粘度测量
阅读：793发布：2020-05-11
专利汇可以提供粘度测量专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种测量 流体 样品的 粘度 的方法。该方法包括以下步骤：(ii)提供所述流体样品的流；(iii)提供组分流，其中所述组分流是所述流体样品进一步包含示踪剂组分的流；(iv)在扩散通道，例如微流体扩散通道(2)中，产生所述流(ii)与所述流(iii)的 层流 ；(iv)测量所述示踪剂组分横穿上述流的侧向扩散；以及，(v)由所测量的扩散分布图确定所述流体的粘度，其中，所述示踪剂组分的尺寸是已知的或已确定的。，下面是粘度测量专利的具体信息内容。
1.一种测量流体样品的粘度的方法，所述方法包括以下步骤：
(ii)提供所述流体样品的流；
(iii)提供组分流，其中所述组分流是所述流体样品进一步包含示踪剂组分的流；
(iv)在扩散通道，例如微流体扩散通道中，生成所述流(ii)与所述流(iii)的层流；
(iv)测量所述示踪剂组分横穿上述流的侧向扩散；以及
(v)由所测量的扩散分布图确定所述流体的粘度，
其中，所述示踪剂组分的尺寸是已知的或已确定的。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：预备步骤(i)，向所述流体样品的一部分添加示踪剂组分。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，步骤(iv)是在多个扩散时间，测量所述示踪剂组分横穿上述流的侧向扩散。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述示踪剂组分是荧光性的，并且所述组分的侧向扩散通过荧光来测量。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述通道是微流体通道。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述流(ii)与所述流(iii)在大横截面通道中接触，并且使接触的流从所述大横截面通道流入所述扩散通道中。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(ii)提供所述流体样品的两个流；并且，这些样品流体流与含所述示踪剂组分的流体流接触，且被提供在含所述示踪剂组分的流体流的两侧。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组分具有在0.5nm至200nm，例如
0.5nm至100nm范围内的半径，例如流体动力学半径。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组分流是所述流体样品进一步包含示踪剂组分的流，并且该示踪剂组分以0.2wt％或更低存在。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组分基本上是单分散性的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组分是聚合物分子。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述流体样品是水性样品。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述流体样品包含一种或多种组分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述流体样品包含具有多肽基团、多核苷酸基团或多糖基团的组分。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中，所述流体样品包含半径，例如流体动力学半径在0.5nm至200nm，例如0.5nm至100nm范围内的组分。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，所述示踪剂组分的半径，例如流体动力学半径，为所述流体样品中的组分的半径的10％至200％。
粘度测量
技术领域
背景技术
[0002] 复合溶液粘度的测量是生物学、生物物理学和生物技术科学中普遍存在的问题。此外，粘度在基于流体流动的广泛技术应用中起着重要作用。
[0004] 用于确定流体粘度的常见策略涉及监测已知尺寸的示踪剂颗粒的扩散运动。可通过视频显微术来监测单一示踪剂颗粒的移动(参见例如Valentine et al.和Tseng et al.)。或者，可通过记录示踪剂颗粒的平均光散射或荧光信号的波动来监测示踪剂颗粒的运动(参见例如Mason et al.；He et al.；Palmer et al.；和Goins et al.)。在这些方法中，根据粘度和扩散之间的斯托克斯-爱因斯坦(Stokes-Einstein)关系，由所测量的示踪剂颗粒的表观扩散系数能够容易地量化流体的粘度。
[0005] 在扩散波谱(DWS)和单一颗粒示踪中，可应用广义朗之万(Langevin)运动方程来关联所测量的均方位移的时间演变与流体的储能模量和损耗模量(参见例如Tseng et al.和Mason et al.)。
[0006] 本发明提供了用于确定粘度例如相对粘度的替代方法。
发明内容
[0007] 总体上来说，本发明提供了一种确定流体样品的粘度的方法。所述方法包括以下步骤：监测所添加的已知尺寸的组分随时间通过流体样品的扩散。由所测量的扩散分布图，可以确定流体样品的粘度。
[0008] 因此，本发明的第一方面提供了一种确定流体样品的粘度的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009] (ii)提供所述流体样品的流；
[0010] (iii)提供组分流，其中所述组分流是进一步包含示踪剂组分的流体样品的流；
[0011] (iv)在通道，例如微流体通道中，产生所述流(ii)与所述流(iii)的层流；
[0012] (iv)测量所述示踪剂组分横穿上述流的侧向扩散；以及
[0013] (v)由所测量的扩散分布图确定所述流体的粘度，
[0014] 其中，所述示踪剂组分的尺寸是已知的或已确定的。
[0015] 在本发明的实施方式中，所述方法进一步包括：预备步骤(i)，向所述流体样品的一部分添加示踪剂组分。
[0016] 所述示踪剂组分是被添加到流体样品中用于确定样品粘度的组分。
[0017] 本发明的方法在流动(flow)装置，例如微流体装置中进行。与例如使用相对昂贵的自相关器的那些方法相比，在本发明的方法中使用流体装置提供了低成本和相对简单的方法。进一步地，流体技术可允许使用少量的样品，并且允许快速的分析时间。
[0018] 本发明的方法对于流体样品的组成不敏感，并且该方法对于添加到流体样品一部分中的示踪剂组分的尺寸也不敏感。如本文所示，本发明的方法与基于动态光散射的粘度方法不同，在基于动态光散射的粘度方法中粘度测量是复杂的，其中所添加的示踪剂组分应具有与流体样品内的其它组分相当的尺寸。
[0019] 因此，本发明的方法相应地不局限于使用特定的组分或特定的流体样品。
[0020] 此外，本发明的流体方法可与其它流体技术组合。在本发明的方法中所使用的流体装置可被设置为与其它流体装置流体相连，并且这些装置可被整合在一个流动芯片内。
[0021] 在本发明的其它方面中，提供了用于本发明第一方面的方法中的流体装置。
[0023] 图1a和图1b是用于本发明实施方式的扩散方法中的流体装置的示意图。
[0024] 图2示出了在图1a和图1b的流体装置中所测量的，水性甘油溶液中10wt％(蓝色)和50wt％(红色)的47nm颗粒的扩散分布图。在沿扩散通道的12个位置处，于十二个不同的扩散时间测量扩散分布图。扩散距离(mm)是距大横截面通道与扩散通道的接合部的距离。低粘度样品和高粘度样品分别是10wt％和50wt％的甘油水溶液。
[0025] 图3是一系列图片(左)，示出了颗粒横穿图1a和图1b的流体装置中的扩散通道中的流体流的扩散。还提供了各图片的扩散分布图(右)，其中分布图包括测量的扩散分布图(虚线)和模拟的扩散分布图(实线)。这些图片使用10wt％的甘油水溶液。位置I、II、III和IV分别位于沿扩散通道的5.3mm、18.6mm、30.4mm和88.7mm处。
[0026] 图4示出了在25℃下通过图1a和图1b的流体装置中测量的相对粘度(ηr)随着水性样品溶液中甘油浓度(mg/mL)变化的变化(圆形)，以及通过常规的动态光散射技术所测量的相对粘度(ηr)随着水性样品溶液中甘油浓度(mg/mL)变化的变化(方形)。也示出了文献报道的数值(三角形)。短划线代表文献中报道的经验函数。
[0027] 图5示出了在25℃下、使用100nm直径的标准纳米颗粒，通过图1a和图1b的流体装置中测量的相对粘度(ηr)随着水性样品溶液中牛血清白蛋白(BSA)浓度(mg/mL)变化的变化(圆形)，以及通过常规的动态光散射技术测量的相对粘度(ηr)随着水性样品溶液中牛血清白蛋白(BSA)浓度(mg/mL)变化的变化(方形)。
[0028] 图6示出了对于含47nm直径(a)或100nm直径(b)的0.05％标准纳米颗粒的100g/L BSA溶液，通过动态光散射测量的尺寸分布(nm)。
[0029] 图7a和图7b是用于本发明实施方式的扩散方法中的流体装置的示意图，其中，(a)是具有2通道配置的串联装置，(b)是具有3通道配置的串联装置。
[0030] 图8a和图8b是用于本发明实施方式的扩散方法中的流体装置的示意图，其中，(a)是具有2通道配置的并联装置，(b)是具有3通道配置的并联装置。
具体实施方式
[0031] 本发明提供了一种确定流体样品的粘度的方法。分析用流体样品以多个部分来使用，其中一部分具有添加到其中的示踪剂组分，而另一部分没有经过这样的改变。在通道中产生流体部分的层流，并且使该一部分中的示踪剂组分扩散到另一部分中。监测示踪剂组分随时间的移动。由所测量的扩散分布图，可确定流体样品的粘度。
[0032] 将流体流提供到流动装置(例如微流体装置)的通道中。用于测量扩散的流动装置在本领域中是已知的，并且下文将作进一步的详细描述。
[0033] 本发明人之前在WO 2014/064438中已经描述了使用扩散技术来分析多组分混合物。在验证其方法时，本发明人监测了具有已知尺寸的组分的扩散。然而，从该早期工作并不能显而易见的知晓，利用示踪剂组分，扩散技术可以而且应该用于确定测试样品的粘度。
[0034] 为了验证尺寸测量，WO 2014/064438描述了荧光标记的25nm和100nm的聚苯乙烯颗粒单独和一起进入空白水性流中的扩散。所使用的聚苯乙烯颗粒的浓度按体积计为0.2％。从这一工作并不能显而易见的知晓，已知尺寸且相对低浓度的颗粒可以且应当添加到测试样品中以确定测试样品的粘度。
[0035] WO 2014/064438的方法着眼于组分离开样品流体流，进入(缓冲液的)空白流体流的移动。相比之下，本案的方法着眼于示踪剂组分进入样品流体流的移动。
[0036] 流体样品
[0037] 本发明的方法允许确定流体样品的粘度。本发明的方法允许分析未知组成的流体，并且对于流体样品内的组分的性质和浓度没有限制。
[0038] 在一个实施方式中，所述流体样品是粘度未知的流体样品。
[0039] 所述流体样品可以是液体样品。
[0040] 在本发明的方法中，所述流体样品以至少两个部分来提供。所述流体样品的第一部分是具有示踪剂组分的部分。在分析之前可将该示踪剂组分添加到流体样品中。另一部分是不含示踪剂组分的流体样品。在本发明的方法中，使所述流体样品的这些部分的流接触，以形成层流。然后，使该组分从第一部分的流扩散至另一部分的流。
[0041] 对样品流的提及是对流体样品的不含示踪剂组分的部分的流体流的提及。
[0042] 对示踪剂组分流的提及，是对流体样品的含示踪剂组分的部分的流体流的提及。
[0043] 因此，除了示踪剂组分流中存在示踪剂组分之外，样品流和示踪剂组分流的组成可以是相同的。因此，如上下文所阐述的，对样品流性质的提及可被视为对示踪剂组分流的提及。
[0044] 所述样品流体可以具有溶解或分散在其中的一种或多种组分。这些组分包括生物分子，并且该组分可具有多肽基团、多糖基团或多核苷酸基团。
[0045] 例如，样品流体中的组分可以是蛋白，包括抗体。
[0046] 在一个实施方式中，所述样品流体包含多种组分。由此得出，依据示踪剂组分横穿多组分流的移动来测量扩散。在一个实施方式中，所述流体样品是多组分混合物。在一个实施方式中，所述样品流体的组成或所述流体内的组分浓度可以是未知的。
[0047] 当所述示踪剂组分被提供在流体样品的一部分中时，该示踪剂组分是除了该流体样品内的组分之外的组分。
[0048] 所述流体样品可包含分子量，例如重均分子量为至少300Da、至少500Da、至少1000Da(1kDa)或至少2kDa的组分。
[0049] 所述流体可包含分子量，例如重均分子量为至多5kDa、至多10kDa、至多20kDa、至多50kDa或至多100kDa的组分。
[0050] 例如，如上所述，所述样品流体可以包含一种或多种蛋白。
[0051] 所述流体样品可以包含(或者可疑似包含)尺寸与示踪剂组分近似的组分。发明人发现了无论示踪剂组分的尺寸如何，而且无论存在于流体样品内的组分的尺寸如何，本发明的流体技术都能确定粘度。因此，本发明的方法可用于确定具有复杂组成和/或未知组成的流体样品的粘度。
[0052] 本发明人发现了在添加的示踪剂分子具有与流体样品内的一种或多种组分近似尺寸的情况下，之前描述的用于确定粘度的动态光散射方法是有问题的。具体地，来自流体样品中的示踪剂组分和尺寸近似的组分的光散射信号的盘绕(convolution)不能准确地按尺寸对示踪剂颗粒进行分级，从而导致错误的粘度确定。该情况示于本申请的工作例中。
[0053] 考虑到动态光散射实验的结果可能并不总是可信的，可能需要使用尺寸不同的示踪剂组分来重复动态光散射实验，以验证所计算的粘度值。或者，可能需要以一些其它方式，例如增加流体样品内的示踪剂组分的浓度，来增加光散射信号的强度。但是，后一种方式往往是不可取的，因为添加大量的示踪剂组分很可能导致样品粘度发生变化。
[0054] 对流体样品中的组分尺寸的提及可以是对组分的半径，例如流体动力学半径的提及。组分尺寸可以使用标准分析技术来确定。例如，可以使用扩散测量来确定流体样品内的组分的尺寸。
[0055] 存在于流体样品中的组分可具有至少0.05nm、至少0.1nm、至少0.5nm、至少1nm或至少5nm的半径。
[0056] 存在于流体样品中的组分可具有至多10nm、至多15nm、至多25nm、至多50nm、至多100nm或至多200nm或至多500nm的半径。
[0057] 组分可具有选自上述给出的半径的上限和下限之间范围内的半径。例如，本发明尤其适于确定含半径为0.5nm至500nm，例如0.5nm至200nm，例如0.5nm至100nm，例如0.5nm至15nm的组分的流体样品的粘度。
[0059] 在本发明的方法中，通过将示踪剂组分添加到流体样品的一部分中来由流体样品制备含示踪剂组分的流体。提供流体样品的又一部分，并且该部分不含示踪剂组分。该又一部分用于产生样品流。
[0060] 可通过使示踪剂组分与流体样品的一部分简单混合，来制备流体样品含示踪剂组分的部分。
[0061] 示踪剂组分可以以相对低的浓度来使用。用于本发明的检测方法，例如荧光检测能检测极低浓度的示踪剂组分。
[0062] 将示踪剂组分以足以基本上保持流体粘度的水平添加到流体样品中。因此，样品流和示踪剂组分流的粘度即使不相同，也是基本上相同的。
[0063] 如果样品流体和示踪剂组分流体的粘度存在很大差异，则所确定的样品流体的粘度值将不够准确。
[0064] 以足以能够在流体流中对其进行检测的量，来提供示踪剂组分。可使用的示踪剂组分的最低量将取决于示踪剂组分的分析性质，例如示踪剂组分的荧光效率，以及所使用的检测器的检测效率。
[0065] 所述示踪剂组分可以以至少0.001wt％、至少0.005wt％或至少0.01wt％的浓度提供至流体样品的一部分中。
[0066] 所述示踪剂组分可以以至多0.05wt％、至多0.1wt％、至多0.2wt％、至多0.5wt％或至多1.0wt％的浓度提供至流体样品的一部分中。
[0067] 所述示踪剂组分可以选自上述给出数值的上限和下限之间范围内的浓度来使用。例如，所述示踪剂组分可以以0.01wt％至0.05wt％的浓度提供至流体样品的一部分中。
[0068] 所述流体样品可包含一种或多种组分，并且这些组分也将存在于示踪剂组分流中。示踪剂组分流中的这些组分的浓度基本上与样品流中的那些组分相同。因此，向流体样品的一部分中添加示踪剂组分，与流体中组分的稀释或浓度不相关。因此，当示踪剂组分流和样品流以层流形式接触时，基本上没有组分横穿流体流的浓度梯度。相比之下，存在示踪剂组分横穿流体流的浓度梯度，并且随时间监控的是该浓度梯度的变化。
[0069] 在本发明的某些实施方式中，上述方法提供了使用两个不含示踪剂组分的流体样品流。如下文进一步详细描述的，这些流体流可以由流体样品的单一部分来产生，或者这些流体流可以由流体样品的两个部分来产生。这两个流可被提供在示踪剂组分流的两侧。
[0070] 示踪剂组分
[0071] 用于本发明的方法中的示踪剂组分是其尺寸已知的组分。该组分的尺寸在本领域中可以是已知的，或者可以是在该组分用于本发明的方法中之前已确定的。所述示踪剂组分的尺寸可以是从文献中获知的，和/或该信息可以是由该组分的商业供应商提供的。
[0072] 或者，所述示踪剂组分的尺寸可以是在该组分用于本发明的方法中之后确定的。
[0073] 所述示踪剂组分的尺寸可以是使用标准分析技术确定的(或证实的)。
[0074] 对示踪剂组分的尺寸的提及可以是对该组分的半径，例如流体动力学半径的提及。
[0075] 在本发明的方法中使用的示踪剂组分可以具有至少0.05nm、至少0.1nm、至少0.5nm、至少1nm或至少5nm的半径。
[0076] 在本发明的方法中使用的示踪剂组分可以具有至多10nm、至多15nm、至多25nm、至多50nm、至多100nm或至多200nm或至多500nm的半径。
[0077] 所述示踪剂组分可以具有上述给出半径的上限和下限之间范围内的半径。例如，本发明尤其适于使用半径为0.5nm至500nm，例如0.5nm至200nm，例如0.5nm至100nm，例如0.5nm至15nm的示踪剂组分。
[0078] 所述示踪剂组分的尺寸可以具有与流体样品内所含有的组分基本上近似的尺寸。
[0079] 在一个实施方式中，所述示踪剂组分的半径为流体样品中的组分半径的至少10％、至少20％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0080] 在一个实施方式中，所述示踪剂组分的半径为流体样品中的组分半径的至多100％(即与该组分的半径相同)、至多150％、至多200％、至多500％或至多1000％。
[0081] 所述示踪剂组分可具有选自上述给出的上限和下限之间范围内的半径。例如，所述示踪剂组分的半径为流体样品中的组分半径的10％至200％。
[0082] 在对具有一定范围的粘度(或预计范围的粘度)的多种流体样品进行扩散测量时，优选所有实验均使用具有小尺寸的示踪剂组分。
[0083] 如上所述，即使在示踪剂组分的尺寸与流体样品内的组分相当的情况下，本发明的方法也能确定粘度。
[0084] 所述示踪剂组分在其群体中通常具有均一的尺寸。使用示踪剂颗粒的基本同质的群体确保了所确定的粘度值是准确的。
[0085] 因此，在一个实施方式中，用于本发明的示踪剂组分基本上是单分散性的。
[0086] 在一个实施方式中，所述示踪剂组分具有标准偏差小于平均值的15％、小于平均值的10％、小于平均值的5％或小于平均值的1％的尺寸分布。
[0088] 可以使用具有不同尺寸的示踪剂组分，其中不同尺寸的示踪剂组分各自的相对数量是已知的。例如通过使用如WO 2014/064438中记载的本发明人开发的技术，可以对多组分混合物的扩散分布图进行解析。为简单起见，优选使用具有基本上相同尺寸的示踪剂组分。
[0089] 所述示踪剂组分可溶解在流体样品中。然而，本发明还可用于追踪分散在流体内的示踪剂组分的移动。因此，用于上述方法中的流体可以是胶质的，并且可以是溶胶或乳液，在其中示踪剂组分是分散相。
[0090] 进行本发明方法的分析所需的示踪剂组分的量不大，而且非常少量的材料可以穿过微流体装置。还可以收集离开扩散通道的流体，可对该流体进行再分析。
[0091] 本发明的方法包括测量示踪剂组分横穿流体流扩散的步骤。所述示踪剂组分可以使用标准分析技术，例如荧光光谱法、发光光谱法、UV-vis光谱法等等来检测。
[0092] 通常，所述示踪剂组分是不与或预期不与流体样品内的组分发生反应的组分。出于这一原因，当测量生物流体的粘度时，避免使用蛋白作为示踪剂组分。存在蛋白示踪剂会与生物流体的组分(例如其它蛋白)互相作用的风险。
[0093] 所述示踪剂组分可以是分子，例如聚合物分子。
[0094] 所述示踪剂组分可以是颗粒。
[0095] 在一个实施方式中，所述示踪剂组分是聚合物，例如聚合物颗粒。所述示踪剂组分可以是聚苯乙烯，例如聚苯乙烯颗粒。
[0096] 在一个实施方式中，所述示踪剂组分是染料分子。
[0097] 组分可以是经过标记的，以辅助检测。例如，在本文所描述的示例性方法中，使用经荧光标记的聚苯乙烯颗粒作为示踪剂组分。
[0098] 所述示踪剂组分可根据其分析性质来进行选择。例如，所述示踪剂可具有样品流体中不存在(或是不认为是存在的)的可检测的官能度。
[0099] 例如，所述示踪剂组分可以是荧光活性的，并且对于样品流体中的组分，荧光激发波长和荧光发射波长不是典型的或者不是预期的。在本案中，使用具有荧光活性的示踪剂组分来确定含牛血清白蛋白的溶液的粘度。示踪剂颗粒的荧光活性不与牛血清白蛋白共享。因此，所检测的荧光信号仅与示踪剂组分相关，而不与样品流体的任何其它组分相关。
[0100] 方法
[0101] 本发明可用于确定流体样品的粘度，例如相对粘度。本发明的方法旨在测量已知尺寸的示踪剂组分通过流体样品的扩散。所述示踪剂组分随时间的扩散能确定流体的粘度。
[0102] 在本发明的方法中，建立流体样品的流。这便是样品流。还建立了流体样品含示踪剂组分的流。这变是组分流。这些样品流和组分流接触，并且在扩散通道中产生层流。一旦建立了层流，就监测组分从组分流进入样品流的扩散。从而，可在不同的扩散时间，确定所述组分横穿一个或所有流体流的位置。根据所测量的组分的扩散分布图，可确定所述流体样品的粘度。
[0103] 所述通道被称为扩散通道，由于它是允许组分扩散并且监控组分扩散的流体通道。
[0104] 在分析步骤的过程中，使各个流的流速保持在基本恒定的水平。可以仅在在扩散通道中建立了稳定的流动时，才开始进行分析。
[0105] 对所使用的流速没有特别的限制，并且样品流和示踪剂组分流的流速没有必要相同。
[0106] 可以独立于样品流的流速，来更改示踪剂组分流的流速。
[0107] 在实践中，选择流速以适应组分横穿流体流的扩散。选择流速，以便在流动通道内有足够的停留时间来允许待监测的示踪剂组分的扩散。
[0108] 所述通道是流体装置的一部分。所述流体装置适于与在通道的多个位置处的检测器一起使用。所述通道与样品流和组分流的供应通道流体相连。
[0109] 在一些实施方式中，两个样品流被提供在示踪剂组分流的两侧上。因此，本发明的方法可考虑示踪剂组分流中的示踪剂组分进入两侧样品流体流中的任一个或两个的扩散。使用两个样品流体流是有利的，因为这些样品流体流可用于提供横穿示踪剂组分流的稳定的平衡压力。
[0110] 两个样品流的组成是相同的。两个样品流的流速通常是相同的。
[0111] 本发明的方法通常在具有低雷诺数的流中进行。例如，流的雷诺数可以为1或更低，0.5或更低，0.1或更低，或者0.05或更低。
[0112] 本发明的方法可以在室温或约室温，例如15℃、20℃或25℃下进行。或者，本发明的方法可以在较低的温度(例如5℃或10℃)或者较高的温度(例如35℃、40℃或50℃)下进行。本发明的方法还可以包括测量用于本发明的流体温度的步骤。
[0113] 在一个实施方式中，上述层流的流体流量是至少1μLh-1、至少5μLh-1、至少10μLh-1、至少50μLh-1或至少100μLh-1。
[0114] 在一个实施方式中，上述层流的流体流量是至多200μLh-1、至多400μLh-1、至多500μLh-1、至多1000μLh-1、至多2000μLh-1或至多5000μLh-1。
[0115] 在一个实施方式中，上述层流的流量是选自上述数值的上限值和下限值之间范围内的数值。例如，所述流量可以在5μLh-1至400μLh-1的范围内。
[0116] 所述流体流量是处于稳定状态下的流量。
[0117] 层流的流体流量指样品流(或多个样品流)与示踪剂组分流的组合流量。可以调节示踪剂组分流和样品流的流量，以在扩散通道中实现期望的流量。
[0118] 使用流量在上述范围内的微流体装置意味着，可在分析操作中使用相对少量的组分流体。例如，一定范围内的体积足以在扩散通道中建立稳态流动，用于获得至少一个扩散分布图的读数。
[0119] 在一个实施方式中，用于上述方法的流体的总体积是至多50μL、至多100μL、至多200μL、至多500μL或至多1000μL。
[0120] 在一个实施方式中，用于上述方法的流体的总体积是至少0.1μL、至少0.5μL、至少1μL、至少5μL或至少10μL。
[0121] 在一个实施方式中，所使用的流体的总体积是选自上述数值的上限值和下限值之间范围内的数值。例如，所述总体积可以在1μL至50μL的范围内。
[0122] 流体的总体积指用于上述方法的示踪剂组分流体和样品流体的组合体积。
[0123] 在一个实施方式中，在多个扩散时间，测量示踪剂组分从示踪剂组分流进入样品流体流的侧向扩散。
[0124] 因此，所述侧向扩散可以是在沿扩散通道的多个位置处的测量值。对测量点之间的间隔没有特别的限制，但可以是足够的距离，使得所记录的扩散分布图在测量点之间具有显著的变化。
[0125] 在替代性实施方式中，在通道中的单一位置处测量示踪剂组分的侧向扩散。一旦记录到了侧向扩散，就更改示踪剂组分流和样品流体流的流量，并且一旦建立了稳定的流动，就在单一位置处测量示踪剂组分的侧向扩散。因此，可以通过改变流量，来获得不同扩散时间的扩散分布图。流量可以改变一次、两次、三次或更多次。
[0126] 流体装置
[0127] 本发明的第一方面的方法使用扩散通道，该扩散通道是流体装置，例如微流体装置的一部分。
[0128] 因此，所述流体装置包括扩散通道。所述扩散通道容纳示踪剂组分流与样品流体流的层流，或者所述扩散通道容纳示踪剂组分流与提供在示踪剂组分流两侧上的两个样品流体流的层流。
[0129] 所述扩散通道适于与分析装置一起使用，该分析装置适用于在沿扩散通道的一个或多个位置处确定示踪剂组分的侧向分布。
[0130] 所述扩散通道可以与具有较大横截面的上游通道(大横截面通道)流体连通。相应地，所述扩散通道可被称为小横截面通道。本发明人在WO 2014/064438(其内容通过引用整体并入本文)中描述了在扩散装置中使用大横截面通道和小横截面通道。
[0131] 使用微流体通道来容纳示踪剂组分流和样品流体流确保了这些流动以低雷诺数进行，因此对流和扩散是体系内与质量传递相关仅有的机制。相应地，这允许进行准确的数值计算。
[0132] 对装置中的通道的总体尺寸进行选择，以提供合理的运用率(mobilisation rate)和分析时间。还可对装置的尺寸进行选择，以降低进行充分分析操作所需的流体的量。
[0133] 所述扩散通道(和大横截面通道，当存在时)是具有适当尺寸的通道，允许在其中产生并保持两个(或三个)液流的层流。两个液流的层流指多个流是并排的并且是稳定的。因此，通常没有流体再循环的区域，并且湍流是最少的。通常，这样的条件由小通道，例如微通道来提供。
[0134] 用于分散测量的装置在本领域中是公知的，并且记载于例如Kamholz等人(Biophysical Journal,80(4):1967-1972,2001)和WO 2014/064438中。
[0135] 本文中对通道例如扩散通道的提及是对横截面基本上为矩形的通道的提及。因此，所述通道可由基本上平坦的底部和基本上垂直于该底部延伸的壁以及可选的顶盖构成。所述底部和壁通常由硅酮基板形成。所述盖可以是玻璃盖，例如标准玻璃载片或硼硅酸盐晶片。检测设备可设置在扩散通道上方。
[0136] 对宽度的提及是对通道中侧向扩散尺寸(在一些现有技术的参考文件中被称为d)的提及。
[0137] 所述扩散通道在其整个长度上具有基本上恒定的宽度。
[0138] 所述扩散通道的宽度可以是至多500μm、至多700μm、至多1000μm或至多2000μm。
[0139] 所述扩散通道的宽度可以是至少5μm、至少10μm、至少50μm、至少100μm或至少200μm。
[0140] 在一个实施方式中，所述扩散通道的宽度可以在选自上述给出的上限值和下限值之间的范围内。例如，所述宽度可在10μm至500μm的范围内。
[0141] 所述扩散通道的长度可以具有这样的长度：该长度适于允许组分流中的组分扩散至形成样品流体流边界的通道边缘。因此，至流体流抵达扩散通道的端部的时间为止，存在于组分流中的所有组分都已经达到了最大的熵配置。
[0142] 所述扩散通道的长度足以允许示踪剂组分从示踪剂组分流体流扩散进入样品流体流中。对于具有本文所述分子量的示踪剂组分(例如聚合物)来说，1mm长度或更长的扩散通道长度一般是足够的。
[0143] 在一个实施方式中，所述扩散通道为至少0.5mm、至少1mm、至少2mm或至少5mm长。
[0144] 在一个实施方式中，所述扩散通道为至多10mm、至多20mm或至多50mm长。
[0145] 在一个实施方式中，所述扩散通道的长度可以在选自上述给出的上限值和下限值之间的范围内。例如，所述扩散通道的长度可以在0.5mm至50mm，例如1mm至20mm的范围内。
[0146] 流体的流动是沿扩散通道的纵向轴线的。示踪剂组分流中的示踪剂组分进入样品流中的扩散与流的纵向轴线横切，横穿通道的宽度。
[0147] 在一些实施方式中，所述扩散通道的至少一部分是盘绕的(convoluted)。因此，所述扩散通道可包括例如一个弯曲部或一系列弯曲部。盘绕的几何结构的使用能够最大限度地降低装置的尺寸。盘绕的路径的使用还可以在单一检测区内提供多个流动通道。在单一检测区中，多个通道(对应于不同的流动距离，并且因此对应于不同的扩散时间)可穿过检测器，从而能同时进行多个测量。
[0148] 所述扩散通道可接收直接来自各样品流体和示踪剂组分流体的供应通道的样品流体流和示踪剂组分流体流。因此，多个流体流在扩散通道上游区的接合部处接触。
[0149] 在另一实施方式中，所述扩散通道可接收来自上游大横截面通道的样品流体流和示踪剂组分流体流。
[0150] 可以收集离开所述扩散通道的流体用于进一步分析。因此，所述扩散通道与样品收集储液器流体连通。或者，所述扩散通道可以与又一流体装置，例如用于测量流体的第二物理性质的装置流体连通。在一个实施方式中，所述扩散通道处于第二分析装置的上游，该第二分析装置用于确定样品流体内的组分(该组分可以被称为分析物)的流体动力学半径。
[0151] 所述流体装置可以设置有供应通道，用于提供在收集储液器和扩散通道之间直接的流体连通或经由大横截面通道的流体连通。在两个样品流要被提供在扩散通道中(并且在示踪剂组分流的两侧)的情况中，可以从不同的储液器独立地递送各样品流体流。然而，可以从经由两个供应通道与大横截面通道连接的单一储液器来提供各样品流体流。
[0152] 对各供应通道的尺寸没有特别的限制，并且可以与扩散通道类似或相同。在一个实施方式中，各供应通道的宽度大于扩散通道的宽度。在一个实施方式中，各供应通道的宽度小于扩散通道的宽度。
[0153] 各储液器可以是与流体装置的供应管线连接的注射器。该注射器可以受适当编程的计算机控制，其中适当编程的计算机能够独立地控制流体从储液器至大截面通道的流速。对这样的装置的控制在本领域中是公知的。
[0154] 或者，各储液器可以被设置为微流体装置的一部分。
[0155] 在其他实施方式中，来自一个或多个储液器的流体流可以是重力供给。
[0156] 可以使用本领域已知的标准技术来生产本发明的和用于本文所述方法的流体装置。因此，可以使用光刻法，在适当的基板(例如硅酮基板)中产生流体通道和可选的流体储液器。Kamholz等人(Biophysical Journal)记载的技术可以经过适当的改变来用于光刻掩膜，以在需要时引入大横截面通道和额外的样品流体流通道。
[0157] 通过光刻技术生产的流体通道可以通过提供流体进出口而终止，例如通过在基板上钻孔以提供相关通道的进口。在使用外部储液器(例如注射器)将流体直接供应至大横截面通道或供应通道的情况中，可以使用适当的歧管。
[0158] 所述流体装置可以与经合适编程和可编程的计算机组合使用，该计算机用于控制进入大横截面通道的流动和用于管理检测装置。该计算机还可以分析所记录的数据，并且提供实时扩散值。
[0159] 上述装置适于与测量扩散通道中一种或多种组分的侧向扩散的检测器整合。
[0160] 可以选择所述扩散通道的深度，以降低分析物横穿通道宽度扩散的时间尺度(从而减少到达稳态溶液所耗费的时间)。可以选择所述通道的深度，以最小化或消除与最深通道相关的假象(参见Kamholz等人，Biophysical)。可以选择所述通道的深度，以最小化或消除与非常浅的通道相关的加载问题和高流体阻力(ibid.)。在存在大横截面通道时，它的深度可以与所述扩散通道相同。
[0161] 在一些现有技术的参考文件中，所述通道的高度或深度被称为宽度，w。
[0162] 宽高比，所述通道的宽度与所述通道的高度之间的比率可以为100或更低、50或更低、25或更低，或者10或更低。
[0163] 所述宽高比可以为1或更高、2或更高、4或更高，或者5或更高。
[0164] 在一个实施方式中，所述宽高比可以在选自上述给出的上限值和下限值的范围内。例如，所述宽高比可以在5至100的范围内。
[0165] 通常，较大的宽高比(例如4或更高)是有利的，因为完全发展的速度分布图横穿通道的高度将呈抛物线形，并且横穿通道的宽度将近似为钝形(参见Kamholz et al.Biophysical)。
[0166] 除了上面讨论的考虑事项之外，对所述扩散通道的通道高度(或者通道深度)没有特别限制。在存在大横截面通道时，该大截面通道的通道高度可以与所述扩散通道的相同。所述通道高度在整个通道上是基本恒定的。
[0167] 在一个实施方式中，所述通道高度为至少5μm、至少10μm或至少15μm。
[0168] 在一个实施方式中，所述通道高度为至多30μm、至多50μm、至多100μm或至多500μm。
[0169] 在一个实施方式中，所述通道高度可以在选自上述给出的上限值和下限值的范围内。例如，所述通道高度可以在10μm至50μm的范围内。
[0170] 现有技术中已知的通道通常具有在10μm至100μm范围内的深度(参见Kamholz et al.)。
[0171] 如上所述，可以相对于所述通道的宽度，来选择所述通道的深度，以提供合适的宽高比。
[0172] 没有必要将层流彼此分离开，以进行解析分析。可以记录横穿组分流和样品流的解析测量值。
[0173] 所述装置还设置有用于检测组分在扩散通道中的位置的检测器。下文中对此作了进一步详细地描述。
[0174] 在一个实施方式中，所述流体装置设置有大横截面上游，并且与所述扩散通道流体相连。使用大横截面旨于最小化所述装置中的流体停滞，并且最小化自停滞点延伸的流动初始区(flow development region)，从而允许在缩减的时间内形成稳定流动。
[0175] 大截面通道是示踪剂组分流体流与样品流体流在其中相接触的区域。然后，使上述流通过大横截面通道而导向至扩散通道。在扩散通道中，监测示踪剂组分进入样品流中的扩散。
[0176] 大横截面通道与扩散通道流体连通。在存在大横截面通道存在的情况中，扩散通道可以是基本上直的并且与大横截面通道一致。
[0178] 大横截面通道可以具有最大宽度基本恒定的区域，随后下游为渐缩区，在渐缩区中，通道的宽度变窄，直至宽度与扩散通道的宽度相匹配。
[0179] 或者，大横截面通道可以仅包括渐缩区，其中通道的宽度从最大宽度变窄，直至宽度与扩散通道的宽度相匹配。
[0180] 渐缩区变窄的速率可以是恒定的。
[0181] 对渐缩区变窄(喷嘴的角度)的精确速率没有特别限制，因为变窄常常与组分流不相关。
[0182] 然而，本发明人普遍发现喷嘴具有在40°至70°，例如50°至70°，例如55°至65°范围内的角度。在此，角度是相对于示踪剂组分流在宽横截面通道中的流动方向。
[0183] 大横截面通道的最大宽度w，大于扩散通道的宽度。
[0184] 在一个实施方式中，大横截面通道中不存在宽度小于扩散通道的宽度的截面。在一个实施方式中，大横截面通道的最小宽度与扩散通道的宽度相同。
[0185] 大截面通道的最大宽度w，可以为至多500μm、至多700μm、至多1000μm、至多2000μm、至多5000μm，或者至多10000μm。
[0186] 大于10000μm的通道宽度一般是不实际的，因为制造上述装置的材料(通常是PDMS)很可能会下沉。
[0187] 大截面通道的最大宽度w，可以为至少50μm、至少100μm、至少200μm，或至少500μm。
[0188] 在一个实施方式中，大横截面通道的最大宽度可以在选自上述给出的上限值和下限值的范围内。例如，该宽度可以在200μm至5000μm、例如200μm至1000μm，或例如1000μm至5000μm的范围内。
[0189] 大截面通道的长度为至多500μm、至多700μm或者至多1000μm。
[0190] 大截面通道的长度为至少10μm、至少50μm、至少100μm或者至少200μm。
[0191] 在一个实施方式中，大横截面通道的长度可以在选自上述给出的上限值和下限值的范围内。例如，该长度可以在50μm至500μm，例如100μm至500μm的范围内。
[0192] 在大横截面通道包括最大宽度基本恒定的区域以及宽度在其中渐缩至扩散通道宽度的下游区，最大宽度基本恒定的区域可以为大横截面通道的总长度的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0193] 在一个实施方式中，大截面通道的最大宽度为扩散通道宽度的至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍或至少10倍。
[0194] 在一个实施方式中，大截面通道的最大宽度为扩散通道宽度的至多20倍、至多50倍、至多100倍。
[0195] 在一个实施方式中，相对于扩散通道，大横截面通道的最大宽度可以在选自上述给出的上限值和下限值的范围内。例如，大横截面通道的最大宽度可以在扩散通道宽度的5至20倍的范围内。
[0196] 大截面通道的长度是从样品流体流与示踪剂组分流体流相接触的点至大截面通道的通道宽度与扩散通道的宽度一致的点之间的距离。扩散通道接收来自大横截面通道的样品流体流和示踪剂组分流体流。
[0197] 检测
[0198] 本发明的方法包括步骤：确定示踪剂组分横穿扩散通道的侧向分布。对于测量示踪剂组分进入样品流中的扩散的方式没有特别限制，并且所采用的检测方法可以基于待检测的示踪剂组分。
[0199] 检测器是适用于与流体流动通道，尤其是微流体通道一起使用的检测器。扩散检测方法是本领域公知的，并且记载在例如Kamholz等人(Biophysical)中。除其它外，实例包括UV-vis光谱法、荧光光谱法或发光光谱法等。
[0200] 示踪剂组分的侧向分布可以在扩散通道中的一个位置处确定。在此，不同扩散时间的测量可以通过改变扩散通道中的流体的流量来实现。
[0201] 组分的分布可以在沿扩散通道的两个或更多个(例如三个、四个或五个)位置处确定。如上所述，所述方法可以包括步骤：在扩散通道中的多个位置处，确定组分的扩散分布图。
[0202] 在示踪剂组分扩散至通道边缘(装置对于样品流体流的边界)之前，应记录至少一个扩散测量值。应理解的是，小的示踪剂组分将快速扩散至通道边缘，而较大示踪剂组分将耗费更多时间。
[0203] 在沿扩散通道进行多个扩散测量的情况中，对沿通道的第二位置和后续位置都没有特别的限制。通常，后续测量在沿扩散通道足够远的距离处进行，以给出与之前的测量值具有有用差异的扩散分布图。
[0204] 本发明的方法不需要样品流与组分流分离开。因此，可在组分流与样品流保持接触的同时，测量一种或多种组分的扩散分布图。
[0205] 为了便于检测，可对示踪剂组分进行选择。示踪剂组分可以具有能够通过例如标准UV-vis光谱法、荧光光谱法或发光光谱法检测到的化学基团形式的官能团。
[0206] 粘度确定
[0207] 在本发明的方法中，流体流动以层流态发生。例如，雷诺数一般为1×10-7的数量级。如前所述，组分在扩散通道内的传递仅由对流和扩散运动来控制。这样可以容易地通过相应的质量传递方程来模拟。
[0208] 在模式模拟和实验数据之间的对比表明以高准确度确定了示踪剂组分的扩散系数。对模式模拟和拟合程序的详细描述可以在Arosio等人(印刷中)和WO 2014/064438中找到，其内容通过引用整体并入本文。实验数据与理论数据的示例性拟合示于本申请的图3中。
[0209] 获得大量的扩散分布图是有利的：增加扩散测量的信息含量允许对扩散系数进行抗差估计(robust estimation)。因此，在本发明的方法中，在多个扩散时间测量组分的扩散。通常在沿扩散通道的多个位置处测量组分的扩散。
[0210] 根据组分的表观扩散系数(D)，可以按照斯托克斯-爱因斯坦关系来计算流体的粘度(η)：
[0211]
[0212] 其中，T是温度，κ是玻耳兹曼常数，并且Rh是示踪剂组分的流体动力学半径。
[0213] 粘度(η)测量值可以称为相对粘度(ηr)测量值，其被定义为给定的样品流体的粘度(η)与纯水(例如milli-Q水)的粘度(η0)之间的比值。可以相对于进行扩散实验时的样品流体的温度，来确定和描述粘度值。
[0214] 其他偏好设置
[0215] 在此明确公开了以上所述的各个实施方式以及实施方式的各种可行性组合，如同单独且明确地对各个实施方式以及各种可行性组合进行描述。
[0216] 鉴于本发明公开的内容，本领域技术人员将清楚本发明的多个其他方面和实施方式。
[0217] 在本文中所使用的“和/或”被视为明确公开了两个具体特征或组分中的每一个(具有或不具有另外一个)。例如“A和/或B”被视为明确公开了(i)A、(ii)B，以及(iii)A与B中的每一种情况，就像每一种情况在本文中单独地给出一样。
[0218] 除非上下文中另有规定，否则上文对特征的描述和定义不限制于本发明的任何特定方面或实施方式，而是等同地应用于所述的所有方面和实施方式。
[0219] 现在，将通过实施例的方式，并参考上述附图，来阐明本发明的某些方面和实施方式。
[0220] 实验
[0221] 材料
[0222] 由ThermoFisher Scientific(UK)供应标称直径为47nm(绿)或100nm(红)，且密度为1.06kg/dm3的荧光聚苯乙烯纳米颗粒。绿色颗粒的最大激发波长和最大发射波长分别是468nm和508nm，红色颗粒的最大激发波长和最大发射波长分别是542nm和612nm。由Sigma Aldrich(USA)供应甘油和牛血清白蛋白(BSA)。所有水性溶液都制备在milli-Q水中。探针纳米颗粒的浓度是0.05wt％。
[0223] 微流体装置
[0224] 按照图1a和图1b中示出的装置设计图来准备微流体装置。图1a示出了图1b的装置的一部分。
[0225] 微流体装置1具有盘绕的扩散通道2，用于容纳样品流和示踪剂组分流的层流(图1b中仅示出了扩散通道的一部分)。在扩散通道2的下游端，可以设置收集器3，以收集流体样品。收集器3可以是注射泵式储液器，用于从装置中抽出流体。或者，扩散通道2的下游端可以与另一微流体分析装置流体连通。
[0226] 扩散通道2适用于允许在沿通道的一个或多个位置处进行扩散测量。在存在多个记录示踪剂组分扩散的位置的情况中，各个位置对应于不同的扩散时间。可以使用标准光谱法技术(例如包括荧光技术)来确定示踪剂组分横穿通道的位置。用于确定示踪剂组分的位置的设备没有示于图1a和图1b中。
[0227] 扩散通道2的上游是大横截面通道4，其具有比扩散通道大的横截面。在大横截面通道与扩散通道2流体连通的情况中，该大横截面通道朝着它的下游端逐渐较小。大横截面通道4可以被称为喷嘴。
[0228] 大横截面通道4与在喷嘴上游端部处的接合部处汇合的三个供应通道5、6、7流体连通。设置大横截面通道4，以建立示踪剂组分流和样品流的稳定流动。大横截面通道4确保示踪剂组分在接合部处有最小的停留(停滞)。
[0229] 大横截面通道4设置有用于供应示踪剂组分流的中央供应通道5，和在中央供应通道5两侧用于供应样品流的两个侧供应通道6、7。
[0230] 中央供应通道5的上游是容纳示踪剂组分流体的储液器8，该示踪剂组分流体是样品流体进一步含示踪剂组分的部分。两个侧供应通道6、7的上游相同，是容纳样品流体的一部分的储液器9。或者，两个侧供应通道6、7中的每一个可以由单独的储液器来供应，其中单独的库各自容纳部分样品流体。
[0231] 在使用中，允许样品流体和示踪剂组分流体流动穿过它们各自的供应通道5、6、7，并且在大横截面通道4的接合部相接触。
[0232] 在大横截面通道4上游端部的接合部处，样品流被提供在示踪剂组分流的两侧。这些流被允许向下游流动进入扩散通道2。
[0233] 可以通过位于扩散通道2下游端部的注射泵来控制流体穿过装置1的流动。因此，可以使用注射泵来抽吸从供应储液器8、9穿过装置的流体。
[0234] 或者，储液器8、9各自可以是注射泵式储液器。因此，各注射泵可以从供应储液器推动流体穿过装置。此时，可以独立地改变样品流和示踪剂组分流的流速。
[0235] 通过以下来制造具有如图1b所示设计图的微流体装置：通过标准软光刻技术在主晶片(master wafer)上浇注(cast)聚二甲硅氧烷(PDMS)(Sylgard 184kit；Dow Corning)，在65℃固化75分钟，剥离固化的产物并且在等离子体活化之后使其结合至玻璃载玻片上。通道高度是25μm。检测区(扩散通道)中的通道宽度是300μm，喷嘴(大横截面通道)处是3000μm，且在用于将缓冲液和分析物引入喷嘴的流体动力学阻件(供应通道)中是100μm。
[0236] 在出口处通过使用外部注射泵(Cetoni neMESYS)施加负压，来控制通道中的流动。在给定的粘度范围中，通过调整流速来控制滞留时间能够容易地对技术的分辨率进行优化。为了在通道中有充分的扩散传递，可以对滞留时间的选择进行优化，以提供关于扩散性的有效信息，同时避免分析物一直扩散至通道的一侧，此时扩散运动的信息就会丢失。
[0237] 使用LED光源(Cairn Research)照射流体，其中LED光源配备有适用于特定荧光团的滤光镜套件(Chroma Technology Corporation,Bellows Falls,VT,USA)。具体来讲，对于绿色纳米颗粒来说，激发波长和发射波长的范围分别是450nm至490nm和500nm至550nm(49002ET-EGFP)；对于红色纳米颗粒来说，分别是624nm至654nm和668nm至718nm(49009ET-Cy5)。使用配备有荧光照明系统(Cairn Research OptoLED)和制冷CCD相机(Photometries Evolve 512)的倒置显微镜(Zeiss Axio Observer D1)，在沿通道的距离10mm至100mm范围内的12个不同点处收集图像。曝光时间通常在0.5s至1s的范围内。
[0238] 微流体扩散的测量
[0239] 使用含不同量的甘油的水性样品，验证确定样品粘度的方法。使用上文描述的且如图1b示意性示出的微流体装置，确定样品的粘度。
[0240] 制备含0wt％至50wt％甘油的水性样品。
[0241] 从各水性样品，制备样品流和示踪剂组分流的流体。样品流简单地是未经改变的样品流。示踪剂组分流是水性样品已添加了示踪剂组分(0.05％)的流。
[0242] 使用47nm的纳米颗粒作为示踪剂组分流内的示踪剂组分，根据在20℃进行的扩散测量，来确定粘度值。对于其中甘油浓度分别小于或大于40wt％的实验，样品流和示踪剂组分流在扩散通道中的组合(对流)流动的流量是40μLh或5μL/h。
[0243] 在距离扩散通道的上游端部直至约90mm的，沿扩散通道的12个位置处，测量47nm纳米颗粒的扩散分布图。图2中示出了含10wt％(蓝色)和50wt％(红色)甘油的水性样品的示例性扩散分布图。如所预期的，对于来自高粘度50wt％的甘油样品的流动来说，47nm纳米颗粒随时间的扩散更慢。自大横截面通道汇入扩散通道中的点，沿扩散通道的3.52mm、5.29mm、8.57mm、10.33mm、18.61mm、20.37mm、28.65mm、30.41mm、58.69mm、60.45mm、88.73mm和90.5mm处测量扩散分布图。
[0244] 图3示出了沿通道的四个不同扩散位置处的扩散通道图像。因为可检测到的信号横穿图像扩散，因此可清楚地观察到47nm纳米颗粒随时间的扩散。还示出了四个图像各自的扩散分布图(扩散分布图中的实线)，同时示出了各不同扩散时间的模拟的扩散分布图(扩散分布图中的短划线)。自大横截面通道汇入扩散通道中的点，沿扩散通道的5.3mm、18.6mm、30.4mm和88.7mm处测量扩散分布图。使用10wt％的甘油水溶液。
[0245] 图4中示出了水-甘油混合物的相对粘度(ηr)随甘油含量的增加而增加(圆形)。图4中还示出了通过动态光散射确定的同一样品的粘度测量值(方形)，以及Segur等人报道的文献报道的粘度值(三角形)和Cheng报道的根据经验确定的粘度值(短划线)。动态光散射在下文中进行了进一步详细的描述。
[0246] 使用相同的设备和技术，来确定具有不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)的溶液的粘度。在pH 7.0、20mM的磷酸盐缓冲液中制备含0mg/mL至100mg/mL BSA的样品。于25℃下，利用100nm纳米颗粒并采用40μL/h的流量，对各BSA溶液进行测量。
[0247] 与甘油样品一样，在距离扩散通道的上游端部直至约90mm的，沿扩散通道的12个位置处测量47nm纳米颗粒的扩散分布图。
[0248] 图5中示出了水-BSA混合物的相对粘度(ηr)随BSA含量的增加而增加(圆形)。图5中还示出了通过动态光散射确定的同一样品的粘度测量值(方形)。
[0249] 从BSA实验可以看出，本文所述的方法对于测量生物技术和生物研究中的蛋白溶液的粘度特别有吸引力。
[0250] 很可能是如下的情况：流体样品，例如生物流体样品将包含例如蛋白、蛋白聚集物等组分，该组分具有与用于确定粘度的示踪剂组分相似的尺寸。
[0251] 本发明的方法可用于确定样品粘度，并且很大程度上无需考虑示踪剂组分的尺寸和流体样品内的组分的尺寸。
[0252] 动态光散射实验并不如此。相比之下，尺寸与示踪剂组分相似的组分(例如聚集物)的存在，可能损害基于传统动态光散射检测的技术的应用。
[0253] 这可以在同时含BSA和47nm或100nm颗粒的样品的简单的动态光散射强度实验中看出来。在此，样品包含在pH 7.0、20mM磷酸盐缓冲液中的100mg/mL BSA，并且颗粒以0.05wt％来提供。通过动态光散射，测量各溶液的强度粒度分布。结果示于图6中。
[0254] 当与蛋白分子相比，示踪剂组分不足够大时(图6a)，来自蛋白和纳米颗粒的光散射信号是盘绕的。在这种情况下，对相应于纳米颗粒的峰进行准确分级，以及由此估算溶液粘度是存在挑战的。
[0255] 实际上，根据图6a中强度粒度分布所估计的纳米颗粒的表观直径为103.97±0.34nm，这提供了2.21的相对粘度。这不同于在使用更大示踪剂颗粒时通过本发明的方法确定的1.73的值以及通过动态光散射确定的1.77的值(图6b)。
[0256] 可以通过增加来自示踪剂组分的光散射信号的强度，例如通过增加组分的尺寸或浓度来缓解这一限制。然而，这种优化方法在溶液组成未知的状况下是有挑战性的。
[0257] 如上所述，本发明的方法在很大程度上对于示踪剂组分的尺寸和混合物的组成是不敏感的。
[0258] 动态光散射
[0259] 利用配备有波长为633nm的光源的Zetasizer Nano仪器(Malvern,UK)上在163°以反向散射模式工作来进行动态光散射(DLS)测量。通过测量47nm颗粒的表观扩散系数，来估计水-甘油混合物的粘度，同时对于BSA溶液，考虑100nm的胶质物，因为来自47nm颗粒的散射信号与来自蛋白分子的信号是盘绕的。
[0260] 并联和串联的装置
[0261] 本发明的方法可便于与其他流体分析方法组合。因此，在已经测量了必需的扩散分布图之后，可以将包括样品流和组分流的层状流体流导向至另一微流体装置。因此，扩散通道的下游末端可以与第二流体装置，例如第二分析装置流体连通。第二分析装置可使用流体技术来确定样品流体的又一性质。
[0262] 本发明人之前已经描述了使用流体技术，确定样品流体的组成和该流体内的组分的尺寸(参见例如WO 2014/064438)，流体内的组分的质量(参见例如WO 2015/071681)，以及流体内的组分的荷质比(参见例如WO 2015/071683)。
[0263] 例如，使用流体扩散技术测量分析物的尺寸需要准确知晓容纳该分析物的样品流体的粘度。
[0264] 在预备步骤中，可以通过本申请的方法测量样品流体的粘度。因此，如上所述，将示踪剂组分添加到样品流体的一部分中，并且使该示踪剂组分扩散进入样品流体的另一部分中。
[0265] 随后，样品流体被引向第二扩散装置，在第二扩散装置中，可以研究分析物进入流体或离开流体的扩散。通过这样的方式，可以确定分析物的尺寸，例如流体动力学半径。
[0266] 在一种方法中，在不存在分析物的情况下，确定样品流体的粘度。例如，样品流体可以是含高浓度的变性剂或共存溶质的缓冲液。可以将分析物(例如蛋白)添加到样品流体中，并且可以测量该分析物进入没有分析物的样品流体的扩散。在此记录的扩散分布图能确定分析物的尺寸。
[0267] 图7是示出两个串联式流体装置的布置的示意图。每一装置均具有用于确定流体样品粘度的第一扩散通道，以及用于确定添加至流体样品的分析物的尺寸的下游第二扩散通道。分离在扩散通道的下游端部的流体部分，并且使其转向至第二装置的扩散通道，在第二装置的扩散通道中，使其与容纳有分析物的流体样品接触。
[0268] 因此，图7a示出了具有第一扩散通道12的流体装置11，该第一扩散通道12由上游供应通道13和14供应。一个供应通道13供应具有未知粘度的流体样品流，而第二供应通道14供应额外包含已知尺寸的示踪剂组分(例如标准纳米颗粒)的流体样品流。该流体是示踪剂组分流体。允许样品流体流和示踪剂组分流体流在扩散通道12的上游区接触，并且生成层流。随着流体向下流过扩散通道，使示踪剂组分从示踪剂组分流扩散进入样品流体流。在沿扩散通道12的一个或多个位置处，测量示踪剂组分的扩散。根据这些测量值，可以确定样品流体的粘度。
[0269] 在扩散通道12的下游末端，使层流的一部分，例如样品流体流的一部分经由供应通道16转向至第二扩散通道15。第二扩散通道15由上游供应通道16和另一供应通道17供应，其中该另一供应通道17供应含未知流体动力学半径的分析物的流体样品流。该含未知流体动力学半径的分析物的流体样品流是分析物流。使自第一扩散通道12转向的分析物流和流体流在第二扩散通道15的上游区接触，并且生成层流。随着流体流向下流过第二扩散通道15，使分析物从分析物流扩散进入自第一扩散转向的流体流中。在沿第二扩散通道15的一个或多个位置处，测量分析物的扩散。根据这些测量值，可以确定分析物的流体动力学半径。
[0270] 图7a的装置是两通道装置的示意图，其中扩散通道12、15各自设置有两个上游供应通道13、14、16、17。图7b是三通道装置21的示意图，其中扩散通道22、25各自设置有三个上游供应通道。在三通道装置中，层流生成在扩散通道22、25中，该层流具有中央流体流和两个侧流。组分，例如示踪剂组分或分析物(它们的扩散是待研究的)被包含在中央流中。侧流包含样品流或分析物流。将该流来自第一扩散通道22的部分供应为第二扩散通道25的中央流。如前所述，第一扩散通道22用于为了确定流体粘度的目的而用于监测扩散，第二扩散通道25用于为了确定分析物的流体动力学半径的目的而监测扩散。
[0271] 第一扩散通道22由上游两侧供应通道23和上游中央供应通道24来供应。供应通道23供应具有未知粘度的流体样品流，而中央供应通道24供应额外包含已知尺寸的示踪剂组分(例如标准纳米颗粒)的流体样品流。使样品流体流和示踪剂组分流体流在扩散通道22的上游区接触，并且生成层流。
[0272] 随着流体向下流过扩散通道22，使示踪剂组分从中央示踪剂组分流扩散进入两侧样品流体流的每一个中。在沿第一扩散通道22的一个或多个位置处，测量示踪剂组分的扩散。根据这些测量值，可以确定样品流体的粘度。
[0273] 来自第一扩散通道22的层流的一部分，经由两侧供应通道26被转向第二扩散通道25。将含流体动力学半径的分析物的中央流从中央供应通道27提供至第二扩散通道25。使经转向的样品流体流和分析物流体流在扩散通道25的上游区接触，并且生成层流。
[0274] 随着流体流向下流过扩散通道25，使分析物从中央分析物流扩散进入两侧流体流的每一个中。在沿第二扩散通道25的一个或多个位置处，测量分析物的扩散。根据这些测量值，可以确定流体动力学半径。
[0275] 图8平行示出了用于确定样品流体粘度的流体装置和用于确定分析物尺寸的流体装置的示意图。图8a是二通道装置的示意图，图8b是三通道装置的示意图。
[0276] 并联装置的实验设置与上述串联装置所使用的设置类似。在并联装置中，来自一个扩散通道的流体不被转向至另一扩散通道中。用于粘度确定和流体动力学半径确定的扩散测量并行运行。粘度测量与上面针对串列式装置所述的一样。对于流体动力学半径的测量，样品流体不是提供自用于粘度测量的扩散通道，而是被直接供应至用于流体动力学半径测量的扩散通道。
[0277] 参考文件
[0279] WO 2014/064438
[0280] WO 2015/071681
[0281] WO 2015/071683
[0282] M.T.Valentine,P.D.Kaplan,D.Thota,J.C.Crocker,T.Gisler,R.K.Prud'homme,M.Beck and D.A.Weitz,Physical Review E,2001,64.
[0283] Y.Tseng,T.P.Kole and D.Wirtz,Biophysical Journal,2002,83,3162-3176.[0284] T.G.Mason,H.Gang and D.A.Weitz,journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision,1997,14,139-149.
[0285] F.He,G.W.Becker,J.R.Litowski,L.0.Narhi,D.N.Brems and V.I.Razinkov,Analytical Biochemistry,2010,399,141-143.
[0286] A.Palmer,T.G.Mason,J.Y.Xu,S.C.Kuo and D.Wirtz,Biophysical journal,1999,76,1063-1071.
[0287] A.B.Goins,H.Sanabria and M.N.Waxham,Biophysical journal,2008,95,5362-5373.A.E.Kamholz,B.H.Weigl,B.A.Finlayson and P.Yager,Analytical Chemistry,
1999,71,5340-5347.
1999,71,5340-5347.
[0288] A.E.Kamholz,E.A.Schilling,and P.Yager.Biophysical Journal,80(4):1967-1972,2001.J.B.Segur and H.E.Oberstar,Industrial and Engineering Chemistry,
1951,43,2117-2120.
1951,43,2117-2120.
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
粘度热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈