技术领域
[0001] 本
发明涉及共聚焦
显微镜技术领域，尤其涉及一种低荧
光漂白共聚焦成像方法及系统。
背景技术
[0002] 荧光漂白三大因素为荧光分子、化学环境、光剂量，降漂白技术也主要从这三方面入手，使用特殊
荧光染料如
量子点，或改变荧光分子化学环境如添加抗
漂白剂这两类方法不适用于普通
生物样本，而改进成像技术来减少光剂量的方法更适用于普通生物样本。
[0003] 目前共聚焦显微成像都采用高数值孔径物镜进行聚焦成像，形成的高功率
密度聚焦光斑容易导致样本荧光漂白。为了避免荧光漂白，可以简单地降低光功率密度，或减少光照时间来降低光剂量，缓解荧光漂白的问题，但这样会降低有效荧光
信号，导致图像丢失细节，
信噪比降低。
发明内容
[0004] 有鉴如此，有必要针对
现有技术存在的
缺陷，提供一种适用于低荧光漂白共聚焦成像方法及成像系统，旨在提供一种既能控制光剂量减少光漂白、又不影响图像
质量的成像技术。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0006] 一种低荧光漂白共聚焦成像方法，包括下述步骤：
[0007] 选取一共聚焦图像作为参考图像，并根据所述参考图像的
像素值设定
阈值；
[0008] 根据实时荧光强度反馈与所述阈值比较结果判断像素内荧光分子密集程度，并根据像素内荧光分子密集程度控制像素的光照时间，所述反馈指某像素扫描过程中某时刻读取的像素值；及获取低荧光漂白共聚焦成像图像。
[0009] 在一些较佳的
实施例中，选取一共聚焦图像作为参考图像，并根据所述参考图像的像素值设定阈值，包括下述步骤：
[0010] 将所述参考图像中
[0011] 将所述参考图像中其中：
[0012] 所述决策时间为第一次读取反馈的时间，所述像素驻留时间为光斑中心停留在单个物方像素的时间，所述反馈指某像素扫描过程中某时刻读取的像素值称为
采样像素值。
[0013] 在一些较佳的实施例中，根据所述阈值判断像素内荧光分子密集程度，并根据像素内荧光分子密集程度控制像素的光照时间，包括下述步骤：
[0014] 从所述决策时间开始读取反馈作判断，若反馈低于所述低阈值，关闭像素的光照时间；若反馈高于所述高阈值，关闭像素的光照时间。
[0015] 另外，本发明还提供了一种低荧光漂白共聚焦成像系统，包括：共聚焦成像模
块、
电子控
制模块以及上位机模块，所述共聚焦成像模块包括
激光器、光强调节部件、高速光
开关、二色镜、反射镜、中继透镜、筒镜、物镜、位移台、探测器、针孔及探测透镜；所述电子
控制模块电性连接所述高速光开关，所述上位机模块电性连接所述电子控制模块；其中：
[0016] 所述共聚焦成像模块用于形成参考图像，所述上位机模块根据所述参考图像的像素值设定阈值，所述电子控制模块获取荧光强度反馈数值与所述阈值比较，最后根据比较结果控制所述高速光开关的开启及闭合实现对像素的光照时间的控制，所述反馈指某像素扫描过程中某时刻读取的像素值。
[0017] 在一些较佳的实施例中，所述电子控制模块由中央控制单元和光开关控制单元组成，所述中央控制单元用于电性连接所述上位机模块，所述光开关控制单元电性连接于所述高速光开关，所述中央控制单元通过以太网与所述上位机模块进行实时通讯，用于接收、解析上位机发送的任务指令以及将
硬件状态反馈给所述上位机模块，所述光开关控制单元用于根据所述中央控制单元的指令，输出控制
波形所述高速光开关的开启，实现对光路中像素的光照时间的控制。
[0018] 在一些较佳的实施例中，所述中央控制单元还电性连接所述探测器及位移台。
[0019] 本发明采用上述技术方案的优点是：
[0020] 本发明提供的低荧光漂白共聚焦成像方法及系统，首先选取一共聚焦图像作为参考图像，并根据所述参考图像的像素值设定阈值，再根据实时荧光强度反馈与所述阈值判断像素内荧光分子密集程度，并根据像素内荧光分子密集程度控制像素的光照时间，最后获取低荧光漂白共聚焦成像图像，本发明提供的低荧光漂白共聚焦成像方法及系统，控制每个物方像素的光照时间，以更高效地利用荧光信息，在不牺牲图像质量的情况下降低了荧光漂白，可适用于多种生物样本。
附图说明
[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0022] 图1为本发明实施例1提供的低荧光漂白共聚焦成像方法的步骤
流程图。
[0023] 图2(a)为本发明实施例1提供的荧光分子极稀疏的反馈判断过程示意图。
[0024] 图2(b)为本发明实施例1提供的荧光分子高密度的反馈判断过程示意图。
[0025] 图2(c)为本发明实施例1提供的荧光分子密度适中的反馈判断过程示意图。
[0026] 图3为本发明实施例1提供的高阈值判断过程分段示意图。
[0027] 图4(a)为本发明实施例1提供的像素光照时间分布图。
[0028] 图4(b)为本发明实施例1提供的采样像素值分布图。
[0029] 图4(c)为本发明实施例1提供的CLE-CM恢复图像。
[0030] 图5为本发明实施例2提供的低荧光漂白共聚焦成像系统的结构示意图。
[0031] 图6为本发明实施例2提供的电子控制模块的工作原理示意图。
具体实施方式
[0032] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033] 实施例1
[0034] 请参阅图1，为本发明实施例1提供的低荧光漂白共聚焦成像方法10的步骤流程图，包括下述步骤：
[0035] 步骤S110：选取一共聚焦图像作为参考图像，并根据所述参考图像的像素值设定阈值。
[0036] 可以理解，在低荧光漂白共聚焦成像方法(Controllable Light Exposure-Confocal Microscopy,CLE-CM)成像前取一张标准共聚焦图像，作为参考图像，并对该参考图像进行阈值设定。
[0037] 在一些较佳的实施例中，上述步骤S110，具体包括下述步骤：
[0038] 步骤S111：将所述参考图像中
[0039] 步骤S112：将所述参考图像中
[0040] 步骤S120：根据实时荧光强度反馈与所述阈值比较结果判断像素内荧光分子密集程度，并根据像素内荧光分子密集程度控制像素的光照时间。
[0041] 在本实施例中，反馈指某像素扫描过程中某时刻读取的像素值I称为采样像素值，第一次读取反馈的时间Td称为决策时间，光斑中心停留在单个物方像素的时间Tp称为像素驻留时间，CLE-CM激光实际开启的时间Te称为像素实际光照时间，与Te对应的Ie称为实际像素值。
[0042] 在一些较佳的实施例中，步骤S120具体包括下述步骤：
[0043] 步骤S121：从所述决策时间开始读取反馈作判断，若反馈低于所述低阈值，关闭像素的光照时间。
[0044] 可以理解，每个像素扫描过程前一小段时间保持光照，从决策时间开始读取反馈作判断，若反馈未达到低阈值，说明像素内荧光分子极稀疏，无法提供荧光信息，立刻关闭激光，即关闭像素的光照时间，如图2(a)所示，表示为荧光分子极稀疏的反馈判断过程示意图。
[0045] 步骤S122：若反馈高于所述高阈值，关闭像素的光照时间。
[0046] 可以理解，若反馈达到高阈值，说明像素内荧光分子很密集，已获得足够荧光信息，立刻关闭激光，关闭像素的光照时间，如图2(b)所示，表示为荧光分子高密度的反馈判断过程示意图；若像素驻留时间结束采样像素值仍未达到高阈值，说明该像素内荧光分子密度适中，光剂量并未过剩，如图2(c)所示，表示为荧光分子密度适中的反馈判断过程示意图。
[0047] 进一步地，反馈判断的理想情况是实时监测反馈，且在其恰好达到高阈值的时刻关闭激光，但实际上这种实时监测很难实现，所以采用近似方法，将像素驻留时间分成如图3所示的N段，在每段时间末尾读取反馈，像素实际光照时间
δT为相邻判断的时间间隔。理论
上，N越大，k取值范围越大，像素光照时间变化越细微。
[0048] 步骤S130：获取低荧光漂白共聚焦成像图像。
[0049] 可以理解，CLE-CM中一幅图像扫描结束得到两组数据，一组是各像素实际光照时间，如图4(a)所示；另一组是各像素实际像素值，如图4(b)所示。
[0050] 由于激光强度恒定，假定荧光未饱和，荧光强度不变，像素值等于荧光强度与像素驻留时间T_p内光照时间的乘积，根据两者线性关系可以恢复出CLE-CM图像如图4(c)所示。
[0051] 本发明实施例1提供的低荧光漂白共聚焦成像方法，首先选取一共聚焦图像作为参考图像，并根据所述参考图像的像素值设定阈值，再根据实时荧光强度反馈与所述阈值比较结果判断像素内荧光分子密集程度，并根据像素内荧光分子密集程度控制像素的光照时间，最后获取低荧光漂白共聚焦成像图像，上述方法，可控制每个物方像素的光照时间，以更高效地利用荧光信息，在不牺牲图像质量的情况下降低了荧光漂白，可适用于多种生物样本。
[0052] 实施例2
[0053] 请参阅图5，为本发明实施例2提供的低荧光漂白共聚焦成像系统20的结构示意图，包括：共聚焦成像模块210、电子控制模块220以及上位机模块230。所述共聚焦成像模块210包括激光器211、光强调节部件212、高速光开关213、二色镜214、反射镜215、中继透镜
216、筒镜217、物镜218、位移台219、探测器2110、针孔2111及探测透镜2112。所述电子控制模块220电性连接所述高速光开关213。所述上位机模块230电性连接所述电子控制模块
220。
[0054] 可以理解，通过所述共聚焦成像模块210可以获取共聚焦图像并作为参考图像；所述上位机模块230根据所述参考图像的像素值设定阈值，并根据所述阈值判断像素内荧光分子密集程度，所述上位机模块230还用于根据荧光分子密集程度控制所述电子控制模块工作，所述电子控制模块220控制所述高速光开关213的开启及闭合实现对像素的光照时间的控制。
[0055] 请参阅图6，所述电子控制模块220由中央控制单元221和光开关控制单元222组成。所述中央控制单元221用于电性连接所述上位机模块230。所述光开关控制单元222电性连接于所述高速光开关213。其中：
[0056] 中央控制单元221由ARM、FPGA控制板组成，中央控制单元221通过以太网与上位机模块230进行实时通讯，用以接收、解析通过上位机模块230发送的任务指令；同时，中央控制单元221可将硬件状态反馈给上位机模块230，实现各个硬件控制单元的有效控制。
[0057] 光开光控制单元222负责接收中央控制单元221的反馈，并与阈值比较并根据判断结果输出控制波形，所述控制波形控制高速光开关213开启与关闭，从而实现对光路中激光的开关控制。
[0058] 在一些较佳的实施例中，所述中央控制单元221还电性连接所述探测器2110及位移台219，通过所述中央控制单元221可以实现对探测器2110与位移台219扫描的同步控制，实现可控光剂量的共聚焦成像。
[0059] 本发明提供的低荧光漂白共聚焦成像系统，包括：共聚焦成像模块210、电子控制模块220以及上位机模块230，通过所述共聚焦成像模块210可以获取共聚焦图像并作为参考图像；所述上位机模块230根据所述参考图像的像素值设定阈值，并根据所述阈值判断像素内荧光分子密集程度，所述上位机模块230还用于根据荧光分子密集程度控制所述电子控制模块工作，所述电子控制模块220控制所述高速光开关213的开启及闭合实现对像素的光照时间的控制，有效降低共聚焦成像时的荧光漂白，有助于共聚焦成像技术在生物研究中的应用。
[0060] 当然本发明的低荧光漂白共聚焦成像方法还可具有多种变换及改型，并不局限于上述实施方式的具体结构。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。
