本发明涉及细胞材料从悬浮介质中絮凝化的方法。通常希望将细 胞材料(如细胞和/或细胞碎片)从含有细胞材料的液体悬浮培养基 中分离出来，一种方法是将细胞材料絮凝化以致于形成的絮凝物可以 从液体悬浮培养基中分离出来，分离出来后细胞材料本身仍可以使 用。此外可以弃去细胞材料，而使用悬浮培养基中的内含物。

然而已经证实难以找到能够在悬浮介质中给予足够絮凝化作用 的絮凝化体系，通常从该悬浮介质中必须分离出细胞材料。特别是经 常需要从复杂的介质如生长培养基中分离细胞材料。已经发现使用标 准絮凝剂如聚合物进行絮凝化在这些环境中尚有问题。

Sitkey等人在Biotechnology Techniques，6卷，1期，49- 52(1992)描述了从发酵肉汤中除去细胞、固体和胶体的方法，分离 的目的是回收悬浮培养基中存在的胞外酶。描述了用作絮凝剂的16 种聚合物材料。所使用的絮凝剂类型是弱阳离子、中性阳离子、强阳 离子、弱阴离子、中性阴离子和非离子的。然而根据作者所述只有两 种聚合物能得到有效的澄清，即中性阴离子聚合物Sedipur T1和 Sedipur TF5，购于BASF公司。也描述了加入各种阳离子和非离子聚 合物，每种都以单一剂量加入作为唯一的絮凝剂，但并没有有效地澄 清发酵肉汤。

Mukhopadhyay等人在Biotechnology Techniques，4卷，2期， 121-126(1990)也尝试从发酵肉汤中分离出悬浮的固体，其目的是 回收溶解在悬浮培养基中的胞外酶。作者采用了多种不同体系以改进 凝胶化或絮凝化。所使用的絮凝剂是冰乙酸、氯化钙、硫酸铝和阳离 子聚丙烯酰胺。还采用这些体系，其中两种或多种这些试剂均加入到 悬浮培养基中。作者特别描述了这种体系，其中硫酸铝和阳离子聚丙 烯酰胺被用作两种絮凝剂。在此示范体系中阳离子聚丙烯酰胺的用量 为0.1、0.3和0.5g/l(100、300和500ppm)，而硫酸铝的用量 通常为5.0g/l(5000ppm)。尽管采用这种体系得到了发酵肉汤的 澄清，但作者声明形成的絮凝物在高剪切条件下会分解为较小的颗 粒，这就妨碍了沉积。因此这种体系可以澄清发酵肉汤，但不会提供 大块的絮凝物。出于此原因，能够在随后用来从上清液中分离絮凝物 的方法受到限制。作者特别建议要用更加温和的离心方法。

欧洲公开专利申请EP-A-448926披露了一种用来使酶絮凝化的 体系，细胞材料如细胞和细胞碎片通过机械方法如离心从悬浮培养基 如发酵肉汤中除去，而留在上清液中的酶用一种特殊的絮凝剂絮凝 化。该絮凝剂是Mannich丙烯酰胺聚合物和二烯丙基二甲基卤化铵聚 合物的一种共混物。在所述体系中，必须首先通过机械方法从发酵肉 汤中除去细胞材料，因为细胞材料会污染以后的化学沉淀产物。

Weir等人在Biotechnology Techniques，7卷，3期，(1993.3) 199-204页中公开了使用壳聚糖从发酵肉汤中使细胞絮凝化的方 法，壳聚糖是一种阳离子聚电解质，据报道pH为7.9以上时是中性 的。相同的作者还在Biotechnology Techniques，8卷，2期， (1994.2)129-132页中描述了在用壳聚糖作为絮凝剂之前使用各 种阴离子聚合物作为预处理剂。

已知在液体培养基中用阳离子聚电解质对微生物细胞进行絮凝 化会协助从培养基中分离细胞。当培养基含有高浓度的阴离子聚电解 质作为培养基的成分和/或由细胞产生的成分时，加入高分子量阳离 子絮凝剂会产生絮凝物。这些絮凝物将会被浓缩的絮凝剂和聚电解质 络合物的混合物污染，此络合物由一种阴离子和阳离子聚合物(聚合 盐)和/或一种阴离子和阳离子聚合物的沉淀物形成，从而导致絮凝 物粘在加工设备上。一种替代的方法是向含有高浓度阴离子聚电解质 的细菌培养基中加入低分子量阳离子聚合物絮凝剂，如果要想达到足 够的絮凝化，由于形成了阴离子和阳离子聚合物络合物和/或沉淀 物，则该方法需要较高的聚合物剂量。此外已经发现使用低分子量阳 离子聚合物絮凝剂所产生的絮凝物明显弱于用高分子量聚合物所产 生的絮凝物。在剪切作用下细胞从使用低分子量阳离子聚合物絮凝剂 所产生的絮凝物中释放出来，并由此导致分离效率的下降。

希望能够提供一种有效的体系以将细胞材料从悬浮培养基如发 酵肉汤中分离出来。还希望能够在絮凝化之后使用多种分离方法，并 且希望能够提供足以经受各种分离方法的絮凝物块，且如果需要能够 提供后续的使用方法。

根据本发明，申请人提供了一种将细胞材料从含有细胞材料的悬 浮培养基中絮凝化的方法，该方法包括向悬浮培养基中加入一种第一 聚合材料，该材料是阳离子的并且特性粘度不超过2dl/g，之后或同 时向悬浮培养基中加入一种第二阳离子聚合材料，该材料是阳离子的 或基本上是非离子的，并且特性粘度至少是4dl/g，然后将细胞材料 絮凝化。

我们发现使用给定的第一和第二聚合材料以将细胞材料絮凝化 会导致产生适用于高剪切作用下分离的絮凝物块，而不需要过多的聚 合物剂量。特别是我们发现通过用特性粘度不超过2dl/g的阳离子 聚合物来预处理含有大量阴离子聚电解质的微生物肉汤，然后再使用 特性粘度至少是4dl/g的聚合物絮凝剂，会产生不含粘结浓缩聚合 物的絮凝物块。总的聚合物剂量高于单独使用特性粘度至少是4dl/g 的聚合物的已知方法，但低于单独使用特性粘度不超过2dl/g的聚 合物的已知方法。

令人惊讶的是，我们还发现当两种聚合物基本上同时加入或以共 混物加入时，本发明的两种聚合物体系的总聚合物剂量可以减少高达 30％。同样令人惊讶的是发现特性粘度至少是4dl/g的聚合物和特 性粘度不超过2dl/g的聚合物同时加入或者以共混物加入不会产生 粘性的絮凝物。

因此本发明提供了可灵活使用的多种类型分离方法，且不会破坏 絮凝物。

在本发明中细胞材料从悬浮培养基中絮凝化出来。至于细胞材 料，我们是指细胞、细胞碎片孢子和/或生物微粒，特别是细胞和/或 细胞碎片。絮凝化不只包括细胞产物如酶或聚合物。

本发明可以用来将各种微生物细胞材料絮凝化。因此本发明对于 将悬浮培养基中的任何微生物细胞材料絮凝化而言是有价值的。它们 包括悬浮介质中的细菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

悬浮培养基中细胞材料的浓度通常至少是0.5g(干重)/l，通 常至少2或3g/l，并且可以最高达100或150g/l。

悬浮培养基通常是一种生长培养基，因此细胞材料可从发酵肉汤 中絮凝化。这是一种复杂的培养基，它含有标准的生长培养基成分如 淀粉(例如马铃薯淀粉)、玉米粉、玉米面、玉米浸出液、大豆粉、 玉米麸、酵母提取物、糖浆蒸馏物、鱼粉、蛋白胨以及其它市售的溶 解产物。悬浮培养基的pH值并非很严格，而通常可以是3-10，优选 4-9，例如6-8。

生长培养基倾向于含有大量阴离子材料如阴离子聚电解质，它或 者是作为生长培养基的部分成分或者作为生长细胞的产物。本发明特 别适用于这种介质，因为已经证实细胞材料从其中絮凝化出来特别困 难。

在本发明的方法中，第一和第二聚合材料加入到含有细胞材料的 悬浮培养基中。这两种聚合材料可以相继地加入到悬浮培养基中，即 先加入第一阳离子聚合材料，然后加入第二阳离子聚合材料。当采用 相继加入时，优选在第二阳离子聚合材料加入之前将第一阳离子聚合 材料混入悬浮培养基中。

优选基本上同时将第一和第二阳离子聚合材料加入到悬浮培养 基中。它们可以在不超过30秒的时间间隔内同时分别加入。基本上 不会将一种聚合材料在加入另一种之前混到悬浮培养基中。

它们优选作为预形成的共混物加入，我们发现同时加入，特别是 以预形成的共混物，与相继(即不同时)加入两种聚合材料相比特别 有利。事实上与相继加入相比，同时加入可以减少这两种聚合材料的 剂量，而且性能仍然保持。

聚合材料可以任意适当的方式加入到悬浮培养基中。适当的加入 方式包括粉末，但优选水性溶液。例如，如果第一和第二阳离子聚合 材料分别加入，则优选以水溶液形式加入，其浓度至少是0.05％ w/v，且通常不超过1.0％w/v。水溶液中的适当浓度约为0.1％ w/v，但也可以是很高的浓度，例如高于8.0％w/v，且在某些情况下 可以最高至50.0％w/v。

加到悬浮培养基中的活性第一阳离子聚合材料的用量可以是不 超过1000ppm，优选不超过500ppm，基于悬浮培养基的总重量(包 括细胞材料和添加聚合物)。通常它不超过300或200ppm。用量低 至150ppm及以下时可以得到良好的结果，而用量低至120ppm时甚 至可以得到最佳的结果。通常用量至少为50ppm，优选至少100ppm。 但是如果要絮凝较高的生物量浓度，那么就可能需要非常高的剂量， 例如最高至4000ppm。类似地，对于特性粘度至少是4dl/g的聚合 物而言，可能需要比以上范例更高的剂量。

加到悬浮培养基中的活性第二聚合材料的用量通常是不超过500 ppm，优选不超过250ppm。它通常低于100或80ppm，且在用量为 50ppm或以下时甚至可以得到最佳结果。通常用量为至少25ppm。

第一和第二聚合材料的这些用量适用于分别加入(相继或同 时)，并且适用于以预形成的共混物形式使用这两种聚合材料。但是 同时加入，特别是以预形成的共混物，允许使用比相继加入更少的用 量。

在预形成的共混物中，第一和第二聚合材料的比例(活性聚合 物，重量)第一∶第二聚合材料优选40∶60到95∶5，该比例更优选为 50∶50到90∶10，最优选60∶40到80∶20。已经用第一∶第二聚合材料 的比例为65∶35到75∶25，特别是大约70∶30的共混物得到了特别好 的结果。

加入到悬浮培养基中的活性聚合物共混物的总量通常低于1000 ppm，优选低于500ppm。它可以低于300或250ppm，且在用量为低 于200ppm时已经得到良好的结果。用量低至170ppm时甚至可以得 到最佳结果。加到悬浮培养基中的活性聚合物总量通常至少是50 ppm，优选至少100ppm。

当第一和第二聚合材料以共混物加入时，可采用任意适当的方 式，例如粉末或优选水性溶液。聚合物在水溶液中的总浓度通常至少 是0.05％w/v，且通常不超过1％w/v。

我们还设计了一种新型方法以预测悬浮培养基和细胞材料的任 意具体组合，其中每类聚合物的剂量将给出最佳性能，该方法如下：

1.悬浮培养基取样。通过机械方法，如间歇离心将细胞材料从 悬浮培养基样品中分离出来，以提供分离的细胞材料和用过的悬浮培 养基。

2.第一聚合材料加入用过的悬浮培养基中，并且混合良好的样 品在600nm处测量的吸光度增加。吸光度增加最大时的第一聚合材 料用量标作剂量1。

3.分离出来的细胞材料重新悬浮在等体积的盐溶液中，离子强 度和pH值与用过的悬浮培养基相同。

4.然后将第二聚合材料逐步加入到重新悬浮后的细胞材料中， 并且如下文中所述观察到混浊度(以样品在600nm处测量的吸光度 测定)降低。混浊度降低最大时的第二聚合材料剂量标作剂量2。

5.然后将第一和第二聚合材料按剂量1∶剂量2的比例使用以使 细胞材料从全部悬浮培养基中絮凝化。

以上方法给出了一个第一和第二聚合材料的最佳比例近似值。但 实际上共混物形式中聚合物的绝对剂量较低。此外最佳混合比例可以 根据测试方法作程度较小的改变，其中低分子量部分可以更多一些。

第一聚合材料的特性粘度不超过2dl/g，在本说明书中，特性粘 度(IV)用气承液柱粘度计在25℃下，缓冲到pH为7的1N氯化钠溶 液中测量。优选IV不超过1.5dl/g，优选其至少为0.5dl/g，它最 高可至1dl/g或以下。

聚合材料是阳离子的，它优选是一种合成聚合材料，并且通常由 烯键式不饱和单体或单体混合物聚合而成。

优选第一阳离子聚合材料具有相对较高的电荷密度，特别是其理 论阳离子电荷密度至少是4meq/g，通常至少5meq/g。理论阳离子 电荷密度通常不超过约25meq/g。在本说明书中，理论阳离子电荷密 度是由用来形成聚合物的单体组成计算得到的电荷密度。

优选聚合物由至少60重量％、优选至少70重量％是阳离子的单 体形成，阳离子单体含量优选至少90重量％并且可以是100重量％。

适当的阳离子单体包括二烯丙基二烷基卤化铵，例如二烯丙基二 甲基氯化铵(DADMAC)。它与少量(通常低于30重量％，且优选低 于10重量％)(甲基)丙烯酰胺的共聚物也可以使用，尽管均聚物 才是优选的。二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酸季盐或酸加成盐的均聚 物以及二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺，任选地以季盐或酸加成盐 的均聚物，以及这些化合物和少量(通常低于30重量％，且优选低 于10重量％)(甲基)丙烯酰胺的共聚物也可以使用。其它合适的 第一阳离子聚合材料包括聚乙烯亚胺、聚胺、表氯醇二胺的缩聚产 物、双氰胺的聚合物和其它传统的低分子量阳离子凝结聚合物。优选 聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)。

第二聚合材料的特性粘度至少是6dl/g。优选IV是8-15dl/g 或8-20dl/g或更高。

此材料可以是阳离子的或基本上是非离子的。优选它是阳离子 的。如果是阳离子的，那么通常第二聚合材料的阳离子电荷密度相对 较低。优选理论阳离子电荷密度在4meq/g的量级，通常约3或2 meq/g。但它可以低至约0.1meq/g，或甚至约0.5meq/g。

第二聚合材料优选是一种合成聚合物，特别是由烯键式不饱和单 体或单体混合物聚合而成。当第二聚合材料是阳离子的时，混合物中 阳离子单体的含量通常至少是2或3重量％。它可以最高至50重量 ％，但通常不超过20重量％。

优选的阳离子单体是酸加成物形式的二烷基氨基烷基(甲基)丙 烯酸盐，或者优选其季盐。也可以使用二烷基氨基烷基(甲基)丙烯 酰胺，优选以酸加成物或季盐形式，但优选该聚合物不是Mannich丙 烯酰胺聚合物。每个烷基基团可以含有1-4个碳原子，而氨基烷基 基团可含有1-8个碳原子。特别优选的是二烷基氨基乙基(甲基) 丙烯酸盐。

这些单体通常与非离子单体如甲基丙烯酰胺或优选丙烯酰胺共 聚。第二阳离子聚合材料可以是一种两性聚合物，因其包含较少量的 阴离子单体，如丙烯酸或其它烯键式不饱和羧酸单体。

此外第二聚合材料可以是基本上非离子的，并且离子单体含量可 以低于3重量％(基于单体混合物的重量)。例如它可以由100％的 丙烯酰胺，任选地与发生少量水解而形成的低于3重量％、通常低于 1或2重量％的丙烯酸来形成。其它非离子单体包括甲基丙烯酰胺。

第二聚合材料，特别是当其为阳离子的时，可以是完全可溶于水 的材料或者它也可以是已交联聚合物的形式。该聚合物可以用少量交 联剂来制备，例如在欧洲专利EP-A-202780中所述。此类型聚合物 优选含有一个20-80％的离子部分(如EP-A-202780中所述)。 该聚合物优选是一种线型聚合物。

在本方法中第一和第二聚合材料被加入到悬浮培养基中，然后将 细胞材料絮凝。优选絮凝化在搅拌下进行，通常这是一种连续混合。

当加入两种聚合材料后，通常随后将悬浮液沉降约5-30分钟， 一般10-20分钟。通过观察由细胞材料絮凝物形成的固体界面并观 察在直径12mm的标准12ml试管中此界面移动1cm所用的时间来 测量沉降速率。在优选的方法中此沉降速率至少是3，优选至少8 cm/min，并且在特别优选的方法中它至少是10cm/min。

絮凝化的效力根据混浊度的减少百分数来测定(％RT)。此％RT 是悬浮培养基在絮凝化之后的吸光度(600nm)与絮凝化之前的吸光 度相比的减少值，由此

              ％RT＝((A1-A2)×100)/A1

其中A1＝悬浮培养基在絮凝化之前于600nm处的吸光度，A2＝悬 浮培养基在加入第一和第二聚合材料并沉降15分钟之后于600nm处 的吸光度。

在本方法中％RT可以非常高，例如至少90％或95％，并且甚至 可以是至少98％或者基本上是100％。

在本发明中我们计算了活性聚合物的最小有效剂量(MED)。MED 是产生90％RT的聚合物最低活性剂量(第一和第二聚合材料的总量， 单独地或作为共混物)。在本发明中MED可以低至200ppm或以下， 甚至低至170ppm或以下。

本发明的一个优点是所形成絮凝物的结块。在本发明中我们根据 絮凝物强度指数(FSI)测量了絮凝物的强度，FSI值代表絮凝物在高 剪切作用下的强度。经过15分钟沉降后形成的絮凝物经受高剪切作 用，在此定义为在标准12ml试管中的5ml悬浮液上施加30秒涡流混 合的剪切作用，此混合是在miximatic(Jencons)混合机的最高设 定值下进行的。然后将经过剪切作用后的絮凝物沉降15分钟，测量 沉降后悬浮液的％RT，由此

絮凝物强度指数＝100-(％RTA-％RTB)

其中％RTA＝絮凝化后的％RT

且％RTB＝剪切作用后的％RT

％RT通常是相对于未絮凝化的悬浮培养基的混浊度来计算。

优选FSI为至少90％，优选至少95％，并且甚至可以高达至少 98％。

评价絮凝物强度的另一种方法是测量剪切测试后的沉降速率。剪 切作用后的沉降速率优选至少2，优选至少3cm/min，并且通常至少 5cm/min。

然后将絮凝化后的细胞材料从澄清的悬浮培养基中分离出来。适 当的分离方法包括离心(间歇式)、半连续或连续过滤，例如真空过 滤、以及任何其它已知的分离方法。

本发明的一个优点是提高了絮凝物强度，从而使得可以使用多种 不同的分离方法，包括那些使絮凝物经受机械搅拌和/或剪切作用以 及对于较弱的絮凝物会导致絮凝物破裂的方法。

分离出来之后，絮凝化的细胞材料可以用于许多工艺中，例如作 为催化剂。上清液中的内含物也可以用在许多工艺中。如果需要，上 清液中存在的酶可以从上清液中絮凝化出来。

接下来本发明将会通过下列实施例加以说明。

实施例

在这些实施例中，絮凝化效力以如上所述测量的％RT来表示，最 小有效剂量如上所述测量，沉降速率和絮凝物强度指数也如上所述进 行测量。使用下列聚合物：

聚合物1，聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)，IV约为1dl/g。

聚合物2，67重量％丙烯酰胺和33重量％阳离子单体(用氯代 甲烷季铵化的二甲基氨基乙基甲基丙烯酸盐)的共聚物，IV约为11 dl/g。

在实验中按如下方法进行絮凝化，除非另有说明。使用生物量浓 度为2.7g(干重)/l的枯草芽孢杆菌(B subtilis)悬浮液，等份 的培养基(4ml)置于12ml的试管中，然后在用涡流混合机高强度 搅拌期间将每种絮凝剂聚合物或共混物加入，搅拌约5秒以确保充分 混合。

每种聚合物或共混物以0.1％(w/v)的水溶液形式加入到培养基 中，除非另有说明。

实施例1

在此实施例中，测试聚合物1和聚合物2的各种共混物以找到这 两种聚合物在上述枯草芽孢杆菌(B subtilis)悬浮液中的最佳比例。

聚合物1∶聚合物2的比例为40∶60、50∶50、60∶40、65∶35和70∶30 的共混物如上所述进行测试。按70∶30混合会得到最好的沉淀物，它 们完全是颗粒。按65∶35混合也会得到足够的沉淀物，其中一些是颗 粒一些是纤维物质。对于在悬浮液中的这些聚合物而言，40∶60、50∶50 和60∶40的共混物不是最佳的，会得到相当多的“纤维”沉淀物。

实施例2

进一步测试在实施例1中被发现是最佳的70∶30共混物。单独是 聚合物1的MED值、单独是聚合物2的MED值、以及聚合物1和聚合 物2的70∶30共混物的MED值均已测出。

观察沉淀物的性质，以及加入共混物后的沉降速率。

絮凝化之后的％RT也如上所述进行计算。如上所述，絮凝物经受 高剪切作用以得到絮凝物强度指数。高剪切作用后再次测定沉降速 率。结果列于表1：

表1  聚合物   MED/   ppm   沉淀物    说明    沉降速率    (cm3/min)  高剪切作用后   的沉降速率   (cm3/min)  絮凝物强度     (FSI)     2   130    纤维      17.6      5.3       99     1   229    颗粒       1.8      0.3       86  共混物   166    颗粒      10.6      5.3       99

从这些结果可以看出尽管单独使用聚合物1会得到颗粒沉淀，但 沉降速率降低，且絮凝物强度也降低，如低FSI值和高剪切作用后的 低沉降速率所证实的那样。单独使用聚合物2会得到良好的沉降速率 和絮凝物强度，但会得到纤维状沉淀物。而使用共混物则会得到颗粒 沉淀物和良好的沉降速率以及絮凝物强度，同时也注意到其MED要比 聚合物1的MED低，而比聚合物2的MED略高。

实施例3

在本实验中进行测试以得到每种第一和第二阳离子材料的最佳 用量。

在营养肉汤培养基中生长到浓度为4g/l的枯草芽孢杆菌(B subtilis)样品在3000g下离心15分钟。然后回收上清液，并将离 心下来的细胞重新悬浮在等体积的盐水溶液中(0.85％[w/w]氯化 钠)。

聚合物1的最佳用量通过将聚合物1的溶液连续地加入到上清液 中直至600nm处的吸光度达到最大而得到，所需剂量为140ppm。

聚合物2的最佳剂量通过将不同剂量加入到枯草芽孢杆菌(B subtilis)悬浮液在盐溶液的悬浮液中直至观察到100％的RT而得 到，其所需剂量为50ppm。

然后如上所述，用140ppm聚合物1和50ppm聚合物2的共混 物来使枯草芽孢杆菌(B subtilis)絮凝化，沉降15分钟后的％RT 为100％。

下列实施例中，在250cm3的烧杯中用Lightnin A200叶轮搅拌 器(直径4.7cm)搅拌将100cm3液体进行絮凝化，然后在100cm3 测量圆筒中测量沉降速率，时间间隔为絮凝化后的枯草芽孢杆菌(B subtilis)浆线移动50mm。

聚合物3是一种市售的阳离子聚合物[活性组成：40％丙烯酰胺 和60％阳离子单体(氯代甲烷季铵化的二甲基氨基乙基甲基丙烯酸 盐)]，其特性粘度约为12dl/g。

聚合物4是一种市售的阳离子聚合物[活性组成：20％丙烯酰胺 和80％如聚合物3中的单体]，其特性粘度为4dl/g，优选经过剪切 作用之后(如欧洲专利0202780B中所述)。

聚合物1以及3或4单独地或以共混物形式加入到培养基中，分 别以1％和0.2％(w/v)的水溶液，除非另有说明。

实施例4

在本实施例中，首先将一个剂量的聚合物1加入4.76g/l的枯 草芽孢杆菌(B subtilis)悬浮液中，B subtilis在2升带挡板摇 瓶中的13g/l营养肉汤(Oxoid)里于30℃下生长16小时。所用的 聚合物1第一剂量为210ppm，在单独处理用过的培养基时发现该剂 量会导致最大量的沉淀。在第二个实验中所使用的聚合物1剂量为 290ppm，该剂量明显过量于在第一个实验中的剂量。聚合物处理过 的这两种悬浮液然后被分为等份，向每个等份的悬浮液中(210ppm 和290ppm处理)加入不同剂量的聚合物3或聚合物4，直至观察到 聚合物3或4的MED(95％RT)。结果列于表2：

表2：聚合物的相继加入       聚合物1剂量(ppm)     210     290   聚合物1剂量(mg/g/干细胞)     44     60.9       聚合物3MED(ppm)     175     148   聚合物3MED(mg/g/干细胞)     36.8     31.1       聚合物4MED(ppm)     250     200   聚合物4MED(mg/g/干细胞)     52.5     42.0

结果表明聚合物1的较高剂量会导致所需聚合物3或4的最小有 效剂量减少。

实施例5

用聚合物1和聚合物3以65∶35比例的共混物以及聚合物1和聚 合物4以60∶40比例的共混物将在用过的营养肉汤中(Oxoid)浓度 为4.76g(干细胞)/l的枯草芽孢杆菌(B subtilis)进行絮凝化。

这两种共混物中每种的最小有效剂量列于表3中。

表3     聚合物共混物   MED(ppm)   MED(mg/g[干细胞])   聚合物1∶聚合物3        65∶35     290         60.9   聚合物1∶聚合物4        60∶40     414         87.0

比较用来使相同的枯草芽孢杆菌(B subtilis)悬浮液絮凝化的 聚合物总剂量(采用相继加入聚合物，例如实施例4的表2中聚合物 1和聚合物3相继加入的剂量之和)，令人惊讶的是共混物形式表现 出聚合物总剂量大大减少。

实施例6

表4表示出絮凝物的沉降性能以及由下列方法产生的絮凝物的剪 切稳定性：只加入聚合物1、加入聚合物1后接着加入聚合物3或4、 以及将聚合物1和聚合物3或4混合加入。

在实施例4和5中，要被絮凝化的悬浮液是用过的营养肉汤中的 枯草芽孢杆菌(B subtilis)，其浓度为4.76g/l(干细胞)。为 了测试由每种方法产生的絮凝物的剪切稳定性，絮凝后的悬浮液(100 cm3)在250cm3烧杯中用Triton混合器剪切混合90秒(搅拌速度： 300rpm，叶片直径：6.2cm，叶片宽度：0.5cm)。

表4：沉降速率    MED   (ppm)    MED   (mg/g)   ％RT   沉降速率   (cm/min)   剪切作用   后的沉降     速率   (cm/min)   剪切   作用   后的   ％RT 聚合物1    700   147   96.5      2.1      0.8   86.4 聚合物1+ 聚合物3   210+22   1＝431   44.1+   46.4＝   90.5   95.7     29.5     22.7   98.2 聚合物1+ 聚合物4   210+28   0＝490   44.1+   58.8＝   102.9   96.8     49.1     12.3   98.1 聚合物1/ 聚合物 3＝65/35   320   67.2   95.7     14.4      8.4   93.3 聚合物1/ 聚合物 4＝65/35   430   90.3   96.7     18.5      3.9   92.8

单独使用聚合物1会提供一种颗粒细小的低沉降速率絮凝物悬浮 液，并且由此产生的絮凝物剪切稳定性较差，这由剪切作用后％RT的 减小所证实。采用相继加入聚合物1和聚合物3或4产生大量快速沉 降的絮凝物，在高剪切作用下其尺寸会减小(由沉降速率测量)，但 不会侵蚀(由高FSI证实)。聚合物共混物提供了高沉降速率的絮凝 物，在聚合物总剂量大大减少时它仍是剪切稳定的。