具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒及其制备和应用
阅读：205发布：2020-05-27
专利汇可以提供具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒及其制备和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种可见 光激发 的强 荧光 性纳米铕荧光微粒的制备及其在 生物 检测技术中的应用。首先利用 氨 基 硅 烷化 试剂 与可见光激发的三元铕配合物形成荧光前驱体，然后再与 硅酸 酯在油包 水 型微乳液中共聚，生成一种表面带有活性基团的纳米铕荧光微粒。这种纳米铕荧光微粒具有强可见激发峰， 荧光寿命 在390微秒左右， 荧光量子产率 可达66％。将其作为生物荧 光标 记物进行时间分辨荧光生物测定时可有效消除各种短寿命背景荧光的干扰，且采用可见光激发可显著提高标记物的光 稳定性 并减少对生物样品的光损伤，在时间分辨荧光免疫分析、活细胞及 生物组织 染色 以及时间分辨荧光 显微镜 成像分析等生化检测领域中有重要的应用前景。，下面是具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒及其制备和应用专利的具体信息内容。
1.具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒，其特征在于：其是由氨基硅烷化试剂与一种可见光激发的三元铕配合物于有机溶剂中发生共价键合反应，得到荧光前驱体，然后其再与硅酸酯及带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体发生共聚，形成具有可见光激发性能且可用于生物标记的功能性纳米铕荧光微粒；
其中所述的可见光激发的三元铕配合物是由三价铕离子与四齿β-二酮类配位体和
2-(4-N，N-二乙基苯胺基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪配位体形成的三元荧光配合物，两种配位体的结构式为：
式中R为＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1或CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5；
所述三价铕离子、四齿β-二酮类配位体及2-(4-N，N-二乙基苯胺基)-4，6-二(3，
5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪，它们之间的摩尔比例为1∶0.5～3∶0.5～3，并保持四齿β-二酮类配位体与氨基硅烷化试剂的摩尔比例为1∶1～4。
2.根据权利要求1所述的纳米铕荧光微粒，其特征在于：所述硅酸酯的分子式为Si(OR)4，其中的R是-CnH2n+1，n＝1～5。
3.根据权利要求1所述的纳米铕荧光微粒，其特征在于：所述氨基硅烷化试剂及带有氨基的硅烷化单体均为3-氨基丙基三烷氧基硅或N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅，带有巯基的硅烷化单体为3-巯基丙基三烷氧基硅。
4.一种权利要求1所述的纳米铕荧光微粒的制备方法，其特征在于：
具体操作过程为，
1)荧光前躯体：在有机溶剂中，先将四齿β-二酮类配位体与氨基硅烷化试剂在室温条件下搅拌0.5～4小时，使之发生共价结合反应，两者的摩尔比例为1∶1～5，体系中四
3+
齿β-二酮类配位体的摩尔浓度为1～15μmol/ml，然后再加入Eu 和2-(4-N，N-二乙基
3+
苯胺基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪继续搅拌4～24小时，保持Eu 、四齿β-二酮类配位体及2-(4-N，N-二乙基苯胺基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪的摩尔比例为1∶0.5～3∶0.5～3，蒸发溶剂并干燥得到可见光激发的荧光前躯体；
2)配制微乳液：将有机溶剂、助表面活性剂、表面活性剂和水按摩尔比为15～
25∶2～7∶1∶6～10均匀混合后制成微乳液；
3)在微乳液中加入荧光前躯体，室温条件下搅拌0.5～1小时，然后加入硅酸酯和带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体，用重量含量3-25％的氨水引发聚合，搅拌下室温反应
4～48小时，离心分离即可，从而制备出可见光激发且具有生物标记功能的荧光纳米微粒；
荧光前躯体在微乳液体系中的浓度为0.05～1mg/ml；
硅酸酯与带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体的摩尔比为1∶0.05～0.2，硅酸酯在微乳液体系中的摩尔浓度为14～45μmol/ml；
所述有机溶剂为：苯、正己烷、环己烷或石油醚；助表面活性剂为乙醇、丙醇、异丙醇、正己醇、乙二醇、正辛醇或正癸醇；表面活性剂为聚氧乙烯基辛基苯基醚或聚氧乙烯基壬基苯基醚。
5.按照权利要求4所述的纳米铕荧光微粒的制备方法，其特征在于：
步骤1)和3)中所述氨基硅烷化试剂及带有氨基的硅烷化单体均为3-氨基丙基三烷氧基硅或N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅；
步骤3)中所述带有巯基的硅烷化单体为3-巯基丙基三烷氧基硅。
6.一种权利要求1所述纳米铕荧光颗粒作为生物标记物的应用，其特征在于：所述纳米铕荧光颗粒作为纳米探针，利用时间分辨荧光测定方式进行生化测定。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于：所述时间分辨荧光测定方式是指时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法或时间分辨荧光生物芯片测定法。
具有可见光激发性能的纳米铕荧光微粒及其制备和应用
技术领域
背景技术
[0002] 稀土(铕和铽)荧光配合物具有非常特殊的荧光性质，如长的荧光寿命，大的Stokes位移和尖的发射光谱。基于这些特征，以稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光免疫测定技术近20年来已经取得了重大的进展，在医学与生命科学的实践与研究中发挥着越来越重要的作用。近年来，基于稀土荧光配合物的时间分辨荧光生物成像分析技术也成为一种有用的工具，在生物分子的可视化测定及环境病源微生物检测等方面得到了成功的应用(文献1：K.Suhling，P.M.W.French，D.Phillips，Photochem.Photobiol.Sci.2005，4，13；文献2：R.Connally，D.Veal，J.Piper，Microsc.Res.Techniq.2004，64，312)。时间分辨荧光生物分析技术的最大优点是通过在脉冲激发后引入适当的延迟时间，完全消除各种散乱光和生物样品中各种短寿命背景荧光的干扰，从而极大地提高测定灵敏度。
[0003] 由于绝大多数铕、铽配合物的荧光发光要经过分子内三线态能量传递过程，其激发窗口被限制在小于370nm的近紫外区域(文献3：F.J.Steemers，W.Verboom，D.N.Reinhoudt，E.B.V.D.Tol，J.W.Verhoeven，J.Am.Chem.Soc.1995，117，9408)，这种高能量的短波长激发光不但对生物样品具有一定的损伤作用，对标记物本身的光稳定性也有显著影响。因此，开发一种可见光激发的稀土荧光探针意义重大。目前已有几个研究小组开发出了几种长波长激发的铕配合物(文献4：Y.Bretonnière，M.J.Cann，D.Parker，R.Slater，Chem.Commun.2002，1930； 文 献 5：J.H.Yu，D.Parker，R.Pal，R.A.Poole，M.J.Cann，J.Am.Chem.Soc.2006，128，2294；文献6：R.Pal，D.Parker，Chem.Commun.2007，474；文献7：M.H.V.Werts，M.A.Duin，J.W.Hofstraat，J.W.Verhoeven，Chem.Commun.1999，
799；文献8：C.Yang，L.M.Fu，Y.Wang，J.P.Zhang，W.T.Wong，X.C.Ai，Y.F.Qiao，B.S.Zou，L.L.Gui，Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，5010；文献9：S.M.Borisov，O.S.Wolfbeis，Anal.Chem.2006，78，5094)，但是由于这些配合物存在着水不溶性、极性溶剂中不稳定或量子产率低等缺陷限制了其在生物标记中的应用。
799；文献8：C.Yang，L.M.Fu，Y.Wang，J.P.Zhang，W.T.Wong，X.C.Ai，Y.F.Qiao，B.S.Zou，L.L.Gui，Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，5010；文献9：S.M.Borisov，O.S.Wolfbeis，Anal.Chem.2006，78，5094)，但是由于这些配合物存在着水不溶性、极性溶剂中不稳定或量子产率低等缺陷限制了其在生物标记中的应用。
[0004] 稀土荧光配合物直接作为标记物使用的另外一个缺点是抗光漂白能力差，这也是所有分子标记物的共同缺陷。随着纳米生物分析技术的发展，各种功能性纳米荧光材料相继出现，并广泛应用在生物大分子的单分子原位检测、荧光显微镜检测等生物测定技术领域。纳米荧光生物探针由于可包覆大量的荧光分子使其荧光信号得到放大，显著提高测定的灵敏度，并且在外层包覆基质的保护下荧光分子的光稳定性也可显著增强。目前已经开发出的纳米荧光生物探针主要有：(1)半导体纳米晶(又称量子点)；(2)内包荧光分子的复合纳米荧光颗粒(一类是高分子塑料基质纳米荧光颗粒，另一类是内包各种荧光物质的纳米硅胶颗粒)(文献10：W.H.Liu，M.Howarth，A.B.Greytak，Y.Zheng，Nocera，D.G.A.Y.Ting，M.G.Bawendi，J.Am.Chem.Soc.2008，130，1274；文献11：X.J.Zhao，L.R.Hilliard，S.J.Mechery，Y.P.Wang，R.P.Bagwe，S.G.Jin，W.H.Tan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004，101，15027)，但这些荧光微粒用于生物测定时仍存在着发光闪烁、标记过程复杂、荧光分子易泄漏以及严重的背景荧光干扰等问题。
[0005] 最近，几种基于铕、铽配合物的复合纳米荧光微粒已被开发出来并被用于高灵敏度时间分辨荧光免疫分析及成像检测(文献12：Y.Xu，Q.G.Li，Clin.Chem.2007，53，1503；文献13：P.Huhtinen，M. O.Kuronen，V.Hagren，H.Takalo，H.Tenhu，T.
，H. ，Anal.Chem.2005，77，2643；文献14：袁景利，谭明乾，叶志强，王桂兰，一种功能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用，中国发明专利，专利号：ZL02144517.6；文献15：
袁景利，谭明乾，海晓丹，王桂兰，β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应用，中国发明专利，专利号：ZL03133857.7；文献16：J.Wu，G.L.Wang，D.Y.Jin，J.L.Yuan，Y.F.Guan，J.Piper，Chem.Commun.2008，365)，然而，这些纳米稀土荧光微粒仍无法避免使用高能量的紫外激发光源，因此在一些应用领域受到限制。
，H. ，Anal.Chem.2005，77，2643；文献14：袁景利，谭明乾，叶志强，王桂兰，一种功能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用，中国发明专利，专利号：ZL02144517.6；文献15：
袁景利，谭明乾，海晓丹，王桂兰，β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应用，中国发明专利，专利号：ZL03133857.7；文献16：J.Wu，G.L.Wang，D.Y.Jin，J.L.Yuan，Y.F.Guan，J.Piper，Chem.Commun.2008，365)，然而，这些纳米稀土荧光微粒仍无法避免使用高能量的紫外激发光源，因此在一些应用领域受到限制。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种具有可见光激发性能且可用于生物标记的强荧光性纳米铕荧光微粒，并将其作为荧光标记物用于时间分辨荧光免疫测定及复杂环境样品中病源微生物的时间分辨荧光显微成像测定。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 首先将四齿β-二酮类配位体和氨基硅烷化试剂发生共价结合反应，再与EuCl3和2-(4-N，N-二乙基苯胺基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪(DPBT)反应制成可见光激发的荧光前躯体，然后将该前躯体与硅酸酯和带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体用氨水引发共聚合，从而制备出具有强可见激发和生物标记功能的纳米铕荧光微粒。所用四齿β-二酮类配位体及DPBT的结构式如下：
[0009]
[0010] 其中R为＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5(R为—C3F7时配位体缩写为BHHCT)；
[0011] 所述三价铕离子、四齿β-二酮类配位体及2-(4-N，N-二乙基苯胺基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪，它们之间的摩尔比例为1：0.5～3：0.5～3，并保持四齿β-二酮类配位体与氨基硅烷化试剂的摩尔比例为1：1～4；
[0012] 所述硅酸酯的分子式为Si(OR)4，其中的R是—CnH2n+1，n＝1～5。
[0014] 可见光激发纳米铕荧光微粒的具体制备过程为：
[0015] 1)荧光前躯体：在有机溶剂中，先将四齿β-二酮类配位体与氨基硅烷化试剂在室温条件下搅拌0.5～4小时，使之发生共价结合反应，两者的摩尔比例为1：1～4，体系中3+
四齿β-二酮类配位体的摩尔浓度为1～15μmol/ml，然后再加入Eu 和2-(4-N，N-二乙
3+
基苯胺基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪继续搅拌4-24小时，保持Eu 、四齿β-二酮类配位体及2-(4-N，N-二乙基苯胺基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪的摩尔比例为1：0.5～3：0.5～3，蒸发溶剂并干燥得到可见光激发的荧光前躯体；
四齿β-二酮类配位体的摩尔浓度为1～15μmol/ml，然后再加入Eu 和2-(4-N，N-二乙
3+
基苯胺基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪继续搅拌4-24小时，保持Eu 、四齿β-二酮类配位体及2-(4-N，N-二乙基苯胺基)-4，6-二(3，5-二甲基吡唑基)-1，3，5-三嗪的摩尔比例为1：0.5～3：0.5～3，蒸发溶剂并干燥得到可见光激发的荧光前躯体；
[0016] 2)配制微乳液：将有机溶剂、助表面活性剂、表面活性剂和水按摩尔比为15～25:2～7:1:6～10均匀混合后制成微乳液；
[0017] 3)在微乳液中加入荧光前躯体，室温条件下搅拌0.5～1小时，然后加入硅酸酯和带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体，用重量含量3-25％的氨水引发聚合，搅拌下室温反应4～48小时，离心分离即可。
[0018] 荧光前躯体在微乳液体系中的浓度为0.05～1mg/ml；
[0019] 硅酸酯与带有活性基团氨基或巯基的硅烷化单体的摩尔比为1:0.05～0.2，硅酸酯在微乳液体系中的摩尔浓度为14～45μmol/ml。
[0020] 所述有机溶剂为：苯、正己烷、环己烷或石油醚；助表面活性剂为乙醇、丙醇、异丙醇、正己醇、乙二醇、正辛醇或正癸醇；表面活性剂为聚氧乙烯基辛基苯基醚或聚氧乙烯基壬基苯基醚。
[0021] 总之，本发明以可见光激发强荧光性三元铕配合物为发光物质，采用共价键合的方法将稀土荧光配合物牢固地固定在硅胶的网络体系中，通过反相微乳液共聚合成粒技术制备而成，并且纳米微粒表面同时引入可与生物分子共价键结合的活性官能团。
[0022] 本发明的可见光激发纳米铕荧光微粒可作为标记物用于各种时间分辨荧光生物分析法，包括时间分辨荧光免疫分析法，时间分辨荧光DNA杂交分析法，时间分辨荧光显微镜成像分析法及时间分辨荧光生物芯片分析法。
[0023] 本发明的纳米铕荧光微粒作为标记物具有如下优点：
[0024] (1)实现了具有可见激发峰的长荧光寿命生物标记物。在水溶液中，本发明的纳米铕荧光微粒在可见光区仍有强激发峰，其激发光谱可延伸到450nm以上的蓝光区。
[0025] (2)显著提高了纳米荧光生物探针的荧光发光强度。本发明采用的新型三元铕配合物前驱体本身具有很强的荧光发光强度，采用该前驱体与硅酸酯共聚合的方法使得单个纳米颗粒中固定有大量的铕配合物，极大地提高了纳米荧光微粒的荧光发光强度。
[0026] (3)光稳定性增强。相对于绝大多数紫外光激发的稀土荧光化合物而言，低能量的可见光激发使纳米铕荧光颗粒的抗光漂白能力显著提高，可延长标记物的连续测定时间，同时，外层二氧化硅基质可以有效屏蔽周围溶剂和活性自由基，进一步保护内部的铕配合物。
[0027] (4)本发明建立了基于可见光激发纳米铕荧光标记物的高灵敏度病源微生物的时间分辨荧光显微成像分析新方法。该方法不仅可完全消除复杂环境样品中各种短寿命背景荧光对测定的干扰，使得测定的特异性及灵敏度得以极大地提高，而且由于可见光激发的时间分辨荧光测定可避免激发光对生物样品的损伤，预示了新方法在活细胞及生物组织时间分辨荧光显微成像测定领域也应具有很好的应用前景。附图说明
[0028] 图1是可见光激发纳米铕荧光颗粒的透射电子显微镜照片。a，b，c，d，e分别为加入不同量(2，4，6，8，10毫克)荧光前驱体时得到的纳米铕荧光颗粒。
[0029] 图2是荧光前驱体APS-BHHCT-Eu3+-DPBT在不同溶剂中的时间分辨荧光激发光谱。a，N，N-二甲基甲酰胺；b，四氢呋喃；c，乙醇；d，丙酮；e，正庚烷；f，甲苯；g，氯仿；h，二氯甲烷。
[0030] 图3是可见光激发纳米铕荧光颗粒在pH值7.8的Tris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧光光谱。
[0031] 图4是可见光激发纳米铕荧光颗粒(A)和纯硅胶纳米微粒(B)的紫外-可见吸收光谱。
[0032] 图5是可见光激发纳米铕荧光颗粒(A)和罗丹明B(B)的光稳定性实验结果。
[0033] 图6是用可见光激发纳米铕荧光颗粒标记链霉亲合素时间分辨荧光免疫测定人血清中的前列腺特异抗原(PSA)的工作曲线。
[0034] 图7是用可见光激发纳米铕荧光颗粒标记链霉亲合素时间分辨荧光显微成像测定环境水样品中病源微生物蓝氏贾第鞭毛虫的成像图片。(a)明场成像；(b)330-380nm激发常规荧光成像；(c)380-420nm激发常规荧光成像；(d)330-380nm激发时间分辨荧光成像；(e)380-420nm激发时间分辨荧光成像。
[0035] 图8.用可见光激发纳米铕荧光颗粒标记链霉亲合素时间分辨荧光显微成像测定环境水中蓝氏贾第鞭毛虫对照实验的显微镜成像图片。(a)明场成像；(b)330-380nm激发常规荧光成像；(c)380-420nm激发常规荧光成像；(d)330-380nm激发时间分辨荧光成像。
[0036] 图9是可见光激发纳米铕荧光颗粒特异性识别蓝氏贾第鞭毛虫后在显微镜下的光稳定性实验测定结果。(A)在汞灯330-380nm波段强光下照射5分钟的时间分辨荧光图片(330-380nm氙灯激发)；(B)在汞灯380-420nm波段强光下照射5分钟的时间分辨荧光图片(380-420nm氙灯激发)。
具体实施方式
[0037] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例仅用于对本发明进行说明，基于相同原理和类似原料的方法也属本发明的范围。
[0038] 实施例1：可见光激发纳米铕荧光颗粒的制备及表征
[0039] (1)荧光前驱体APS-BHHCT-Eu3+-DPBT的制备
[0040] 将25μmol BHHCT溶于4mL无水四氢呋喃中，搅拌下加入62.5μmol氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，室温搅拌3小时，然后加入15mL溶有50μmolDPBT的无水四氢呋喃溶液，稍加搅拌后加入25μmol EuCl3·6H2O，搅拌24小时，用旋转蒸发仪将溶剂蒸干并真空干燥3+
即得荧光前驱体APS-BHHCT-Eu -DPBT。
即得荧光前驱体APS-BHHCT-Eu -DPBT。
[0041] (2)可见光激发纳米铕荧光生物探针的制备
[0042] 将上述荧光前驱体APS-BHHCT-Eu3+-DPBT(2毫克，4毫克，6毫克，8毫克和10毫克)溶于1.5mL甲苯中，分别加入到含有7.25克环己烷、2.37克Triton X-100、1.82克正辛醇和0.55mL水的反相微乳液中，室温搅拌15分钟，然后加入100μL正硅酸乙酯(TEOS)和5μLAPS，再加入100μL氨水引发聚合。反应液室温反应24小时后，加入乙醇将固体纳米微粒沉淀出来，离心后用乙醇和水洗，以除去未反应的原料和表面活性剂。
[0043] (3)纳米铕荧光微粒的形态及大小尺寸表征
[0044] 图1是可见光激发纳米铕荧光颗粒的透射电子显微镜照片，从图可见当前驱体加入量为2-8毫克时，纳米荧光颗粒呈均匀的圆球形，粒径均小于50nm，且单分散性好。继续增大前驱体加入量到10毫克，则纳米荧光颗粒表面变得粗糙并出现聚集。此外，粒径的大小可以通过调整前驱体的量、水与表面活性剂的比例、助表面活性剂的种类、氨水的浓度、硅酸酯(如TEOS)的量以及反应时间等来进行控制。
[0045] (4)荧光前驱体APS-BHHCT-Eu3+-DPBT的荧光光谱特性
[0046] 图2是荧光前驱体APS-BHHCT-Eu3+-DPBT在不同有机溶剂中的时间分辨荧光激发光谱。从图中可见在极性小的非配位型溶剂中(如甲苯、氯仿、正庚烷和二氯甲烷等)，前驱体在406nm处的可见激发峰非常强，而在强极性配位型溶剂中(如N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙醇和丙酮等)，可见激发峰严重减弱甚至消失，可见溶剂性质对荧光前驱体3+
APS-BHHCT-Eu -DPBT的荧光激发性质有很大的影响。
APS-BHHCT-Eu -DPBT的荧光激发性质有很大的影响。
[0047] (5)纳米铕荧光颗粒的荧光光谱特性
[0048] 图3是纳米铕荧光颗粒在pH值7.8的Tris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧光光谱。从图中可见纳米颗粒在缓冲溶液中仍然具有很强的406nm可见激发峰，说明该制备方法得到的纳米铕荧光颗粒在很大程度上保留了荧光前驱体的可见光激发特性。此外，该方法制得的纳米荧光颗粒的荧光寿命经测定为0.39毫秒，说明纳米荧光微粒的荧光仍然保持了铕配合物的长荧光寿命特征。
[0049] (6)纳米铕荧光颗粒和纯硅胶纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱
[0050] 如图4，与纯硅胶纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱图相比，纳米铕荧光颗粒出现了几个明显的吸收峰，包括在以416nm为中心的可见光区的宽吸收峰，说明荧光前驱体已被有效地结合到了硅胶基质当中。
[0051] (7)纳米铕荧光颗粒的光稳定性实验
[0052] 纳米铕荧光颗粒的光稳定性实验结果如图5所示，所用光源为30W氘灯。在氘灯发出的强光照射60分钟后，有机荧光化合物罗丹明B的荧光强度衰减到起始时的32％，而纳米铕荧光颗粒的荧光强度仅衰减到起始时的70％，说明制成的纳米铕荧光颗粒具有远优于有机荧光化合物的光稳定性。
[0053] 实施例2：纳米铕荧光颗粒作为标记物用于时间分辨荧光免疫测定人前列腺特异抗原(简称PSA)
[0054] (1)纳米铕荧光微粒标记链霉亲和素(简称SA)
[0055] 将1.0毫克纳米铕荧光颗粒和3.0毫克牛血清白蛋白(BSA)用pH值7.1的-1
0.1mol·L 磷酸缓冲溶液1.2mL完全溶解后，搅拌下加入0.3mL的1％戊二醛水溶液，室温搅拌24小时。将纳米颗粒离心收集并用磷酸缓冲溶液充分洗涤后，加入0.9mL含有0.2毫克SA的磷酸缓冲溶液和0.2mL的1％戊二醛水溶液，4℃搅拌22小时，加入2.0毫克硼氢化钠继续反应2小时。表面标有SA分子的纳米颗粒经离心、磷酸缓冲溶液充分洗涤后，以-1
pH值8.0的0.05mol·L 碳酸氢铵水溶液为洗脱液，用1.0×29.1cm的SephadexG-50柱进一步纯化，得到2.6mL纳米颗粒标记的SA溶液。加入5.2毫克的BSA和2.6毫克的叠氮化钠，4℃保存备用。当用于免疫测定时，用含有0.2％BSA-0.1％NaN3-0.9％NaCl的pH值-1
7.8的0.05mol·L Tris-HCl缓冲溶液稀释。
0.1mol·L 磷酸缓冲溶液1.2mL完全溶解后，搅拌下加入0.3mL的1％戊二醛水溶液，室温搅拌24小时。将纳米颗粒离心收集并用磷酸缓冲溶液充分洗涤后，加入0.9mL含有0.2毫克SA的磷酸缓冲溶液和0.2mL的1％戊二醛水溶液，4℃搅拌22小时，加入2.0毫克硼氢化钠继续反应2小时。表面标有SA分子的纳米颗粒经离心、磷酸缓冲溶液充分洗涤后，以-1
pH值8.0的0.05mol·L 碳酸氢铵水溶液为洗脱液，用1.0×29.1cm的SephadexG-50柱进一步纯化，得到2.6mL纳米颗粒标记的SA溶液。加入5.2毫克的BSA和2.6毫克的叠氮化钠，4℃保存备用。当用于免疫测定时，用含有0.2％BSA-0.1％NaN3-0.9％NaCl的pH值-1
7.8的0.05mol·L Tris-HCl缓冲溶液稀释。
[0056] (2)生物素标记山羊抗人PSA抗体的制备
[0057] 1.0mL的山羊抗人PSA抗体(0.5mg·mL-1)在4℃、24小时对3L水两次透析后，加入8.4毫克的碳酸氢钠和3毫克的NHS-LC-biotin，室温搅拌1小时后，4℃下24小时放置。反应液在4℃、24小时对3L含有0.25克叠氮化钠的0.1mol/L碳酸氢钠水溶液两次透析后加入5毫克的BSA和5毫克的叠氮化钠，放置-20℃备用。当用于免疫测定时，用缓冲溶液
1稀释300倍后使用。
1稀释300倍后使用。
[0058] (3)时间分辨荧光免疫测定人PSA
[0059] (a)96微孔板的包被：在96微孔板的各孔中分别加入50μL含有10μg·mL-1小-1鼠抗人PSA单克隆抗体的pH值9.6的0.1mol·L 碳酸氢钠缓冲溶液，4℃、24小时包被后，-1
用含有0.05％Tween20的pH值为7.8的0.05mol·L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液1)洗-1
两次，再用pH值为7.8的0.05mol·L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液2)洗1次，包被后的微孔板-20℃下保存。
用含有0.05％Tween20的pH值为7.8的0.05mol·L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液1)洗-1
两次，再用pH值为7.8的0.05mol·L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液2)洗1次，包被后的微孔板-20℃下保存。
[0060] (b)人PSA的免疫测定：将PSA抗原标准溶液用含有5％BSA-0.9％NaCl-0.1％-1NaN3的pH值为7.8的0.05mol·L Tris-HCl缓冲溶液稀释到一定浓度，取标准溶液45μL注入上述包被后的微孔板的各孔中，37℃、1小时反应后，用上述缓冲溶液1洗两次，缓冲溶液2洗一次。将45μL生物素标记的抗PSA抗体溶液加入到各微孔中，37℃、1小时反应后，用上述缓冲溶液1洗两次，缓冲溶液2洗一次。将45μL纳米粒子标记的SA溶液加入到各微孔中，37℃、1小时反应后，用缓冲溶液1洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。测定用仪器为Perkin Elmer Victor1420多标记计数仪，测定条件为：激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。
[0061] 用该法测定人PSA的工作曲线如图6所示，本法的最低检出下限为29.8pg/mL(计算方法：d1＝(3SD×C)/(I-I0)，SD是本底信号的标准偏差，C是最低测定液浓度，I是其对应的荧光强度，I0是本底信号的荧光强度)，工作曲线上限可达50ng/mL。
[0062] 实施例3：纳米铕荧光颗粒作为标记物用于时间分辨荧光显微镜成像测定复杂环境样品中的病源微生物-蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)
[0063] (1)复杂环境样品中蓝氏贾第鞭毛虫的时间分辨荧光显微镜成像测定取5μL蓝6
氏贾第鞭毛虫(2×10 个/mL)加入到15μL含有大量各种杂质的10000倍浓缩环境水样品中，然后依次加入16μL抗蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体(50μg/mL)，16μL生物素标记的兔抗鼠二次抗体(50μg/mL，制备方法同生物素标记山羊抗人PSA抗体)和6μL纳米荧光颗粒标记的SA溶液，室温孵育24小时，低速离心(500转/分)收集蓝氏贾第鞭毛虫并重新分散在水中，反复几次除去未反应的纳米微粒和抗体。将纳米微粒免疫染色后的蓝氏贾第鞭毛虫用环境水稀释，然后取少量置于载波片上进行显微镜成像测定。
氏贾第鞭毛虫(2×10 个/mL)加入到15μL含有大量各种杂质的10000倍浓缩环境水样品中，然后依次加入16μL抗蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体(50μg/mL)，16μL生物素标记的兔抗鼠二次抗体(50μg/mL，制备方法同生物素标记山羊抗人PSA抗体)和6μL纳米荧光颗粒标记的SA溶液，室温孵育24小时，低速离心(500转/分)收集蓝氏贾第鞭毛虫并重新分散在水中，反复几次除去未反应的纳米微粒和抗体。将纳米微粒免疫染色后的蓝氏贾第鞭毛虫用环境水稀释，然后取少量置于载波片上进行显微镜成像测定。
[0064] 图7是环境水中蓝氏贾第鞭毛虫的显微镜成像测定结果。由图可见，分别用330-380nm及380-420nm的激发光测得的常规荧光成像图片中存在着非常强的样品中共存杂质的背景荧光干扰，而采用时间分辨荧光成像模式测得的图片中杂质的背景荧光被完全消除，只可观察到被纳米颗粒特异性染色的蓝氏贾第鞭毛虫的红色信号，说明时间分辨荧光成像模式具有极高的选择性及灵敏度。此外，对比两个激发波段(330-380nm和
380-420nm)的荧光成像图片可以看出，紫光(380-420nm)激发下的荧光信号强度仅仅稍弱于紫外光(330-380nm)激发下的荧光信号强度，足以满足时间分辨荧光显微成像测定的需要。
380-420nm)的荧光成像图片可以看出，紫光(380-420nm)激发下的荧光信号强度仅仅稍弱于紫外光(330-380nm)激发下的荧光信号强度，足以满足时间分辨荧光显微成像测定的需要。
[0065] (2)免疫染色及成像测定的特异性-对照实验
[0066] 在5μL蓝氏贾第鞭毛虫(2×106个/mL)中加入16μL生物素标记的兔抗鼠二次抗体(50μg/mL)和6μL纳米荧光探针标记的SA溶液，室温孵育24小时，低速离心(500转/分)收集蓝氏贾第鞭毛虫并重新分散在水中，反复几次除去未反应的纳米微粒和抗体，最后用二次水稀释，取少量置于载波片上进行显微镜成像测定。
[0067] 图8是该反应条件下蓝氏贾第鞭毛虫的显微镜成像测定结果。由图可见在不加入抗蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体的情况下，蓝氏贾第鞭毛虫表面没有纳米微粒的红色荧光，说明该条件下纳米荧光颗粒不会非特异性地吸附在蓝氏贾第鞭毛虫的表面而产生假阳性的结果。
[0068] (3)蓝氏贾第鞭毛虫表面的纳米铕荧光标记物的光稳定性
[0069] 将纳米铕荧光颗粒特异性免疫染色的蓝氏贾第鞭毛虫用显微镜装备的100W汞灯的330-380nm和380-420nm波段光分别照射5分钟，每隔一分钟采集一次时间分辨荧光成像图片，观察蓝氏贾第鞭毛虫表面的纳米铕荧光标记物的光稳定性。
[0070] 图9给出了该条件下的实验结果。由图可见，在高能量的330-380nm光照射下，蓝氏贾第鞭毛虫表面的纳米铕荧光标记物的红色荧光漂白速度很快，到5分钟时已基本完全消失，而在低能量的330-380nm光照射下，纳米铕荧光标记物的红色荧光漂白速度明显变慢，5分钟后红色荧光信号仍然清晰可见。此结果有力地证明了可见光激发能够显著减弱标记物的光漂白速度，从而延长样品的可连续测定时间，这种优点在某些需要长时间连续示踪测定的研究中应具有很好的应用价值。
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