分散和操作样品体积的方法和设备
阅读：509发布：2022-07-15
专利汇可以提供分散和操作样品体积的方法和设备专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的实施方式涉及对样品体积进行简单、稳固和多用途分散和操作的方法和设备。 流体 装置利用流体 力 之间的相互作用、界面 张力 、螺槽几何形状和形成的液滴和/或分散化体积的最终 稳定性 分隔样品。这些分隔的体积能使样品分离并分隔为随后可操作和分析的局部化阵列。分散化体积的分离连同所述装置的固有便携性使本发明具有用于多个领域的多种用途，包括但不限于PCR、数字PCR、诊断学和 预后 学的 生物 鉴定、癌症诊断和预后、高流体积筛选、单分子和单细胞反应或鉴定、结晶研究和其它统计学过程、 蛋白质 结晶、药物筛选、环境测试和与生物医学鉴定和测量的多种分析检测技术进行结合。最小流体互相连接和简单的流动几何结构使所述装置易于使用和实施，具有制造和操作的经济性，并在其运转中具有稳固性。，下面是分散和操作样品体积的方法和设备专利的具体信息内容。
1.一种方法，其包括：
提供包括以下组件的流体格：
具有流体轴的流体螺槽，和
与所述流体螺槽存在流体交换并与所述流体轴存在偏移的多个流体容纳室；
使第一连续液体流过所述流体格以在所述多个流体容纳室内提供第一液体；和使第二连续液体流过所述流体格，所述第二连续液体与第一液体不混溶，从而所述第二液体将第一液体从流体螺槽移出，同时允许第一液体保留在所述多个流体容纳室中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一液体包括水性溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述第二液体快速流动以将一些第一液体从多个流体容纳室中的至少一个移出。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在使第一连续液体流过之前，使起始连续液体流过流体格，其中所述起始液体与第一液体不混溶，从而使第一液体流过将至少一部分起始液体从流体螺槽和多个流体容纳室中移出。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一液体包括水性溶液。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，使所述第一液体快速流动以将少于全部的第三液体从多个流体容纳室中的至少一个移出。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一液体包含分析物，所述方法还包括在多个流体容纳室中的至少一个内对第一液体进行分析。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分析物包括生物材料。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物材料选自：细胞、病毒、朊病毒、核酸、蛋白质、遗传材料、遗传材料的表达产物、结晶分子或颗粒。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，进行所述分析包括进行生化分析。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一流体包含多个核酸链和一定体积的流体螺槽，所述多个流体容纳室的构造使一个核酸链或无核酸链包含于多个流体容纳室中的各个容纳室，所述方法还包括在多个流体螺槽内进行数字聚合酶链反应(PCR)。
12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分析物在流体容纳室中经历结晶。
13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分析物包含至少一种选自以下稀有细胞：表达恶性表型的细胞、胎儿细胞、循环内皮细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞、用感兴趣的基因转染的细胞、或存在于患自身免疫或自体反应疾病的对象外周血中的T细胞或B细胞的异常亚型。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个流体容纳室中至少一个的形状不同于球形。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述流体容纳室中至少一个的横截面是T形、L形、三角形、矩形、圆形、椭圆形、多边形或正方形。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个流体容纳室中至少一个在流体轴之上的垂直方向位移以保留浮力物质。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个流体容纳室中至少一个在流体轴之下的垂直方向位移以保留稠密物质。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述流体容纳室中至少一个的表面进行改性以影响其与第一液体和/或第二液体的相互作用。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过辅助螺槽向所述多个流体容纳室中至少一个递送材料或能量。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个流体容纳室沿流体螺槽平行、串联或同时平行并串联排列。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使所述多个流体容纳室其中一个的内容物与化学物质混合。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述混合由所述多个流体容纳室其中一个与包含所述化学物质的隔室之间的壁破裂引起。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述隔室位于由流体螺槽限定的平面之外。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述多个流体容纳室中至少一个移出包含第一液体的内容物。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述内容物通过通道螺槽移出。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述内容物通过使另一连续液体流过流体格而移出，所述另一连续液体与所述内容物不混溶。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述另一连续液体的粘度不同于所述内容物的粘度。
28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述另一连续液体包含表面活性剂。
29.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述内容物通过对流体容纳室中至少一个的内容物施加力而移出。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述力选自：热能、真空、气动压力、声波压力、超声脉冲、辐射压力、电磁场、电润湿、光诱导的表面润湿、电毛细管现象、表面或界面张力、热梯度衍生力、静电相互作用、光学力或磁力中的至少一个。
31.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述内容物采用阀移出。
32.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述内容物通过用针穿透流体格而移出。
33.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对从多个流体容纳室其中一个移出的内容物进行进一步操作。
34.一种设备，其包括：
具有流体轴的流体螺槽，所述流体螺槽与第一连续液体的来源存在选择性流体交换，并与不混溶于第一液体的第二连续液体的来源存在选择性流体交换；和
与所述流体螺槽存在流体交换并与所述流体轴存在偏移的多个流体容纳室。
35.如权利要求34所述的设备，其特征在于，所述多个流体容纳室中至少一个的形状不同于球形。
36.如权利要求35所述的设备，其特征在于，所述流体容纳室中至少一个的横截面是T形、L形、三角形、矩形或正方形。
37.如权利要求34所述的设备，其特征在于，所述多个流体容纳室中至少一个在流体轴之上的垂直方向位移以保留第一液体内的浮力物质。
38.如权利要求34所述的设备，其特征在于，所述多个流体容纳室中至少一个在流体轴之下的垂直方向位移以保留第一液体内的稠密物质。
39.如权利要求34所述的设备，其特征在于，对所述流体容纳室中至少一个的表面进行改性以影响其与第一液体和/或第二液体的相互作用。
40.如权利要求34所述的设备，其特征在于，所述多个流体容纳室沿流体螺槽平行、串联或同时平行并串联排列。
41.如权利要求34所述的设备，其特征在于，所述设备还包括与多个流体容纳室中至少一个存在流体交换的第二螺槽。
42.如权利要求34所述的设备，其特征在于，所述设备还包括构造为将材料或能量递送到接近多个流体容纳室中至少一个的第二螺槽。
43.一种进行数字聚合酶链反应(PCR)的方法，所述方法包括：
提供包含以下组件的流体格：
具有流体轴的流体螺槽，和
与所述流体螺槽存在流体交换并与所述流体轴存在偏移的多个流体容纳室；
使第一液体流过所述流体格，其中所述第一连续液体包含多个核酸链，使所述多个流体容纳室中各容纳室内仅提供一个核酸链或无核酸链；
使第二连续液体流过所述流体格，所述第二连续液体与第一液体不混溶，从而所述第二液体将第一液体从流体螺槽移出，同时允许第一液体保留在所述多个流体容纳室中；
在所述多个流体容纳室内对第一流体进行多个热循环；和
检测多个流体容纳室内的核酸链浓度。
分散和操作样品体积的方法和设备
[0001] 相关申请的交叉引用
[0004] 本发明借助美国政府的支持，在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号R01 EB005197的资助下完成。美国政府享有本发明的一定权利。
[0005] 发明背景
[0006] 诸多化学和生物应用的第一步均是将样品体积分散为小的单独体积，以便进行随后的鉴定和分析，其中所述鉴定和分析可以是相同类型或不同类型。这些应用的多样性突出了对具有不同优点的不同样品生成技术的需求。存在若干方法实现该目的。产生小体积样品的传统方法包括采用喷雾器形成气溶胶，并将样品与不混溶相混合以形成乳液。然而，这些方法具有有限性。喷雾器形成的液滴显示很宽范围的大小。类似地，将两个不混溶相混合以形成乳液不产生单分散液滴。而且，任一种方法形成的液滴一旦形成后均难以进行单独操作和分析。此外，这些方法均不适合进行原位鉴定必需的持续监测。
[0007] 形成分散样品的常用方法是将小体积样品分配到小孔或微孔中。尽管这是形成空间定位样品阵列的一种成功方法，但分别填充单个孔是一种单调乏味的过程。此外，人为的误差可妨碍均匀分散样品。为避免该问题，研究者们开发了专门的分散仪器，如机器移液管。然而，对专用分散仪器的需求限制了这些微孔平台的灵活性，并增加了成本。此外还难以对非常小体积(0.5μL以下)的样品进行操作，因为移液管的分散体积较高且存在样品蒸发的问题。(Jackman，R.J.，Duffy，D.C.，Ostuni，E.，Willmore，N.D.和Whitesides，G.M.Anal.Chem.1998，70，11，2280-2287，Morrison，T.，Hurley，J.，Garcia，J.，；Yoder，K.，Katz，A.，Roberts，D.等，Nucleic Acids Research 2006 34，18，15)，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
[0008] 不依赖于手工分散样品的两种样品阵列产生方法是将液滴排列在模式化自装配单层(SAM)上(Biebuyk，H.A.，Whitesides，G.M.Langmuir 1994，10，2790.)和采用电润湿法进行液滴操作(Pollack，M.G.，Fair，R.B.，Shenderov，R.B.Appl.Phys.Lett.2000，77，1725)，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。在这两种情况中，通过基材的表面性质分散样品，产生更为均匀的液滴体积。然而，电润湿法大多用于纳升级以上的样品，并需要复杂的电极图形，大大限制了其实用性。模式化SAM可用来产生较小体积样品，然而，制备这些表面可能非常费力。此外，必须用一层金涂覆表面，然后进行修饰以达到所述模式化表面。这可能会限制分析的可能，因为基材常常不透明。
[0009] 近期出现了样品体积分散的新方法。这些方法包括采用微流体阀使样品体积彼此分离(Unger，M.A.，Chou，H.P.，Thorsen，T.，Scherer，A.和Quake，S.R.Science 2000288(5463)：113-116)或产生液滴流(Sgro，A.，Allen，P.B.，Chiu，D.T.Anal.Chem.2007，
79，4845-4851.)或 单 独 液 滴 (Lorenz，R.M.，Edgar，J.S.，Jeffries，G.D.M.，Chiu，D.T.Anal.Chem.2006，78，6433-6439.)，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
79，4845-4851.)或 单 独 液 滴 (Lorenz，R.M.，Edgar，J.S.，Jeffries，G.D.M.，Chiu，D.T.Anal.Chem.2006，78，6433-6439.)，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
[0010] 然而，这些方法可能具有某些缺陷。例如，采用阀和泵需要复杂的流体控制和造价倾向于昂贵的装置，特别在涉及很多分散样品体积(几百到几千)时。采用稳态方法产生液滴流使随后对液滴的操作和固定化难以进行，但更重要的是，因为其为稳态方法，其常包含样品体积的损失，即存在一些样品的初始损失，因为必须在常规形成液滴之前建立稳态流。此外，这样的流动法需要对流速的精确控制，也会增加最终装置或设备的复杂度和费用。
[0011] 因此，本领域需要操作样品体积的新的方法。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明的实施方式涉及简单、稳固和多用途的分散样品体积的新方法。在具体实施方式中，流体装置不是基于稳态方法如形成液滴流而是基于流体力之间的相互作用、界面张力、螺槽(channel)几何形状和形成的液滴和/或分散化体积的最终稳定性之间的相互作用来分隔样品。这些分隔的体积能使样品分离并分隔为随后可操作和分析的局部化阵列。最小流体互相连接和简单的流动几何结构使所述装置易于使用和实施，具有制造和操作的经济性，并在其运转中具有稳固性。
[0014] 所述装置的多用途的基础在于但不限于：其易于产生和具有可调整性，其由装置内螺槽的表面性质、螺槽的几何形状、界面的性质和连续和不连续相的性质控制。分散化体积的分离连同其固有便携性进一步扩展了用于多个领域的多种用途，包括但不限于：PCR、数字PCR、基因分型、单细胞基因表达分析、确定拷贝数量变化、诊断学和预后学的生物鉴定、癌症诊断和预后、DNA甲基化鉴定、高流体积筛选、单分子和单细胞反应或鉴定、结晶研究和统计学过程、蛋白质结晶、药物筛选、环境测试和与生物医学鉴定和测量的多种分析检测技术进行结合。所述装置的独特稳定性使操作和检测方法可平行进行或串联使用，形成引入补充检测技术的手段。
[0016] 图1中的a和b)为分散装置的示意图和某些特征的图示定义。b)显示样品隔室和主螺槽的放大的分散区部分。这些特征可能具有或可能不具有相同高度。c)采用所述装置分散的样品体积阵列的荧光发射图像。将100μM羧基荧光素溶液用作样品相。不混溶相为含0.01％司盘(Span)80的轻质矿物油。比例尺对应于200μm。
[0017] 图1A中的a和b)流体格的示意图和c)在流体容纳室(fluidic harbor)中形成的流体包的荧光图像。
[0018] 图2为显示采用填充方法1分散样品的图像的示意图和顺序。a)首先用不与样品相(例如水性溶液)混溶的流体(例如油)填充芯片。b)然后将所述样品相缓慢引入到螺槽中。c)之后再次使不混溶相流过所述螺槽。在该步骤中，所述样品相被移出主螺槽但仍保留在隔室内，使所述样品相被分散为主要由隔室几何尺寸限定的体积。采用100μM Alexa488作为样品相、含0.01％司盘80的轻质矿物油作为不混溶相进行实验时间顺序(b和c)。比例尺对应于200μm。
[0019] 图2A为显示实施例1中流体容纳室的流体行为的图像的示意图和顺序。
[0020] 图3显示可将小体积样品引入螺槽中进行完全分散而不造成任何死体积或样品体积损失。a-c)100％样品体积分散和保留的示意图。d)显示该现象的实验时间顺序。穿过螺槽的小样品堵塞物持续填充各随后的隔室，直至所述堵塞物消失后形成液滴。所述图像显示样品相(100μM Alexa 488)的荧光。所述不混溶相是含0.01％司盘80的轻质矿物油，比例尺对应于200μm。
[0021] 图3A中的a-c)为流体包形成和连续流体体积100％保留的示意图。d)显示该现象的实验时间顺序。
[0022] 图4为显示采用填充方法2分散样品的图像的示意图和顺序。a)首先用样品相填充芯片。b)然后使不混溶相流过螺槽。在该步骤中，所述样品相被移出主螺槽但仍保留在隔室内，使所述样品相被分散为主要由隔室几何尺寸限定的体积。采用100nM磷酸盐缓冲液作为样品相、含0.01％司盘80的轻质矿物油作为不混溶相进行实验时间顺序(c)。比例尺对应于200μm。
[0023] 图4A为显示实施例2中流体容纳室的流体行为的图像的示意图和顺序。
[0024] 图5显示可将分散装置设定为保留不同浮力的物质。为采用该方法分散样品，所述样品相必须与所述不混溶相具有不同浮力。a和b)用来保留有浮力物质的设计的一些例子。c)设计为保留有浮力物质的样品隔室的三维示意图。所述样品隔室的高度大于主螺槽的高度。如果所述样品相比所述不混溶相更为稠密(即更重)，则可采用转换为描述为可采用的即低于底板的隔室(而非隔室高于顶板)的螺槽几何形状。
[0025] 图5A为从不同密度或浮力的流体产生流体包的流体格。
[0026] 图6为显示水相流速对分散体积的影响的图像。在图a)、b)、c)和d)中，水相流速分别为0.2、1.1、6.9和8.3mm/秒。对应于这些流速的所得液滴图像显示，分散样品的体积与水相流速成反比。这些图像中的水相为100μM 5，6-羧基荧光素，油相为含0.01％司盘80的轻质矿物油。比例尺对应于200μm。
[0027] 图6A为显示第二连续流体的流速对包体积的影响的图像。
[0028] 图7为显示采用填充方法2的不混溶相流速对分散体积的影响的图像。a)以快速不混溶相流速形成的分散样品。b)以较慢不混溶相流速形成的分散样品。这些图像中的水相为100nM磷酸盐缓冲液，油相为电子氟化液(Fluorinert)。比例尺对应于200μm。
[0029] 图7A为显示其它连续流体的流速对包体积的影响的图像。
[0030] 图8为采用不同不混溶相通过填充方法1(a、b、c、d)和填充方法2(e、f)分散的小体积的例子。用来形成所示样品的不混溶相为：a)含0.01％司盘80的轻质矿物油，b)电子氟化液，c)AS-4，d)AR-20，e)轻质矿物油和f)电子氟化液。
[0031] 图8A为采用不同连续流体形成的流体包的图像。
[0032] 图9显示可加入表面活性剂以促进分散。a)采用纯轻质矿物油尝试的分散。b)采用含0.01％司盘80的轻质矿物油分散的样品。c)采用含0.01％八甘醇单癸醚的轻质矿物油分散的样品。d)采用含0.01％四甘醇单癸醚的轻质矿物油分散的样品。
[0033] 图9A为可用于在流体容纳室中产生流体包的表面活性剂的例子。
[0034] 图10显示可通过改变装置基材的表面性质来调整所述装置的分散能力。a、b和c)为在表面性质不合适的装置中采用填充方法1引入所述装置的样品相缺乏分散的示意图。b和c)显示该现象的实验时间顺序。图b)中引入所述装置的样品相在如图c)所示的随后不混溶相流动期间未得到保留。b和c)中的实验图像显示由100μM羧基荧光素组成的样品相的荧光。所述不混溶相是含0.01％司盘80的轻质矿物油，比例尺对应于200μm。
[0035] 图10A显示改变流体格的表面性质时缺乏流体包形成。
[0036] 图11为样品和不混溶相入口几何形状的一些例子。在a)中直接将两相引入所述装置。各相具有与主螺槽连接的入口螺槽。b)所述装置具有一个可与阀连接的入口。可调整所述阀以选择引入芯片的相。可依次将不同的相引入所述装置。
[0037] 图11A为流体入口构造的例子。
[0038] 图12显示可优化所述装置的分散区以使其达到最适合于应用。a和b)分散区的尺寸。可改变任何或所有这些尺寸。还可改变样品隔室的形状。c)不同样品隔室变化的一些例子。这些样品隔室可与主螺槽具有相同高度或可具有不同高度。d)样品隔室相对主螺槽的不同位置的一些例子。可优化这些隔室的取向以适合于不同应用。
[0039] 图12A显示流体容纳室的各种几何形状。
[0040] 图13显示采用不同形状样品隔室的一些例子分散的水性样品。a)将含0.01％司盘80的轻质矿物油用作不混溶相。b)将电子氟化液用作不混溶相。
[0041] 图13A为在各种形状的流体容纳室中产生的流体包的图像。
[0042] 图14显示还可制造具有引导返回主螺槽的排出螺槽的分散隔室。这些排出螺槽可用来促进样品填充。a和b)具有排出螺槽的样品隔室的一些例子。所述排出螺槽可与主螺槽具有相同的高度或不同高度。c和d)在包括排出螺槽的装置中形成的分散样品。
[0043] 图14A为在多于一个位置处与主流动螺槽连接的流体容纳室的例子。
[0044] 图15为可用来达到大阵列分散样品的装置几何形状的例子。a)可依次或平行填充的5个平行主螺槽。b)具有交替样品隔室的以蜿蜒形式折叠的单个主螺槽。c)具有紧密间隔相邻样品隔室的蜿蜒主螺槽的另一个例子。可预定分散样品的数量和间隔以适合于特定应用。
[0045] 图15A为流体格构造的例子。
[0046] 图16显示采用两隔室系统用于鉴定的多层结构。a-b)显示两种不同样品的填充隔室矩阵。c)显示(a)和(b)的分层结合，其中两组隔室或样品体积之间存在垂直连接以使顶部和底部样品体积可混合。d-f)分别为(a-c)的图示。为清楚起见，移去在(f)中分隔两个层的膜。该薄膜可形成所述隔室的顶板和底板，可采用多种不同方法将其去除以引入两组顶部和底部隔室之间的连接，由此形成两个不同样品体积以进行混合。
[0047] 图16A为由可去除的膜分隔相邻流体容纳室的流体格的多层设计。
[0048] 图17显示采用两隔室系统用于可处理鉴定的平面结构。a)填充样品隔室的3D图像，其中不同样品由薄膜(为清楚起见省略膜)分隔，所述薄膜可形成所述隔室的其中一个壁或可为形成分隔两个隔室的壁的唯一材料。b)由薄膜分隔隔室的填充隔室的2D图像。c)隔室之间的光学膜破坏。d)通过外部或模式加热器进行隔室之间的热学膜破坏。e)膜破裂，两隔室混合融合液滴或分散样品体积。f)所得融合或混合样品。
[0049] 图17A显示由可单独去除的膜分隔相邻流体容纳室的流体格的平面设计。
[0050] 图18显示采用两隔室系统用于大面积鉴定的平面结构。a)填充隔室的3D图像，其中不同样品由薄膜(为清楚起见省略膜)分隔，所述薄膜可形成所述隔室的其中一个壁或可为形成分隔两个隔室的唯一材料。b)由薄膜分隔隔室的填充隔室的2D图像。c)通过外部或模式加热器进行隔室之间的热学膜破坏。d)膜破裂，相对隔室混合融合或混合样品。e)所得融合或混合样品阵列。
[0051] 图18A为由可去除的膜分隔相邻流体容纳室的流体格的平面设计。
[0052] 图19为辅助螺槽示意图的例子。在诸如PCR过程中加热水性分散样品时，辅助螺槽可用来用水使空气可渗透的聚合芯片和/或不混溶相饱和，以抑制体积损失。a)在分散区任一侧具有整合的辅助螺槽的分散装置的例子。在该例子中，主螺槽任一侧各具有两个辅助螺槽。b)a)中所示装置的辅助螺槽和分散区的放大视图。c)主螺槽任一侧各具有单个辅助螺槽的分散装置的例子。d)c)中所示装置的辅助螺槽和分散区的放大视图。
[0053] 图19A为辅助螺槽示意图的例子。图19(b)和(d)分别为1905和1925区的放大视图。
[0054] 图20为不具有水填充辅助螺槽(a-e)和具有水填充辅助螺槽(f-j)的装置中加热的水性分散样品的图像。图像中的样品相为10mM Tris HCl、50mM KCl和1.5mM MgCl2。不混溶相为含0.01％司盘(Span)80的轻质矿物油。
[0055] 图20A为不具有水填充辅助螺槽(a-e)和具有水填充辅助螺槽(f-j)的加热的流体包的图像。
[0056] 图21显示可通过使不混溶相以增大的流速流过所述装置来从样品隔室中释放分散的样品。在这些图像中，所述样品相为1nM磷酸盐缓冲液，所述不混溶相为含0.01％司盘80的轻质矿物油。所述不混溶相的流速为每分钟3μL。比例尺对应于200μm。
[0057] 图21A为通过改变流速从流体容纳室部分释放的流体包的例子。
[0058] 图22为通过使粘度更大的不混溶相流过所述装置来从所述样品移出分散样品的示意图。粘度较高的不混溶相的流动引起分散体积逃出所述隔室。
[0059] 图22A为通过使另一连续流体流入流体格而从流体容纳室完全释放的流体包的例子。
[0060] 图23显示可将外部通道螺槽结合到分散装置中以解决和促进将所选分散样品移出。通过样品隔室螺槽将外部通道螺槽与样品隔室连接。可优化外部通道螺槽和样品隔室螺槽的尺寸以适合于具体应用。a)具有与主螺槽平行延伸的外部通道螺槽的分散装置的例子。该外部通道螺槽与提供各样品隔室通道的样品隔室螺槽连接。b)具有用来单独通向不同样品隔室的三个外部通道螺槽的分散装置的例子。采用的这些辅助样品通道螺槽可具有之前详述的分散几何形状中的任何一种。
[0061] 图23A为通道螺槽释放特定流体包的例子。
[0063] 图23C显示在向通道螺槽施加正压力引起流体流入通道螺槽时释放一部分的流体包的顺序图像。
[0064] 图24为通过界面加热移出样品的方案。a)沿主螺槽长度具有模式或插入加热器的填充样品隔室的示意图。b)随张力减小变形自由度更大的界面示意图。c)应用连续相流(方向如箭头所示)协助从隔室中移出样品。d)从隔室释放后，所述样品形成堵塞物或液滴，在连续相流的驱动下沿螺槽向下流动。可不采用流体流而使用向样品体积施加力来协助移出的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。
[0065] 图24A为通过加热从流体容纳室释放流体包的示意图。
[0066] 图25显示采用直接或间接光学加热从隔室中移出样品。通过用激光直接加热分散样品界面或通过采用在表面上成层的吸收材料。a)填充隔室，星爆标志指示隔室中样品上的多种可能的激光位置。b)定位加热造成的界面变形。c)界面持续变形，与引导样品流出隔室的连续相流结合。d)隔室完全空置，样品可作为堵塞物流而流动。可不采用流体流而使用向样品体积施加力来协助移出的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。
[0067] 图25A为通过界面光学加热从流体容纳室释放流体包的示意图。
[0068] 图26显示采用电润湿法使样品体积移动并将其从隔室中移出。(a)中隔室中的样品已经过褪色处理以显示电极。为清楚起见，(b-d)中省略了电极。可采用独立而非串联导线连接电极来单独处理样品体积。a)显示一种可能的电极排列的样品阵列。b-c)随电极1和2之间的电压变化，所述样品开始移动并润湿越过到电极2上。d)一旦所述样品基本上占据电极2，连续相可用来将堵塞物向下游移动。可不采用流体流而使用施加力以移动样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。也可将电极设置在主螺槽内以采用电润湿法将样品向下游移动。改变表面张力以促进从隔室中移出液滴的描述的其它方法可与该电润湿法结合，以便使从单独隔室移出和操作液滴的性能增强。
[0069] 图26A为通过电润湿法从流体容纳室释放流体包的示意图。
[0070] 图27显示用于阀控制包封样品阵列移出的温度和/或溶剂可降解膜。a)温度和/或溶剂反应性材料呈螺槽之间的三明治形式或被填充入狭窄出口进料螺槽。b)单独加热所述膜后或通过溶剂的其它溶解作用，所述阀溶解，开放出口螺槽。c)使连续相流动，由于R2与R1相比是阻力更低的途径，所述样品体积移动到出口螺槽中。d)样品体积完全占据所述出口螺槽，其它连续相注入使其向出口移动。可不采用流体流而使用施加力以移动样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。
[0071] 图27A为通过破坏临时壁从流体容纳室释放流体包使其进入通道螺槽的示意图。
[0072] 图28显示移出包封样品阵列的磁临时阀。a)将磁珠排列到出口螺槽之上的区域中，将磁铁置于芯片之下，形成对磁珠的向下吸引，完全或部分密封所述出口螺槽。b)去除所述磁铁后，磁珠在芯片下释放，开放所述出口螺槽。c)使连续相流动，由于R2与R1相比是阻力更低的途径，所述样品体积移动到出口螺槽中。d)样品体积完全占据所述出口螺槽，其它连续相注入使其向出口移动。可不采用流体流而使用施加力以移动样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。除磁珠以外，可采用具有合适磁性的其它材料，如永久磁铁和铁流体。
[0073] 图28A为通过开放临时阀从流体容纳室释放流体包使其进入通道螺槽的示意图。
[0074] 图29显示采用直接或间接光学加热从隔室中对样品进行单独处理和移出样品。通过用激光直接加热分散样品界面或通过采用在表面上、样品体积中或不混溶相流体中成层的吸收材料。a)填充隔室阵列(星爆标志指示激光照明)。b)定位加热造成的界面变形。c)界面持续变形，与引导样品流出隔室的连续相流结合。d)所选样品完全从隔室中释放，可沿主螺槽向下自由流动。可不采用流体流而使用施加力以移动样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。
[0075] 图29A显示通过直接或间接光学加热从流体容纳室单独释放流体包。
[0076] 图30显示采用直接或间接光学力和/或辐射压力从隔室中移出单独处理样品。通过光束与样品之间的相互作用产生的吸引力或排斥力。a)填充隔室阵列(红圈指示激光照明)。b)光学力造成的界面变形。c)界面持续变形，与引导样品流出隔室的连续相流结合。d)所选样品完全从隔室中释放，可沿主螺槽向下自由流动。可不采用流体流而使用施加力以移动样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。
[0077] 图30A显示通过光学力从流体容纳室单独释放流体包。
[0078] 图31显示通过直接压力刺激的单独样品逐出(如果致动器阵列可与隔室对齐，则该过程还可实现大量释放)。a)用样品填充隔室。b)在隔室上施加直接压力，使样品堵塞物变形，引导其返回到主螺槽中。c)连续相流的应用能实现将样品体积离开样品隔室阵列被传输到下游。可不采用流体流而使用施加力以移动样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。
[0079] 图31A显示通过压缩从流体容纳室单独释放流体包。
[0080] 图32显示分散后的鉴定分析和提取。a)将样品分散到隔室阵列中。b)将与注射器连接的小针穿过基材插入到样品隔室中(具有机器视野ID标记，可采用自动致动器进行定位)。c)将所述样品提取到注射器中，然后进行传输以供进一步分析(d)。
[0081] 图32A显示通过破坏壁从流体容纳室单独释放流体包。
[0082] 图33为下游样品传输方案。a)分散样品图像。b)从隔室移出的流体流中样品堵塞物的示意图。c)与液滴流区连接的分散区末端，其中加入任选加速鞘流(指示为在主螺槽之上和之下流动)。d)显示两种可能的加工为液滴的技术。左边显示来自单个隔室的一个堵塞物形成一个液滴。右边显示采用鞘流将隔室体积进一步分隔以使所述堵塞物破裂为多个液滴。
[0083] 图33A为释放流体包之后的随后操作的示意图。
[0085] 图34A为通过电生液滴释放流体包的示意图。
[0086] 图35中a)分散装置热循环的示意图。将装置置于热循环仪之上或之中以在分散样品上进行聚合酶链反应(PCR)。也可在热循环中对分散样品进行成像，以进行实时PCR或监测信号增大。如果样品中的模板量经稀释使无样品隔室包含多于一个模板，则所述分散装置可用来进行数字PCR。b)来自经过40个热循环周期的分散实时PCR样品的荧光。除显示的方案以外，可采用用于PCR的使分散装置进行热循环的多种其它方法，如采用外置灯或芯片上整合的电阻加热器，或简单地采用等温PCR方案。
[0087] 图35A为采用本发明进行PCR的示意图。
[0088] 图36显示流体包的结晶。
[0089] 图37显示采用流体包进行细胞计数和血液分析。
[0091] 图39为使流体格与DNA发动机热循环仪相界的机械结构的各组件。
[0092] 图40为使流体格与DNA发动机热循环仪相界的具有阀连接的机械结构的各种视图。
[0093] 图41为使流体格与DNA发动机热循环仪相界的具有阀连接的机械结构的组件。
[0094] 发明详述
[0095] 本发明的实施方式涉及采用流体格形成流体包的分析物质的方法和设备，所述物质包括但不限于化学物质、生化物质、遗传材料或生物细胞。本发明实施方式的可能应用包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、核酸序列扩增(NASBA)、蛋白质和小分子结晶和对生物流体中存在的稀有细胞的分析。
[0096] 本文描述了样品体积分散和操作装置，其可适用于多种不同应用和分析方法。图1显示所述装置的解剖整体视图。在一个实施方式中，所述装置由主螺槽组成，其上散布有高度不同于主螺槽的相邻的样品隔室(室)。可改变这两个特征的尺寸以限定分散样品的体积。所述分散体积一旦形成就驻留在样品隔室内。通过所述装置样品隔室之间的间距来预先限定大型样品阵列的间距。除该具体实施方式以外，也可采用多种其它设计和实施方式，以下将对其进行更详细的描述。
[0097] 以下也将与流体螺槽具有流体交换的样品隔室或室称为“流体容纳室”。这些流体容纳室通常与通过流体螺槽的流体轴之间存在偏移。
[0098] 如果所述流体容纳室的开口的取向不是接受通过螺槽的流体的直接冲击，则所述流体容纳室与通过流体螺槽的流体轴之间存在偏移。在某些实施方式中，流体可以不平行于主流体螺槽的流体轴的角度进入流体容纳室。例如，在一些实施方式中，流体可以垂直于通过流体螺槽流体轴的方向进入偏移的流体容纳室。据称，如果在容纳室中心和流体螺槽中心线之间绘制的线长于螺槽壁和其中心线之间的最短距离，则流体容纳室也可与通过流体螺槽的流体轴之间存在偏移。
[0099] 本文所用的术语不混溶指不形成均一溶液或存在可观察到的分隔流体的界限的流体。这样的界限可在显微镜下通过光散射或通过检测某种分子在一种流体相对另一种流体的优先分布而观察到。
[0100] 本发明的实施方式可包括进行生化分析的方法和设备，其中：
[0101] (1)第一连续流体流过螺槽进入流体格，所述流体格包括保护流体免受螺槽中高速度或速度梯度影响的流体容纳室。
[0102] (2)第二连续流体流过所述流体格，搅乱所述第一流体。
[0103] 在某些实施方式中，第三连续流体在所述第二流体之后流入所述流体格，搅乱所述第二流体。
[0104] 在某些实施方式中，所述第三流体与所述第一流体在化学上相同。
[0105] 在某些实施方式中，一种或多种流体在所述第一流体之后流入所述流体格，各流体分别搅乱之前的流体。
[0106] 本发明的某些实施方式涉及进行生化分析的方法或设备，其中将连续流体依次调换入驻留在流体容纳室中的流体包，所述流体包保持连续流体的顺序。
[0107] 本文所用的术语“调换”指制剂重排。在调换中，在调换之前和之后均保留可识别的顺序。例如，在调换之后，所述可识别顺序可与原始顺序具有相同的次序。在另一个实施例中，在调换之后，所述可识别顺序可与原始顺序具有相反的次序。在另一个实施例中，在调换之后，所述可识别顺序可仅包含原始顺序的偶数条目。在另一个实施例中，在调换之后，所述可识别顺序可仅包含原始顺序的奇数条目。在另一个实施例中，在调换之后，所述可识别顺序可包含原始顺序的分段调换，保留顺序包。
[0108] 在一个实施方式中，顺序指空间组成分布。
[0109] 在分析连续流体的组成时，由于所述流体的自由流动性质，在进行意在揭示组成分布的探询、加热、反应或其它操作时可能难以保持组成特征的空间分布。本发明的实施方式采用连续流体，将其解构为驻留在流体容纳室中的流体包，但在解构过程中也调换所述连续流体的组成特征。例如，如果进入的连续流体在流体体积的右部包含5个生物细胞、在流体体积中部包含10个细胞、在流体体积左部包含15个细胞，则所述调换过程可产生驻留在最左边流体容纳室的包含5个细胞的第一流体包、驻留在中部流体容纳室的包含10个细胞的第二流体包和驻留在最右边流体容纳室的包含15个细胞的第三流体包。由此细胞数量的顺序得以保持，但在调换之后以相反次序存在。
[0110] 调换过程提供的一个优点是在允许操作的情况下以某种方式保留顺序。将连续流体解构为流体包可切断意外混合的可能性和由此可能引起的空间组成信息的破坏。调换能保留原始样品顺序，使可追溯到连续流体进行定位。
[0111] 在一个实施方式中，流过螺槽进入流体格的各流体可保持连续直至进入第一流体容纳室。液滴、泡沫、堵塞物或分段流体为分散的不连续实体，不将其视作连续流体。
[0112] 在一个实施方式中，连续流体包含体积等于或大于两个流体容纳室体积的任何未扰动的流体。在其它实施方式中，连续流体包含体积等于或大于5个流体容纳室体积的流体。在另一个实施方式中，连续流体包含体积等于或大于20个流体容纳室体积的流体。
[0113] 本文所用的“生化分析”指确定流体内存在的分析物的身份、浓度、比例、反应性、物理或分子性质。例如，生化分析可包括PCR、核酸序列扩增(NASBA)、化合物的结晶或沉淀、单细胞生物的观察或细胞鉴定等。“生化分析”还可指感兴趣的过程如反应、晶体生长和纳米颗粒形成。
[0114] 本文所用的“分析物”指感兴趣的物质，其可包括但不限于化学物质、生化物质、小分子、遗传材料、颗粒或生物细胞。
[0115] 术语“流体格”指通过一个或多个螺槽相互连接的流体容纳室的网状物。流体容纳室的排列可能在连接螺槽的一侧或多侧上具有或不具有周期重复性。
[0116] 术语“流体容纳室”指提供保护免受螺槽中流体影响的沿螺槽的位置，由此可在容纳室中形成流体包。流体包在容纳室中累积到充分占据所述体积并基本呈现所述容纳室的形状。例如，如果流体容纳室为矩形，则包含于其中的流体包应基本呈现矩形。在流体包形状与外壳的形状不一致的情况中(例如，如果在外壳为立方体时流体呈现球形)，这样的外壳不视作流体容纳室，因为存在抵抗流体流出外壳壁的的壁力，所述流体无法受到充分保护免受流体螺槽的速度或速度梯度的影响。
[0117] 流体容纳室保护流体包免受高速流体或高速度梯度流体冲击的影响。在某些实施方式中，流体容纳室不阻碍与其进行交换的流体螺槽中的流体。在某些实施方式中，流体容纳室入口处的流动方向垂直于与其进行交换的流体螺槽中的流动方向。
[0118] 在某些实施方式中，“基本呈现容纳室形状的流体包”指与球形状态相比，流体体积的表面积或周长增大2％或更多。在一些实施方式中，“基本呈现容纳室形状的流体包”指与球形状态相比，流体体积的表面积或周长增大5％或更多。在一些实施方式中，“基本呈现容纳室形状的流体包”指与球形状态相比，流体体积的表面积或周长增大10％或更多。在另一个实施方式中，“基本呈现容纳室形状的流体包”指与球形状态相比，流体体积的表面积或周长增大25％或更多。
[0119] “主流体螺槽”指用来依次连接单个流体容纳室的螺槽。所述主流体螺槽提供与流体容纳室的流体交换。
[0120] 在某些实施方式中，流体容纳室的特征为从所述螺槽伸出的突起。流体容纳室仅与一个主螺槽连接，但可与主螺槽进行多于一次的连接。
[0121] 在某些实施方式中，流体容纳室提供对包括于所述流体容纳室内的流体包进行定位或将一个流体包与另一个进行区分的坐标。例如，可为各流体容纳室分配一串独特的文字数字字符识别包括于其中的流体包。在将连续流体样品调换入流体格时，将所述样品解构为物理性质不同的流体包，各流体包根据其驻留的流体容纳室具有独特的可识别性。
[0122] 术语“流体包”指定位的流体体积。流体包可与相同流体剩余部分的体积完全或基本分离。可用中间固体(例如壁)、液体(例如不混溶液体)、气体或真空完成分离。“基本分离”表示在流体包和相同流体剩余部分的体积之间进行桥连的流体直径不大于流体包的液压直径的90％。
[0123] 图1A显示流体格的示意图。在图1A(a)中，连续流体流入具有流体入口101和103以及流体出口102的流体格110。所述流体格包括具有的流体容纳室120用于产生流体包的流体螺槽。图1A(b)显示流体容纳室的剖面图和平面图。在剖面图中，流体容纳室
131与可具有不同高度的流体螺槽133连接。在平面图中，两个流体容纳室134和132与流体螺槽135连接。图1A(c)显示在流体容纳室160中形成的包含150μM羧基荧光素的流体包150的荧光图像。应注意，流体包基本呈现流体容纳室的形状。该情况中的第一和第三流体是含0.01％司盘80的轻质矿物油。比例尺对应于200μm。
131与可具有不同高度的流体螺槽133连接。在平面图中，两个流体容纳室134和132与流体螺槽135连接。图1A(c)显示在流体容纳室160中形成的包含150μM羧基荧光素的流体包150的荧光图像。应注意，流体包基本呈现流体容纳室的形状。该情况中的第一和第三流体是含0.01％司盘80的轻质矿物油。比例尺对应于200μm。
[0124] 流体格可具有不同数量的流体入口或出口。例如，如图11A所示，流体格1120可仅具有单个入口1111，但与流体源1114和1115在流体格外部的T-连接点1113连接。
[0125] 在某些实施方式中，所述第一连续流体和第二连续流体可在流体容纳室处显示不同的表面亲和力或在流体容纳室内显示不同的界面松弛。表面亲和力可包括接触角、界面张力、毛细作用力、润湿、电润湿、电毛细管现象、结合、化学或物理吸附。例如，所述第二连续流体可显示比所述第一流体更强的驻留在流体容纳室内的倾向，由此搅乱之前流体容纳室内静止的第一流体。
[0126] 在某些实施方式中，可用化学或生物试剂对所述流体容纳室进行改性以使与流体接触的表面优先被第一或第二连续流体润湿。例如，可对所述表面进行改性以允许第二流体优先驻留在流体容纳室内，由此搅乱之前静止在流体容纳室中的第一流体。也可对所述表面进行改性以允许所述第一流体优先占据流体容纳室，使第二流体仅可搅乱第一流体的一部分。
[0127] 在某些实施方式中，连续流体可包含各种分析物，包括但不限于化学物质、生化物质、遗传材料(DNA、RNA等)、遗传材料的表达产物(蛋白质、代谢产物)、结晶分子、生物细胞或颗粒。
[0128] 突起可采用各种形状、尺寸并且侧向和轴向偏离螺槽。例如，突起可类似于菱形、五边形、“L”形、“T”形、矩形或三角形。15.流体容纳室的横截面可为T形、L形、三角形、矩形、圆形、椭圆形、多边形或正方形。在流体格内，所述流体容纳室可包括多于一种的几何形状和多于一种的大小且无特定的重复式样。流体容纳室可能具有其它形状。可对流体容纳室的形状进行改性使具有不同界面张力的不同流体可显示不同的优先驻留在流体容纳室内的倾向。
[0129] 小流体包可在流体容纳室中即刻形成，而不采用液滴形成的分离的不同步骤，之后将液滴定位于隔室。区域中的液滴形成和液滴定位可能不具有独立且不同的操作。
[0130] 在某些实施方式中，流体包可呈现外围流体容纳室的形状。
[0131] 在某些实施方式中，小流体包通过依次流动连续而非不连续(例如，堵塞物、液滴或区段)流体进入流体螺槽以占据流体容纳室而形成。
[0132] 在某些实施方式中，流体容纳室产生流体包不需阻抗区。流体容纳室仅与一个主流体螺槽具有流体交换。
[0133] 操作
[0134] 实施例1：用三种流体在流体容纳室中产生流体包
[0135] 采用本装置分散样品的方法不止一种。在填充方法1(图2)中，首先用与待分散样品相不混溶的流体填充所述装置。接着将所述样品相缓慢引入所述装置。之后使不混溶相再次流过所述装置。在该最后一个步骤中，所述样品相被移出主螺槽但仍留在样品隔室中，使所述样品相被分散为主要由隔室几何尺寸限定的体积。所述分散有时可在初始样品相填充步骤中发生。就样品处于水性溶液中的生物鉴定而言，填充方法1会包括首先用不混溶相(例如，油或电子氟化液(Fluorinert))填充所述装置，之后用样品(水相)填充，最后使不混溶油相再次流过所述装置。
[0136] 在该实施例中，如图2A(a)所示，使起始连续流体202流过螺槽进入流体格，所述流体格包含产生并保护流体包的流体容纳室201。在图2A(b)中，使包含分析物211的第一连续流体流过流体格，搅乱起始流体214。这之后，使第二连续流体223流过流体格(图2A(c))，其中流体容纳室与通过螺槽流体的轴299之间存在偏移。图2A(d，e)下部的荧光图片显示在矩形流体容纳室中观察到的荧光运动。
[0137] 在该实施例中，所述起始连续流体为含0.01％司盘80的轻质矿物油，所述第一连续流体为含100μM Alexa488的水性溶液，所述第二连续流体与第一连续流体相同。
[0138] 我们注意到，由于所述矩形流体容纳室保护流体包241免受螺槽243中主流体246的影响，为所述流体包提供相对无应力的环境，所述流体包呈现的形状为流体容纳室的形状而非球形液滴的形状。
[0139] 填充方法1可用来100％分散样品(图3)。移动穿过主螺槽的小样品堵塞物会继续填充各随后的隔室并分为更小的体积直至所述堵塞物消失。这是本应用方法的重要性能，其中待分析的材料量很小，如多种生物鉴定的情况一样。填充方法1是大多数应用分散样品体积的优选方法。
[0140] 在一个实施方式中，产生的流体包的总体积与第二连续流体的进入体积完全相同。可将连续流体体积引入螺槽并将其完全转变为流体包而不造成任何死体积或样本损失。图3A(a-c)显示流体包形成过程和所得连续流体体积100％保留的示意图。由于首先用起始流体314填充螺槽，之后用流体315填充以调换为用于分析的流体包，流体315继续解构为流体包321，直至最后一个流体容纳室保留小于容纳室体积的任何残余连续流体。图3A(d)为显示该现象的实验时间顺序。所述图像显示流体包(100μM Alexa 488)的荧光。
363所示流体为含0.01％司盘80的轻质矿物油，比例尺对应于200μm。
363所示流体为含0.01％司盘80的轻质矿物油，比例尺对应于200μm。
[0141] 在一个实施方式中，采用相反次序将所述第二流体调换为流体包。将所述第二流体的最右边部分调换为最左边的流体包，且由于所述第二流体的左边部分在流动方向上前进，产生的流体包位于右边。
[0142] 实施例2：用两种流体在流体容纳室中产生流体包
[0143] 图4显示采用本装置的第二种分散方法。在该方法(填充方法2)中，首先用样品相填充所述装置。然后通过使不混溶相流过主螺槽来分散所述样品相。就样品处于水性溶液中的生物鉴定而言，填充方法2包括首先用水性样品溶液填充所述装置，之后用不混溶相如油(例如矿物油)或氟化溶剂(例如电子氟化液)填充。与填充方法1类似，随不混溶相流过所述装置，所述样品相被移出主螺槽但仍留在样品隔室中。同样，分散的样品相主要由样品隔室的尺寸限定。与填充方法1的三个步骤相比，填充方法2仅具有两个填充步骤，可能对某些应用具有优势。
[0144] 在该实施例中，如图4A(a，b)所示，仅采用两种连续流体在流体容纳室中产生流体包。使连续第一流体414流过螺槽进入流体格，所述流体格包含产生并保护流体包413的流体容纳室。然后使第二连续流体411流过流体格。图4A(c)显示流体容纳室产生第一连续流体的流体包时流体容纳室的顺序图片。
[0145] 在顺序图像图4A(c)中，所述第一连续流体为包含100nM磷酸盐缓冲液的水性溶液，所述第二连续流体为含0.01％司盘80的轻质矿物油。比例尺对应于200μm。
[0146] 随连续第一流体流过螺槽进入流体格，所述流体进入流体容纳室，受到保护免受主流体螺槽的速度或速度梯度的影响。所述第一流体(水性)随其累积而呈现容纳室的矩形形状。然后所述第二连续流体(油)搅乱留在主流体螺槽中的第一流体，在流体容纳室中形成矩形流体包。
[0147] 在一个实施方式中，采用相反次序将所述第一流体调换为流体包。将所述第一流体的最右边部分调换为最左边的流体包，且由于所述第二流体的左边部分在流动方向上前进，产生的流体包位于右边。
[0148] 实施例3：用不同密度的流体在流体容纳室中产生流体包
[0149] 我们开发的用于样品分散的另一个方法基于对样品相和不混溶相浮力的潜在差异的利用。在该方法中，根据样品相的浮力大于或小于不混溶相的浮力，样品隔室驻留在主螺槽之上或之下。如果样品相的浮力大于不混溶相，所述隔室位于主螺槽之上，如果样品相的浮力小于不混溶相，所述隔室在主螺槽之下。图5包括可用于该方法的可能的分散区几何形状的例子。可通过首先将样品或不混溶相引入所述装置，然后按照填充方法1或2所述的顺序流程来实施该方法。可根据最适合具体应用的原则选择采用的特定流体顺序。
[0150] 在一个实施方式中，实施例1或实施例2采用的流体可具有不同密度。在该实施例中(参见图5A)，所述流体容纳室可驻留在主流体螺槽之上或之下的平面而非螺槽所在的同一平面上，但不在流体轴上。如果包含分析物的流体的浮力大于其它流体，则所述流体容纳室位于主螺槽之上。如果包含分析物的流体的浮力小于其它流体，则所述流体容纳室位于主螺槽之下。图5A(a，b)显示用来保留浮力物质的流体容纳室501、503、511、513的例子。图5A(c)显示图a和图b对应的剖面示意图(上图指由轮廓线510圈出的区域的剖面，下图指由轮廓线520圈出的区域的剖面)，其显示螺槽534正上方用来保留浮力物质的流体容纳室531。所述样品容纳室的高度大于螺槽的高度。如果包含分析物的连续流体的密度大于不含分析物的流体，则所述流体容纳室位于主流体螺槽之下。
[0151] 实施例4：用不同流速的流体在流体容纳室中产生流体包
[0152] 尽管分散样品的体积主要由样品隔室的尺寸确定，但可对其进行细微调整。一种调整方式可通过填充方法1达到。如图6所示，缓慢流动的水相相比快速移动的水相能更大程度填充样品隔室。该填充程度与最终分散样品体积相关。因此，在采用填充方法1时，可通过调整样品相的流速来调整分散样品的精确体积。在填充方法2中，可通过改变不混溶相的流速来改变分散样品的体积(图7)。在不混溶相的流速很快时，移出占据各隔室的一些样品体积，形成较小的样品体积。在不混溶流速较低时，分散样品会较大。
[0153] 在一个实施方式中，连续流体的流速可用来控制容纳室中流体包的形成。尽管流体包的体积主要由流体容纳室的尺寸确定，但也可调整所述连续流体的流速以影响所述流体包的体积。
[0154] 图6A为显示连续流体流速对流体包体积的影响的一系列图像。将包含100μM 5，6-羧基荧光素的水性溶液用作包含分析物的流体，将含0.01％司盘80的轻质矿物油用作其它连续流体。
[0155] 如图6A所示，缓慢流动的流体相比快速移动的流体可更大程度占据容纳室。因此，流体包(100μM 5，6-羧基荧光素的水性溶液)的体积与流体流速成反比，在主要调整基于容纳室体积的情况下作为对流体包体积的二次调整。图6A(a)、(b)、(c)和(d)的流体速度分别为0.2、1.1、6.9和8.3mm/秒。比例尺对应于200μm。产生于8.3mm/秒水性溶液的流体包642明显小于产生于0.2mm/秒的流体包612。
[0156] 或者可调整其它流体的流速以控制流体包体积。在采用实施例2所述方法产生的第二连续流体流体包的流速增大时，流体容纳室不提供对主流体螺槽中高速度的充分保护作用。图7A(a)显示较多包含分析物的水相被较高流速的油(有机)相搅乱，产生较小的流体包701。在油(有机)相的流速降低时(图7A(b))，流体容纳室被较大流体包721所占据。这些图像中的水相为100nM磷酸盐缓冲液，油相为电子氟化液。比例尺对应于200μm。
[0157] 实施例5：用不同流体在流体容纳室中产生流体包
[0158] 可采用各种不混溶相来分散样品。一些不混溶相包括但不限于天然油如矿物油和大豆油、硅油如AR-20和AS-4、PDMS油、氟化油如电子氟化液和全氟萘烷(perfluorordecalin)、有机溶剂如十六烷和苯乙酮。图8显示采用不同不混溶相分散的一组样品图像。
[0159] 在一个实施方式中，不含分析物的流体可包括天然油如矿物油和大豆油、硅油如AR-20和AS-4、PDMS油、氟化油如电子氟化液和全氟萘烷、有机溶剂如十六烷和苯乙酮、或水性溶液如缓冲液或水。
[0160] 图8A显示采用不同流体形成的流体包。用来形成如实施例1所述流体包的不含分析物的连续流体为：含0.01％司盘80的轻质矿物油(图a)、电子氟化液(图b)、AS-4硅酮油(图c)、AR-20硅酮油(图8A(d))。用来形成如实施例2所述流体包的不含分析物的连续流体为：轻质矿物油(图8A(e))和电子氟化液油(图8A(f))。
[0161] 实施例6：用各种表面活性剂在流体容纳室中产生流体包
[0162] 在一些情况中，采用表面活性剂调整分散动力学。图9包括不用表面活性剂分散的样品和采用各种表面活性剂分散的样品的图像。表面活性剂可用来协助从大体积样品形成分散样品。采用的表面活性剂不限于图9所示的例子，可包括例如，非离子表面活性剂如脱水山梨糖醇单油酸酯(司盘80)、两性离子表面活性剂如3-(N，N-二甲基十二烷铵)丙烷磺酸盐(DDAPS)、阴离子表面活性剂如二辛基磺基丁二酸钠(AOT)、阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，更重要的是，尤其适用于某些生物鉴定的聚乙二醇化和氟化的表面活性剂。
[0163] 在某些实施方式中，将表面活性剂加入到一种或多种流体中以协助在容纳室中产生流体包。在图9A中，将表面活性剂如司盘80、八甘醇单癸基醚和四甘醇单癸基醚系统地加入到轻质矿物油中，以研究其对流体包形成的影响。图9A(a)显示在纯轻质矿物油中的水性流体包的图像。图9A(b)显示在含0.01％司盘80的表面活性剂的轻质矿物油中的水性流体包的图像。在图9A(b)中，流体包的形状在此时与容纳室的形状相符。图9B(c)为包含0.01％八甘醇单癸基醚的轻质矿物油中的水性流体包的图像。该情况中的流体包的形状与容纳室的形状相符。图9B(d)为包含0.01％四甘醇单癸基醚的轻质矿物油中的水性流体包的图像。在图9B(c和d)中，流体包的形状在此时与容纳室的形状相符。
[0164] 除图9A中采用的表面活性剂以外，也可引入其它表面活性剂用于在容纳室中形成流体包的目的。其它表面活性剂包括但不限于：两性离子表面活性剂如3-(N，N-二甲基十二烷铵)丙烷磺酸盐(DDAPS)、阴离子表面活性剂如二辛基磺基丁二酸钠(AOT)、阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，更重要的是，尤其适用于需要流体包中整体流体与周围相/壁之间相互作用最小的情况的基于硅酮、聚乙二醇化和氟化的表面活性剂。
[0165] 实施例7：用化学改性的壁在流体容纳室中产生流体包
[0166] 可对另一个参数即分散区的表面进行改性以定义所述装置的分散能力。图10所示装置为玻璃/PDMS芯片，其中在氧化两个表面(PDMS和玻璃)并使二者接触以形成所述装置之后立即用含0.01％司盘80的轻质矿物油进行填充。在将样品相引入该芯片然后引入更多不混溶相流体时，无分散样品形成。相反，图2所示装置为与图10中装置类似的PDMS芯片，但在装置形成之后在115℃烘烤48小时。在用含0.01％司盘80的轻质矿物油填充图2所示装置时，样品相被引入到所述芯片中，之后是更多不混溶相流体，分散样品很容易形成。因此，可对所述装置的表面进行改性以控制分散是否会发生。
[0167] 在某些实施方式中，流体容纳室的壁可进行化学改性以增大连续流体的表面亲和力。例如，图10A显示由聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃制造的流体格。在执行实施例1所述流体方案之前用氧等离子体氧化所述流体格。该情况中的第一连续流体为含0.01％司盘80的轻质矿物油，第二连续流体为包含分析物的水相，第三连续流体与第一流体相同。我们注意到，在容纳室的壁刚被氧化时，无流体包(图10A(b-c))形成。进入流体容纳室的流体不呈现容纳室的形状，也不与容纳室的壁发生显著的相互作用。
[0168] 另一个也用氧等离子体氧化的流体格在氧化之后在115℃烘烤48小时。长时间的烘烤使容纳室的壁具有疏水性(或亲油性)。执行实施例1和之前段落所述的方案。如图2A(b，c)所示，流体包在该情况中很容易形成。
[0169] 此外，可对流体容纳室的壁表面进行化学改性，以增强润湿或协助吸附所选的化学物质、流体、细胞、颗粒或分子。表面改性化学物质可包括但不限于，硅烷如三甲基氯硅烷(TMCS)、六甲基二硅胺烷(HMDS)、1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷((Tridecafluoro-1，1，2，2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane)、氯二甲基辛硅烷、十八烷基三氯硅烷(OTS)或γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷；聚合物如丙烯酸、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺(DMA)、丙烯酸-2-羟乙酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)、环氧聚二甲基丙烯酰胺(epoxy poly(dimethylacrylamide)(EPDMA)或PEG-单甲氧基丙烯酸酯(PEG-monomethoxyl acrylate)；表面活性剂如普流罗尼克(Pluronic)表面活性剂、基于聚乙二醇(PEG)的表面活性剂、十二烷基磺酸钠(SDS)十二烷基三甲基氯化铵(DTAC)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或聚凝胺(PB)；纤维素衍生物如羟丙基纤维素(HPC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)，胺如乙胺、二乙胺、三乙胺或三乙醇胺；含氟化合物如包含聚四氟乙烯(PTFE)或特氟隆的化合物。
[0170] 制造
[0171] 本文制造和描述并显示于附图中的示例装置由聚二甲基硅氧烷(PDMS)或/和玻璃制成。除PDMS和玻璃以外，其它优选的基材包括但不限于硅、热固性聚酯(TPE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚对二甲苯、聚氯乙烯、氟乙基丙烯(fluoroethylpropylene)、热塑聚碳酸酯、聚苯乙烯、环烯烃共聚物、聚氨酯、掺混聚丙烯酸酯的聚氨酯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、25聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚己内酯、聚酮、聚酞酰胺、醋酸纤维素、聚丙烯腈、聚砜、环氧聚合物、热塑性材料、含氟聚合物、聚偏氟乙烯、聚酰胺、聚酰亚胺、无机材料(玻璃、石英、硅、GaAs、氮化硅)、熔融二氧化硅、陶瓷、玻璃(有机)、金属和/或其它材料及其组合。就生物鉴定而言，优选的基材基于聚合物材料，使所述装置可用后即弃供一次性使用。
[0172] 几何参数
[0173] 实施例8：在各种形状的流体容纳室中产生流体包
[0174] 为将液体引入所述装置，根据制造所述装置的材料和感兴趣的填充方法，存在各种不同选择。必须最少采用两种流体以采用本装置分散样品。流体之间转换的方法包括但不限于：装置内用于不同相的内置螺槽(图11(a))、芯片上阀控制或离线阀控制(图11(b))。可调整离线阀以选择引入芯片的相，芯片上阀可控制引入分散区的芯片中的流体类型。可依次将不同的相引入所述装置的分散区。在涉及多个螺槽时，可将不同溶液平行、依次或根据某种预定顺序引入不同螺槽，可进行自动操作。
[0175] 分散区的尺寸具有灵活性，可进行调整以最适合于感兴趣的应用。分散区的变化可包括但不限于图12所示的情况。图12(b)提供分散装置设计中可改变的一些几何参数的例子。图12(c)所示的一组几何形状提供一些可能选择的取样，包括各种不同的样品隔室形状。可能的样品隔室形状不限于所示的这些形状。所述样品隔室可与主螺槽具有相同高度或不同高度。一个实施方式中隔室具有与主螺槽不同的高度，如图1(b)中所示。图12(d)显示样品隔室相对主螺槽的不同位置的例子。可优化这些隔室的取向以适合于不同的应用。图13包括采用具有一组不同分散区几何形状的装置分散的样品的图像。
[0176] 可采用各种平面内和平面外的流体容纳室几何形状，一些例子显示于图12A。例如，流体容纳室可类似于菱形、五边形、“L”形、“T”形、矩形或三角形。在流体格内，所述流体容纳室可包括多于一种的几何形状和多于一种的大小且无特定的重复式样。流体容纳室也可具有多种几何亚单元形状。
[0177] 图13A显示在各种形状包括菱形和T形的流体容纳室中产生的流体包的图像。
[0178] 在一个实施方式中，流体容纳室的高度可高于其连接的流体螺槽。可利用高度差异产生来自不同密度或浮力的流体或具有与界面松弛相关的不同能量的流体包。在一个实施方式中，流体容纳室的高度可低于其连接的流体螺槽。
[0179] 实施例9：在与流体螺槽具有多重连接的流体容纳室中产生流体包
[0180] 也可为分散室配置引导返回主螺槽或辅助螺槽的排出螺槽。这些排出螺槽可用来促进样品填充或样品移除。图14(a和b)显示具有排出螺槽的样品隔室的一些例子。所述排出螺槽可与主螺槽具有相同高度或不同高度。图14(c和d)为在包括排出螺槽的装置中形成的分散样品的图像。
[0181] 在一些实施方式中，流体容纳室可在多于一个位置与流体螺槽连接。例如，如图14A所示，流体容纳室1402(或1411)可为“排出”螺槽1403(或1415)的特征，所示排出螺槽引导返回主流体螺槽以促进流体容纳室中流体包的产生或移除。尽管图14A显示仅与主流体螺槽具有两处连接(例如，图14A(a)中的1401和1403，图14A(b)中的1412和1415)的流体容纳室，但应考虑到流体容纳室可具有任何数量的与主流体螺槽的连接。还应考虑到流体容纳室可具有任何数量的与主流体螺槽连接的排出螺槽。
[0182] 与流体容纳室连接的排出螺槽可与主流体螺槽具有相同高度或不同高度。图14A(a和b)显示具有排出螺槽的流体容纳室的一些例子。图14A(c和d)为在具有排出螺槽的流体容纳室中产生的流体包的图像。
[0183] 实施例10：流体容纳室的排列
[0184] 存在不同方法采用本装置形成大阵列分散样品。图15显示可用来达到大阵列分散样品的装置几何形状的例子。在图15(a)中，5个平行主螺槽并排排列。在多种平行生物鉴定中，平行螺槽的数量最高可为几百，并可能达到几千。可对这些装置依次或同时进行填充。图15(b)所示的一种替代形式具有包括交替样品隔室以蜿蜒方式折叠的单个主螺槽。图15(c)显示具有紧密间隔相邻样品隔室的蜿蜒型主螺槽的另一个例子。分散样品的数量和间隔具有灵活性，可进行调整以适合于特定应用。
[0185] 在某些实施方式中，流体格中可结合有具有流体容纳室的多个流体螺槽。如图15A(a)所示，5个平行主流体螺槽并排排列，包括几百到几千个流体容纳室。这些流体螺槽可依次(一次填充一个流体螺槽)或同时(同时填充所有螺槽)进行填充。
[0186] 在某些实施方式中，所述流体容纳室可位于主流体螺槽的多于一个侧面上。如图15A(b)所示，流体容纳室以交替式样在主流体螺槽(具有6个U形转弯的蜿蜒状)的两个侧面形成。在另一个实施方式中，所述流体容纳室可在非常宽的螺槽的底板或顶板上形成二维阵列。
[0187] 在另一个实施方式中，所述流体容纳室可仅在主流体螺槽的一个侧面上形成。图15A(c)显示仅位于主流体螺槽(具有4个U形转弯的蜿蜒状)一个侧面上的流体容纳室。
[0188] 样品操作
[0189] 实施例11：混合流体容纳室的成分
[0190] 将样品分散后，可实施各种操作技术用于需要进行和监测的鉴定和反应。
[0191] 以2D和3D方式混合隔室
[0192] 由于设计的多用途性和制造的简易性，所述分散方案可以2D和3D两种阵列实施。为实现不同样品体积间的混合，2D阵列对彼此相邻的具有不同成分的样品体积进行定位(参见图17和18)，从而使分隔两个样品体积(隔室)的分隔物(壁)的破坏引起之前包括于两个独立隔室的两个样品体积融合和混合。在3D阵列(图16f)中，不同样品体积在彼此之上或之下堆叠，使分隔顶-底两个隔室的底板或顶板的破坏引起两个不同样品体积成分的融合和混合。各方式的示例性实施可参见图16(3D)以及图17和18(2D)。
[0193] 在某些实施方式中，流体容纳室可与一个或多个流入容纳室相邻，由一个或多个可去除的壁分隔。破坏可去除壁后，所述流体容纳室的成分可共混合。图17A和18A显示流体容纳室的二维排列，其中同一水平平面上的两个相邻的容纳室由可去除壁分隔。破坏所述壁后，流体包发生融合和混合。
[0194] 在一个实施方式中，流体容纳室可在一个或多个流入容纳室之上或之下成层，由一个或多个可去除壁分隔。例如，图16A(f)显示流体容纳室的三维排列，其中位于两个水平平面上的流体容纳室在另一个之上成层，各对相邻的容纳室由可去除壁分隔。
[0195] 所述3D成层设计需要样品隔室在彼此之上排列。图中显示两层，但这可倍增形成更多层。在样品隔室的3D或2D阵列中，成分待相互混合的隔室由薄膜或基材在隔室内进行空间隔离，使相邻隔室的样品体积在薄膜或基材被破坏或去除之前不发生混合。
[0196] 分隔相邻流体容纳室的可去除壁或膜可由可采用以下方法中任一种降解的任何材料制成：光诱导(图17A(c)，破坏膜1712)、热诱导(图17A(d)，条状加热器1711破坏膜1713)、溶剂诱导、电场诱导、磁场诱导、化学诱导、机械诱导、气动诱导、溶解诱导或其组合。
[0197] 该薄膜可由任何可降解(通过光诱导、热诱导、溶剂诱导、电场诱导、磁场诱导或其组合)材料制成，所述可降解材料会作为碎片或溶解物质分别进入不混溶相或连续相(或二者)。优选来自薄膜的材料不溶解进入水相以避免干扰在水相中进行的鉴定。所述膜还可由在连续相中具有某种溶解度而使其成为临时膜的材料制成，一旦样品体积在隔室内发生分散，所述临时膜就在预定时间或在不混溶相进行交换后(用一种类型的不混溶相代替另一种)发生溶解。例如，所述膜可能不溶于硅油但溶于全氟溶剂，其中所述分散过程可在硅油中进行，所述膜溶解可采用全氟溶剂进行，这里的硅油和全氟溶剂均不与水性溶液混溶。
[0198] 在某些实施方式中，可去除壁或膜由优先溶于连续流体中的一种的材料制成。可能需要可去除壁的碎片不溶解进入含分析物的流体，以避免干扰感兴趣的分析物。
[0199] 该薄膜或基材的破坏或去除可基于多种机制，包括但不限于，激光消融、激光加热、光诱导膜破裂、光诱导分子构象改变、光诱导膜在不混溶相或水相中溶解度改变、采用模式加热垫进行热诱导膜去除、电场诱导膜去除、电解、膜介电击穿、膜电穿孔、溶剂诱导膜去除、磁场诱导膜去除、超声诱导膜去除、催化剂或化学诱导膜去除、pH诱导膜去除或其一些组合。
[0200] 在一些实施方式中，分隔相邻流体容纳室的壁可由以下技术中任何一种去除：激光消融、激光加热、光诱导膜破裂、光诱导分子构象改变、光诱导膜在不混溶有机相或水相中溶解度改变、通过模式加热垫进行热诱导膜去除、电场诱导膜去除、电解、膜介电击穿、膜电穿孔、溶剂诱导膜去除、磁场诱导膜去除、超声诱导膜去除、催化剂或化学诱导膜去除、pH诱导膜去除或其组合。
[0201] 在一个实施方式中，分隔相邻流体容纳室的壁可单独去除。
[0202] 2D设计在构造上较为简单，仅需要在相邻隔室之间夹入一个膜层。其一个示例性构造可参见图17和18，其突出了所述设计的单独可处理性或全排可处理性。在图17(a)中，连同17(b)中的填充螺槽的示意图像提供所述螺槽的3D示意图，其中不同样品由薄膜分隔。在图17(a)中，为分隔图像的清楚起见，省略分隔膜。凭借该3D设计，可如上所述采用各种方法破坏所述膜。
[0203] 在某些实施方式中，分隔相邻流体容纳室的多个壁可同时去除。例如，可同时处理包含多个相邻流体容纳室的流体格的整个区域，同时去除分隔相邻容纳室的所有壁。图18A显示5对相邻流体容纳室的例子，各对由可去除壁1811分隔。一条加热元件1821横穿所有5对容纳室，同时去除5个壁，引起5组流体包成分的混合同时进行。
[0204] 除单独处理鉴定或隔室以外，可采用相同破坏方案处理整个芯片区段或芯片的排或所选部分，能使多种样品鉴定或反应(可为同一类型或不同类型)在所述芯片中进行。其一个示例性实施方法可参见图18，其中模式化加热元件用来破坏一行膜，使一排隔室融合。
[0205] 采用辅助螺槽保持样品条件和使用分散样品进行PCR
[0206] 实施例12：辅助螺槽的存在稳定流体容纳室中的流体包
[0207] 在某些实施方式中，用辅助流体螺槽递送的物质能够稳定在流体容纳室中产生的流体包。
[0208] 作为例子，包含遗传材料水性溶液的流体包在流体容纳室中产生，并在聚合酶链反应(PCR)过程中经历加热步骤。流体格由气体可渗透材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。由于流体包被加热，水分蒸发并从容纳室中逸出，导致分析物浓度产生不受控制的变化。两个辅助螺槽(例如，图19A(a)中的辅助螺槽1902和1903，图19A(c)中的辅助螺槽1922和1923)各有一个位于主流体螺槽的各侧，可用来携带具有特定流速的水性溶液以用水使PDMS饱和，最大程度减少流体包体积的蒸发或降低，而通过扩散补充流体包的水性成分。
[0209] 图20A包括不存在(图20A(a-e))和存在(图20A(f-j))用流动水填充的辅助螺槽时加热的流体包的图像。在如图19A所示存在辅助螺槽时加热时，避免或最大程度减少了流体包体积损失。图20A中的流体包包含10mM Tris HCl、50mM KCl和1.5mM MgCl2的水溶液。其它连续流体为含0.01％司盘80的轻质矿物油。所述辅助螺槽的存在能保持流体包体积，由此可在PCR实验的加热过程中稳定流体包组分的浓度。
[0210] 在某些实施方式中，不与流体容纳室进行流体交换的辅助螺槽位于流体容纳室附近，以稳定所述流体容纳室的成分。在一些实施方式中，辅助螺槽携带可扩散组分以注入流体容纳室中流体包的组成成分。在某些实施方式中，辅助螺槽携带抑制流体容纳室中流体包组分逃逸的组分。
[0211] 在一些实施方式中，用辅助流体螺槽递送或去除的能量稳定在流体容纳室中产生的流体包。作为例子，辅助螺槽可携带加热的流体以通过传导升高流体包的温度。或者，辅助螺槽可携带冷却的流体以通过传导降低流体包的温度。流体包的精确温度控制可能是优化PCR反应速率必需的。
[0212] 本发明所述装置的实施方式能使分散和操作过程分离。这部分归因于布局和构造，以及芯片上隔室内样品的稳定性。还受到通过采用辅助控制螺槽保持最佳样品条件的能力的协助。例如，就一些应用如聚合酶链反应(PCR)而言，加热分散样品可能是必需的。如果所述装置由气体可渗透材料如PDMS制成，可能发生加热中样品蒸发的复杂问题。位置接近样品隔室的辅助螺槽可用来用水使气体可渗透的聚合物芯片或不混溶相饱和，以抑制加热水性分散样品时的体积损失。可以最适合具体应用的方式结合这些辅助螺槽。图19提供辅助螺槽示意图的例子。图19(a)中为在分散区两侧各结合辅助螺槽的分散装置样式。在该实施例中，主螺槽任一侧上均有两个薄辅助螺槽。在一个替代构型中，主螺槽任一侧上可能均有一个大辅助螺槽(图19(c))。图20包括不存在(图20(a-e))和存在(图
20(f-j))用水填充的辅助螺槽时加热的样品体积的图像。在包括水性辅助螺槽的分散装置中加热时，避免或最大程度减少了样品体积损失。图像中的样品相为10mM Tris HCl、50mM KCl和1.5mM MgCl2。不混溶相为含0.01％司盘(Span)80的轻质矿物油。可清楚地看到，所述辅助螺槽的存在能保持样品体积，由此在PCR实验的加热和冷却循环中保持浓度。
20(f-j))用水填充的辅助螺槽时加热的样品体积的图像。在包括水性辅助螺槽的分散装置中加热时，避免或最大程度减少了样品体积损失。图像中的样品相为10mM Tris HCl、50mM KCl和1.5mM MgCl2。不混溶相为含0.01％司盘(Span)80的轻质矿物油。可清楚地看到，所述辅助螺槽的存在能保持样品体积，由此在PCR实验的加热和冷却循环中保持浓度。
[0213] 通常，位置常接近样品隔室和分散区的这些辅助螺槽能注入和保持可部分溶于需要在实验之前或期间进行饱和的基材或不混溶相的任何材料。所述辅助螺槽还能使隔室的其它局部环境参数(例如温度)受到主动控制。例如，由于尺寸级别小，芯片的热扩散系数非常大，一旦发生改变，能建立快速平衡。这使所述辅助螺槽作为分隔体积的实时环境控制发挥作用。
[0214] 将分散样品传输出隔室
[0215] 实施例13：从流体容纳室释放流体包
[0216] 在某些实施方式中，可从用来形成流体包的流体容纳室释放所述流体包。
[0217] 流体包在流体容纳室中产生之后，常需要从流体容纳室移出整个或一部分流体包用于进一步分析、处理或监测。
[0218] 分散分隔样品之后，常需要移出一些或全部样品用于进一步分析或监测。这可通过逐滴操作方式(一次移出部分分隔样品)、采用流体转移完全移出所述体积，或采用界面张力改性使所述样品在流动中更易于变形来完成。以下将描述达到移出分隔样品的一些方法。
[0219] 通过改变流速提取分隔样品
[0220] 一种提取或样品体积移出方法是通过使不混溶相以增大的流速流过所述装置。该方法的实验可参见图21。在该图中，所述样品相为1nM磷酸盐缓冲液，所述不混溶相为含0.01％司盘80的轻质矿物油。为从隔室移出所述样品，将不混溶相的流速设为每分钟
3μL。所述不混溶相的流动引起分散体积逃出隔室。通过改变不混溶相的流速，可调整提取液滴的体积，如果需要，可达到完全移出所述样品体积。
3μL。所述不混溶相的流动引起分散体积逃出隔室。通过改变不混溶相的流速，可调整提取液滴的体积，如果需要，可达到完全移出所述样品体积。
[0221] 在某些实施方式中，可通过改变流速从流体容纳室释放流体包。在某些实施方式中，可通过使另一连续流体流入流体格来从流体容纳室释放流体包。在一些实施方式中，可通过改变流体之间的相互作用来从流体容纳室释放流体包。
[0222] 图21A显示通过改变流速从流体容纳室部分释放流体包的例子。在图21A中，所述流体包为1nM磷酸盐缓冲液，所述另一连续流体2105为含0.01％司盘80的轻质矿物油。为从用来形成流体包的流体容纳室移出一部分流体包，将所述轻质矿物油的流速增大到每分钟3μL(在流体包形成之后)。所述轻质矿物油的流动引起所述流体包的各部分逃出容纳室。
[0223] 通过引入第二不混溶相提取分隔样品
[0224] 芯片设计的多用途性能实现结合多重分散连续相入口。移出样品体积的一种替代方法是使具有不同粘度和/或不同密度的第二不混溶相流过所述装置。例如，通过在样品分散之后使粘度更大的不混溶相流过所述装置，可以有序方式从隔室完全移出所述样品并将其转移到不同区域用于进一步分析。该技术还能完全清空芯片，使其再循环供多次使用。在采用利用样品相和不混溶相之间浮力差异的填充方法时，与第一不混溶相具有不同密度的第二不混溶相会从样品隔室移出分散样品。
[0225] 图22A显示通过使另一连续流体流入流体格而从流体容纳室释放的流体包的例子。例如，在流体容纳室中产生流体包之后，可使粘度更高的另一连续流体流入流体格，搅乱所述流体包。可以有序方式从容纳室完全移出所述流体包，并将所述流体包转移到不同区域用于进一步分析。从流体容纳室移出流体包的能力还能完全清空流体格，以使所述流体格再循环并将其用于形成不同流体包。
[0226] 在一个实施方式中，所述进行搅乱的连续流体可能比之前的连续流体粘度更大。
[0227] 在一个实施方式中，所述进行搅乱的流体可能比之前的流体更轻或密度更小。在一个实施方式中，所述进行调换的流体可能比之前的流体密度更大。
[0228] 此外，可通过将不混溶流体转换为包含增大或减小量的表面活性剂或仅包含不同表面活性剂的不混溶流体来进一步调节从隔室进行样品提取。在该情况中，所述第二不混溶相流可以是相同的不混溶油但具有不同类型或量的表面活性剂，或可以是完全不同的不混溶油，其包含相同量或不同量或类型的表面活性剂。一旦使该具有不同表面活性剂含量的第二不混溶相流过芯片，一些表面活性剂会迁移到将样品溶液与不混溶相分隔的界限，由此改变界面张力并使样品体积更易于发生界面变形和更易于从隔室移出。
[0229] 在一个实施方式中，所述进行搅乱的连续流体可与之前的连续流体类似或相同，但与不同量的表面活性剂混合。在另一个实施方式中，所述进行搅乱的连续流体在化学上可不同于之前的连续流体，但与相同组成的表面活性剂混合。这两个实施方式均改变流体包的界面张力，可使所述流体包更易于发生界面变形和更易于从用来产生所述流体包的流体容纳室排出。
[0230] 通过结合外部通道螺槽从隔室完全提取样品体积
[0231] 从分隔区提取样品的另一种方法是通过引入外部通道螺槽。可利用外部通道螺槽以受控方式移出样品体积(图23)，可将这些通道螺槽结合到分散装置中以处理和促进单个所选分散样品的移出。通过样品隔室螺槽将外部通道螺槽与样品隔室连接。可优化外部通道螺槽和样品隔室的尺寸以适合于具体应用。图23显示一些可用的结合技术，整个阵列(图23(a，b))和区域选择性方式(图23(c，d))均可采用。由于分散区中的装置具有灵活性，这些外部通道螺槽可采用之前详述的分散几何形状中的任何一种。图23(a)显示外部通道螺槽与主螺槽平行延伸的分散装置的例子。该外部通道螺槽与提供进入各样品隔室通道的样品隔室螺槽连接。可将所述外部通道螺槽设置为如所需一样多或一样少的样品隔室发生相互作用，如图23(c，d)所示具有用来独立处理不同样品隔室的3个外部通道螺槽的分散装置的例子。通过向这些外部通道螺槽施加正压力，例如，可将所述分散样品从隔室推入不混溶相流或主螺槽中，它们可在其中被输出用于进一步分析。除采用流体传输排出或逐出的样品体积之外，可采用施加力以移动样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。
[0232] 在一个实施方式中，可通过进入通道螺槽的流体从流体容纳室释放流体包。图23A显示结合于流体容纳室旁以释放流体包的通道螺槽，整个流体格(图23A(a，b))和选择性方式(图23A(c，d))均可采用。图23A(b)为由轮廓线2302圈出的图23A(a)的放大视图，其显示具有与主螺槽2334平行延伸的外部通道螺槽2333的流体格的例子。可将所述外部通道螺槽设置为如所需一样多或一样少的流体容纳室发生相互作用，如图23A(c，d)所示具有用来独立处理不同流体容纳室的3个外部通道螺槽2363、2373和2383的流体格的例子。通过向这些外部通道螺槽施加正压力，可从流体容纳室释放流体包使其进入主螺槽中，所述流体包可在其中被输出用于进一步分析。图23B显示通过对与各流体容纳室连接的外部通道螺槽施加正压力选择性释放的两个流体包2373和2377的顺序图像。主流体螺槽2379的流速为1μL/分钟。通过人工操作填充油的注射器来施加所述正压力。比例尺对应于100μm。图23C显示采用替代通道螺槽构型的流体包释放的顺序图像。
[0233] 在一个实施方式中，可通过进入通道螺槽的流体从流体容纳室释放一部分流体包。图23C显示在向通道螺槽2389施加正压力引起流体流入通道螺槽时释放一部分2394(之后为2391)的流体包2390的顺序图像。通过人工操作填充油的注射器来施加所述正压力。主螺槽的流速为1μL/分钟。比例尺对应于100μm。
[0234] 在另一个实施方式中，流体包通过临时壁与通道螺槽分隔。如图27A所示，通道螺槽2702通过温度或溶剂反应性壁或膜2703与流体容纳室2701分隔(图27A(a))。在用条状加热器2712加热后或通过溶剂溶解效应，所述膜溶解/破裂，使流体容纳室和通道螺槽之间发生流体交换(图27B(b))。然后驻留在流体容纳室内的流体包可流入用于收集的通道螺槽。如果R2是流体阻力低于R1的途径，则所述流体包可移动进入通道螺槽(图27B(c))。一旦进入通道螺槽，所述流体包向下游移动以供进一步分析(图27B(d))。除采用条状加热器的直接加热方案和壁或膜溶解以外，可采用其它壁或膜技术，如直接和/或间接光学加热方法以启动壁或膜破裂。
[0235] 在另一个实施方式中，流体包通过可转换阀与通道螺槽分隔。例如，如图28A所示，可在流体容纳室和通道螺槽2801之间设置芯片上阀2803以控制流体包2806的释放。作为例子，磁珠2805可位于流体容纳室和通道螺槽之间，防止流体交换。将磁铁条2802置于流体格之下以控制磁珠的位置(图28A(a))。在去除流体格下的磁铁后，磁珠可被释放，使流体容纳室和通道螺槽之间发生流体交换(图28A(b))。一旦通道螺槽开放，如果R2与R1相比是阻力更低的途径，则流体包可进入通道螺槽(图28A(c))。一旦进入通道螺槽，所述流体包可发生融合或保持独立，并向下游移动以供进一步分析(图28B(d))。图中显示采用永久磁铁，虽然也可采用电磁体，可在R1和R2之间调节阻力以从隔室部分移出流体包。
还可采用其它直接或间接机械变形方案以实现阀控制，如采用小机械点(如来自盲文显示器(Braille display))以使基材变形并由此将其用作阀。
还可采用其它直接或间接机械变形方案以实现阀控制，如采用小机械点(如来自盲文显示器(Braille display))以使基材变形并由此将其用作阀。
[0236] 通过采用热实现界面张力或热膨胀提取分隔样品
[0237] 在某些实施方式中，可通过在流体包上施加力来从流体容纳室释放流体包。力可包括但不限于，真空、气动压力、声波压力、超声脉冲、辐射压力、电磁场、电润湿、光诱导表面润湿、电毛细管现象、表面或界面张力、热梯度衍生力、静电相互作用或磁力。
[0238] 可通过采用温度改变(例如降低)隔室内样品的界面张力(IFT)协助从隔室提取样品。例如，降低IFT使样品体积更易于发生界面变形并更易于通过流体从隔室移出。这样的一种方案可参见图24，其中在样品-不混溶相界限处采用模式加热垫。可调整这些温度垫以使区域在不混溶相流动时优先并选择性释放样品。例如，仅加热预先确定的样品隔室的界面。在从隔室释放后，所述样品形成堵塞物或液滴并受连续相流的驱动沿螺槽向下流动。除流体以外，可采用通过施加力以移动样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力或磁力。
[0239] 在某些实施方式中，可通过改变温度从流体容纳室释放流体包。改变温度可直接改变界面张力并可使流体包从流体容纳室释放。该实施方式的示意图可参见图24A，其中模式加热垫2402位于流体容纳室2403和流体格2401的主流体螺槽的界限附近。可调整这些加热垫以使区域在连续流体流动的情况下优先并选择性释放流体包。从容纳室释放后，流体包受连续流体相流的驱动沿螺槽向下流动。达到流体包释放的其它方案包括但不限于采用激光点加热所选流体包的界面以改变界面张力并引起流体包从流体容纳室选择性释放。
[0240] 模式加热垫也可用来加热不混溶相或水相以诱导热启动体积变化而非加热界面以实现IFT变化，由此从隔室逐出样品。例如，加热不混溶相产生泡沫以从隔室排出样品体积。
[0241] 在某些实施方式中，可通过相变从流体容纳室释放流体包。在一些实施方式中，可通过产生泡沫从流体容纳室释放流体包。在一个实施例中，模式加热垫也可用来加热流体包以诱导气泡产生而非加热流体包以实现界面张力变化，由此从容纳室逐出流体包。如图25A所示，在另一个实施例中，可采用辐射源(例如具有聚焦激光)代替热源以引起界面张力变化或诱导相变。通过使聚焦激光靶向流体包2502和不混溶连续流体2503之间界面界限2501，可通过光学加热扭曲所述界面随后引起流体包释放。由于聚焦激光系统可简单地进行测量、改装并具有动态性，还可通过用激光直接加热或通过采用在表面上成层的吸收材料来单独处理感兴趣的流体包并从容纳室移出所述流体包。这样的可单独处理系统的一个例子可参见图29A，其中在所示5个流体包中，通过将激光聚焦在界面2912，仅有流体包
2911被释放进入主螺槽。
2911被释放进入主螺槽。
[0242] 以与采用模式加热器以改变界面张力或实现热膨胀的相似方式，还可采用直接光吸收(例如用聚焦激光)或间接光学加热(例如吸收周围材料或模式元件)，如图25所示。由于聚焦激光系统可简单地进行测量并具有动态性，还可通过用激光直接加热液滴/堵塞物界面或通过采用在表面上成层的吸收材料来单独处理感兴趣的隔室并从所述隔室移出样品。所述可单独处理系统的一个例子可参见图29。
[0243] 如采用加热垫进行加热的情况，一旦界面变形或热膨胀发生，可采用连续相使所述样品流出隔室，形成液滴样品液滴/堵塞物流。类似地，除流体以外，可采用通过施加力以移动样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力、超声或磁力。
[0244] 采用电润湿驱动分散体积离开隔室来提取样品
[0245] 通过将电极模式整合到所述装置中，可采用电润湿方案来引导液滴运动。该方案要求电极在分散隔室和由小距离分隔的主流体螺槽中形成模式(图26(a))。采用电润湿使样品堵塞物移动需要控制置于电极两侧上的电荷。通过改变它们之间的电荷，可改变一个电极上液滴的润湿角，使样品体积移动并使其从隔室移出。
[0246] 在一个实施方式中，可通过电润湿从流体容纳室释放流体包。通过将模式电极2604(与导线2601电连接)和2602(与导线2603电连接)整合到流体容纳室和主流体螺槽2605中(图26A(a))，由于电极带有电荷，可增大主流体螺槽的表面润湿，由此诱导流体包移动出容纳室进入主流体螺槽。可通过采用独立而非串联的导线连接电极来单独处理所述流体包。图26A显示该方法的示意图，其中从流体容纳室同时提取出一组5个流体包进入主流体螺槽。可通过光学手段控制表面润湿，其中光照明引起所述表面的润湿性质改变(例如，由于光诱导分子取向或表面分子排列变化)。
[0247] 还可通过采用独立而非串联的导线连接电极来单独处理分散的样品。图26显示所述技术的可能利用，其中从隔室同时提取一系列液滴进入不混溶流体。也可将电极设置在流体螺槽内以采用电润湿法将样品向下游移动。
[0248] 对外部通道螺槽采用膜分隔引起临时封闭来提取样品
[0249] 引入外部通道螺槽可在分散之后沿不同途径引导样品流。可通过能进行阀控制和将样品隔室与通道螺槽分隔的温度和/或溶剂可降解膜将这些螺槽与主分散隔室分隔。一个示例性实施方法可参见图27。该分隔膜可以是温度和/或溶剂反应性材料，所述膜夹在样品隔室和通道螺槽之间(图27(a))。在单独加热膜后或通过溶剂额外的溶解效应，所述膜溶解/破裂，开放出口螺槽(图27(b))。一旦去除了所述膜，外部通道螺槽就可通向样品隔室，连续或不混溶相可流动。由于R2与R1相比是阻力更低的途径，样品堵塞物移动进入出口螺槽(图27(c))。一旦进入外部通道螺槽，所述样品堵塞物在进一步注入连续相后向下游移动以供进一步分析(图27(d))。虽然显示的是直接加热方案，但直接和/或间接光学加热方法也可用来启动膜破裂。还可采用如上所述的多种其它膜破裂机制。
[0250] 采用外部操作螺槽阀控制提取样品
[0251] 外部通道螺槽也可通过采用直接或间接芯片上阀控制(例如磁或用机械变形)具有调节通道用于移出分隔样品阵列。这样的一个示例性实施方法可参见图28。将磁珠排列到出口螺槽之上的区域中，将磁铁置于芯片之下，形成对磁珠的向下吸引，完全或部分密封所述出口螺槽(图28(a))。去除芯片下的磁铁后，磁珠释放，开放所述外部通道螺槽(图28(b))。一旦外部通道螺槽开放，连续相可流动，由于R2与R1相比是阻力更低的途径，样品堵塞物移动进入外部通道螺槽(图28(c))。一旦进入外部通道螺槽，样品堵塞物在进一步注入连续相后向下游移动以供进一步分析(图28(d))。图中显示采用固定磁铁，虽然也可采用电磁体，可在R1和R2之间调节阻力以从隔室逐滴移出样品。采用电磁体还会使隔室可重新密封，可实施简单阀控制，其可用来冲洗和补充芯片供进一步使用。还可采用其它直接或间接机械变形方案以实现阀控制，如采用小机械点(如来自盲文显示器)以使基材变形并由此形成可处理的阀控制。
[0252] 采用光学力效应的单独可处理性和样品移出
[0253] 除加热效应以外，可采用直接或间接光学力和/或辐射压力，通过由光束与样品之间的相互作用产生的吸引或排斥力从隔室单独移出分散样品。这样的一个实施方法如图30所示。所述激光用来在样品上施加力，依靠光学辐射力扭曲界面和/或移动界面(图30(b，c))。采用该吸引/或排斥力(取决于介质的折射率和所用光束的形状和大小)，所选样品可从隔室释放并可沿螺槽向下自由流动(图30(c，d))。除流体以外，可采用通过施加力以在主螺槽中传输样品体积的其它方法，所述力如辐射压力、电场衍生力、表面张力衍生力、热梯度衍生力、超声或磁力。
[0254] 在某些实施方式中，通过光学力从流体容纳室释放流体包。作为例子，可采用直接或间接光学力或辐射压力，通过激光束与流体包的相互作用产生的吸引或排斥力从流体容纳室移出单独流体包。图30A显示该方法的实施。激光用来在流体包3001上施加光学辐射力3011，扭曲界面3012和/或移动所述界面(图30A(b，c))。采用该吸引/或排斥力(取决于周围流体相对于流体包的折射率和所用激光束的形状和大小)，所选流体包可从流体容纳室释放(图30A(c，d))。
[0255] 对隔室采用定向压力的单独可处理性和样品移出
[0256] 在某些实施方式中，通过压缩从流体容纳室释放流体包。该方法的示意图可参见图31A。作为例子，流体格可由弹性体材料制成，使应用压缩力(例如压力)3111后，流体容纳室收缩或塌陷，逐出其中的流体包3112。致动器阵列可位于流体格之上或之下，并且这些致动器可编入独立的程序以在流体容纳室上施加压缩力。例如，可采用单独可编程的机械点阵列如来自盲文显示器的阵列达到本文所述流体包的释放方法。
[0257] 通过对隔室采用外部施加的直接压力(之上、之下或在平面内)，应可能实现使隔室临时塌陷，有效逐出单独样品，将成分挤出进入主不混溶流体螺槽。该技术的示意图可参见图31。如果致动器阵列与隔室对齐，该过程还允许大量释放。例如，可采用单独可编程的机械点阵列如来自盲文显示器的阵列达到本文所述样品体积逐出的方法。
[0258] 通过穿透隔室顶部的直接注射器移出提取样品
[0259] 通过选择可易于被具有小针尖直径的小针穿透的基材，可完成样品体积分散后阵列的微注射器提取，并将其传输到外部仪器供进一步分析。一种可能方案的示意图可参见图32，其中将针定位，在鉴定或分析之后提取隔室体积。通过现代机器视野和各隔室旁识别标记的协助，可对所述针定位，采用可编程和自动化的致动器提取样品。
[0260] 在某些实施方式中，可通过破坏壁从流体容纳室释放流体包。如图32A所示，流体格可由软材料制成，使可通过穿透容纳室的顶部或底部从流体容纳室释放流体包。在一个实施方式中，可通过用小针3212进行穿透来从流体容纳室释放流体包3211。通过现代机器视野、定位设备和各流体容纳室旁识别标记的协助，可对所述针进行具有高度精确性的定位，可采用可编程和自动化的致动器提取流体包。
[0261] 采用电生液滴提取样品
[0262] 已通过对不混溶相界限施加电脉冲对液滴形成过程进行了说明。采用该方法，可从隔室内包含的样品内进行液滴电生，分隔仍位于隔室内的样品体积。示例性的实施方法如图34所示，其中所述样品被分隔为阵列(图34(a))，在对与样品相邻的电极施加高电压后，开始形成泰勒锥(图34(b))。该高电压供给的脉冲能实现从样品孔进行受控液滴电生，可使其向下游流动以供进一步分析(图34(c))。
[0263] 在某些实施方式中，通过施加电场从流体容纳室释放流体包。作为例子(图34A)，可通过用高电压电脉冲破坏流体界面从流体容纳室释放流体包。流体包可与电极3401接触，而周围流体可与另一个电极3403接触。如图34A(a，b)所示，在两个电极之间施加电势差后，在流体包/不混溶连续流体界面形成锥形逐出物(泰勒锥)3412，小液滴3423可与流体包分隔。施加电势脉冲可提供受控从流体包分隔出的液滴，其可向下游流动以供进一步分析(图34A(c))。
[0264] 后隔室提取和进一步操作
[0265] 实施例14：在从流体容纳室释放流体包之后的流体包分析
[0266] 一旦所述样品从样品隔室阵列移出，如果向主螺槽下游流动，主螺槽下游存在多种处理方法。一种方法是将流过螺槽的堵塞物转变为液滴。一旦所述堵塞物被转移到较大流体区，其界面会松弛，由此形成液滴并能实施传统的液滴操作方案，包括但不限于，分类(光学、流体动力学、电动学)、融合(递送或被递送试剂)、分裂、混合、停放(docking)、储存、冷冻、加热和用于整合到分隔螺槽中的界面融合(例如毛细管电泳或毛细管凝胶电泳)。
[0267] 在某些实施方式中，在从流体容纳室释放流体包之后，对释放的流体包进行进一步操作。作为例子，可对释放的流体包进行分类(采用光学、流体动力学或电动学方法)、与另一个流体包融合以进行化学反应、分裂为较小流体包、混合、停放、冷冻、加热或与另一流体融合用于整合其它化学分离技术(例如，毛细管电泳或毛细管凝胶电泳)。图33A显示可能方案的取样，其中流体包一旦释放就可对其进行操作：可由图33A(c)中的侧向螺槽3325和3322和图33A(d)中的3331和3334注射流体作为鞘流(以控制流体包轨道)、加速流(以控制流体包速度或间隔)或作为剪切流以从流体包产生液滴3342(图33A(d))。可采用操作释放流体包的其它方案。
[0268] 也可对所述流体作为一个整体作进一步改动，例如，以便以半连续方式进行进一步热循环用于包括PCR的应用。
[0269] 在某些实施方式中，在流体包从流体容纳室释放之后，所述流体包经历化学反应。作为例子，包含遗传材料的释放的流体包可在聚合酶链反应(PCR)中经历一系列热循环以扩增所述遗传材料。
[0270] 图33显示两种常用的堵塞物到液滴的转移方案。一旦所述堵塞物转移到连续/不混溶相流体螺槽的末端，任选引入加速流或鞘流(在图33(c)中显示为在主螺槽之上和之下流入)以在液滴进入较大流体螺槽时分隔所述液滴。两个处理步骤的示意图可参见图33(d)，其中左图显示来自单个隔室形成一个液滴的一个堵塞物。右图显示通过采用鞘流将所述堵塞物分裂为多个液滴进行分隔的来自单个隔室的样品体积。
[0271] 除以上操作以外，还可聚合水相-不混溶相界限，使样品体积包含于界面聚合的聚合物的外壳内。
[0272] 在某些实施方式中，在流体包从流体容纳室释放之后，所述流体包可发生聚合以形成包封体积。作为例子，可将所述两种连续流体之间的相界限交联到邻近的膜中以形成固体界限保护流体包成分。在另一个实施例中，可将整个流体包交联到凝胶中。在一个实施方式中，可将流体包交联到凝胶中而不使其从流体容纳室释放。
[0273] 应用
[0274] 实施例15：流体容纳室中流体包的分析
[0275] 一旦样品体积被分散，根据本发明所述的灵活性方法和装置的实施方式对多个领域的应用具有多用途性，包括但不限于PCR、数字PCR、实时PCR、等温PCR、诊断学和预后学的生物鉴定、癌症诊断或预后、疾病诊断或预后、遗传筛选、基因分型、确定拷贝数量变化、DNA甲基化分析、高流量筛选、单分子和单细胞反应或鉴定、单细胞基因表达特征分析、单细胞器研究、单分子和酶动力学、单细胞蛋白质组和“组”研究、结晶研究和统计学过程、蛋白质结晶、药物筛选、环境测试、有机和无机分子的合成、纳米颗粒和胶囊的合成以及与生物医学鉴定和测量的多种分析检测技术进行结合。最小流体互相连接，简单流动几何结构使所述装置易于使用和实施，可优化用来形成所述装置的材料用于分析或感兴趣的读出方法。
[0276] 在某些实施方式中，流体容纳室可用来进行生化分析，包括但不限于：数字PCR、实时PCR(RT-PCR)、NASBA、单细胞成像、单细胞识别或计数、诊断学和预后学的生物鉴定、高流量筛选、单分子或单细胞反应或鉴定、单分子和酶动力学、单细胞蛋白质组或其它“组”研究、蛋白质或其它物质的结晶、药物筛选、环境测试、统计分析、有机和无机分子的合成以及纳米颗粒和纳米胶囊的合成。
[0277] 同样地，所述方法和装置的一个具体实用性能是在分析之前将样品分为多个独特等份的能力。一旦与分离或分析技术结合，该方法能以100％或接近100％的效率等分小体积样品，由此减少样品损失并具有多个样品等份用于平行或重复分析或同时进行二者。
[0278] 在某些实施方式中，从流体容纳室释放的流体包可与其它分析检测技术结合用于生物医学鉴定和测量。
[0279] 聚合酶链反应(PCR)和遗传分析
[0280] 实施例16：在流体容纳室中的流体包内进行遗传分析
[0281] 可很容易地对装置进行热循环以在分散样品上进行PCR。也可在热循环中对所述分散样品进行成像，以进行实时PCR。如果样品中的模板量经稀释使无样品隔室包含多于一个模板，则所述分散装置可用来进行数字PCR。可采用该技术形成分散样品体积的大阵列，所述装置非常适合数字PCR。图35显示采用本发明进行实时PCR的示意图。图35(b)中显示来自经历了40个热循环的分散实时PCR样品的荧光图像。可实施多种其它方案将本分散装置与数字PCR结合，包括采用整合的电阻加热器或热电装置进行芯片上PCR。也可采用热循环的其它芯片外方案，如加热灯或其它辐射源以加热样品体积用于PCR应用。
[0282] 在某些实施方式中，驻留在流体容纳室中的流体包可包含多个拷贝的遗传序列(DNA或RNA)。在一个实施方式中，驻留在流体容纳室中的流体包可包含不多于一个DNA分子。在一个实施方式中，驻留在流体格的流体容纳室中的至少一个流体包可不包含任何DNA。
[0283] 在一个实施例中，包含驻留在流体容纳室中的流体包的流体格可进行热循环以进行PCR。可在热循环过程中对各单独流体包进行成像以进行实时PCR。如果样品中的模板量经稀释使无流体包包含多于一个模板，则该流体格可用来进行数字PCR(或数字实时PCR)。流体格可迅速产生大量流体包，所述流体包各包含不多于一个拷贝模板且根据其驻留的流体容纳室各具有独特的可识别性。图35A显示本发明用于进行实时PCR(或任何形式PCR)的示意图。图35A(b)显示来自包含经历了40个热循环的实时PCR试剂的流体包的荧光图像。
[0285] 在某些实施方式中，流体容纳室可与加热器接触以进行数字PCR。接触的加热器可包括加热灯、传导加热器或辐射源。
[0286] 在某些实施方式中，流体格可通过机械结构与DNA发动机热循环仪连接。图38显示这样的用来作为通用界面以将流体格与市售DNA发动机热循环仪连接的机械结构的各种视图。在图38中，该机械结构以平面视图(3801)、反面视图(3802)、末端视图(3803)、倾斜视图(3804)和侧向剖面图(3805)显示。图39显示这样的机械结构的各组件：所述结构可由在一侧的具有铜指3908的热导性铜顶板3904、在另一侧的支持流体格3902的芯片持夹器3903和3907以及固定所述组件的止动螺栓3901和3905组成。通过与流体端口3906连接的管道将流体递送到流体格。
[0287] 图40显示引入阀和O环衬垫的替代机械结构设计。在图40中，所述替代机械结构以平面视图(4001)、反面视图(4002)、末端视图(4003)、倾斜视图(4004)和侧面视图(4005)显示。图41显示所述替代机械结构的各种组件，其包括在一侧的具有铜指4101的热导性铜顶板4112、在另一侧的支持凹进槽4110中流体格4103的芯片持夹器4106和4107以及固定所述组件的止动螺栓4102和4109组成。包括阀连接4104和O环衬垫4105、4108和4111以提供稳固的流体密封和控制。
[0288] 虽然数字PCR非常适合用所述装置和方法进行，但也可采用其它类型的PCR，包括但不限于标准PCR、实时PCR、用于分析RNA和单细胞的逆转录PCR以及各种类型的等温PCR。
[0289] 在某些实施方式中，流体容纳室可用来进行聚合酶链反应(PCR)。作为例子，流体格可经历热循环以在PCR反应中扩增遗传材料。可进行各种形式的PCR，包括但不限于数字PCR、分散PCR、标准PCR、实时PCR、用于分析RNA和单细胞的逆转录PCR以及各种类型的等温PCR，包括但不限于NASBA。
[0290] 在标准PCR操作下，包含分散样品的芯片进行热循环以扩增感兴趣的DNA序列。通常通过一个(等温)、两个或三个温度区循环来扩增包含预定数量靶DNA的各样品体积。
[0291] 在标准PCR操作下，包括流体包的流体格进行热循环以扩增感兴趣的遗传序列。可通过一个(等温)、两个或三个温度循环操作扩增包含预定数量靶遗传序列的各流体包。
[0292] 在实时PCR操作下，采用对阵列进行大面积荧光成像或扫描荧光共聚焦成像持续监测芯片。该成像每个循环至少进行一次，能形成各样品体积的阈值循环的外推和指数增长图。通过独立分析所有的分散体积，可记录并定量分析样品的不均匀性。
[0293] 在实时PCR操作下，可采用对流体格进行大面积荧光成像或共聚焦荧光扫描成像持续监测流体格。该成像每个循环至少进行一次，能形成各流体包的指数增长荧光图和阈值循环的外推。通过独立分析所有的流体包，可记录并定量分析从连续流体形成的流体包的不均匀性。
[0294] 可采用小隔室体积和/或稀释样品来达到在芯片中实施数字PCR。各隔室中具有少于一个拷贝的靶DNA能引起表达和待检测序列的变化。也可通过将样品中的全细胞和/或亚细胞组分转移到分散隔室来在芯片中进行数字PCR。用本装置可进行多种遗传分析，如遗传筛选、基因分型、确定拷贝数量变化、DNA甲基化分析，这些分析是疾病诊断或预后，特别是癌症诊断或预后中的有用鉴定。
[0295] 可采用小流体容纳室和/或稀释样品在流体格中实施数字PCR。各容纳室中具有少于一个拷贝的靶DNA能引起表达和待检测序列的变化。也可通过将包括但不限于样品中生物液体(例如，血液、血浆、脑脊髓液、淋巴液、唾液、尿液等)、全细胞、细胞部分和/或亚细胞组分的材料转移到流体容纳室来在流体格中进行数字PCR。
[0296] 在PCR的实施中，特别是在数字PCR中，在扩增之后直接对产生的DNA测序正在成为感兴趣的做法。本分隔芯片可包含大阵列样品，其中可采用荧光探针以协助识别感兴趣的靶特异性样品隔室用于测序。其还能有序去除所有隔室。
[0297] 由于本装置简单且易于作出设计改动，可直接向所述装置引入各种分析技术。这样的一个例子可在样品隔室下游包括凝胶电泳分隔螺槽。然后可分别、依次或平行移出所述样品，并使其以液滴/堵塞物形式流入分隔螺槽。然后可将其与界面融合，将所述样品有效注射到分隔螺槽中。由此可将凝胶电泳分析用于对各样品体积/隔室中的扩增DNA进行测序。PCR装置的一个例子可参见图34，显示结合的简易性。图34(b)显示在经历40个热循环之后的示例性PCR样品隔室的图像。
[0298] 在某些实施方式中，流体容纳室可用来进行DNA甲基化分析。数字PCR可用于多种诊断、预后、生物医学和生物鉴定。例如，所述装置和方法可用来对来自患者血样的甲基化DNA进行数字PCR，因为DNA的外遗传改变如DNA超甲基化和染色质修饰已在人癌症中显示和建立。在该应用中，本装置和方法可用来进行亚硫酸氢盐转化DNA的PCR扩增用于DNA甲基化分析，或采用数字格式的传统和市售的鉴定甲基化荧光(MethylLight)鉴定，因为本装置和方法可有效地将样品体积分散为大阵列。虽然这些鉴定最好是以数字格式进行，但本装置和方法可以非数字格式达到同样良好的效果，原始样品体积分隔为多个平行分散样品体积仍非常有利。
[0299] 实施例17：流体容纳室中流体包内的结晶
[0300] 在某些实施方式中，驻留在流体容纳室中的流体包可用于结晶。在一些实施方式中，驻留在流体容纳室中的流体包可用来进行蛋白质结晶。在某些实施方式中，驻留在流体容纳室中的流体包可用来进行小分子结晶。
[0301] 可在驻留在流体容纳室中的流体包中进行的结晶实验包括但不限于多晶型筛选、溶剂合物筛选、盐筛选、共结晶、晶体染色、蛋白质结晶、手性拆分、均相结晶、多相结晶和用“特制”添加剂结晶。
[0302] 在某些实施方式中，驻留在渗透性流体格中的流体容纳室中的流体包可用来结晶。用感兴趣的分析物饱和的从连续流体形成的流体包可用来产生渗透性流体格的流体包中的小有机分子的多晶型。渗透性流体格可由例如空气或溶剂可渗透材料制成，所述材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)，使流体包的所选组分可通过流体格材料蒸发或被流体格材料吸收(或溶解)。这些所选组分可包括但不限于溶剂。经流体格的溶剂蒸发或吸收过程可增强结晶过程，允许对生长的晶体类型进行精细控制。图36显示在流体格中的流体容纳室中晶体的图像，所述流体格由玻璃和PDMS制成，其在将由溶于50％水性乙醇的1x -2 -510 M 2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB)和1x 10 M甲基红组成的流体包置于室温下2-3天时形成。另一连续流体是含0.05％司盘80的轻质矿物油。所有比例尺(图36(a)、(b)和(c))均为100μm。
[0303] 在某些实施方式中，各种尺寸的流体容纳室均可用于结晶。在另一个实施方式中，各种尺寸的流体容纳室可同时用来在药物开发中进行多种结晶条件的平行筛选。尺寸可指大小、表面积或体积。图36显示用来生成不同晶体的5种尺寸的流体容纳室。由于渗透性组分的蒸发/吸收速率随流体容纳室的尺寸发生变化，分析物浓度可发生变化并可引起一些其它混合物组分包括感兴趣的分析物优先结晶。结晶条件的变动可形成多晶型现象，即固体材料以多于一种形式或晶体结构存在的能力。多晶型和其它结晶形式的识别在制药工业中极为重要，因为必须对各结晶形式单独进行专利保护(包括其中有多于一种物质存在于重复晶胞中的晶体，如溶剂合物或共晶)。因此必须在药物开发阶段识别尽可能多的结晶形式。此处，单个连续流体分隔为多个平行流体包，各流体包置于不同结晶条件下，这是非常有利的结晶筛选方法。此外，在仅合成小量潜在新药时，小体积的流体包是感兴趣的特征。
[0304] 图36显示驻留在流体格中的流体容纳室中的结晶多晶型的图像。在图36(图b)中，由3612和3613标出的晶体界面角看来与之前在I型2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB)中观察到的一致。在图36(图c)中，由3623和3624标出的界面角看来与之前在II型2，5-DHB(与I型2，5-DHB不同的多晶型物)中观察到的一致。此外，在图36(图(b)和(c))中观察到的甲基红的颜色看来分别与之前在I型和II型2，5-DHB中观察到的一致。流体容纳室的体积在图36(b)中比在图36(c)中大。
[0305] 在另一个实施方式中，流体格可以可变速率冷却或加热以诱导结晶。在另一个实施方式中，一个流体容纳室可与另一个流体容纳室具有不同的加热或冷却速率。通过改变所述加热和/或冷却速率，可在同一流体格内同时筛选多种结晶条件。各单独流体容纳室的加热或冷却速率可预定或易于设定。加热和冷却装置可包括但不限于电阻加热器、热电装置、金属垫、加热灯、传导加热器或辐射源。加热和/或冷却装置可受计算机控制并易于调整。
[0306] 可对流体容纳室中生长的晶体进行分析的方法包括但不限于光显微法、电子显微法、采用偏振光的显微法、偏振吸收光谱法、吸收光谱法、拉曼显微光谱法、红外显微光谱法、X射线衍射法、热分析法、固态NMR法、粒度分析法和熔点确定法。
[0307] 实施例18：在流体容纳室中的流体包内进行细胞分析
[0308] 在某些实施方式中，流体容纳室中的流体包可包含生物颗粒或分析物。在一些实施方式中，流体容纳室中的流体包可包含生物细胞。
[0309] 根据某些实施方式，流体容纳室中的流体包可包含稀有细胞。稀有细胞可以有核或无核。稀有细胞包括但不限于以下细胞：表达恶性表型的细胞、胎儿细胞如母体外周血中的胎儿细胞、循环内皮细胞、肿瘤细胞如从肿瘤进入血液或其它体液或骨髓的肿瘤细胞、病毒感染细胞如HIV感染细胞、用感兴趣基因转染的细胞以及存在于患自身免疫或自体反应疾病的对象外周血中的T细胞或B细胞的异常亚型。
[0310] 如果细胞浓度具有以下特征则将其视作稀有细胞：(1)占流体样品中总细胞数量少于10％；(2)占流体样品中总细胞数量少于1％；或(3)每毫升流体样品中的细胞数量少于1百万。
[0311] 在一个实施方式中，流体容纳室可用来进行生物颗粒的分析。在另一个实施方式中，流体容纳室可用来进行稀有细胞的分析。例如，图37(a)是在驻留在流体容纳室中的流体包3703(和3704)中形成的具有稀有浓度的细胞3701(和3702)的图像。有序流体容纳室内部的流体包允许对这些分隔的稀有细胞进行简单的视觉识别、计数和生化分析。该情况中含分析物的流体由95％生长培养基和5％B细胞组成(以体积计)。
[0312] 图37(b)是形成驻留在流体容纳室中的流体包3711的由白细胞、红细胞、血小板和血浆组成的未稀释人血的图像。因此，可进一步分析有序流体容纳室内部的流体包的生化成分，其可与人疾病状态相关联或可提供诊断或预后信息。
[0313] 本发明所述实施方式可用于生物和疾病诊断中的各种应用，包括捕获来自体液的癌症细胞或癌症干细胞用于癌症预后、循环内皮细胞、免疫细胞亚群、寄生虫如鞭毛虫或隐孢子虫用于水质监测、疟疾感染的红细胞用于疟疾诊断、淋巴细胞和白细胞用于HIV监测、母体血液中的胎儿细胞用于疾病筛选、干细胞用于治疗、朊病毒感染的细胞用于朊病毒相关(例如疯牛病)疾病筛选。
[0314] 在一个实施例中，本对象物质包括的流体格的制造材料包括但不限于：聚合材料(聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、热固性聚酯(TPE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚对二甲苯、聚氯乙烯、氟乙基丙烯、热塑聚碳酸酯、聚苯乙烯、环烯烃共聚物、聚氨酯、掺混聚丙烯酸酯的聚氨酯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚己内酯、聚酮、聚酞酰胺、醋酸纤维素、聚丙烯腈、聚砜、环氧聚合物、热塑性材料、含氟聚合物、聚偏氟乙烯、聚酰胺、聚酰亚胺)、无机材料(玻璃、石英、硅、GaAs、氮化硅)、熔融二氧化硅、陶瓷、玻璃(有机)、金属和/或其它材料及其组合。
[0315] 此外，壁材料可由以下制成：羊毛、金属(例如不锈钢或蒙耐合金(Monel))、玻璃、纸或合成(例如，尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对二甲苯和各种聚酯)、烧结不锈钢和其它金属、多孔无极材料如氧化铝、二氧化硅或碳的多孔膜、织造或非织造纤维(如布或网状物)。
[0316] 可通过例如以下诱导流体动力学流体压力的方法和装置递送连续流体流，所述方法和装置包括但不限于：基于机械原理(例如，外部注射器泵、气动膜泵、振动膜泵、真空装置、离心力和毛细管行为)、电学或磁学原理(例如，电渗流、电动泵、压电/超声泵、磁流体堵塞物、电流体力学泵和磁流体力学泵)、热动力学原理(例如，气泡产生/相变诱导体积膨胀)、表面润湿原理(例如，电润湿、化学、热合放射诱导表面张力梯度)而操作的方法和装置。
[0317] 产生连续流体驱动力的其它方法可通过以下提供：流体动力学压力、重力供给、表面张力(如毛细管行为)、静电力(电动流)、离心流(置于光盘上并旋转的基材)、磁力(振荡离子引起流)、磁流体动力学力和真空或压力差，以及其它连续流体驱动力产生方法。
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