全部三种细胞类型的质膜的高渗透性，并在扩散控制下在细胞内积聚。极有可能的是，并不需要特定的跨膜输送机制(通过膜通道或受体介导的内吞作用)，并揭示出这些Pt(II)化合物用作宽范围的真核细胞类型中的标记物的可能。
合物的时间明显缩短。极短的温育时间意外地表明，[PtLCl]具有穿透所研究的全部三种细胞类型的质膜的高渗透性，并在扩散控制下在细胞内积聚。极有可能的是，并不需要特定的跨膜输送机制(通过膜通道或受体介导的内吞作用)，并揭示出这些Pt(II)化合物用作宽范围的真核细胞类型中的标记物的可能。
[0066] 细胞中的Pt(II)络合物在激发时发出特征性绿至黄光。经染色的CHO、HDF和1
C8161细胞核发出的光的常见光谱曲线基本与[PtLCl]在水溶液中的光谱相同(图3)，其中发射顶点处于490nm～550nm。发射光谱的特征振动结构——即振动级数(vibrational progression)的0-0带最为强烈，表明与基态相比，发射激发态中的重组度较低。络合物在细胞内部与在溶液中获得了相似的谱线，这令人信服地确认了作为发射引起者的″PtL″单元在细胞内保存完好。
C8161细胞核发出的光的常见光谱曲线基本与[PtLCl]在水溶液中的光谱相同(图3)，其中发射顶点处于490nm～550nm。发射光谱的特征振动结构——即振动级数(vibrational progression)的0-0带最为强烈，表明与基态相比，发射激发态中的重组度较低。络合物在细胞内部与在溶液中获得了相似的谱线，这令人信服地确认了作为发射引起者的″PtL″单元在细胞内保存完好。
[0067] 通过使用标准细胞核染剂DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)经由落射荧光显1
微术进行的共染色实验对明显的细胞核优先标记进行了研究。合宜的是，[PtLCl]的发射谱并不与DAPI的发射谱重叠，并且可将前者激发至以488nm为中心且DAPI不进行吸收的
1
S→T吸收带，使得两种化合物在细胞中的定位能够进行独立的可视化。使用[PtLCl]对CHO或HDF细胞进行预温育，并进行固定；然后用300nM的DAPI进行染色5分钟。图4a示
1
出了通过其特征性绿色发射使[PtLCl]在CHO细胞中的定位可视化；通过其在400nm激发
1
下于460nm处的蓝色荧光使DAPI的定位(图4b)可视化。叠加的[PtLCl]和DAPI图像
1
(图4c)确认了[PtLCl]在细胞核中的优先积聚。
微术进行的共染色实验对明显的细胞核优先标记进行了研究。合宜的是，[PtLCl]的发射谱并不与DAPI的发射谱重叠，并且可将前者激发至以488nm为中心且DAPI不进行吸收的
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S→T吸收带，使得两种化合物在细胞中的定位能够进行独立的可视化。使用[PtLCl]对CHO或HDF细胞进行预温育，并进行固定；然后用300nM的DAPI进行染色5分钟。图4a示
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出了通过其特征性绿色发射使[PtLCl]在CHO细胞中的定位可视化；通过其在400nm激发
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下于460nm处的蓝色荧光使DAPI的定位(图4b)可视化。叠加的[PtLCl]和DAPI图像
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(图4c)确认了[PtLCl]在细胞核中的优先积聚。
[0068] 4.单光子激发下的活共焦稳态细胞成像
[0069] 为了进一步研究[PtL1Cl]生色团的亚细胞定位，使用以上加载条件对各细胞类型获取了15～30个正交共焦1μm z图像。图5中示出了各类型的代表性图像，再次确认了对细胞核的优先标记。鉴别出与核仁亚细胞器相对应的高强度发射的清晰区域(见下)。1
对确认出主要的核仁定位的各细胞图像的强度曲线进行了校准，并表示在[PtLCl]灰度照片(图5)旁边。近来对核仁的研究揭示了产生28S、18S和5.8S核糖体RNA的核糖体重复段DNA基因簇周围的结构组织。反过来，这些RNA可被加工和组装成核糖体。还已知的是，在细胞周期中，核仁可独立存在或成簇存在。CHO、成纤维细胞和C8161细胞的共焦图像在所研究的全部细胞的细胞核内均鉴别出簇结构(图5)。所做的共焦图像观察因而与在细
1
胞内与DNA的结合一致，而且由于核仁的异质组成，其还将表明[PtLCl]可能与RNA结合。
观察到的细胞质的弱染色并不均匀。注意到，细胞质类似结构中较亮的染色区域可能对应于线粒体，其因而也包含DNA。
对确认出主要的核仁定位的各细胞图像的强度曲线进行了校准，并表示在[PtLCl]灰度照片(图5)旁边。近来对核仁的研究揭示了产生28S、18S和5.8S核糖体RNA的核糖体重复段DNA基因簇周围的结构组织。反过来，这些RNA可被加工和组装成核糖体。还已知的是，在细胞周期中，核仁可独立存在或成簇存在。CHO、成纤维细胞和C8161细胞的共焦图像在所研究的全部细胞的细胞核内均鉴别出簇结构(图5)。所做的共焦图像观察因而与在细
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胞内与DNA的结合一致，而且由于核仁的异质组成，其还将表明[PtLCl]可能与RNA结合。
观察到的细胞质的弱染色并不均匀。注意到，细胞质类似结构中较亮的染色区域可能对应于线粒体，其因而也包含DNA。
[0070] 通过在NaCl的存在下，使用在水性磷酸盐或HEPES缓冲液中的小牛胸腺与鲑鱼精1 1
子DNA的溶液滴定来确认[PtLCl]与核酸的交互作用。在核酸的存在下[PtLCl]的发射得到了提高，络合物∶DNA碱基对的饱和比率为约1∶2.3。
子DNA的溶液滴定来确认[PtLCl]与核酸的交互作用。在核酸的存在下[PtLCl]的发射得到了提高，络合物∶DNA碱基对的饱和比率为约1∶2.3。
[0071] 鉴于在细胞质中、优先在细胞核区域中观察到[PtL1Cl]的存在，与核糖核酸结合1
也是可能的。[PtLCl]的氯被核苷碱基的N杂环供体取代这一结合机制并未被发射数据排+ +
除，因为发射源自″Pt-L″片段。应注意，水和吡啶基的加合物[PtL(H2O)] 和[PtL(py)]具有与[PtLCl]相似的谱图。
也是可能的。[PtLCl]的氯被核苷碱基的N杂环供体取代这一结合机制并未被发射数据排+ +
除，因为发射源自″Pt-L″片段。应注意，水和吡啶基的加合物[PtL(H2O)] 和[PtL(py)]具有与[PtLCl]相似的谱图。
[0072] 最后，在数小时的时间内未观察到[PtL1Cl]扩散出细胞，这也表明发光体与亚细胞结构的强结合。
[0073] 5.时间分辨成像
[0074] 由于在细胞内的高发射强度和体外长发光寿命，[PtL1Cl]成为用于微秒时间尺度的时间分辨成像的潜在优异且前所未有的备选物。
[0075] 使用脉冲长度为约0.6ns的355nm脉冲激光激发对经染色的活细胞进行寿命成像实验。用时间门控CCD相机获得时间分辨图像，这使得能够在激发脉冲后的不同时间延迟点记录一系列图像。时间门控能力的一个简单而明显的实例通过在荧光素双阴离子{Гf＝1
3.6ns}的存在下由经[PtLCl]预处理的细胞获得的低分辨率图像得到证明，所述荧光素双阴离子的发射用作短寿命背景荧光的对抗模式(challenging model)。在激光激发脉冲(图6a)后，极少图像可以立即被分辨出，因为荧光素发射淹没了图像。在激光激发脉冲后
10ns的延迟后激活相机，通过来自Pt(II)络合物的长寿命发射可使细胞可视化(图6b)。
1
这些实验清楚地表明了用[PtLCl]成像且不受自体荧光背景干扰的可能性和能力。
3.6ns}的存在下由经[PtLCl]预处理的细胞获得的低分辨率图像得到证明，所述荧光素双阴离子的发射用作短寿命背景荧光的对抗模式(challenging model)。在激光激发脉冲(图6a)后，极少图像可以立即被分辨出，因为荧光素发射淹没了图像。在激光激发脉冲后
10ns的延迟后激活相机，通过来自Pt(II)络合物的长寿命发射可使细胞可视化(图6b)。
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这些实验清楚地表明了用[PtLCl]成像且不受自体荧光背景干扰的可能性和能力。
[0076] 图7中示出了在激光脉冲后的50ns～2900ns时间段内由经[PtL1Cl]预温育的CHO细胞获得的一组代表性时间分辨图像。明显的是，甚至在激发激光脉冲后3μs时，该图像还具有足以使细胞可视化的对比度。
[0077] 可以容易地在不同细胞中、以及在同一细胞的不同区域中监测发射强度衰减的定量动力学。在各个情况中观察到的时间衰减与双指数函数拟合良好，其中主要成分的寿命1
为760ns±100ns。这与[PtLCl]于室温在空气平衡的水溶液中测得的值580ns±30ns相近。在细胞中略长的寿命可能反映出因与核酸等大分子结合而免受氧导致的扩散淬灭影响的水平，如前文所讨论，这是不具有显著的单线态氧引发的细胞毒性的原因。
为760ns±100ns。这与[PtLCl]于室温在空气平衡的水溶液中测得的值580ns±30ns相近。在细胞中略长的寿命可能反映出因与核酸等大分子结合而免受氧导致的扩散淬灭影响的水平，如前文所讨论，这是不具有显著的单线态氧引发的细胞毒性的原因。
[0078] 发射并不遵循在溶液中观察到的单指数衰减是对不同局部环境和络合物在细胞器内预期的结合模式的反映。观察到的双指数拟合可能是由环境分布引起的多指数衰减动力学的最简单近似，这与数个亚细胞结构作为可能的结合部位是一致的。这些数据突出了以下方便性：由此可在TREM中于数微秒的时间尺度生成动力学曲线。
[0079] 6.多光子激发下的活细胞成像
[0080] 除了时间分辨，本发明的另一目的在于这些明亮且耐光的Pt(II)发光体在活细胞内的多光子激发。特别是双光子激发。这使得可以利用TPE的优势，最重要的是可以利用本征高分辨率和在近IR中以低能量激发示踪剂的能力。
[0081] 7.[PtLCl]的双光子吸收截面的确定
[0082] 通过在790nm激发下监测DMF溶液中的发射强度，使用荧光素和罗丹明B作为标-50 4准来确定Pt(II)络合物的双光子吸收截面δ。获得的值4(±2)×10 cms/光子(4GM)低于荧光素的值，但无疑足以用于实际应用。通过发光强度随激光功率增加的二次方增加来确认激发过程的双光子特性。790nm下激发而测得的发射寿命与在355nm下的单光子激发观察到的发射寿命相同，从而确认了在两种情况中形成了相同的激发态。
[0083] 8.双光子激发下的高分辨率共焦成像
[0084] 使用在758nm运行的锁模Ti蓝宝石激光器在活CHO细胞中实现[PtL1Cl]的双光子激发。通过激光光斑在xy平面的光栅扫描来生成细胞的高分辨率图像(图9)。该图像清楚地确认了在上述线性共焦实验中已观察到的生色团在核仁中的优先定位。结果证实了铂络合物的TPE在活细胞中的存活率，并对细胞没有明显的短期不利影响。据信，这是使用过渡金属络合物在活细胞中双光子成像的首例实例。
[0085] 9.材料和方法通过前文所述来制备铂(II)络合物。细胞培养源和操作的细节是常用的。
[0086] 10.单光子激发和共染色下的共焦和落射荧光成像
[0087] 使用了具有20x和40x远程水浸镜片的Zeiss LSM 510共焦显微镜。用Ar离子激光器在488nm激发细胞中的[PtLCl]，通过505nm～530nm的滤镜监测反射自545nm分色镜的发射。使用Carl Zeiss Laser Scanning Systems LSM 510软件、版本3.2(CarlZeiss GmbH，德国)进行图像数据获取和分析。使用Leica-DM-IRB倒置显微镜通过以下方式进行落射荧光显微术：对于[PtLCl]在485nm使用落射荧光发光和100X油浸镜片并在520nm获取，对于经DAPI标记的细胞核在400nm发光并在460nm获取。使用荧光素作为标准(δ＝38±9.7GM)，在40μMDMF溶液中(如Xu和Webb所述)使用在790nm产生180fs脉冲的8W
532nm(Verdi，Coherent Ltd)泵浦Mira 900-F Ti蓝宝石激光器测量双光子截面。使激光聚焦在使用x40、NA 0.9显微镜物镜的倒置显微镜(Nikon TE2000U)台上。使用同一物镜，通过分色镜(660IK，Comar)收集荧光，并在快速微通道板光电倍增管(PMT)上成像。使用Becker-Hickl SPC700时间相关单光子计数模块来使来自PMT的信号与激光脉冲同步。首先确定罗丹明B和荧光素的相对吸收截面(δ)值，以确保本实验设置产生的数据与文献中先前报道的那些数据一致。上述测量中校准的常见困难会引起δ值的不确定性，其因氧和细胞内自淬灭对Φ1um的影响所需的校正值的数量而增大。
532nm(Verdi，Coherent Ltd)泵浦Mira 900-F Ti蓝宝石激光器测量双光子截面。使激光聚焦在使用x40、NA 0.9显微镜物镜的倒置显微镜(Nikon TE2000U)台上。使用同一物镜，通过分色镜(660IK，Comar)收集荧光，并在快速微通道板光电倍增管(PMT)上成像。使用Becker-Hickl SPC700时间相关单光子计数模块来使来自PMT的信号与激光脉冲同步。首先确定罗丹明B和荧光素的相对吸收截面(δ)值，以确保本实验设置产生的数据与文献中先前报道的那些数据一致。上述测量中校准的常见困难会引起δ值的不确定性，其因氧和细胞内自淬灭对Φ1um的影响所需的校正值的数量而增大。
[0088] 11.时间分辨成像实验
[0089] 具有重复频率(1kHz～20kHz)、短脉冲持续时间(0.6ns)的355nm(12mJ/脉冲)的主动Q开关纳秒AOT-YVO-20QSP/MOPANd：钒酸盐二极管泵浦微激光器在外部触发模式下运行。使用Stanford DG535脉冲延迟发生器(PDG)生成的脉冲作为激光器的触发信号。将355nm激光脉冲导入显微镜(Nikon，TE200U)的落射荧光端口，并经分色镜(410BK，Comar)反射进入x40镜头(NA 0.9)的后出光口。通过同一物镜收集来自样品的磷光，在通过PDG设置延迟并与纳秒激光器同步的亚纳秒门控增强CCD(Andor iStar)上成像。在CCD相机前方使用420GY(Comar)滤光器阻断激光。根据特定的观察模式，显微镜的三个出口端口用来将输出导向至门控CCD相机、稳态Q-Cam10-bit彩色相机或iDus CCD相机。对于门控CCD，常用的曝光时间为0.02s，积累次数为5～20。图6说明了时间门控的原理。通过在脉冲后以递增的间隔监测“时间片”(例如每100ns)，可根据检测图像的强度。
[0090] 使用Ti蓝宝石激光器和上述倒置显微镜来进行双光子激发下的成像。通过激光光斑的光栅扫描使用x，y检流计(GSI Lumonics，USA)点对点地形成图像，使用在单光子计数模式下运行的Hamamatsu PMT(R3809U)来探测荧光。
[0091] 本发明使得能够在微秒范围内成像，包括生物结构的成像，并且特别适用于时间分辨发射成像显微术(TREM)。通过证实具有亮发射性、耐光性和低细胞毒性的Pt(II)络合物可作为体外或体内培养的活细胞用成像剂，克服了实用TREM的先前的障碍。这些生色团的极高的发射量子产率和适当长的寿命使得门控发射试验和基于寿命的时间分辨成像能够在迄今为止未企及的时间尺度实现。这些较小的电中性化合物具有显著的简单性和方便性，由此其易于根据特殊目标的需要而合成和衍生。
[0092] 在5分钟的显著短的温育时间内，在所研究的全部细胞类型如CHO、HDF和黑素瘤C8161中均获得了最大发射强度，这表明不需要特定的跨膜输送机制，且该化合物可在任何1
真核细胞类型中用作标记物。[PtLCl]在长时间的强辐照下的耐光性使得能够首次在活细胞中结合过渡金属络合物使用NIR双光子激发。高分辨率双光子图像确认了Pt(II)络合
1
物在细胞核中，特别是在核仁中的优先积聚。对于[PtLCl]建议的细胞内优先目标部位是DNA，其可能扩展至RNA。
真核细胞类型中用作标记物。[PtLCl]在长时间的强辐照下的耐光性使得能够首次在活细胞中结合过渡金属络合物使用NIR双光子激发。高分辨率双光子图像确认了Pt(II)络合
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物在细胞核中，特别是在核仁中的优先积聚。对于[PtLCl]建议的细胞内优先目标部位是DNA，其可能扩展至RNA。
[0093] 本发明显示出寿命编图和双光子激发用于活细胞成像的能力，并提供了一种在复杂的生物结构内进行数百微米的非侵入成像的方法。还可以扩展到其中需要较高的荧光团耐光性的抗体结合中。
[0094] 本发明的背景技术文献
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