发明领域

本发明属于药物化学领域，并且涉及可以抑制介导细胞凋亡和炎 症的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)的新化合物及其药物 组合物。本发明还涉及使用本发明的化合物和药物组合物治疗与天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性有关之疾病的方法。

                       发明背景

细胞凋亡或程序性细胞死亡是生物体排除不需要的细胞的重要机 制。已证实细胞凋亡的失调(可以是过度的细胞凋亡或无法发生细胞凋 亡)与一系列疾病例如癌症、急性炎症和自身免疫性疾病、局部缺血性 疾病和某些神经变性疾病有关(参见Science，1998，281，1283-1312； Ellis等，Ann.Rev.Cell.Biol.，1991，7，663)。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶是一族半胱氨酸蛋白酶，它是细 胞凋亡和细胞分解的信号传导途径的重要介质(Thornberry，Chem. Biol.，1998，5，R97-R103)。这些信号传导途径随着细胞类型和刺 激而改变，但所有的细胞凋亡途径似乎均集中于一种共同的导致重要 蛋白发生蛋白分解的效应物途径。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶涉 及信号传导途径的效应期及其引发时的上游。涉及引发事件的上游天 冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶被激活并随后激活涉及细胞凋亡晚期的 其它天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1是第一个被证实天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶，它也被称为白介素转化酶或“ICE”。天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶-1通过将前体白介素-1β(“pIL-1β”)在Asp-116 和Ala-117之间特异性地裂解将pIL-1β转化成致炎活性形式。除天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1之外，还有11种其它已知的人类天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，所有这些酶均可以在天冬氨酰残基处进 行特异性地裂解。还发现它们必需要求在裂解部位的N-末端一侧有至 少4个氨基酸残基。

依据其优选的或主要识别的氨基酸序列可将天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶分为3组。已证实包含天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1、4、 5和13的一组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶优选裂解部位N-末端侧4 位上的疏水性芳香族氨基酸。包含天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶2、3 和7的另一组可以识别裂解部位N-末端侧1位和4位上的天冬氨酰残基， 并优选Asp-Glu-X-Asp序列。包含天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶6、8、 9和10的第三组可以容许主要识别序列中的多种氨基酸，但似乎优选带 有支链脂肪族侧链的残基例如4位上的缬氨酸和亮氨酸。

还根据所了解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的功能对其进行 了分组。第一亚族由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(ICE)、4、5 和13组成。已证实这些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶与致炎细胞因 子的加工有关，因此在炎症中起重要作用。天冬氨酸特异性半胱氨酸 蛋白酶-1是这一类型的酶中研究的最多的酶，它可以通过蛋白分解作 用激活IL-1β前体。因此该酶在炎症反应中起重要作用。天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶-1还与干扰素-γ诱导因子(IGIF)的加工有关，该 因子可以刺激干扰素γ的生产，而干扰素γ是调节抗原呈递、T细胞激活 和细胞粘着的重要的免疫调节剂。

其余的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶构成了第二和第三亚族。 这些酶在导致细胞凋亡的细胞内信号传导途径中是非常重要的。一个 亚族由涉及细胞凋亡途径中的起始事件(包括从浆膜传导信号)的酶组 成。该亚族的成员包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2、8、9和10。 另一个亚族由效应物天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3、6和7组成， 它与导致细胞通过细胞凋亡发生系统性破坏和死亡的最终的下游裂解 事件有关。涉及上游信号传导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶可以 激活下游的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，后者可以阻断DNA修复 机制、断裂DNA、分解细胞骨架并最终使细胞碎裂。

对于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶主要识别的四种氨基酸序列 的了解已被用于设计天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂。已制备 出了结构为CH3CO-[P4]-[P3]-[P2]-CH(R)CH2CO2H的可逆的四肽抑制 剂，其中P2至P4表示最佳的氨基酸识别序列，R是可与天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶的半胱氨酸巯基结合的醛、腈或酮。Rano和 Thornberry，Chem.Biol.4，149-155(1997)；Mjalli，等， Bioorg.Med.Chem.Lett.3，2689-2692(1993)；Nicholson等， Nature 376，37-43(1995)。还制备出了基于类似的四肽识别序列的 不可逆抑制剂，其中R是酰氧基甲基酮-COCH2OCOR’。R’的例子是选择 性取代的苯基例如2，6-二氯苯甲酰氧基并且其中R是COCH2X，其中的 X是离去基例如F或Cl。Thornberry等，Biochemistry 33，3934 (1994)；Dolle等，J Med.Chem.37，563-564(1994)。

已经用肽类的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂证实了天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂用于治疗与细胞凋亡增加有关的各 种哺乳动物疾病状态的用途。例如，在啮齿动物模型中，已证实天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以减少梗塞面积并抑制心肌梗塞 后心肌细胞的细胞凋亡，减轻由中风引起的损伤程度和神经病学缺陷， 减少创伤性脑损伤中的创伤后细胞凋亡和神经病学缺陷，可有效地治 疗暴发性肝破坏以及改善内毒素性休克后的存活率。Yaoita等， Circulation，97，276(1998)；Endres等，J Cerebral Blood Flow and Metabolism，18，238，(1998)；Cheng等，J.Clin.Invest.， 101，1992(1998)；Yakovlev等，J Neuroscience，17，7415(1997)； Rodriquez等，J.Exp.Med.，184，2067(1996)；Grobmyer等，Mol. Med.，5，585(1999)。

总的来说，以上描述的肽类抑制剂对于某些天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶是非常有效的。但是，该效力并不总能反映在细胞凋亡的 细胞模型上。此外，肽抑制剂通常具有不很理想的药理学性质，例如 口服吸收差、稳定性差以及代谢迅速等。Plattner和Norbeck，Drug Discovery Technologies，Clark和Moos编(Ellis Horwood，Chich 酯，England，1990)。

在认识到了需要改善肽类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂 的药理学性质后，出现了肽模拟抑制剂。其中，将其中的P3氨基酸用 3-氨基吡啶-2-酮和5-氨基嘧啶-4-酮衍生物代替的抑制剂受到了大 量的关注(US专利5,756,466(Bemis等)；Dolle等J.Med.Chem.39， 2438，(1996)；Golec等Bioorg.Med.Chem.Lett.7，2181，(1997)； Semple等，Biorg.Med.Chem.Lett.7，1337，(1997))，导致产生 了如下通式的化合物： 其中R1是氢或各种基团，R2是氢、甲基或乙基，R3是烷基、苯基或苯 基烷基，R4是各种基团。

由于肽类抑制剂所固有的问题，一直需要有效、稳定并且能穿透 膜的小分子、非肽类的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂以在体 内提供对细胞凋亡的有效的抑制作用。该化合物在治疗与天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶有关的上述疾病中极为有用。

                           发明概述

现已发现，本发明的化合物及其药物组合物是天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶和细胞凋亡的有效抑制剂。这些化合物具有通式I的结构： 其中R1是氢、CN、CHN2、R或-CH2Y； R是脂肪族基团、取代的脂肪族基团、芳基、取代的芳基、芳烷基、 取代的芳烷基、非芳香族杂环基团或取代的非芳香族杂环基团； Y是电负性离去基或-OR、-SR、-OC＝O(R)或-OPO(R8)(R9)； R8和R9彼此独立地选自R或OR； R2是CO2H、CH2CO2H或其酯、酰胺或它们的等配物； R3是氢或C1-6支链或直链的烷基； 环A含有0-2个双键，并且选择性地与含有0-3个杂原子的饱和或不 饱和的5-7元环稠合； 环A中的X1和X3彼此独立地选自氮或碳，X2选自价键、氧、硫、氮或 碳，其中具有适宜化合价的任何X均可以带有取代基； 环A、包括稠合的环(如果存在的话)中具有适宜化合价的各碳可以彼 此独立地被氢、卤素、R、OR、SR、OH、NO2、CN、NH2、NHR、N(R)2、 NHCOR、NHCONHR、NHCON(R)2、NRCOR、NHCO2R、CO2R、CO2H、COR、CONHR、 CON(R)2、S(O)2R、SONH2、S(O)R、SO2NHR、NHS(O)2R、＝O、＝S、＝NNHR、 ＝NNR2、＝N-OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2R、＝NNHSO2R或＝NR取代； 环A中的各个可以被取代的氮被氢、R、COR、S(O)2R或CO2R取代； 条件是当X3是碳时，X3上的取代基通过除氮以外的原子连接； 进一步的条件是环A中的X至少有一个是氮。

本发明的化合物对一系列天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶靶点具 有很强的抑制特性并且在细胞凋亡的细胞模型中具有良好的效力。此 外，预期这些化合物具有改善了的细胞渗透性和药物动力学性质，并 且，由于它们所具有的效力，预期它们具有改善的对与天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶有关的疾病的效力。

                             发明详述

本发明提供了可用作天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的新 化合物及其可药用衍生物。这些化合物具有通式I的结构： 其中R1是氢、CN、CHN2、R或-CH2Y； R是脂肪族基团、取代的脂肪族基团、芳基、取代的芳基、芳烷基、 取代的芳烷基、非芳香族杂环基团或取代的非芳香族杂环基团； Y是电负性离去基或-OR、-SR、-OC＝O(R)或-OPO(R8)(R9)； R8和R9彼此独立地选自R或OR； R2是CO2H、CH2CO2H或其酯、酰胺或它们的等配物； R3是氢或C1-6支链或直链的烷基； 环A含有0-2个双键，并且选择性地与含有0-3个杂原子的饱和或不 饱和的5-7元环稠合； 环A中的X1和X3彼此独立地选自氮或碳，X2选自价键、氧、硫、氮或 碳，其中具有适宜化合价的任何X均可以带有取代基； 环A、包括稠合的环(如果存在的话)中具有适宜化合价的各碳可以彼 此独立地被氢、卤素、R、OR、SR、OH、NO2、CN、NH2、NHR、N(R)2、 NHCOR、NHCONHR、NHCON(R)2、NRCOR、NHCO2R、CO2R、CO2H、COR、CONHR、 CON(R)2、S(O)2R、SONH2、S(O)R、SO2NHR、NHS(O)2R、＝O、＝S、＝NNHR、 ＝NNR2、＝N-OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2R、＝NNHSO2R或＝NR取代； 环A中的各个可以被取代的氮被氢、R、COR、S(O)2R或CO2R取代； 条件是当X3是碳时，X3上的取代基通过除氮以外的原子连接； 进一步的条件是环A中的X至少有一个是氮。

在本文中使用如下定义，除非另有说明。本文所用的术语“脂肪 族”是指直链、支链或环状的C1-C12烃，它可以是完全饱和的或者可以 含有一个或多个不饱和单元。例如，适宜的脂肪族基团包括取代或未 取代的直链、支链或环状的烷基、链烯基、链炔基及其混合形式例如(环 烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)链烯基。单独使用或作为更大基 团的一部分使用的术语“烷基”和“烷氧基”是指含有1至12个碳原 子的直链和支链的链。单独使用或作为更大基团的一部分使用的术语 “链烯基”和“链炔基”包括含有2至12个碳原子的直链和支链的链。 术语“卤代烷基”、“卤代链烯基”和“卤代烷氧基”是指根据情况 被一个或多个卤原子取代的烷基、链烯基或烷氧基。术语“卤素”是 指F、Cl、Br或I。术语“杂原子”是指N、O或S，并且包括氮和硫 的各种氧化形式以及任何碱性氮的季铵化形式。

单独使用或作为更大的基团例如“芳烷基”的一部分使用的术语 “芳基”是指5-14元的芳香环基团，例如苯基、苄基、1-萘基、2- 萘基、1-蒽基和2-蒽基，以及杂环芳香族基团或杂芳基例如2-呋喃基、 3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、3-异噁唑基、 4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噁二唑基、5-噁二唑基、2-噁唑基、4- 噁唑基、5-噁唑基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4- 吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、3-哒嗪基、3-哒嗪基、2- 噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、5-四唑基、2-三唑基、5-三唑基、2- 噻吩基或3-噻吩基。

芳基还包括其中的碳环芳香族环或杂芳基环与一个或多个其它的 环稠合的稠合多环芳香族环系。其例子包括四氢萘基、苯并咪唑基、 苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并噁唑 基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基等。 本文所用的术语“芳基”还包括其中有一个或多个碳环芳香族环和/ 或杂芳基环与环烷基或非芳香族的杂环稠合的基团，例如二氢化茚基 或四氢苯并吡喃基。

非芳香族杂环是在环中含有一个或多个杂原子例如氮、氧或硫的 非芳香族碳环。该环可以是5元环、6元环、7元环或8元环和/或与 另一个环例如环烷基或芳香族环稠合。其例子包括3-1H-苯并咪唑-2- 酮、3-1-烷基-苯并咪唑-2-酮、2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四 氢噻吩基、3-四氢噻吩基、2-吗啉基、3-吗啉基、4-吗啉基、2-硫代 吗啉基、3-硫代吗啉基、4-硫代吗啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、 3-吡咯烷基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、 4-哌啶基、4-噻唑烷基、二唑酮基(diazolonyl)、N-取代的二唑酮基、 1-苯并[c]吡咯酮基、苯并噁烷(benzoxane)、苯并三唑-1-基、苯并吡 咯烷、苯并哌啶、苯并氧杂环戊烷、苯并硫杂环戊烷和苯并噻烷 (benzothiane)。

芳基(碳环和杂环)或芳烷基例如苄基或苯乙基可以含有一个或多 个取代基。芳基不饱和碳原子上的适宜取代基包括卤素、-R、-OR、-OH、 -SH、-SR、保护的OH(例如酰氧基)、苯基(Ph)、取代的Ph、-OPh、 取代的-OPh、-NO2、-CN、-NH2、-NHR、-N(R)2、-NHCOR、-NHCONHR、 -NHCON(R)2、-NRCOR、-NHCO2R、-CO2R、-CO2H、-COR、-CONHR、-CON(R)2、 -S(O)2R、-SONH2、-S(O)R、-SO2NHR或-NHS(O)2R，其中R是脂肪族基 团或取代的脂肪族基团。

脂肪族基团或非芳香族杂环可以带有一个或多个取代基。脂肪族 基团或非芳香族杂环的饱和碳上的适宜取代基的例子包括以上关于不 饱和碳所列的那些取代基以及如下取代基：＝O、＝S、＝NNHR、＝NNR2、 ＝N-OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2R、＝NNHSO2R或＝NR。

芳香族或非芳香族杂环上的可被取代的氮可以是取代或未取代 的。氮上的适宜取代基包括R、COR、S(O)2R和CO2R，其中R是脂肪族 基团或取代的脂肪族基团。

术语“电负性离去基”具有本领域技术人员已知的定义(参见March， Advanced Organic Chemistry，第4版，John Wiley & Sons，1992)。 电负性离去基的例子包括卤素，例如F、Cl、Br、I、-芳基和烷基磺 酰氧基、三氟甲磺酰氧基。

羧酸、酯和酰胺的等配物或生物等配物通过替换一个原子或多个 原子的基团而形成，生成与母体羧酸、酯或酰胺具有相似生物学性质 的新化合物。生物等配物置换可以以物理化学或拓扑学为基础。羧酸 的等配物置换的例子是CONHSO2(烷基)例如CONHSO2Me。

其中R2是COOH或CH2COOH的本发明化合物是γ(y＝1)或δ-酮基 酸(y＝2)，它们可以在溶液中以开环的形式1或环化的半缩酮形式2 存在。本文中所表示的任何一种异构体均另外一种。

      形式1                                            形式2

同样，对本领域技术人员显而易见的是，某些本发明的化合物可 以以互变异构体的形式或水合物的形式存在，所有这些化合物的形式 均包括在本发明的范围内。若无另外说明，本文中所描述的结构均包 括该结构的所有立体化学形式，即各不对称中心的R和S构型。因此， 本发明化合物的单个立体化学异构体以及对映体和非对映体混合物均 包括在本发明的范围内。若无另外说明，本文中所描述的结构还包括 区别仅在于存在一种或多种同位素富集的原子的化合物。例如，将氢 用氘或氚代替或将碳用13C-或14C-富集的碳代替的具有本发明结构的 化合物均在本发明的范围内。

优选的本发明化合物是其中R2是CO2H或其酯、酰胺或它们的等配 物的式I化合物。更优选其中R2是CO2H或其酯、酰胺或它们的等配物 并且X1是氮的式I化合物。

本发明的一个实施方案涉及其中X1是氮，X2和X3是碳并且和环A 含有两个双键的式I化合物。这些化合物用式IA表示： 其中R1是氢、CN、CHN2、R或-CH2Y； R是脂肪族基团、取代的脂肪族基团、芳基、取代的芳基、芳烷基、 取代的芳烷基、非芳香族杂环基团或取代的非芳香族杂环基团； Y是电负性离去基或-OR、-SR、-OC＝O(R)或-OPO(R8)(R9)； R8和R9彼此独立地选自R或OR； R2是CO2H、CH2CO2H或其酯、酰胺或它们的等配物； R3是氢或C1-6支链或直链的烷基； R4-R6彼此独立地选自氢、卤素、R、OR、SR、芳基、取代的芳基、OH、 NO2、CN、NH2、NHR、N(R)2、NHCOR、NHCONHR、NHCON(R)2、NRCOR、NHCO2R、 CO2R、CO2H、COR、CONHR、CON(R)2、S(O)2R、SONH2、S(O)R、SO2NHR或 NHS(O)2R； R7选自氢、卤素、R、OR、SR、芳基、取代的芳基、OH、CN、CO2R、CO2H、 COR、CONHR、CON(R)2、S(O)2R、SONH2、S(O)R或SO2NHR。

优选的式IA化合物是其中R1是CH2F，R2是CO2H，R3是氢或甲基， R4-R6彼此独立地选自氢、R、苯基或取代的苯基，R7是氢、R、苯基或 取代的苯基的化合物。IA化合物的例子如表1中所示。 表1.式IA化合物的例子   编号 R1  R2  R3  R4 R5 R6  R7  1A-1  CH2F  CO2H  H  H  H  H  H  1A-2  CH2F  CO2H  Me  H  H  H  H  1A-3  CH2F  CO2H  H  Me  H  H  H  1A-4  CH2F  CO2H  H  H  H  Ph  H  1A-5  CH2F  CO2H  H  H  H  H  Ph  1A-6  CH2F  CO2H  H  Et  H  H  Ph

本发明的另一个实施方案涉及其中X1是氮，X2和X3是碳，环A含 有两个双键，R4和R5合在一起形成稠合的、芳香族或非芳香族碳环的 式I化合物。优选该碳环是稠合的苯环。该优选的化合物具有通式IB 的结构，其中R1、R2、R3、R6和R7如上所定义，稠合的苯环可以是取代 或未取代的。IB化合物的例子如表2中所示。 表2.式IB化合物的例子   编号 R1  R2  R3  R6  R7  1B-1  CH2F  CO2H  Me  H  H  1B-2  CH2F  CO2H  H  H  H

本发明的另一个实施方案涉及其中X1是氮，X2是氮或碳，X3是碳， X2和相邻的CR4之间的键是双键或单键并且R6和R7合在一起形成稠合 的、芳香族或非芳香族碳环的式I化合物。优选该碳环是稠合的苯环。 该优选的化合物具有通式IC的结构，其中R1-R5如上所定义，稠合的 苯环可以是取代或未取代的。IC化合物的例子如表3中所示。 表3.式IC化合物的例子 化合物号   R1     R2     R3     R4     R5     X2   键级   X2-CR4   1C-1  CH2F  CO2H     H     H     H     C     双键   1C-2  CH2F  CO2H     Me     H     H     C     双键   1C-3  CH2F  CO2H     H     H     -     N     双键   1C-4  CH2F  CO2H     H     H2     H2     C     单键   1C-5  CH2OAr  CO2H     Me     H     H     C     双键   1C-6  CH2F  CO2H     Me     H     -     N     双键   1C-7  CH2OAr  CO2H     Me     H     -     N     双键   1C-8  CH2F  CO2H     Et     H     -     N     双键   1C-9  CH2F  CO2H     Et     H     -     N     双键   1C-10  CH2F  CO2H     iPr     H     -     N     双键   IC-11  CH2F  CO2H     Pr     H     -     N     双键   1C-12   H  CO2H     Et     H     -     N     双键

本发明的另一个实施方案涉及其中X1和X3是氮，X2是碳，环A含 有一个双键并且R5和R6合在一起形成环、优选芳香族碳环的式I化合 物。这些化合物具有如下所示的通式ID的结构，其中R1-R4和R7如上 所定义。ID化合物的例子如表4中所示。 表4.式ID化合物的例子 化合物号 R1  R2  R3  R4  R7  1D-1  CH2F  CO2H iPr  H2  3-ClPhCH2

本发明的另一个实施方案涉及其中X1是氮，X2是氮或碳，X3是碳， X2和相邻的CR4之间的键是双键或单键并且R6和R7合在一起形成稠合 的、芳香族或非芳香族杂环的式I化合物。这些化合物具有通式IE的 结构，其中R1-R5如上所定义，稠合的杂环可以是取代或未取代的。优 选所述的杂环是含有一个环杂原子的5或6元环。这些化合物具有如 下所示的通式IE的结构。IE化合物的例子如表5中所示。 表5.式IE化合物的例子(R 1 是CH 2 F；R 2 是CO 2 H) 编号 杂环 R3 R4 R5 X2 键级X2-CR4 IE-1 噻吩[2，3-d] H  H -  N 双键 IE-2 吡啶[4，3-d] H  H H  C 双键

本发明的另一个实施方案涉及其中X1是氮，X2是键，X3是碳并且 R6和R7合在一起形成稠合的、芳香族或非芳香族杂环的式I化合物。 这些化合物具有通式IF的结构，其中R1-R5如上所定义，稠合的环可 以是取代或未取代的。优选稠合的环是6元环。这些化合物具有如下 所示的通式IF的结构。IF化合物的例子如表6中所示。 表6.IF化合物的例子     化合物号     R1     R2     R3     R4     IF-1     CH2F     CO2H     H     H2     IF-2     CH2F     CO2H     Me     ＝O     IF-3     CH2F     CO2H     Me     H2

本发明的另一个实施方案涉及其中X1是氮，X2是氮，X3是碳并且 环A含有两个双键的式I化合物。这些化合物具有通式IG的结构，其 中R1-R7如上所定义。IG化合物的例子如表7中所示。 表7.IG化合物的例子 化合物号   R1   R2   R3   R4   R6   R7   IG-1   CH2F   CO2H     Et     H     H     H

本发明化合物可以通过本领域技术人员已知的用于制备类似化合 物的方法进行制备，将通过以下反应方案和随后的制备例举例说明。 反应方案I 试剂：(a)NaH/THF；(b)NaOH/THF/H2O；(c)EDC/DMAP/HOBt；(d) Dess-Martin periodinane；(e)TFA/DCM

在以上反应方案I中，使用了如下缩写：EDC是1-(3-二甲基氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺；HOBT是-1羟基苯并三唑；TFA是三氟乙酸；DCM 是二氯甲烷；DMAP是4-二甲基氨基吡啶。若无另外说明，原料杂环1 可以购买到或者可以通过与Fuss和Koch，Synthesis(1990)，681-685 中所述类似的方法制备。首先将原料杂环 1用氢化钠处理，然后用酯 2 (LG是离去基例如溴或O-三氟甲磺酸酯)处理。将形成的酯 3(例如，Y＝ 烷基)先用碱水解，或者，当Y是叔丁基时，用三氟乙酸水解。然后将 酸 3(Y＝H)与氨基醇 4偶联。根据R1和R2的性质，可以使用氨基酮代 替氨基醇，这可以避免随后的氧化步骤。在氟甲基酮的情况下(其中R1 是CH2F)，氨基醇 4可以按照Revesz等，Tetrahedron Lett.，1994，35， 9693的方法制备。最后将化合物 5中的羟基氧化并根据R2的性质对化合 物进行适当的处理。例如，如果产物I需要R2是羧酸，则 4中的R2优选 是酯并且反应方案中的最后步骤是水解。

因此，本发明的一个方面涉及制备式I化合物的通用方法，该方 法包括如下步骤：

(a)提供式II的酸或酸衍生物，

(b)将II与式4的氨基醇或氨基酮偶联得到式III的中间体， 和

(c)将中间体III转化成化合物I， 其中Y是氢或有机基团；Z是＝O或OH；环A、R1、R2、R3、X1、X2和X3 如上所定义。

该方法特别适用于制备本发明的手性化合物，其中带有R3取代基 的碳是立体化学富集的。正如以下将要举例说明的(参见实施例 21-27)，式II的中间体酸或酸衍生物可以以手性的形式得到。其中所 列举的环A的例子是喹唑啉-4-酮(实施例21-24、26)、嘧啶-4-酮(实 施例25)和二氢喹唑啉-3-酮(实施例27)。II和 4偶联生成III的步骤

(b)可以按照任何适宜的方法进行。应当理解，当 4是酮(Z＝O)时， 它可能需要在II的存在下通过就地将氨基脱保护生成。在步骤(c)中， 将III转化成I的反应取决于Z和R2的性质。如需要，这些基团的合 成操作可以按照本文中的描述或按照本领域技术人员熟知的方法进行。

用于制备本发明化合物的某些手性中间体II是新的。这些中间体 可用嘧啶酮IIA和喹唑啉酮IIB表示： 其中Y是氢或有机基团，嘧啶酮和喹唑啉酮环选择性地按照以上关于 环A的描述被取代，R3是C1-6烷基。 反应方案II 试剂：(a)甲酸乙酯/二异丙基胺；(b)ArCOCl/THF；(c)PPh3/二甲 苯；(d)TFA/DCM；(e)EDC/DMAP/HOBt；(f)Dess-Martin periodinane； (g)TFA/DCM

在以上反应方案II中，将原料氨基酸酯6(其可以购买到或者在 常规条件下合成)先甲酰化然后用活化成例如酰氯形式的2-叠氮基芳 香族酸处理。将形成的酰胺7用还原剂例如三苯基膦处理并将形成的 酯(例如，Y＝烷基)用碱水解，或者，当Y是叔丁基时，用三氟乙酸 水解。然后按照反应方案I中的描述完成合成。 反应方案III 试剂：(a)EDC/DMAP/HOBt；(b)HCl/EtOAc；(c)(EtO)3CH/二甲苯；(d) EDC/DMAP/HOBt；(e)Dess-Martin periodinane；(f)TFA/DCM

在以上反应方案III中，将原料氨基酸酯6(其可以购买到或者 通过已知方法合成)与不饱和的氨基酸在常规条件下偶联得到酰胺10。 将酰胺10(例如，P＝Boc)在酸性条件下脱保护并将形成的胺和甲酰 化试剂例如原甲酸三乙酯一起加热。然后将中间体进行热逆向-Diels Alder反应得到11。然后按照反应方案I中的描述完成合成。 反应方案IV 试剂：(a)Et3N/EtOH/18；(b)RaNi/H2/EtOH；(c)CDI/THF；(d) NaH/DMSO/化合物15；(e)TFA/DCM；(f)化合物4/EDC/DMAP/HOBt；(g) Dess-Martin periodinane；(h)TFA/DCM

在以上反应方案IV中，将原料氨基酸酯6用苄基烷基化(其中LG 可以是卤素、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯等)得到化合物13。将化合物13 中的硝基还原(例如用阮内镍)然后将二胺在羰基源(例如羰基二咪唑， “CDI”)上环化得到喹唑酮14。可将形成的游离NH烷基化得到化合 物16。然后按照反应方案I中的描述完成合成。

                       实施例1 5-氟-4-氧代-3-[(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-丙酰基氨基]-戊酸 (1A-2) 步骤A：(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-丙酸乙酯。

在室温下将搅拌中的1H-吡啶-2-酮(500mg，5.26mmol)的无水 THF(50ml)溶液用60％NaH(231mg，5.78mmol)进行处理。将反应混 合物保持10分钟，然后于室温下将该反应混合物在5分钟内加入到 (R)-2-三氟甲磺酰氧基)丙酸乙酯(1315mg，5.26mmol)的无水THF (2.5ml)溶液中。将形成的混合物搅拌2小时，然后浓缩。将残余物重 新溶于乙酸乙酯并将形成的溶液用冰冷的稀HCl洗涤。除去有机层， 将水层用乙酸乙酯再次萃取。将合并的有机萃取液干燥(MgSO4)、过滤 然后浓缩。将残余物通过色谱纯化(20％至80％乙酸乙酯的己烷溶液)得 到黄色油状的标题化合物(480mg，46％)： [α]27 D＝-56.4°(c＝0.275，CH2Cl2)； 1H NMR(400MHz CDCl3)δ1.3(3H，t)，1.65(3H，d)， 4.2(2H，q)，5.6(1H，q)，6.2(1H，t)，6.4(1H，d)，7.2- 7.3(2H，m). 步骤B：(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-丙酸

将搅拌中的(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-丙酸乙酯(364mg， 1.87mmol)、THF(2ml)、水(1ml)和氢氧化钠(90mg，2.24mmol)的混 合物在室温下保持1小时，然后将其减压浓缩。将残余物重新溶于乙 醚并将形成的溶液用水洗涤。除去有机层，将水层用浓HCl酸化，然 后用乙酸乙酯萃取数次。将合并的有机萃取液干燥(MgSO4)、过滤然后 浓缩。将残余物用乙醚研磨，得到无色固体状的标题化合物(84mg， 27％)： [α]31 D＝-50°(c＝0.2，CH3OH)； 1H NMR(400MHz，DMSO)δ1.5(3H，d)，5.1(1H，q)，6.2(1H， t)，6.4(1H，d)，7.4(1H，m)，7.6(1H，d). 步骤C：5-氟-4-羟基-3-[(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-丙酰基氨 基]-戊酸叔丁酯

将搅拌中的(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-丙酸(70mg， 0.42mmol)、3-氨基-5-氟-4-羟基-戊酸叔丁酯(91mg，0.44mmol)、HOAt (63mg，0.46mmol)和DMAP(59mg，0.48mmol)及无水THF(5ml)的混 合物冷却到0℃，然后向该混合物中加入EDC(88mg，0.46mmol)。将 该混合物在16小时内升温至室温，然后将其减压浓缩。将残余物通过 色谱纯化(3％甲醇的乙酸乙酯溶液)得到白色泡沫状的标题化合物 (137mg，92％)：1H NMR (400MHz，CDCl3)δ1.3-1.5(9H，2xs)，2.5-2.7(2H，m)，3.4- 3.7(1H，m)，3.9-4.6(4H，m)，5.4-5.6(1H，m)，6.2-6.3(1H， m)，6.5-6.6(1H，m)，7.1-7.6(3H，m)；19F NMR(376MHz， CDCl3)δ-230.14，-230.14，-230.17，-230.95，-231.07. 步骤D：5-氟-4-氧代-3-[(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-丙酰基氨 基]-戊酸叔丁酯

在0℃下，将搅拌中的5-氟-4-羟基-3-[(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶 -1-基)-丙酰基氨基]-戊酸叔丁酯(135mg，0.38mmol)的无水DCM(5ml) 溶液用1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氢-1，2-苯并二氧杂环戊烯-3(1H)- 酮(193mg，0.46mmol)进行处理。将形成的混合物于0℃保持1.5小时， 用乙酸乙酯稀释，然后将该混合物倒入饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫 代硫酸钠水溶液的1∶1混合物中。除去有机层，将水层用乙酸乙酯再 次萃取。将合并的有机萃取液干燥(Na2SO4)并浓缩。将残余物通过色谱 纯化(1％甲醇的乙酸乙酯溶液)得到无色胶状的标题化合物(125mg， 93％)：1H NMR (400MHz，CDCl3)δ1.2-1.4(9H，2xs)，2.6-2.9(2H，m)，4.7- 4.9(1H，m)，4.9-5.3(2H，m)，5.6-5.7(1H，m)，6.2-6.3(1H， m)，6.5-6.6(1H，m)，7.2-7.4(1H，m)，7.5-7.6(1H，m)，8.0- 8.2(1H，m)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ16.57，16.87，28.24， 28.29，36.44，36.60，52.50，52.62，52.90，53.09，82.31， 82.44，83.51，83.72，85.33，85.55，107.35，107.44， 120.45，120.49，134.42，134.67，140.22，140.36，162.85， 162.98，169.93，169.99，170.59，170.63，202.58，202.64， 202.75，202.80；19F NMR(376MHz，CDCl3)δ-231.94，- 231.96，-232.48，-232.49. 步骤E：5-氟-4-氧代-3-[(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-丙酰基氨 基]-戊酸

将三氟乙酸(2ml)加入到搅拌中的冰冷的5-氟-4-氧代 -3-[(S)-2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-丙酰基氨基]-戊酸叔丁酯 (115mg，0.32mmol)的无水二氯甲烷(2mL)溶液中。将混合物于0℃搅 拌0.5小时，然后室温搅拌0.5小时。将混合物减压浓缩，然后将残 余物重新溶于干燥的二氯甲烷中。将该过程重复数次以除去过量的三 氟乙酸。将胶状物用HPLC级水冷冻干燥两次，得到米白色固体状的标 题化合物：IR(固体)1789，1730，1654cm-1；1H NMR (400MHz，DMSO)δ1.4-1.6(3H，m)，2.5-2.9(2H，m)，4.2- 4.7(2H，m)，5.0-5.5(2H，m)，6.2-6.3(1H，m)，6.3-6.5 (1H，m)，7.3-7.4(1H，m)，7.6-7.7(1H，m)，8.4-8.9(1H， m)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ17.15，17.27，17.61，17.87， 17.94，33.50，33.57，35.02，35.23，35.31，52.69，53.08， 53.31，53.42，53.47，53.79，53.91，54.49，54.85，81.55， 81.92，83.31，83.68，83.95，84.07，85.72，85.84，105.87， 106.07，106.19，119.67，119.86，120.26，137.05，137.31， 137.36，137.40，137.43，140.60，140.65，140.74，140.85， 162.14，162.18，162.28，162.32，171.25，171.48，171.62， 171.69，172.55，172.63，173.63，173.67，174.52，203.04， 203.18，203.28，203.42； MS(FAB+ve，HR)C13H16FN2O5(MH+)的计算值299.1043，实测值 299.1045。

                        实施例2 5-氟-3-[2-(2-氧代-2H-吡啶-1-基)-乙酰基氨基]-4-氧代-戊酸 (1A-1)按照与实施例1所述类似的方式制备，所不同的是在步骤A中

用溴乙酸乙酯代替(R)-2-三氟甲磺酰氧基)-丙酸乙酯。分离得到黄色 固体状的产物：IR(固体)1657.5， 1694.3，1781.3 cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.5-2.9(2H， m)，4.3-4.7(3.5H，m)，5.1-5.5(1.5H，m)，6.2(1H，m)，6.3- 6.4(1H，m)，7.4(1H，m)，7.6(1H，m)，8.5-9.0(1H，m)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ(DMSO)28.71，33.17，51.13，51.64， 51.70，52.25，52.91，80.96，81.74，82.72，83.46，83.59， 85.35，105.16，105.23，105.31，119.54，140.71，140.82， 140.89，161.82，161.87，161.94，167.62，167.73，168.18， 172.12，173.14，173.80，202.76，202.89；19F(376MHz，DMSO) δ-226.9(t)，-231.8(t)，-233.3(t).

                           实施例3 5-氟-3-[2-(6-甲基-2-氧代-2H-吡啶-1-基)-乙酰基氨基]-4-氧代- 戊酸(1A-3)按照与实施例2所述类似的方式制备，得到无色结晶： IR(固体)3276，1741，1716， 1669，1642，1548，1414，1377，1352，1273，1248，1227， 1189，1163，1043，796cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.25 (3H，s)，2.55-2.95(2H，m)，4.3-4.8(3H，m)，5.1-5.35 (2H，m)，6.06(1H，m)，6.22(1H，m)，7.27(1H，m)，8.51， 8.82(1H，2xd)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ20.83，34.83， 46.47，52.15，83.52，85.29，103.82，116.32，139.97， 162.8，167.8，172.0，173.1，202.86.

                       实施例4 5-氟-3-[2-(4-苯基-2-氧代-2H-吡啶-1-基)-乙酰基氨基]-4-氧代- 戊酸(1A-4)按照与实施例2所述类似的方式从4-苯基嘧啶-2-酮 (Iwasaki等，J.Med.Chem.1996，39，2696)制备，得到无色固体： IR(固体) 3307.5，3216.5，1787.8，1659.7，1582.9，1567.6，1219.4， 1055.5，927.5，763.6cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.66 (1H，m)，2.85(1H，m)，4.31-4.72(3H，m)，5.28(2H，m)， 6.59(1H，m)，6.69(1H，m)，7.51(3H，m)，7.70(3H，m)， 8.50-8.95(1H，br)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ33.2，34.7， 47.6，50.8，51.4，52.3，83.6，85.4，103.8，104.0，104.2， 104.3，115.3，127.0，129.4，129.9，137.1，140.7，151.4， 151.6，161.9，162.0，167.8，168.2，172.1，173.1，202.7， 202.9；19F(376MHz，DMSO)δ-226.8(t)，-231.8(t)，- 233.27(t).

                       实施例5 5-氟-3-[2-(3-苯基-2-氧代-2H-吡啶-1-基)-乙酰基氨基]-4-氧代- 戊酸(1A-5)从3-苯基嘧啶-2-酮制备。通过将嘧啶-2-酮(Oswald和 Martinu J.Am.Chem.Soc.，1982，104，4142)溴化制备3-苯基嘧 啶-2-酮，然后按照Damewood等描述的方法(J.Med.Chem.，1994，37， 3303)用苯硼酸进行钯介导的偶联。按照与实施例2所述类似的方式完 成其余的合成部分，得到无色固体：IR(固体) 3392.3，2941.1，1745.4，1673.9，1635.4，1564.0，1396.3， 1236.2，1203.4，775.5，700.9cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO)δ 2.64(1H，m)，2.79(1H，m)，4.21-4.81(3H，m)，5.29 (2H，m)，6.37(1H，m)，7.28-7.41(3H，m)，7.62-7.25(4H， m)，8.2-8.9(1H，brm)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ32.2， 34.8，47.6，51.9，52.2，52.3，80.9，82.7，83.6，85.4， 103.8，104.0，105.4，105.5，105.6，127.6，127.7，128.2， 129.6，137.0，137.1，137.2，138.6，138.8，139.5，140.1， 158.4，160.8，160.9，162.7，167.7，168.2，169.9，172.1， 173.1，202.7，202.9；19F(376MHz，DMSO)δ-226.8(t)， -231.6(t)，-233.2(t).

                          实施例6 5-氟-4-氧代-3-[(S)-2-(2-氧代-2H-喹啉-1-基)-丙酰基氨基]-戊酸 (1B-1)按照与实施例1所述类似的方式制备，得到白色粉末：IR(固体) 1782，1737，1641cm-1；1H NMR (400MHz，DMSO)δ1.5(3H，m)，2.3-2.4(0.5H，m)，2.6-3.1 (1.5H，m)，4.2-4.8(1.6H，m)，5.0-5.5(1.4H，m)，5.5-6.0 (1H，br s)，6.6(1H，m)，7.3(1H，m)，7.3-7.7(2H，br m)， 7.7-7.8(1H，m)，7.9-8.0(1H，m)，8.2-8.5(1H，br m)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ14.06，14.13，14.25，14.39，32.77， 32.85，34.29，34.43，51.75，51.99，52.30，53.05，83.41， 83.49，85.17，85.26，114.56，114.94，115.13，115.38， 120.95，121.43，121.35，121.61，122.34，122.42，122.48， 129.53，129.59，129.65，130.66，130.84，130.91，130.95， 131.18，140.24，140.32，158.36，158.70，160.98，161.41， 161.47，167.71，170.38，171.86，172.14，172.16，173.26， 202.35，202.49，202.53，202.66；MS(FAB+ve，HR) C17H18FN2O5(MH+)的计算值349.1200，实测值349.1206。

                       实施例7 5-氟-4-氧代-3-[(S)-(R)-2-(2-氧代-2H-喹啉-1-基)-乙酰基氨基]- 戊酸(1B-2)按照与实施例2所述类似的方式制备，得到白色粉末： IR(固体)               1784，1738，1703，1638cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.5-3.2(2H，m)，4.3-4.7(1.3H，m)， 4.8-5.4(3.7H，m)，6.6(1H，m)，7.2-7.3(2H，m)，7.5-7.6 (1H，m)，7.7-7.8(1H，m)，7.9-8.0(1H，m)，8.5-9.0(1H， m)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ33.25，34.90，44.51，44.64， 44.74，47.71，52.81，81.22，81.59，82.98，83.32，83.51， 85.28，114.80，120.48，120.53，120.97，121.09，122.36， 122.41，129.24，131.02，131.06，131.21，139.92，139.99，140.27， 140.34，140.48，161.48，161.56，167.54，167.74，168.09，172.08， 173.13，173.93，202.59，202.73；MS(FAB+ve，HR)C16H16FN2O5(MH+) 的计算值335.1043，实测值335.1046。

                       实施例8 5-氟-4-氧代-3-[2-(1-氧代-1H-异喹啉-2-基)-乙酰基氨基]-戊酸 (1C-1)按照与实施例2所述类似的方式制备，得到白色粉末：IR(固 体)1778，1738，1688，1646cm-1：1H NMR(400MHZ，DMSO)δ2.6-3.2(2H，m)，4.3-4.7(3H，m)， 5.1-5.4(2H，m)，6.6(1H，m)，7.4-7.6(2H，m)，7.6-7.8 (2H，m)，8.2(1H，m)，8.4-8.9(1H，m)；13C NMR(100MHz， DMSO)δ33.20，34.85，51.01，51.40，47.59，52.19，52.91， 81.03，81.72，82.79，83.44，83.56，85.32，104.89，104.97， 105.05，125.57，125.59，126.48，126.88，126.93，127.25， 127.28，132.70，132.74，134.44，134.48，137.61，137.64， 161.51，161.58，161.64，167.95，168.07，168.46，172.60， 173.13，173.81，202.72，202.86，204.52；MS(FAB+ve，HR)

                           C16H16FN2O5(MH+)的计算值 335.1043，实测值335.1044。

                     实施例9 5-氟-4-氧代-3-[(S)-2-(1-氧代-1H-异喹啉-2-基)-丙酰基氨基]-戊 酸(1C-2)按照与实施例1所述类似的方式制备，得到白色粉末：IR(固 体)1783，1739，1646cm-1；1H NMR (400MHz，DMSO)δ1.5-1.6(3H，m)，2.5-3.0(2H，m)，4.3- 4.8(1.7H，m)，5.0-5.7(2.3H，m)，6.6-6.7(1H，m)，7.4- 7.6(2H，m)，7.6-7.8(2H，m)，8.2(1H，m)，8.2-8.9(1H， m)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ16.07，16.71，16.80，17.03， 17.28，17.32，32.99，34.58，34.71，52.24，52.46，52.82， 52.88，53.06，53.20，53.49，53.80，54.18，83.43，83.52， 85.20，85.29，105.19，105.33，105.37，105.46，105.49， 125.43，125.48，125.53，125.57，126.35，126.42，126.87， 126.91，126.94，127.02，127.41，127.49，127.58，130.28， 130.44，130.50，130.57，131.47，132.81，137.09，137.11， 137.15，161.13，161.26，161.34，161.42，170.74，170.91， 171.18，171.30，172.04，172.09，172.31，173.15，173.18， 202.56，202.68，202.70，202.82；MS(FAB+ve，HR) C17H18FN2O5(MH+)的计算值349.1200，实测值349.1198。

                      实施例10 5-氟-4-氧代-3-[2-(1-氧代-1H-异喹啉-2-基)-乙酰基氨基]-戊酸 (1C-3)按照与实施例2所述类似的方式制备，得到白色粉末：IR(固体) 1784，1721，1667 cm-1；1H NMR (400MHz，DMSO)δ2.6-3.0(1.9H，m)，3.2(0.1H，m)，4.3- 4.6(0.6H，m)，4.6-4.7(1H，m)4.7(2H，m)，5.1-5.4 (1.4H，m)，7.5-7.6(1H，m)，7.7(1H，m)，7.8-7.9(1H，m)， 8.1-8.2(1H，m)，8.3-8.4(1H，m)，8.6-9.0(1H，m)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ33.17，34.85，48.25，48.54，48.62， 47.68，52.22，53.01，80.99，81.62，82.75，83.35，83.51，  85.28，  121.75，  126.39，  127.38，  127.43，  127.48，  127.52， 134.85，  134.89，  148.13，  148.19，  148.88，  149.01，  160.47， 160.56，  160.61，  167.32，  167.46，  167.80，  172.04，  173.06， 173.70，  202.55，  202.69，  203.59，  204.52；  MS(FAB+ve，HR)

          C15H15FN3O5(MH+)计算值336.0996，实测值336.0996。

                        实施例11 5-氟-4-氧代-3-[2-(1-氧代-3，4-二氢-1H-异喹啉-2-基)-乙酰基氨 基]-戊酸(1C-4)按照与实施例1所述类似的方式从3，4-二氢-1H-导喹 啉-1-酮(Norman等，J.Med.Chem.，1994，37，2552)制备，得到白 色粉末：IR(固体)  

      1793，1655，1539，1209，1175，1154，1062，1037， 942，748cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.54-2.95(4H，m)， 4.01-4.81(5H，m)，4.91-5.60(3H，br m)，7.24-7.41(2H， m)，7.50-7.52(1H，m)，7.95(1H，m)，8.20-8.65(1H，br m)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ27.6，33.1，34.8，47.2， 47.4，50.1，50.4，52.0，52.7，81.2，81.6，82.9，83.5， 85.3，103.9，104.0，127.0，127.7，127.8，129.1，129.2， 132.1，132.15，139.3，139.4，164.1，164.2，164.3，168.8， 168.9，169.4，172.1，173.2，173.9，202.8，202.9；19F (376MHz，DMSO)δ-229.9(t)，-230.8(t)，-232.2(t).

                     实施例12 5-氟-4-氧代-3-[2-(4-氧代-4H-噻吩并[2，3-d]嘧啶-3-基)-乙酰基 氨基]-戊酸按照与实施例2所述类似的方式制备，得到白色粉末： IR(固体)1666.2，1723.8，1783.7cm-1；1H NMR (400MHz，DMSO)δ2.6-3.2(2H，m)，4.3-4.5(0.3H，m)，4.6- 4.8(1H，m)，4.8(2H，m)，5.1-5.4(1.7H，m)，7.4(1H，m)， 7.6(1H，m)，8.4(1H，m)，8.7-9.1(1H，m).

                      实施例13 5-氟-4-氧代-3-[2-(1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-乙酰基氨基]- 戊酸(1F-1)用与步骤C-E所述类似的方法从2-(1-氧代-1，3-二氢-异 吲哚-2-基)-乙酸制备，得到白色固体状标题化合物。IR(固体) 1782，1731，1660，1532，1470，1455，1419，1209，1055，922 cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.58-2.90(2H，m)， 4.20-4.73 5H)，5.18(1H，dd)，5.29(1H，dd)，7.50(1H， m)，7.61(2H，m)，7.71(1H，m)，8.38/8.69(1H，2d)；19F NMR(376MHz，DMSO-d6)δ-227.0(t)，-23 0.9(t)，-232.6 (t)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ34.8，45.0，50.9，52.0， 84.3，123.2，123.8，128.2，131.9，132.2，142.6，168.2， 168.8，169.0，172.1，202.7.

                       实施例14 5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-(1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-丙酰基 氨基]-戊酸(1F-2) 步骤F：(2S)-2-(1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)丙酸叔丁酯

将(2S)丙氨酸叔丁酯盐酸盐(2.05g，11.2mmol)、二异丙基乙基胺 (1.83mL，10.6mmol)和邻苯二甲酸酐(1.48g，10mmol)的甲苯(10ml) 悬浮液在迪安斯塔克条件下回流3小时。将该反应液冷却至室温，用 Et2O稀释，依次用1N HCl和饱和NaHCO3水溶液洗涤。将有机层干燥 (MgSO4)、过滤然后蒸发得到白色粉末状的小标题化合物(2.465g，90％)： 1H NMR(400MHz CDCl3)δ1.45(9H，s)，1.68(3H，d)，4.90(1H，q)， 7.75(2H，d)，7.88(2H，d)。 步骤G：(2S)-2-(1-羟基-3-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-丙酸叔丁 酯

向THF(10mL)和MeOH(2mL)的混合物中的(2S)-2-(1，3-二氧代 -1，3-二氢-异吲哚-2-基)-丙酸叔丁酯(426mg，1.55mmol)溶液中一次 性加入硼氢化钠(181mg，4.8mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后 于室温蒸除溶剂，将残余物用硅胶柱色谱纯化(石油醚/AcOEt，8/2) 得到无色油状的小标题化合物(284mg，66％)：

1H NMR(400MHz CDCl3)δ1.38-1.40(9H，2s)，1.57- 1.60(3H，2d)，4.38-4.45(1H，m)，4.65-4.76(1H，m)， 5.81-6.01(1H，2d)，7.33-7.64(4H，d). 步骤H：(2S)-2-(1-氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)丙酸

向(2S)-2-(1-羟基-3-氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)-丙酸叔丁酯 (271mg，0.98mmol)的TFA(5mL)溶液中一次性加入三乙基硅烷(170mg， 1.47mmol)。将反应混合物搅拌1小时，然后蒸除溶剂。将残余物用 Et2O研磨然后过滤，得到白色固体状的小标题化合物(165mg，82％)： 1H NMR(400MHz DMSO-d6)δ1.51(3H，d)，4.49-4.55 (2H，m)，4.85(1H，q)，7.51-7.71(4H，m)，12.90(1H，br s).

用与上面的步骤C-E所述类似的方法从(2S)-2-(1-氧代-1，3-二 氢-异吲哚-2-基)-丙酸制备5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-(1-氧代-1，3- 二氢-异吲哚-2-基)-丙酰基氨基]-戊酸。得到白色固体状标题化合物。 IR(固体)1736，1660，1527，1450，1360，1226，1222cm-1； 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.42-1.46(3H，m)，2.68(1H， m)，2.74(1H，m)，4.52-4.63(3H，m)，4.85(1H，m)，5.14- 5.76(2H，br m，)，7.48-7.53(1H，m)，7.62-7.63(2H，m)， 7.70-7.72(1H，m)，8.66(1H，br s)，12.50(1H，br s)；19F NMR(376MHz，DMSO-d6)δ-232.6；13C NMR(100MHz，DMSO-d6) δ16.0，34.4，47.4，49.9，52.2，123.1/123.2，123.8， 128.2，131.8，132.4，142.8，167.9，172.5.

                       实施例15

5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-(1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2- 基)-丙酰基氨基]-戊酸(1F-3)用与上面的步骤F、然后是C-E中所述 类似的方法从(2S)-2-(1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)丙酸叔 丁酯制备。得到无色粘稠油状的标题化合物。IR(薄膜)

      1777，1706，1644，1532，1383，1363，1204，1158， 1045cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.49-1.56(3H，m)， 2.42-2.49(1H，m)，2.74-2.82(1H，m)，4.31-4.90(2H，m)， 4.91-5.39(2H，m)，7.86-7.92(4H，m)，8.59/8.72(1H，2d)； 19F NMR(376MHz，DMSO-d6)δ-226.7，-226.8，-231.0，- 232.2，-233.0，-233.1；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ 15.1/15.2，34.3/34.4，48.0/48.1，52.2/52.5，84.1/84.2， 123.4/123.5，123.5/123.7，132.2，134.7/134.8， 134.8/135.1，167.7，169.7/169.8，172.0/172.1，202.3.

                         实施例16 2，6-二氯-苯甲酸4-羧基-2-氧代-3-[2-(1-氧代-IH-异喹啉-2-基)- 丙酰基氨基]-丁酯(1C-5) 步骤I：2，6-二氯-苯甲酸4-叔丁氧羰基-2-羟基-3-[2-(1-氧代-1H- 异喹啉-2-基)-丙酰基氨基]-丁酯 室温下，将搅拌中的无水DMF(1.5ml)和CH2Cl2(4.5ml)的混合物中 的2-(1-氧代-1H-异喹啉-2-基)-丙酸(150mg，0.7mmol)和2，6-二氯- 苯甲酸3-烯丙氧基羰基氨基-4-叔丁氧基羰基-2-羟基-丁酯(319mg， 0.7mmol)溶液用催化量的二(三苯基膦)氯化钯(II)进行处理，接着向 其中滴加三丁基氢化锡(279？m，1.0mmol)。5分钟后，加入HOBt(186mg， 1.4mmol)，将反应混合物冷却到0℃，向该混合物中加入EDC(132mg， 0.7mmol)，然后将反应混合物搅拌16小时并缓慢升温至室温。将反应 混合物倒入冰冷的1M HCl中并用EtOAc萃取，然后将有机相用饱和碳 酸氢钠水溶液洗涤，随后用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥(Na2SO4)、过滤 然后浓缩。将残余物用石油醚研磨，然后用1∶1的石油醚/EtOAc作为 洗脱剂进行快速色谱纯化，得到无色泡沫状的小标题化合物(190mg， 48％)；1H NMR(400MHz CDCl3)δ1.3-1.5(10H，m)，1.65-1.75(3H，2xd)，2.5-2.7 (2H，m)，4.1-4.5(3H，m)，5.6(1H，2xq)，6.6(1H，2x d)，7.1-7.6(8H，m)，7.7(1H，m)，8.4(1H，d). 步骤J：2，6-二氯-苯甲酸4-叔丁氧羰基-2-氧代-3-[2-(1-氧代-1H- 异喹啉-2-基)-丙酰基氨基]-丁酯

在0℃下，将搅拌中的2，6-二氯-苯甲酸4-叔丁氧羰基-2-羟基 -3-[2-(1-氧代-1H-异喹啉-2-基)-丙酰基氨基]-丁酯(183mg， 0.32mmol)的无水DCM(3ml)溶液用1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氢 -1，2-苯并二氧杂环戊烯-3(1H)-酮(147mg，0.34mmol)进行处理。将 形成的混合物于0℃保持5小时，用DCM稀释，然后将该混合物倒入 饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫代硫酸钠水溶液的1∶1混合物中。除去 有机层，将水层用DCM再次萃取。将合并的有机萃取液干燥(Na2SO4)、 过滤然后浓缩。将残余物用60∶40石油醚/EtOAc作为洗脱剂进行快速 色谱纯化，得到无色泡沫状的小标题化合物(116mg，64％)：

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.2-1.4(9H，2x s)，1.7(3H，d)，2.7-3.0(2H，m)，4.9-5.1(4H，m)，5.8 (1H，m)，6.6(1H，2xd)，7.2-7.6(7H，m)，8.4(1H，m)； MS(FAB+ve)576. 步骤K：2，6-二氯-苯甲酸4-羧基-2-氧代-3-[2-(1-氧代-1H-异喹啉 -2-基)-丙酰基氨基]-丁酯

 将三氟乙酸(2ml)加入到搅拌中的冰冷的2，6-二氯-苯甲酸4-叔 丁氧基羰基-2-氧代-3-[2-(1-氧代-1H-异喹啉-2-基)-丙酰基氨基]- 丁酯(110mg，0.19mmol)的无水二氯甲烷(2ml)溶液中。将混合物于0 ℃搅拌1小时，室温搅拌0.5小时。将反应混合物减压浓缩，然后将 残余物重新溶于干燥的二氯甲烷中。将该过程重复数次以除去过量的 三氟乙酸。然后将残余物用HPLC级水冷冻干燥两次，然后用反相HPLC 通过梯度洗脱(10∶90 CH3CN∶水至100∶0 CH3CN∶水)进行纯化，得到白 色固体状的标题化合物(17mg，16％)：IR(固体) 3295，1736，1648，1618，1590cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO) 1.57(3H，2xd)，2.64-2.80(2H，m)，4.73(1H，m)，5.14- 5.33(2H，m)，5.44-5.53(1H，m)，6.67(1H，m)，7.44-7.74 (7H，m)，8.20(1H，d)，.8.77-8.83(1H，bd)；13C NMR (100MHz，DMSO)16.72，16.90，53.77，105.36，105.49， 125.48，126.37，126.90，127.49，128.85，130.52，130.67， 131.15，132.47，132.82，132.93，137.09，137.12，161.38， 163.56，163.64，171.15，171.25；MS(FAB+ve，HR)

                         C24H20C12N2O7(MH+)的计 算值519.0726，实测值519.0701。                                实施例17 5-氟-3-[2-(6-乙基-2-氧代-2H-吡啶-1-基)-乙酰基氨基]-4-氧代- 戊酸(1A-6)按照与实施例2所述类似的方式制备，得到无色结晶： IR(固体)                            1792.9，1664.9， 1644.4，1547.1，1209.1，1045.2，1019.6，922.3 cm-1；1H NMR (400MHz，DMSO)δ1.15(3H，t)，2.52-2.71(3H，m)，2.74- 2.93(1H，m)，4.28-4.81(4H，m)，5.25(1H，m)，6.10(1H， m)，6.29(1H，m)，7.37(1H，m)，7.85-8.85(1H，m)，12.50 (1H，brs)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ12.4，12.45，25.5， 25.6，25.7，33.2，34.8，45.6，46.1，47.7，52.2，52.8， 81.2，83.0，83.4，83.6，85.，103.7，103.8，103.9，104.0， 116.4，116.5，139.9，140.0，152.6，162.7，162.9，167.8， 167.9，168.3，172.1，173.1，202.7，202.9；19F(376MHz， DMSO)-226.9(t)，-231.6(t)，-233.1(t)；MS(FAB+ve， HR)计算值C14H17FN2O5(M+)312.1122实测值 312.1115.                            实施例18 5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丙酰基氨基]- 戊酸 步骤L：(2S)-2-甲酰基氨基-丙酸叔丁酯

向甲酸乙酯(10ml)和DCM(5mL)的混合物中的(2S)丙氨酸叔丁酯 盐酸盐(3.63g，20mmol)悬浮液中加入二异丙基乙基胺(3.83mL， 22mmol)然后将反应混合物回流过夜。蒸除溶剂，然后将残余物用Et2O 研磨并过滤。将滤液蒸发并将残余物用短的硅胶垫过滤，用乙酸乙酯 作为洗脱剂。蒸除溶剂后得到无色油状的小标题化合物，其在放置过 程中形成结晶(2.806g，81％)：1H NMR(400MHz CDCl3)δ1.43(3H，d)，1.50(9H，s)，4.55(1H，m)，6.31 (1H，br s)，8.16(1H，s). 步骤M：(2S)-2-(N-(2-叠氮基-苯甲酰基)-N-甲酰基氨基)-丙酸叔丁 酯

在-78℃下，将搅拌中的(2S)-2-甲酰基氨基-丙酸叔丁酯(3.524g， 20.3mmol)的无水THF(50mL)溶液用LDA(20.3mmol)处理，并将反应 液搅拌15分钟。然后向该反应液中滴加2-叠氮基苯甲酰氯(T.Okawa， T.Sugimori，S.Eguchi和A.Kakehi，Heterocycles，1998，47，1， 375-382)(20.6mmol)的无水THF(20mL)溶液，然后将该反应混合物 于-78℃搅拌1小时，随后用饱和NH4Cl水溶液终止反应。将反应液加 热至室温，将有机层用饱和NH4Cl水溶液洗涤、干燥(MgSO4)、过滤然 后蒸发，将残余物通过快速色谱纯化(20％乙酸乙酯的己烷溶液)得到淡 黄色油状的小标题化合物(3.437g，53％)：

1H NMR(400MHz CDCl3)δ1.49(9H，s)，1.60(3H，d)， 5.18(1H，m)，7.27(2H，m)，7.40(1H，d)，7.59(1H，t)， 8.60(1H，s). 步骤N：(2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丙酸叔丁酯

在室温下，将三苯基膦(3.41g，13.0mmol)分批加入到 (2S)-2-(N-(2-叠氮基-苯甲酰基)-N-甲酰基氨基)-丙酸叔丁酯 (3.437g，10.80mmol)的二甲苯(70ml)溶液中。将反应混合物室温搅 拌，直到停止放出氮气(约1小时)，然后将反应混合物回流20小时。 蒸除挥发性物质，并将残余物通过快速色谱纯化(30％乙酸乙酯的己烷 溶液)得到无色油状的小标题化合物(2.221g，75％)。

                        1H NMR(400MHz C6D6)δ1.30 (3H，d)，1.34(9H，s)，4.97(1H，q)，7.08(1H，m)，7.31 (1H，m)，7.81(1H，s)，7.86(1H，d)，8.55(1H，m). 步骤O：(2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丙酸

将(2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丙酸叔丁酯(1.434g， 5.23mmol)的TFA(25ml)溶液室温搅拌5小时。将混合物减压浓缩并 将残余物溶于干燥的DCM。将该过程重复数次以除去过量的TFA。将该 胶状物用乙醚研磨然后过滤并用乙醚洗涤数次，得到白色粉末状的小 标题化合物(1.626g，94％)：1H NMR(400MHz DMSO-d6)δ1.67(3H， d)，5.26(1H，q)，7.58(1H，m)，7.71(1H，d)，7.87(1H， m)，8.15(1H，m)，8.44(1H，s).

用与上面的步骤C-E所述类似的方法从(2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑 啉-3-基)-丙酸制备5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3- 基)-丙酰基氨基]-戊酸，得到白色固体状的标题化合物。IR(固体) 1717， 1663cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.63-1.67(3H，2t)， 2.51-2.91(2H，m)，4.30-4.71(1.5H，m，)，5.09-5.51(2.5H， m)，7.55-7.58(1H，m)，7.71(1H，d)，7.84-7.88(1H，m)， 8.14-8.16(1H，m)，8.39-8.41(1H，m)，8.59，8.62，8.79， 8.84，8.90(1H，m)；19F NMR(376MHz，DMSO-d6)δ-75.41(s)， -226.74(t)，-226.82(t)，-230.63(t)，-231.40(t)，- 232.85(t)，-232.95(t)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ 16.65，16.72，16.86，17.28，34.56，34.62，47.74，52.27， 52.34，52.49，53.14，53.52，83.41，85.18，121.59，121.65， 126.52，126.65，127.30，127.34，127.49，134.93，146.73， 146.79，147.70，147.73，158.45，158.83，160.40，170.34， 170.52，170.63，172.01，172.07，172.12，202.47，202.51， 202.61.

                        实施例19 2，6-二氯-苯甲酸4-羧基-2-氧代-3-[2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丙 酰基氨基]-丁酯(1C-7)用与上面的步骤I-K所述类似的方法从 (2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丙酸制备，得到白色固体状的标题 化合物(17mg，57％)IR(固体)

      1735，1676，1612cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO)δ 1.61-1.68(3H，m)，2.59-2.89(2H，m)，4.72(1H，m)，5.19- 5.31(2H，dd)，5.45(1H，m)，7.54-7.68(4H，m)，7.71 (1H，d)，7.86(1H，m)，8.11(1H，m)，8.34(1H，m)，8.60， 8.80，8.96(1H，3xd)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ16.75， 17.25，32.91，34.76，47.74，52.21，53.22，65.64，68.21， 121.65，127.41，128.80，128.87，131.04，132.42，132.97， 134.89，146.66，147.88，160.41，163.63，170.65，172.02， 200.10；19F(376MHz，DMSO)-74.71(s)；MS(FAB+ve，HR)

     计算值  C23H19Cl2N3O7(MH+-TFA)520.0678，实测值 520.0677.

                       实施例20 5-氟-4-氧代-3-[2-(1-氧代-1H-[2，6]萘啶-2-基)-乙酰基氨基]-戊 酸(1E-2) 步骤P：(1-氧代-1H-[2，6]萘啶-2-基)-乙酸叔丁酯

向搅拌中的2，6-萘啶-1-(2H)-酮(80.7mg，0.55mmol)的干燥THF (0.5mL)溶液中一次性加入NaH(27mg，0.66mmol，60％的油分散液)。 将形成的悬浮液室温搅拌15分钟然后补加一份干燥的THF(0.5mL)。 再经过5分钟后一次性加入溴乙酸叔丁酯(129mg，0.66mmol)。4小时 后于减压下除去溶剂，将形成的胶状物在水和EtOAc之间进行分配。 分层，将水层用EtOAc(3×15mL)萃取。将有机相合并、干燥(Na2SO4)、 过滤然后减压浓缩。经柱色谱(2％MeOH的EtOAc溶液)得到深橙色固 体状的小标题化合物(120mg，84％)。 1H NMR(CDCl3)：1.5(9H，s，tBu)，4.65(2H，s，-CH2-)， 6.6(1H，d，Ar)，7.1(1H，d，Ar)，8.2(1H，d，Ar)，8.7(1H， d，Ar)，9.0(1H，s，Ar) 步骤Q：(1-氧代-1H-[2，6]萘啶-2-基)-乙酸

向搅拌中的、在冰浴中冷却的(1-氧代-1H-[2，6]萘啶-2-基)-乙酸 叔丁酯的干燥DCM(2.5mL)溶液中一次性加入TFA(2.5mL)。将形成的淡 黄色溶液于0℃搅拌30分钟然后室温搅拌30分钟。减压除去溶剂和 TFA，然后将得到的物质反复与干燥的DCM(10mL×5)共沸得到橙褐 色胶状物(143mg，定量)，其不需进一步纯化即可使用。

用与上面的步骤C-E所述类似的方法从(1-氧代-1H-[2，6]萘啶 -2-基)-乙酸制备5-氟-4-氧代-3-[2-(1-氧代-1H-[2，6]萘啶-2-基)- 乙酰基氨基]-戊酸。得到亮黄色固体状的标题化合物(46mg，74％)：IR (固体)1628.0，1664.5，1785.3cm-1；1H NMR(DMSO)δ2.6-3.2(2H，

  m)，4.3-4.5(0.5H，m)，4.6(1H，m)，4.7-4.8(2H，m)，5.1-

  5.4(1.5H，m)，6.8(1H，m)，7.6(1H，m)，8.1(1H，m)，

  8.6(0.3H，m)，8.6-8.7(1H，m)，8.7-9.0(0.7H，m)，9.1-

  9.2(1H，s)；19F(DMSO)δ-226.5(较少的)，-226.8，-

  230.9(较少的)-231.4，-233.0；13C(DMSO)δ33.16，34.83， 47.60，51.32，51.64，52.19，52.93，80.97，81.65，82.73， 83.38，83.53，85.30，102.37，102.49，102.56，120.13， 120.19，130.42，130.45，132.26，136.84，136.93，145.14， 145.23，149.34，149.39，160.34，160.42，160.48，167.44， 167.56，167.95，172.09，173.12，173.77，202.64，202.78； HRMS计算值336.099574，实测值336.098907，+2.0ppm

                      实施例21

用与上面的步骤L-O、然后是C-E所述类似的方法从2-叠氮基苯 甲酰氯(T.Okawa，T.Sugimori，S.Eguchi和A.Kakehi，Heterocycles， 1998，47，1，375-382)和2-氨基丁酸叔丁酯盐酸盐制备5-氟-4-氧 代-3-[(2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丁酰基氨基]-戊酸 (1C-8)。得到白色粉末状的标题化合物。IR(固体)

            1722，1665，1365，1203，1136，1055cm-1； 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.81-1.89(3H，m)，2.03-2.27 (2H，m)，2.55-2.91(2H，m)，4.28-4.74 and 5.11-5.42(4H， 2m)，7.54(1H，m)，7.70(1H，m)，7.87(1H，m)，8.14(1H， m)，8.39(1H，m)，8.89-9.01(1H，m)；19F NMR(376MHz， DMSO-d6)δ-75.4(s，TFA salt)，-226.7(t)，-226.8(t)，- 230.4(t)，-231.0(t)，-232.6(t)，-232.7(t)；13C NMR (100MHz，DMSO-d6)δ9.16，22.2/22.4，33.1，50.7/50.9， 56.5/56.9，82.8/82.9，119.9/120.0，125.2，125.9，126.1， 133.6，145.3/145.4，146.0/146.0，159.2，168.5/168.6 170.5/170.5，201.1/201.1.

                     实施例22

5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-(6-甲氧基-4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)- 丁酰基氨基]-戊酸(1C-9)用与步骤L-O、然后是C-E中所述类似的方 法从2-叠氮基-5-甲氧基苯甲酰氯(T.Okawa，T.Sugimori，S.Eguchi 和A.Kakehi，Heterocycles，1998，47，1，375-382)和2-氨基丁酸 叔丁酯盐酸盐制备。得到白色粉末状的标题化合物。IR(固体)1732， 1660，1493，1355， 1222，1198，1026，831cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ 080- 0.84(3H，m)，1.99-2.22(2H，m)，2.56(2H，br s)，3.17 (1H，br s)，3.88(3H，s)，4.50-4.58(1H，m)，4.99-5.31 (2H，br)，5.37-5.45(1H，m)，7.45-7.47(1H，m)，7.51- 7.53，1H，m)，7.64-7.66(1H，m)，8.27-8.29(1H，m)，8.88- 8.95(1H，m)；19F NMR(376MHz，DMSO-d6)δ-75.1(s，TFA salt)，-231.2(br)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ 10.6/10.7，24.0/24.2，56.0，57.6/57.8，106.6， 127.2/127.3，124.4，129.2，142.2，144.6，158.3，160.5， 169.9

                        实施例23 5-氟-4-氧代-3-[(2S)-3-甲基-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丁酰基 氨基]-戊酸(1C-10)用与上面的步骤L-O、然后是C-E中所述类似的方 法从2-叠氮基苯甲酰氯和缬氨酸叔丁酯盐酸盐制备。步骤D后，将两 种非对映异构体通过在Et2O/石油醚(1/1)中连续三次结晶进行分离。 将这两种非对映异构体分别用于步骤E，两者都得到白色粉末。 非对映异构体1： IR(固体)1732，1660，1365，1231，1212，1198cm-1；1H NMR (400MHz，DMSO-d6)δ0.75-1.13(6H，m)，1.24-1.53(1H， m)，2.57-2.92(2H，m)，4.13-5.39(4H，m)，7.56-7.59(1H， m)，7.70-7.72(1H，m)，7.85-7.88(1H，m)，8.17-8.19(1H， m)，8.52-8.57(1H，m)，8.92-9.25(1H，m)；19F NMR(376 MHz，DMSO-d6)δ-75.3(s，TFA)，-226.8(t)，-232.3(t)； 13C NMR(400MHz，DMSO-d6)δ19.6，20.2，30.4，35.2，52.4， 61.4，84.7，121.8，127.4，128.0，128.1，135.6，147.7， 147.9，161.1，169.8，172.3，203.0. 非对映异构体2： IR(固体)1732，1660，1607，13 60，122 6，1212，1193cm-1； 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ0.75-1.11(6H，m)，1.24-1.35 (1H，m)，2.55-2.87(2H，m)，4.37-5.35(4H，m)，7.55-7.57 (1H，m)，7.67-7.71(1H，m)，7.84-7.88(1H，m)，8.16-8.18 (1H，m)，8.55-8.58(1H，m)，8.98-9.25(1H，m)；19F NMR (376MHz，DMSO-d6)δ-75.3(s，TFA)，-22 6.3(t)，-231.8 (t)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ19.1，19.6，30.2，34.5， 52.0，60.4，84.5，121.2，126.9，127.5，127.6，135.1， 146.1，147.3，160.5，169.4，171.8，202.5.

                       实施例24 5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-戊酰基氨基]- 戊酸(1C-11)用与上面的步骤L-O、然后是C-E中所述类似的方法从2- 叠氮基苯甲酰氯和(2S)2-氨基-戊酸叔丁酯盐酸盐制备。得到白色固 体状的标题化合物。IR(固体)

                   2918，1736，1665，1607，1365，1226， 1222，1193cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ0.87-0.88(3H， m)，1.21-1.23(2H，m)，2.08-2.09(2H，m)，2.44-2.90(2H， m)，4.29-5.58(4H，m)，7.55-7.59(1H，m)，7.70-7.72(1H， m)，7.84-7.88(1H，m)，8.15-8.17(1H，m)，8.41(1H，s)， 8.72，9.01(1H，m)；19F NMR(376MHz，DMSO-d6)δ-75.3(s， TFA salt)，-226.7(t)，-226.8(t)，-230.4(t)，-231.0 (t)，-232.6(t)，-232.7(t)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ 13.6/13.6，19.0，32.2/32.3，34.6/34.6，52.2/52.4， 55.9/56.4，84.3/84.5，121.4/121.5，126.7，127.4，127.5， 135.0，146.8/146.9，147.6/147.6，160.6，170.1/170.6， 172.0/172.0，202.5/202.6.

                      实施例25 5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-(6-氧代-6H-嘧啶-1-基)-丁酰基氨基]-戊 酸(1G-1) 步骤R：3-外-叔丁氧羰基氨基二环[2.2.1]-庚-5-烯-2-外-甲酸

向3-外-氨基二环[2.2.1]-庚-5-烯-2-外-甲酸(1.048g， 6.84mmol)的MeCN(10mL)溶液中于0℃加入二异丙基乙基胺(1.311mL， 7.53mmol)，随后加入二碳酸二叔丁酯(1.941g，8.89mmol)。将该反 应液加热至室温并搅拌4小时。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间进 行分配，将水层用2N HCl进行酸化，然后用乙酸乙酯萃取。将有机相 用盐水洗涤，干燥(MgSO4)、过滤然后蒸发得到白色粉末状的小标题化 合物(1.635g，94％)：

1H NMR(400MHz CDCl3)δ1.45(9H，s)，1.67(1H， m)，2.18(1H，m)，2.60(1H，m)，2.74(1H，s)，2.99 (1H，s)，3.96(1H，m)，6.19(2H，m)，6.98(1H，m)， 12.37(1H，brs). 步骤S：(2S)-2-[(3-外-叔丁氧羰基氨基-二环[2.2.1]-庚-5-烯-2- 外-羰基)-氨基]-丁酸叔丁酯

将搅拌中的3-外-叔丁氧羰基氨基二环[2.2.1]-庚-5-烯-2-外- 甲酸(728mg，2.87mmol)、(2S)-2-氨基丁酸叔丁酯盐酸盐(619mg， 3.16mmol)、二异丙基乙基胺(409mg，3.16mmol)、HOBt(415mg， 3.16mmol)和DMAP(386mg，3.16mmol)和无水THF(20ml)的混合物冷却 至0℃，然后向该混合物中加入EDC(606mg，3.16mmol)。将混合物在 16小时内升温至室温，然后减压浓缩。将残余物通过快速色谱纯化 (20％乙酸乙酯的己烷溶液)得到白色固体状的小标题化合物(1.116g， 98％)：1H NMR(400MHz CDCl3)δ0.89-0.94(3H，m)， 1.42-1.54(10H，m)，1.64-1.96(2H，m)，2.13-2.15(1H，m)， 2.35-2.39(1H，m)，2.70-2.74(1H，m)，2.88-2.93(1H，m)， 3.84-3.95(1H，m)，4.37-4.47(1H，m)，5.44-5.84(1H，2d)， 6.14-6.23(3H，m). 步骤T：(2S)-2-[(3-外-氨基-二环[2.2.1]-庚-5-烯-2-外-羰基)-氨 基]丁酸叔丁酯

向(2S)-2-[(3-外-叔丁氧羰基氨基-二环[2.2.1]-庚-5-烯-2-外 -羰基)-氨基]丁酸叔丁酯(1.046g，2.65mmol)的乙酸乙酯(2.5mL)溶 液中加入2M HCl的乙酸乙酯(10mL)溶液。将该反应液室温搅拌4小时， 然后用水、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。将合并的水层用DCM进 行萃取。将合并的有机相干燥(MgSO4)、过滤然后蒸发得到无色油状的 小标题化合物(677mg，87％)： 1H NMR(400MHz CDCl3)δ0.94 (3H，t，J7.5)，1.48-1.49(9H，m)，1.55(1H，m)，1.64- 1.94(4H，m)，2.14-2.20(1H，m)，2.28-2.30(1H，m)，2.59- 2.61(1H，m)，2.94-2.98(1H，m)，3.17-3.21(1H，m)，4.46- 4.52(1H，m)，6.19(2H，m)，6.43-6.54(1H，2d). 步骤U：(2S)-2-(6-氧代-6H-嘧啶-1-基)-丁酸叔丁酯

向(2S)-2-[(3-外-氨基-二环[2.2.1]-庚-5-烯-2-外-羰基)-氨 基]丁酸叔丁酯(655mg，2.22mmol)的二甲苯(10mL)溶液中加入原甲酸 三乙酯(989mg，6.67mmol)，然后将反应混合物回流过夜。蒸除溶剂并 将残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸乙酯50/50)得到无色油状的 小标题化合物(380mg，72％)。

1H NMR(400MHz CDCl3)δ0.98(3H，t)，1.47(9H，m)， 1.98(1H，m)，2.28(1H，m)，5.25(1H，dd)，6.47(1H，d)， 7.90(1H，d)，8.14(1H，s).

用与上面的步骤O、然后是C-E中所述类似的方法从上述化合物 制备5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-(6-氧代-6H-嘧啶-1-基)-丁酰基氨 基]-戊酸。IR(固体)

            1717，1665，1527，1365，1241，1155，841.1775，

1727，1665，1551，1417，1188，1136，1055cm-1；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ0.77-0.81(3H，m)，1.96-2.14(2H，m)， 2.57-2.86(2H，m)，4.28-4.66(1.5H，m)，5.06-5.40(2.5H， m)，6.41-6.45(1H，m)，7.93-7.95(1H，m)，8.47-8.50(1H， m)，8.71-9.02(1H，m)；19F NMR(376MHz，DMSO-d6)δ-75.4 (s，TFA salt)，-226.7(t)，-226.8(t)，-230.4(t)，-231.2 (t)，-232.7(t)，-232.8(t)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ 10.5/10.6，23.7/23.9，34.6/34.7，52.3/52.5，57.6/58.1， 84.3//84.4，114.7/114.8，151.9/153.2， 153.3/153.4，160.5/160.5，169.6/169.7，171.9/172.0， 202.5/202.6.

                  实施例26 (3S)-4-氧代-3-[(2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丁酰基氨基]- 丁酸(1C-12)按照记载于Vertex的专利WO97/22619中的方法从 (2S)-2-(4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-丁酸(111.1mg，0.49mmol)[用与 步骤L-O中所述类似的方法从2-叠氮基苯甲酰氯和2-氨基丁酸叔丁酯 盐酸盐制得]和(2RS，3S)-烯丙氧基羰基氨基-2-苄氧基-5-氧代四氢 呋喃(153.3mg，0.53mmol)制备。得到米白色固体状的标题化合物 (45.5mg，29％，最后两步)：1H NMR(400MHz，CD3OD)δ0.95-1.15 (3H，m)，2.00-2.38(2H，m)，2.45-2.90(2H，m)，4.25-4.45 (1H，m)，4.50-4.80(1H，m)，5.40-5.75(1H，m)，7.75-7.90 (1H，m)，8.00-8.12(1H，m)，8.32-8.44(1H，m)，9.30-9.65 (1H，m)；13C NMR(100MHz，CD3OD)δ11.05/11.48， 25.38/26.79/26.85/27.，，34.98/35.21/35.46， 50.21/50.61/52.95/53.04/53.22/53.30，60.06/60.40/60.46， 98.51/98.73/98.80，106.19/106.46，121.54， 121.84/121.92/121.99，129.29/129.59，131.04/131.31， 138.33，139.50/139.58，159.92/160.01，170.28/170.40， 173.66.

                      实施例27 5-氟-4-氧代-3-[(2S)-2-[1-(3-氯苄基)-2-氧代-1，4-二氢-2H-喹唑 啉-3-基]-3-甲基-丁酰基氨基]-戊酸(1D-1) 步骤V：(2S)-3-甲基-2-(2-硝基-苄基氨基)-丁酸叔丁酯

向缬氨酸叔丁酯盐酸盐(1.5g，7.15mmol)的EtOH(10mL)溶液中加 入三乙胺(2.09mL，15mmol)，10分钟后接着加入2-硝基苄基氯 (1.227g，7.15mmol)。然后将混合物在回流状态下搅拌20小时，然后 进行蒸发。将残余物通过快速色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯，85/15)得 到无色油状的小标题化合物(1.753g，80％)。1H NMR(400MHz CDCl3)δ0.93(6H，m)，1.48(9H，s)，1.83-1.96 (2H，m)，2.82(1H，d)，3.92(1H，d)，4.11(1H，d)，7.39 (1H，t)，7.57(1H，t)，7.65(1H，d)，7.89(1H，d). 步骤W.(2S)-2-(2-氨基-苄基氨基)-3-甲基-丁酸叔丁酯

向(2S)-3-甲基-2-(2-硝基-苄基氨基)-丁酸叔丁酯(1.753g， 5.68mmol)的EtOH(30mL)溶液中加入阮内镍(1.3mL)，然后将反应混 合物气囊压力下氢化2小时。滤除催化剂并将滤液蒸发得到黄色油状 的小标题化合物(1.573g，100％)。

            1H NMR(400MHz CDCl3)δ0.81-0.90(6H，m)， 1.55(9H，s)，1.90(1H，m)，2.89(1H，d)，3.62(1H，d)， 3.86(1H，d)，4.68(2H，vbr s)，6.68(2H，m)，7.02(1H， d)，7.13(1H，t). 步骤X：(2S)-3-甲基-2-(2-氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉3-基)-丁酸叔 丁酯

向(2S)-2-(2-氨基-苄基氨基)-3-甲基-丁酸叔丁酯(1.573g， 5.65mmol)的THF(20mL)溶液中加入羰基二咪唑(1.008g，6.21mmol)， 将该反应液回流搅拌过夜。蒸除溶剂并将残余物通过快速色谱纯化(己 烷/乙酸乙酯，50/50)得到黄色固体状的小标题化合物(662mg，38％)。 1H NMR(400MHz CDCl3)δ0.95(3H，d)，1.08(3H，d)，1.49(9H， s)，2.32(1H，m)，4.39(1H，d)，4.60(1H，d)，4.72(1H， d)，6.81(1H，d)，6.94(1H，t)，7.07(1H，d)，7.18(1H， t)，8.68(1H，s). 步骤Y：(2S)-2-[1-(3-氯-苄基)-2-氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3- 基]-3-甲基-丁酸叔丁酯

向(2S)-3-甲基-2-(2-氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3-基)-丁酸叔 丁酯(633mg，2.08mmol)和3-氯苄基溴(470mg，2.29mmol)的 DMSO(10mL)混合物中加入氢化钠(75mg，1.87mmol)，然后将反应混合 物室温搅拌40小时。然后向该反应液中加入饱和氯化铵水溶液，然后 将混合物用乙酸乙酯萃取。将有机相干燥(MgSO4)、过滤然后蒸发。将 残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸乙酯，70/30)得到无色油状的标 题化合物(477mg，59％)。1H NMR(400MHz CDCl3)δ0.99(3H，d)，1.08(3H，d)，1.48(9H，s)，2.32 (1H，m)，4.42(1H，d)，4.59-4.67(2H，m)，5.05-5.19(2H， m)，6.68(1H，d)，6.97(1H，t)，7.06-7.27(6H，m).

用与步骤O、然后是C-E中所述类似的方法从上述化合物制备5- 氟-4-氧代-3-[(2S)-2-[1-(3-氯苄基)-2-氧代-1，4-二氢-2H-喹唑啉 -3-基]-3-甲基-丁酰基氨基]-戊酸。IR(固体)

1736，1365，1227，1217，1203cm-1；1H NMR (400MHz，DMSO-d6)δ0.84-0.97(6H，m)，2.30-2.33(1H，m)， 2.54-2.87(2H，m)，4.39-5.24(8H，m)，6.73-6.78(1H，m)， 6.93-6.97(1H，m)，7.11-7.35(6H，m)，8.21-8.76(1H，m)； 19F NMR(376MHz，DMSO-d6)δ-232.2(t)，-232.8(t)；13C NMR (100MHz，DMSO-d6)δ19.4/19.5，26.1/26.4，34.6/34.8，43.8， 45.6/45.7，51.8/52.0，62.7/63.1，84.1/84.3，113.6， 121.3/121.4，122.4/122.5，125.3，126.1，126.6，127.1， 128.2，130.7，133.5，137.9/138.0，141.0/141.0， 155.5/155.7，170.8，172.0/172.0，202.6/202.9.

设计本发明化合物的目的是用来抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶。因此，可以测试本发明化合物抑制细胞凋亡和IL-1β释放的能 力或直接测试其抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性的能力。对 各种活性的试验是本领域已知的，并在如下的试验部分作了详细描述。

根据另一个实施方案，本发明提供了含有以上描述的本发明化合 物或其可药用盐和可药用载体的组合物。

如果在这些组合物中使用本发明化合物的可药用盐，这些盐优选 是从无机或有机酸和碱衍生的盐。所述的酸盐包括：乙酸盐、己二酸 盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、 柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐 (digluconate)、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、 甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘 酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、 烟酸盐、草酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦 味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯 磺酸盐和十一酸盐。碱盐包括铵盐、碱金属盐例如钠和钾盐、碱土金 属盐例如钙和镁盐，与有机碱的盐例如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡糖 胺盐以及与氨基酸例如精氨酸、赖氨酸等形成的盐。

此外，碱性的含氮基团可以用低级烷基卤化物例如甲基、乙基、 丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯例如硫酸二甲酯、 二乙酯、二丁酯和二戊酯；长链卤化物例如癸基、十二烷基、肉豆蔻 基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物例如苄基和苯乙 基溴化物等季铵化。由此制得可溶解或分散于水或油中的产物。

本发明的组合物和方法中所用的化合物还可以通过增加适宜的功 能基来进行修饰，以提高其选择性的生物学活性。这些修饰是本领域 已知的，包括增加向指定的生物学系统(例如血液、淋巴系统、中枢神 经系统)中的生物学渗透性、增加口服生物利用度、增加溶解度从而能 够通过注射给药、改变代谢以及改变排泄速率。

可用于这些组合物的可药用载体包括但不仅限于，离子交换剂、 氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质 例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油 酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯 化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类 物质、聚乙二醇、羧基甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙 烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛蜡。

根据一个优选的实施方案，本发明的组合物被配制成用于向哺乳 动物、优选人类给药。

本发明的这些药物组合物可以口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局 部、直肠、经鼻、颊部、阴道或通过植入的储库给药。本文所用的术 语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、 鞘内、肝内和颅内注射或输注技术。优选将组合物口服或静脉内给药。

本发明组合物的无菌可注射形式可以是含水或油性的混悬液。这 些混悬液可以按照本领域已知的技术用适宜的分散剂或湿润剂以及助 悬剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂 或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。 可以使用的可接受的赋形剂和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶 液。此外，通常用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以 使用任何温和的不挥发油，包括合成的单或二甘油酯。脂肪酸例如油 酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射制剂，也可使用天然的可药用 油例如橄榄油或蓖麻油、特别是其聚氧乙基化的形式。这些油溶液或 混悬液还含有长链的醇稀释剂或赋形剂，例如羧基甲基纤维素或常用 于配制可药用剂型、包括乳液和混悬液的类似分散剂。其它常用的表 面活性剂例如Tweens、Spans和其它常用于生产可药用固体、液体或 其它剂型的乳化剂或生物利用度促进剂也可用于制备制剂的目的。

本发明的药物组合物可以以任何可口服的剂型口服给药，包括但 不仅限于胶囊、片剂、含水混悬液或溶液。对于口服使用的片剂，常 用的载体包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂例如硬脂酸镁也经常使用。对 于胶囊形式的口服给药，可以使用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀 粉。当需要用含水混悬液进行口服给药时，可将活性成分与乳化剂或 助悬剂混合。如需要，还可加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。

或者，可将本发明的药物组合物以栓剂的形式用于直肠给药。所 述栓剂可以通过将药物与适宜的非刺激性的赋形剂混合物进行制备， 所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体，因此可以在直肠 中熔化而释放出药物。这些材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

本发明的药物组合物还可以局部给药，特别是当治疗靶点包括易 于通过局部涂抹而达到的区域或器官时，包括眼、皮肤或肠道下部的 疾病。适用于这些区域和器官的局部制剂很容易制备。

对于肠道下部的局部应用可以通过直肠栓剂(见上)或适宜的灌肠 制剂的形式进行。也可以使用局部经皮贴剂。

对于局部应用，可将药物组合物配制成含有悬浮或溶解在一种或 多种载体中的活性成分的适宜软膏。用于本发明化合物局部给药的载 体包括但不仅限于，矿物油、液体矿脂、白凡士林、丙二醇、聚氧乙 烯、聚氧丙烯化合物、乳化用蜡和水。或者，可将药物组合物配制成 含有悬浮或溶解在一种或多种可药用载体中的活性成分的适宜的洗剂 或霜剂。适宜的载体包括但不仅限于，矿物油、脱水山梨醇一硬脂酸 酯、聚山梨酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇 和水。

对于眼部应用，可将药物组合物配制成在等渗的、调节过pH值的 盐水中的微粉化的混悬液形式，或者，优选是在等渗的、调节过pH值 的盐水中的溶液形式，其中可以不含或含有防腐剂例如氯苄烷铵。或 者，对于眼部应用，可将药物组合物配制成软膏例如凡士林的形式。

本发明的药物组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入剂给药。这些组 合物可以按照药物制剂领域公知的技术制备，并可用苄醇或其它适宜 的防腐剂、用于提高生物利用度的吸收促进剂、氟化碳和/或其它常规 的增溶剂或分散剂制备成在盐水中的溶液的形式。

上述组合物特别适用于涉及如下疾病的治疗应用：IL-1介导的疾 病、细胞凋亡介导的疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、破坏性骨疾病、 增殖性疾病、传染性疾病、变性疾病、与细胞死亡有关的疾病、过度 饮酒、病毒介导的疾病、视网膜疾病、眼色素层炎、炎性腹膜炎、骨 关节炎、胰腺炎、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、肾小球性肾炎、类风 湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、慢性甲状腺炎、格累夫斯氏 病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性 中性白细胞减少症、血小板减少症、慢性活动性肝炎、重症肌无力、 炎性肠疾病、节段性回肠炎、牛皮癣、特应性皮炎、疤痕形成、移植 物对抗宿主的疾病、器官移植排斥反应、烧伤后的器官细胞凋亡、骨 质疏松、白血病和相关疾病、骨髓发育不良综合征、多发性骨髓瘤- 相关性骨疾病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、转移性黑瘤、 卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、出血性休克、脓毒病、脓毒性休克、 烧伤、志贺氏菌病、早老性痴呆、帕金森氏症、杭廷顿氏舞蹈症、肯 尼迪氏疾病、朊病毒疾病、脑局部缺血、癫痫、心肌缺血、急性和慢 性心脏病、心肌梗塞、充血性心衰、动脉粥样硬化、冠状动脉旁路移 植术、脊柱肌肉萎缩、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、HIV-相关性 脑炎、衰老、脱发、中风引起的神经病性损伤、溃疡性结肠炎、创伤 性脑损伤、脊髓损伤、乙型肝炎、丙型肝炎、庚型肝炎、黄热病、登 革热或日本脑炎、各种形式的肝脏疾病、肾脏疾病、多囊性肾疾病、 与幽门螺旋杆菌有关的胃和十二指肠溃疡、HIV感染、肺结核和脑膜 炎。所述化合物和组合物还可用于治疗与冠状动脉旁路移植术有关的 并发症。上述组合物中的化合物含量应足以在通过实施例中所描述的 任何试验测量时产生可观察到的疾病严重程度或天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶活性的下降和/或细胞凋亡的减少。

根据另一个实施方案，本发明的组合物还可以含有其它治疗剂。 所述治疗剂包括但不仅限于，溶解血栓的药物例如组织纤溶酶原激活 物和链激酶。当使用第二种药物时，可将第二种药物以独立的剂量形 式给药，或作为与本发明化合物或组合物的单一剂量形式的一部分给 药。

还应当理解，对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案取决于各 种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康情况、 性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物联用、以及主治医师的判断 和所治疗的具体疾病的严重程度。活性成分的量还取决于组合物中的 具体化合物和其它治疗剂(如果存在的话)。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了对患有上述疾病之一的 哺乳动物进行治疗的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用上述可药 用组合物的步骤。在该实施方案中，如果还向患者施用其它治疗剂或 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可将其与本发明的化合物一 起以单一的剂型给药，或者将其作为独立的剂型给药。当以独立的剂 型给药时，可将其它天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂或药物在 施用含有本发明化合物的可药用组合物之前、同时或之后给药。

为了更全面地理解本发明，描述了如下制备和试验实施例。这些 实施例的目的仅仅是为了说明，并不以任何方式对本发明的范围构成 限定。

                        实施例28

                         酶试验

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制试验是基于重组的、纯化人 类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1、-3、-7或-8对荧光底物的裂解。 该试验基本上按照与Garcia-Calvo等(J.Biol.Chem.273(1998)， 32608-32613)所报道的相同的方式用对各种酶特异性的底物进行。天 冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的底物是乙酰基-Tyr-Val-Ala-Asp- 氨基-4-甲基香豆素。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3、-7和8的 底物是乙酰基-Asp-Glu-Val-Asp-氨基-4-甲基香豆素。

通过将数据直接带入Thornberry等所描述的方程式 (Biochemistry 33(1994)，3943-3939)用非线性最小二乘法分析计 算机程序(PRISM 2.0；GraphPad软件)计算出在特定抑制剂浓度下观 测到的酶失活速率Kobs。为了获得二级速率常数Kinact，将Kobs值对各自 的抑制剂浓度绘图然后通过线性回归计算出Kinact。

表8显示了通过上述方法测定的选定的本发明化合物对天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶-1活性的抑制作用。 表8.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的活性   化合物编号   Kinact(M-1S-1)     1A-3     36000     1A-4     40000     1B-1     47000     1C-1     248000     1C-11     419000     1D-1     107000     1E-1     46000     1F-3     115000     1G-1     307000

表9显示了通过上述方法测定的选定的本发明化合物对天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性的抑制作用。

表9.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活性   化合物编号     Kinact(M-1S-1)     1A-3     51000     1A-4       -     1B-1     24000     1C-1     130000     1C-11     185000     ID-1     67000     1E-1     64000     1F-3     220000     1G-1     420000

表10显示了通过上述方法测定的选定的本发明化合物对天冬氨 酸特异性半胱氨酸蛋白酶-7和-8活性的抑制作用。

表10.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-7和-8的活性 化合物编号 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-7          Kinact(M-1S-1)   天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋     白酶-8     Kinact(M-1S-1)     1A-3       -     6750     1A-4       -     13500     1B-1       -     12000     1C-1     26000     27000     1C-11       -     72500     1D-1       -     77000     1E-1       -     13500     1F-3       -     15500     1G-1     147000     68500

                           实施例29 抑制混合的外周血单核细胞(PBMC)群分泌IL-1β

可以用各种细胞源在细胞培养物中测定天冬氨酸特异性半胱氨酸 蛋白酶-1对前体-IL-1β的加工。从健康的供体获得人类PBMC，得到可 以响应多种生理学刺激而生产一系列白介素和细胞因子的混合淋巴细 胞和单核细胞群。

                       实验方法

将试验化合物溶于二甲亚砜(DMSO，Sigma#D-2650)得到100mM 的储备液。将其在由含有10％热灭活的FCS(Gibco BRL#10099-141)、 2mM L-谷氨酰胺(Sigma，#G-7513)、100U青霉素和100μg/ml链霉素 (Sigma#P-7539)的RPMI组成的完全培养基中稀释。在8次稀释步骤 后，试验化合物的最终浓度范围从100μM下降至6nM。试验化合物的 最高浓度相当于在试验中的0.1％DMSO。

通过在Ficoll-Paque白细胞分离介质(Amersham，#17-1440-02) 中离心从得自血库的Buffy Coats中分离出人PBMC，然后在无菌的96 孔平底板(Nunc)中进行细胞试验。各孔含有100μl细胞悬浮液，1×105 细胞，50μl化合物稀释液和最终浓度为50ng/ml的50μl LPS(Sigma #L-3012)。对照由+/-LPS刺激和一系列以与化合物相同的方式稀释 的DMSO稀释液组成。将平板在5％CO2 & 95％湿度下于37℃保温16-18 小时。

16-18小时后，将平板以100xg于18℃离心15分钟后收集上清 液并分析其IL-1β含量。上清液中成熟IL-1β的测定用Quantikine试 剂盒(R&D Systems)按照厂商的说明进行。在阳性对照孔中观察到的 PBMC的成熟IL-1β水平约为600-1500pg/ml。

化合物的抑制效力可用IC50值表示，该值是在上清液中检测到相 当于阳性的对照50％的成熟IL-1β时的抑制剂浓度。表11显示了通过 上述方法测定的选定的本发明化合物对外周血单核细胞分泌IL-1β的 抑制作用。 表11.对PBMC分泌IL-1β的抑制作用   化合物编号   IC50(μM)     1A-3     -     1A-4     -     1B-1     -     1C-1     2.9     1C-11     0.4     1D-1     -     1E-1     10.0     1F-3     4.0     1G-1     0.6

                       实施例30 抗-Fas诱导的细胞凋亡试验

可以通过将Fas配体(FasL)与其受体CD95(Fas)结合来诱导细胞 凋亡。CD95是相关受体家族中的一员，称为死亡受体，它可以通过激 活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的酶级联反应引发细胞凋亡。该过 程通过衔接分子FADD/MORT-1与CD-95受体-配体复合物的胞质结构域 结合而引发。然后天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8与FADD结合并 活化，引发涉及下游天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活和随后的细 胞凋亡的一系列事件。还可以用抗体而不是FasL交联细胞表面的CD95 在表达CD95的细胞例如Jurkat E6.1 T细胞淋巴瘤细胞系中诱导细胞 凋亡。

抗-Fas诱导的细胞凋亡还可以通过激活天冬氨酸特异性半胱氨酸 蛋白酶-8来引发。这为筛选抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8介 导的细胞凋亡途径的化合物的细胞试验提供了础。

                         实验方法

将Jurkat E6.1细胞在由RPMI-1640(Sigma No)+10％胎牛血清 (Gibco BRL No.10099-141)+2mM L-谷氨酰胺(Sigma No.G-7513)组 成的完全培养基中培养。在对数生长期收获细胞。将100ml 5-8×105 细胞/ml的细胞转移到无菌的50ml Falcon离心管中并在100×g下室 温离心5分钟。除去上清液并将合并的细胞沉积物重新悬浮在25ml完 全培养基中。对细胞计数并用完全培养基将密度调整为2×106细胞/ml。

将试验化合物溶于二甲亚砜(DMSO)(Sigma No.D-2650)得到 100mM的储备液。将其在完全培养基中稀释至400μM，然后在96孔板 中进行系列稀释，然后加入细胞试验平板中。

将100μl细胞悬浮液(2×106细胞)加入到无菌的96孔圆底平板 (Costar No.3790)的各孔中。向各孔中加入50μl适宜稀释度的化合 物溶液和最终浓度为10ng/ml的抗-Fas抗体，克隆CH-11(Kamiya No. MC-060)。对照孔不含抗体并且不含化合物，但含有一系列的DMSO稀 释液作为载体对照。将平板在5％CO2和95％下于37℃保温16-18小时。

通过用Boehringer-Mannheim，No.1544 675的“细胞死亡检测试 验”定量DNA的断裂来测定细胞的细胞凋亡。保温16-18小时后，将试 验平板以100×g在室温下离心5分钟。取出150μl上清液并用150μl 新的完全培养基代替。然后收获细胞并向各孔中加入200μl分析试剂 盒中提供的溶解缓冲液。将细胞研磨以确保完全溶解，然后于4℃下 保温30分钟。然后将平板以1900×g离心10分钟，将上清液在所提供 的保温缓冲液中稀释(1∶20)。然后将100μl该溶液完全按照试剂盒中 提供的厂商的说明进行分析。在加入最后的底物20分钟后，在 SPECTRAmax Plus平板读数器(Molecular Devices)中测定OD405nm。将 OD405nm对化合物的浓度绘图，然后用曲线拟合程序SOFTmax Pro (Molecular Devices)用四参数拟合选项计算化合物的IC50值。

表12显示了选定的本发明化合物在FAS诱导的细胞凋亡试验中的 活性。 表12.在FAS诱导的细胞凋亡试验中的活性   化合物编号   IC50(μM)     1A-3     0.21     1A-4     0.65     1B-1     0.14     1C-1     0.06     1C-11     0.02     1D-1     0.02     1E-1     0.07     1F-3     0.03     1G-1     0.02

虽然我们对本发明的一系列实施方案进行了描述，但显然可以对 我们的基本实施例进行修改而得到使用本发明化合物和方法的其它实 施方案。因此应当理解，本发明的范围是由所附的权利要求而不是以 实施例的方式提供的具体实施方案定义的。