利用微流体设备进行的血小板聚集
阅读：57发布：2021-09-09
专利汇可以提供利用微流体设备进行的血小板聚集专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种对从受试者获得的 生物 样品的血小板聚集进行实时监控的微 流体 设备。所述设备包括用于供生物样品通过的通道，所述通道包括突起部，该突起部用于引起形成与下游剪切减速区耦合的上游剪切 加速 区，并在该上游剪切加速区与该下游剪切减速区之间限定剪切率峰值区，该下游剪切减速区限定血小板聚集区域。所述设备进一步包括血小板检测装置，用于检测生物样品通过所述通道而导致在聚集区域出现的血小板聚集。本发明进一步描述了一种实时评估从受试者获得的生物样品的血小板聚集的方法。，下面是利用微流体设备进行的血小板聚集专利的具体信息内容。
1.一种对从受试者获得的生物样品的血小板聚集进行实时监控的微流体设备，其特征在于，该设备包括：
通道，用于供该生物样品通过，该通道包括突起部，该突起部用于引起形成与下游剪切减速区耦合的上游剪切加速区，并在该上游剪切加速区与该下游剪切减速区之间限定剪切率峰值区，该下游剪切减速区限定血小板聚集区域；以及
血小板检测装置，用于检测该生物样品通过该通道而导致在该聚集区域出现的血小板聚集。
2.根据权利要求1所述的微流体设备，其特征在于，当以一定速率泵送所述生物样品-1 -1
通过该设备时，其中该速率将初始剪切率限定并限制到生理范围150s ～10,000s 内，所
3 -1 3 -1
述突起部用于引起10×10s 至150×10s 范围内的剪切率峰值。
3.根据权利要求1或2所述的微流体设备，其特征在于，所述突起部包括上游面和下游面，该上游面与通过所述通道流动的主方向成0°至90°角以限定所述剪切加速区，该下游面与通过该通道流动的主方向成0°至90°角以限定所述剪切减速区。
4.根据权利要求3所述的微流体设备，其特征在于，所述上游面和所述下游面分别与通过所述通道流动的主方向成30°至90°角。
5.根据权利要求3或4所述的微流体设备，其特征在于，所述剪切峰值区由所述突起部和相对的通道壁之间的间隙宽度限定，该间隙宽度选自10μm至40μm之间。
6.根据权利要求5所述的微流体设备，其特征在于，平行于通过所述通道流动的主方向测量的间隙宽度为0.5μm-20μm之间。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的微流体设备，其特征在于，所述上游面和所述下游面基本上是平面的、凹面的或凸面的。
8.一种用于评估从受试者获得的生物样品的血小板聚集的微流体设备，其特征在于，该设备包括：
通道，用于供该生物样品通过，该通道具有用于干扰样品流动的突起部，该突起部的至少一个横截面的尺寸明显小于100微米，该突起部用于在该通道内限定血小板聚集区域；
以及
血小板检测装置，用于检测该生物样品通过该通道而导致在该聚集区域出现的血小板聚集。
9.根据前述权利要求中任一项所述的微流体设备，其特征在于，所述通道的配置和流量适于维持该通道内的雷诺数小于或等于26，以便维持完全稳定的血流，没有流分离或涡流形成。
10.根据权利要求8所述的微流体设备，其特征在于，所述突起部包括位于所述通道内的球状突起部，所述样品必须绕该球状突起部流过。
11.根据权利要求10所述的微流体设备，其特征在于，所述球状突起部位于所述通道宽度的中心，使得基本上等量的该样品在该球状突起部的各个面流过。
12.根据前述权利要求中任一项所述的微流体设备，其特征在于，该设备设置有多个通道，各个通道具有尺寸基本相同的突起部，并且其中所述检测装置可用来检测所有该通道中所有血小板聚集的总和。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的微流体设备，其特征在于，该设备设置有多个通道，各个通道具有尺寸基本不同的突起部，并且其中所述检测装置可用来平行检测该通道阵列中的差别血小板聚集。
14.根据前述权利要求中任一项所述的微流体设备，其特征在于，所述通道表面具有血清蛋白、粘附基质或聚合物，以便增加血小板聚集。
15.根据前述权利要求中任一项所述的微流体设备，其特征在于，所述血小板检测装置包括光学检测装置。
16.根据权利要求15所述的微流体设备，其特征在于，所述光学检测装置包括全内反射传感器，该全内反射传感器紧邻所述通道突起部，以实时监测所述血小板聚集区域中的血小板聚集。
17.根据权利要求15所述的微流体设备，其特征在于，所述光学检测装置包括光发射器以及对准光检测器，其中该光发射器用于发出光，以在构成所述通道的材料内进行内反射，这样该光检测器检测到由于血小板聚集区域中血小板的聚集引起的内部光反射的变化。
18.根据权利要求15所述的微流体设备，其特征在于，所述光学检测装置包括光发射器以及对准光检测器，该光发射器用于发出光，以穿过血小板聚集区域传输，使得该光检测器检测到由于血小板聚集引起的透射光强度的减弱。
19.根据从属于权利要求12或13的权利要求15所述的微流体设备，其特征在于，所述光学检测装置包括光发射器以及对准光检测器，该光发射器用于发出光，以穿过由多个通道的每一个通道各自的突起部限定的血小板聚集区域，使得该光检测器可检测由所有通道中全部血小板聚集引起的透射光强度的减弱。
20.根据前述权利要求中任一项所述的微流体设备，其特征在于，所述设备包括用于制造的块体材料，该块体材料内部形成、嵌入或模制一个或多个密封通道。
21.根据权利要求20所述的微流体设备，其特征在于，制成所述设备的所述块体材料是聚二甲硅氧烷(PDMS)、硼硅玻璃、SF11玻璃、SF12玻璃、聚苯乙烯和聚碳酸酯中的一种。
22.一种用于检测或评估患有血小板或其前体功能或活性异常的相关性疾病或障碍性疾病或具有患该疾病风险的受试者的诊断方法，其特征在于，该方法与根据权利要求1至
21中任一项所述的微流体设备相结合。
23.一种用于诊断患有血小板或其前体功能或活性异常的相关性疾病或障碍性疾病或具有患该疾病风险的受试者的诊断方法，其特征在于，该方法包括：
i)从受试者获得生物样品；
ii)在确定的流动条件下且在来自该生物样品的细胞足以发生聚集的时间内，使该生物样品通过根据权利要求1至21中任一项所述的设备；
iii)检测该细胞的聚集；以及
将该生物样品细胞聚集的时间和聚集体的大小与预定标准作比较，其中任何变化都表示患有血小板或其前体功能或活性异常的相关性疾症或障碍性疾病或具有患该疾病的风险。
24.一种用于判断或评估试剂对生物样品中血小板或其前体聚集的调节作用的方法，其特征在于，该方法包括：
i)在确定的流动条件下且在足以判断在权利要求1至21中任一项所述的微流体设备内是否发生血小板聚集的时间内，并在该试剂存在的情况下，使该生物样品通过该设备；以及
ii)将步骤(i)中获得的结果与在该试剂不存在的情况下进行步骤(i)的结果作比较。
25.一种用于对使用试剂疗法的受试者的治疗进行监测的方法，其特征在于，该方法包括：
(i)在确定的流动条件下且在足以判断在权利要求1至21中任一项所述的微流体设备内是否发生血小板聚集的时间内，使来自该受试者的第一生物样品通过该设备，该第一生物样品在给该受试者施用该试剂之前获得；以及
(ii)在确定的流动条件下且在足以判断在权利要求1至21中任一项所述的设备内是否发生血小板聚集的时间内，使来自该相同受试者的第二生物样品通过该设备，该第二生物样品在给该受试者施用该试剂之后获得；以及
(iii)将步骤(i)中获得的结果与步骤(ii)中获得的结果作比较。
26.一种用于对使用试剂疗法的受试者的治疗进行监测的方法，其特征在于，该方法包括：
(i)在确定的流动条件下且在足以判断在权利要求1至21中任一项所述的设备内是否发生血小板聚集的时间内，使来自该受试者的第一生物样品通过该设备，该第一生物样品在给该受试者施用该试剂的第一剂量之后获得；以及
(ii)在确定的流动条件下且在足以判断在权利要求1至21中任一项所述的设备内是否发生血小板聚集的时间内，使来自该相同受试者的第二生物样品通过该设备，该第二生物样品在给该受试者施用该试剂的第二剂量之后获得；以及
(iii)将步骤(i)中获得的结果与步骤(ii)中获得的结果作比较。
27.根据权利要求1至21中任一项所述的微流体设备用于监测生物样品中血小板的功能和/或活性的用途。
28.一种用于高通量筛选多种候选抗血小板化合物的方法，其特征在于，该方法包括：
(i)将从受试者获得的至少一种生物样品与该多种候选抗血小板化合物的至少第一种化合物接触；
(ii)在确定的流动条件下且在足以判断在权利要求1至21中任一项所述的微流体设备内是否发生血小板聚集的时间内，使该至少一种样品通过该设备；
(iii)检测该多种候选抗血小板化合物的该第一种化合物对该至少一种生物样品的血小板聚集的影响；以及
(iv)将步骤(iii)中观察到的影响与不与该候选化合物接触的对照样品作比较。
29.一种新型的抗血小板试剂，其特征在于，经高通量筛选获得的该试剂与根据权利要求1至21中任一项所述的微流体设备相结合。
30.一种用于监测血小板功能的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括包装材料，该试剂盒还包括：
(i)根据权利要求1至21中任一项所述的微流体设备；以及
(ii)用来说明该微流体设备在监测血小板功能的系统中如何使用的说明书。
31.一种用于实时评估从受试者获得的生物样品的血小板聚集的方法，其特征在于，该方法包括：
使该生物样品按照一定速率通过特定通道，该速率使该通道干扰该样品的流动，并因此引起形成与下游剪切减速区耦合的上游剪切加速区，并在该上游剪切加速区与该下游剪切减速区之间限定了剪切率峰值区，该下游剪切减速区限定了血小板聚集区域；以及检测由于该生物样品通过该通道而在该聚集区域发生的血小板聚集。
利用微流体设备进行的血小板聚集
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2009年3月10日提交的澳大利亚临时专利申请No 2009901033以及2009年10月29日提交的澳大利亚临时专利申请No 2009905303的优先权，将两个专利申请的内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及一种便于分析生物样品中血小板或其前体(progenitor)聚集的设备。该设备诱发导致空间控制血小板聚集(spatially controlled platelet aggregation)的血流局部控制紊乱。本发明还涉及一种使血小板在已知部位聚集以便诊断血小板功能和活性的方法。本发明还涉及一种可控制地调节血小板聚集的速率和程度的方法。本发明的方法尤其用于评估受试者血小板功能方面是否存在异常。该设备还用于在进行药物治疗时测定血小板及其前体的功能和活性。
背景技术
[0004] 动脉血栓形成仍然是工业化社会发病率和死亡率的最常见原因。这个过程的核心是在动脉粥样硬化斑块破裂的部位过度积累血小板和纤维蛋白，导致血管闭塞，组织梗死(infarction)和器官衰竭。早期动脉粥样硬化斑块(advanced atherosclerotic plaque)突出的凝血潜力取决于多种因子，包括发生病变(lesion)的高含量组织因子、有效的血小板活化基质(即胶原蛋白)的存在以及在动脉粥样硬化过程中血管腔缩小引起的高剪切应力(shear stress)血小板活化的直接效应。流变障碍(rheological disturbance)是动脉粥样硬化血栓发生的主要特征，血流障碍在调节动脉粥样硬化过程的各个阶段中起着重要作用。动脉粥样硬化病变通常发生在剪切率(shear rate)可以较低且可不均匀流动的动脉分支点或弯曲(即颈动脉窦)处。随着病变不断发展，管腔狭窄导致一系列的流动变化，例如剪切梯度、流分离、涡流形成和湍流(turbulence)，每种变化对动脉粥样硬化过程具有不同的影响。血流的最大变化可发生在血栓形成过程中。随着血管闭塞的不断发展，流量和剪切率可能会达到极限，构成了在血栓形成过程中血栓剪切依赖性增长的潜在的恶性循环。
[0005] 血管损伤部位的血小板聚集对终止出血和后续血管修复来说是非常重要的；然而，过大的血小板聚集反应会导致动脉血栓的发生，促使诸如急性冠脉综合症和缺血性中风等疾病的发生。越来越多的人赞同流体力学因素(hydrodynamic factors)在血管疾病发病机理中的重要性。然而，仍然不能完全被理解流变加速动脉粥样硬化过程的确切机制。血流障碍对血小板的粘附及活化机理产生重大影响，高剪切应力尤其能加速血小板活化和血栓生长。
[0006] 流过管子的流体可归类为牛顿流体(Newtonian)或非牛顿流体，其中牛顿流体中流体粘度与流体剪切率无关，非牛顿流体中流体粘度可根据流体剪切率发生改变。对于血液来说，细胞成分提供了复杂的粘度分布，可根据流量(flow rate)和血管的几何尺寸发生变化，因此从定义上讲，血液为非牛顿流体。在大多数体外或体内条件下，血流可以被视为流线型(streamlined)或层流型(laminar)，相邻流体层相互平行移动。对流过对称血管的牛顿流体来说，血管壁处的流体阻力(fluid drag)导致抛物线流动剖面(parabolic flow profile)的形成，流的中心具有最大流量，血管壁处具有最小流量。作为粘性阻力的结果，假设的平行血流布局导致在相邻流体层之间产生剪切应力。
[0007] 局部血流施加的机械剪切应力，特别是在微尺度(microscale)血管狭窄的情况下，是复杂的并与简单的层(平行)流模型(laminar flow model)存在很大差异。流过狭窄血管的血液在狭窄部位的进入点可能会出现速度降低，穿过狭窄部位时可能出现急剧的流体加速，在狭窄部位的出口会出现回流(flow reversal)和流分离(扩散流线)。这些复杂的流变条件可显著调节血小板功能。
[0008] 血流影响下的血小板聚集主要取决于表面表达糖蛋白(surface expressed glycoprotein)GPIb/V/IX以及整合素家族成员αIIbβ3(GP IIb-IIIa)的粘附功能。在高或提高的剪切率的条件下，GPIb/V/IX引发可逆的血小板-血小板粘附接触，而整合素αIIbβ3稳定形成的聚集体。
[0009] 关于说明书中包含的文件、法案、材料、设备、物品等的任何讨论仅仅是为了对本发明提供背景。不能被视为承认任何或所有构成现有技术的一部分，或因为在本申请的每项权利要求的优先权日之前存在，而认为这些内容为本发明相关领域的常识。
发明内容
[0010] 根据第一方面，本发明提供一种对从受试者获得的生物样品的血小板聚集进行实时监控的微流体设备，该设备包括：
[0011] 通道，用于供该生物样品通过，该通道包括突起部，该突起部用于引起形成与下游剪切减速区耦合的上游剪切加速区，并在该上游剪切加速区与该下游剪切减速区之间限定剪切率峰值区(region of peak rate of shear)，该下游剪切减速区限定了血小板聚集区域；以及
[0012] 血小板检测装置，用于检测该生物样品通过该通道而导致在该聚集区域出现的血小板聚集。
[0013] 当以一定速率泵送所述生物样品通过所述设备时，其中该速率将初始剪切率限定-1 -1 3 -1 3 -1并限制到生理范围150s ～10,000s 内，所述突起部用于引起10×10s 至150×10s 范-1 -1
围内的剪切率峰值。所述突起部可用于将初始剪切条件限定并限制在300s -7000s 的范-1 -1
围内。所述突起部可用于将初始剪切条件限定并限制在450s -3,500s 的范围内。所述突-1
起部可用于将初始剪切条件限定并限制在大约1,800s 。流量可以为非常稳定的、或可以为脉动的或者为变化的流量，以改变血小板聚集的速率和程度。
围内的剪切率峰值。所述突起部可用于将初始剪切条件限定并限制在300s -7000s 的范-1 -1
围内。所述突起部可用于将初始剪切条件限定并限制在450s -3,500s 的范围内。所述突-1
起部可用于将初始剪切条件限定并限制在大约1,800s 。流量可以为非常稳定的、或可以为脉动的或者为变化的流量，以改变血小板聚集的速率和程度。
[0014] 所述突起部包括与通过过所述通道流动的主方向成0°至90°角以限定所述剪切加速区的上游面，以及与通过该通道流动的主方向成0°至90°角以限定所述剪切减速区的下游面。更优选地，所述上游面和所述下游面分别与通过所述通道流动的主方向成30°至90°角，更优选与主流向成大约85°角。所述上游面和下游面基本上是平面的、凹面的或凸面的。
[0015] 在一个实施例中，所述剪切峰值区由所述突起部和相对的通道壁(opposite channel wall)之间的间隙宽度限定，该间隙宽度选自10μm至40μm之间，例如但不限于15μm、20μm、25μm、30μm以及35μm。平行于通过所述通道流动的主方向测量的间隙宽度为0.5-20μm。
[0016] 根据第二方面，本发明提供了一种用于评估从受试者获得的生物样品的血小板聚集的微流体设备，该设备包括：
[0017] 通道，用于供该生物样品通过，该通道具有用于干扰样品流动的突起部，该突起部的至少一个横截面尺寸(cross-sectional dimension)明显(substantially)小于100微米，该突起部用于在该通道内限定血小板聚集区域；以及
[0018] 血小板检测装置，用于检测该生物样品通过该通道而导致在该聚集区域出现的血小板聚集。
[0019] 在第二方面的实施例中，所述突起部可包括位于所述通道内的球状突起部，所述样品必须绕该球状突起部流过。所述球状突起部位于所述通道宽度的中心，使得基本上等量的该样品在该球状突起部的各个面流过。
[0020] 所述突起部或突出可包括位于所述通道内的立柱，所述样品必须绕该立柱流过。在这种实施例中，所述立柱可从所述通道的一个壁部分延伸穿过所述通道。在另一实施例中，所述立柱位于所述通道的中心，使得基本上等量的样品在所述立柱的各个面流过。
[0021] 在第一或第二方面的实施例中，所述设备可设置多个通道，各个通道具有尺寸基本相同的突起部。在这种实施例中，所述检测装置可用来检测所有该通道中所有血小板聚集的总和。在一个实例中，所述多个通道并行设置。当单一样品被分开并通过所述多个通道的每一个时，本发明实施例具有改善检测血小板聚集的可靠性的优点。
[0022] 在第一或第二方面的实施例中，可设置多个通道，各个通道具有尺寸基本不同的突起部。在这种实施例中，所述检测装置可用来平行检测该通道阵列中的差别(differential)血小板聚集。在一个实例中，所述多个通道并行设置。当单一样品被分开并通过所述多个通道的每一个时，本发明实施例具有改善筛选检测血小板异常的优点。
[0023] 在第一或第二方面的实施例中，所述通道表面的至少一部分可具有血清蛋白、粘附基质或聚合物，以便增加血小板聚集。
[0024] 在第一或第二方面的实施例中，所述通道的配置和流量适于维持该通道内的雷诺数小于或等于26，以便维持完全稳定的血流，没有流分离或涡流形成。在一个实施例中，以每分钟8微升的流量通过直径20微米的微通道产生0.86的雷诺数，从而确保在无流动不稳定性或涡流形成的情况下出生减速流动或剪切率增加。
[0025] 可使用能够检测并监测血小板聚集的任何检测装置。该检测装置可根据时间来记录血小板聚集的图像。
[0026] 在第一或第二方面的实施例中，本发明进一步结合可能被或不被整合到所述设备、并可用作血小板检测装置的光学检测装置。该光学检测装置包括全内反射传感器(total internal reflection sensor)，该全内反射传感器紧邻所述通道突起部，以实时监测所述血小板聚集区域中的血小板聚集的。任选地，所述光学检测装置可包括光发射器(light emitter)以及对准光检测器(aligned light detector)，其中该光发射器用于发出光，以在构成所述通道的材料内进行内反射，这样该光检测器检测到由于血小板聚集区域中血小板聚集引起的内部光反射的变化。任选地，所述光学检测装置可包括光发射器以及对准光检测器，该光发射器用于发出光，以穿过血小板聚集区域传输，使得该光检测器检测到由与血小板聚集引起的透射光强度的减弱。任选地，所述光学检测装置包括光发射器以及对准光检测器，该光发射器用于发出光，以穿过由多个通道的每一个通道各自的突起部限定的血小板聚集区域，使得该光检测器可检测由所有所述通道中全部血小板聚集引起的透射光强度的减弱。
[0027] 所述光学检测装置和/或血小板检测装置可用于在远离所述通道侧壁的位置观察血小板聚集，以避免对血小板行为产生侧壁效应(side wall effects)。例如，所述光学检测装置和/或血小板检测装置可用于在远离所述通道侧壁大约35微米的位置观察血小板聚集。
[0028] 任选地，所述血小板检测装置可包括摄像机。该摄像机可为CCD摄像机。该摄像机可包括辐射导向设备(radiation direction device)，该设备将来自目标的辐射导向该摄像机的图像采集元件，例如一个或多个透镜和/或滤光片和/或反射镜。所述检测装置可包括显微镜。所述显微镜可通过检测来自相互作用的目标的辐射(例如可见光)来检测目标的相互作用。所述显微镜可采用明视场模式进行操作，检测包括可见光的辐射。所述显微镜可采用荧光模式进行操作，检测包括荧光信号的辐射。所述显微镜可为落射荧光显微镜。所述显微镜可包括辐射导向设备，该设备将来自目标的辐射导向所述显微镜的图像采集元件，例如一个或多个透镜和/或滤光片和/或反射镜。所述显微镜的图像采集元件可为摄像机。
[0031] 如果不希望受理论的约束，一般认为所述块体材料可结合血液样品中存在的可溶性蛋白，且所述块体材料的特性会影响所述微流体设备的有效性。相应地，优选所述块体材料具有允许可溶性血蛋白与材料结合的特性。
[0032] 所述微流体设备的微通道可以与所述块体材料的材料相同或不同。在一个实施例中，所述微通道的横截面直径小于1000μm。在另一实施例中，横截面直径在100-200μm之间。在又一实施例中，所述微通道的长度在大约3mm至7mm的范围内，优选从入口至出口大约为5mm。
[0033] 所述设备可包括防污阱，位于所述或每个突起部的上游，以便充分防止各自的通道产生积垢。
[0034] 所述设备可进一步包括“固体载体”(solid support)，该固体载体包括任何具有基本上水平的平面、所述块体材料可放置在上面的固体结构。在一个实施例中，该固体载体例如可为玻璃(如显微镜载玻片等)、聚合物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、纤维素或任意其他光学透明材料。
[0035] 应了解本发明的所述微流体设备可设置为一次性的或可更换的产品或作为系统的一部分。
[0036] 根据另一方面，本发明提供了一种对从受试者获得的生物样品的血小板聚集进行实时监控的系统，该系统包括：
[0037] 外壳(housing)；
[0038] 根据第一或第二方面的实施例的任一项所述的微流体设备，该微流体设备容纳在该外壳中。
[0039] 所述系统可包括与所述微流体设备的一个或多个入口和/或一个或多个出口连接的流体输送系统。所述流体输送系统可直接与所述微流体设备的一个或多个入口和/或一个或多个出口连接。任选地，所述流体输送系统可通过所述外壳的相应入口和/或出口间接与所述微流体设备的一个或多个入口和/或一个或多个出口连接。
[0040] 所述流体输送系统可用于通过所述微流体设备的所述或每个流道控制流体样品的流量。与所述微流体设备的出口连接的所述流体输送系统可为抽吸泵(suction pump)。与所述微流体设备的样品入口连接的所述流体输送系统可为灌注泵、自流喂送器、蠕动泵或任意形式的压力驱动泵。抽吸泵和压力泵可为电动泵或手动泵(例如灌注泵)。
[0041] 所述系统可进一步包括将热量提供给所述微流体设备的加热器。所述加热器可设置在或连接到放置所述微流体设备的平台上。所述加热器可包括电气电阻线圈、电阻油墨印刷图案等。所述加热器可为电阻加热器(resistive heater)，该电阻加热器包括涂敷有导热粘合剂的蛇形线。所述加热器能够将所述微流体设备内的样品流体的温度调节到37℃至60℃，优选约37℃。
[0042] 所述系统可包括软件，所述软件集成在所述系统内部，可以控制系统的各个部件，例如控制放置所述微流体设备的平台的温度，控制流体注入所述设备的泵，所述设备内流量的计算，控制摄像机的配置(例如采集参数和图像处理)。这些控制范围的每一个都可被模块化并且可以独立使用，或结合主控处理器使用。
[0043] 所述系统可包括定位装置，用以定位所述微流体设备相对于所述检测装置的位置。
[0044] 所述光学检测装置可进一步结合记录血小板聚集的装置。当所述检测装置记录图像时，可记录不同时间点的多张图像以便确定在所述微流体设备中实时观察到的血小板聚集程度。
[0045] 通过利用彩色或荧光标记物标记生物样品中的目标，可提高目标的可视化，更容易确定血小板的聚集。因此，所述方法可包括将彩色或荧光标记物与生物样品混合的步骤。该步骤可以在所述生物样品进入所述通道之前、过程中或之后进行。例如，生物样品可以在下列位置与彩色或荧光标记物混合：在生物样品被引入样品入口之前在所述设备外；在样品入口和流动腔(flow cavity)之间(例如在入口和流动腔之间的通道内设置的混合井中)。
[0046] 根据本发明，可使用的合适的荧光标记物的实例包括例如：长链碳花青、如Dil、DiO及其类似物。具体实例包括由Invitrogen制备的亲脂性碳花青DilC18、DiIC6、DiOC18、DiOC6以及由Sigma制备的膜探针。其他适用于本发明的膜探针为本领域的技术人员所熟知。
[0047] 显现含有荧光标记的目标时，所述方法可包括将来自激发辐射源(excitation radiation source)的辐射照射到标记的血小板上以激发荧光标记的步骤。辐射可通过合适的感光滤光片照射到血小板上。激发辐射源例如可为蓝色发光源，如二极管或其他合适的光源。所述检测装置可包括发射光滤光片(emission filter)，定位于使所述光源到达所述设备之前引导辐射从该发射光滤光片通过。
[0048] 根据第三方面，本发明提供了一种实时评估从受试者获得的生物样品的血小板聚集的方法，该方法包括：
[0049] 使生物样品按照一定速率通过特定通道，该速率使该通道干扰该样品的流动，并因此引起形成与下游剪切减速区耦合的上游剪切加速区，并在该上游剪切加速区与该下游剪切减速区之间限定了剪切率峰值区，该下游剪切减速区限定了血小板聚集区域；以及[0050] 检测由于该生物样品通过该通道而在该聚集区域发生的血小板聚集。
[0051] 所述特定通道被理解为包括与第一方面、第二方面或实施例的任何一个相关的突起部。
[0052] 本发明还提供了一种用于评估从受试者获得的生物样品的血小板聚集的方法，该方法包括：
[0053] 使该生物样品通过通道，该通道具有用于干扰样品流动的突起部，该突起部的至少一个横截面的尺寸明显小于100微米，该突起部用于在该通道内限定血小板聚集区域；以及
[0054] 检测由于该生物样品通过该通道而在该聚集区域发生的血小板聚集。
[0055] 本发明还提供了一种用于评估从受试者获得的生物样品的血小板聚集的设备，该设备包括：
[0056] 通道，用于供该生物样品通过，该通道用特定方式干扰样品的流动，以便在该样品以合适的流量通过该通道时诱导形成该样品中的高剪切区域，以及在该高剪切区域下游的负剪切梯度区域中诱导形成血小板聚集区域；以及
[0057] 血小板检测装置，用于检测由于该生物样品通过该通道而在该聚集区域发生的血小板聚集。
[0058] 本发明还提供了一种用于评估从受试者获得的生物样品的血小板聚集的方法，该方法包括：
[0059] 使该生物样品按照一定速率通过特定通道，该特定速率使该通道具有干扰该样品流动特征，以诱导该样品中形成的高剪切区域以及在该高剪切区域下游的负剪切梯度区域中诱导形成血小板聚集区域；以及
[0060] 检测由于该生物样品通过该通道而在该聚集区域发生的血小板聚集。
[0061] 在本发明的某些实施例中，样品灌注之前，脱气台氏缓冲液(Turodes buffer)(4.3mM K2HPO4，4.3mM NaHPO4，24.3mM NaH2PO4，113mM NaCl，5.5mM D-葡萄糖，pH7.2)用于灌注所述通道，用于除去所有气泡，该台氏缓冲液加热至45℃。
[0062] 所述突起部或突出可包括部分阻塞所述通道的屏障。在该实施例中，该屏障和相对的通道壁之间的间隙优选大约在0.5-40微米之间。平行于通过所述通道流动的主方向(dominant direction)测量的间隙宽度优选为0.5-20微米，更优选约为15微米，并优-1选配置为在合适流量下产生大约20,000s 的剪切条件。然而应了解剪切率峰值基本上-1 -1
在10,000s 至150,000s 的范围内或更大。输入通道优选配置为在间隙的上游产生大约-1
1,800s 的剪切条件。屏障优选包括与通过所述通道流动的主方向成30°至90°角的上游面。屏障优选进一步包括与通过所述通道流动的主方向成30°至90°角的下游面。所述上游面和下游面基本上是平面的、凹面的或凸面的。
在10,000s 至150,000s 的范围内或更大。输入通道优选配置为在间隙的上游产生大约-1
1,800s 的剪切条件。屏障优选包括与通过所述通道流动的主方向成30°至90°角的上游面。屏障优选进一步包括与通过所述通道流动的主方向成30°至90°角的下游面。所述上游面和下游面基本上是平面的、凹面的或凸面的。
[0063] 在一个实施例中，所述设备进一步包括容纳生物样品的入口或小孔(aperture)以及出口。入口和出口位于微毛细管或与之相连的微通道的任一端。
[0064] 本文涵盖的标准流量(typical flow rate)涉及构成被提出存在于体内血管系统的流量所需的范围。一般来说，通过微毛细管或微通道的生物样品的流量在500-0.5微升/分钟的范围内，例如可以在2-42μl/min的范围内。
[0065] 本发明还提供了一种用于检测或评估患有血小板或其前体功能或活性异常的相关性疾症或障碍性疾病或具有患该疾病风险的受试者的诊断方法；该方法与本发明的微流体设备相结合。
[0066] 本发明还提供了一种诊断患有血小板或其前体功能或活性异常的相关性症状或障碍性疾病或具有患该疾病风险的受试者的诊断方法，该方法包括：
[0067] i)从受试者获得生物样品；
[0068] ii)在确定的流条件(defined flow condition)下且在来自该生物样品的细胞足以发生聚集的时间内，使该生物样品通过根据本发明的设备；
[0069] iii)检测该细胞的聚集；以及
[0070] 将该生物样品细胞聚集的时间和聚集体的大小与预定标准作比较，其中任何变化都表示患有血小板或其前体功能或活性异常的相关性疾症或障碍性疾病或具有患该疾病的风险。
[0071] 在本发明的一个实施例中，所述方法可用于诊断血栓形成和溶解、心血管疾病、由疾病和药物引起的止血机制变化、血小板功能障碍和受体异常、药物治疗敏感、出血病症如血管性血友病或维生素K缺乏症、狭窄症、糖尿病、凝血功能障碍、中风、血小板功能紊乱如血小板无力症、巨大血小板综合症以及贮存池病(Storage Pool Disease)。
[0072] 利用“血小板功能或活性异常”，它指的是与血小板粘附、血小板聚集、血小板易位(translocation)、血小板速率(velocity)、血小板形态以及血栓稳定性相关的任何活性或缺陷。该术语还旨在包括血小板脱粒以及细胞质颗粒释放的任何缺陷。该术语还旨在包括影响血小板功能的细胞质因子(plasma factor)的异常。
[0073] 本发明领域的技术人员应了解各种血小板缺陷。
[0074] 本发明还提供了一种用于判断或评估试剂对生物样品中血小板或其前体聚集的调节作用的方法，该方法包括：
[0075] i)在确定的流动条件下且在足以判断在本发明的微流体设备内是否发生血小板聚集的时间内，并在该试剂存在的情况下，使该生物样品通过该设备；以及[0076] ii)将步骤(i)中获得的结果与在该试剂不存在的情况下进行步骤(i)的结果作比较。
[0077] 应了解本发明的设备和方法可用于评估用抗血小板药物治疗的受试者体内抗血小板药物的有效性。该受试者包括利用介入心脏病学导管插入术治疗的受试者。介入心脏病学导管插入术包括血管造影术、血管成形术和支架植入术。此外，所述设备可用于监测接受人工心脏瓣膜的患者体内的抗血小板药物的有效性。
[0079] 本发明的设备和方法还可用于诊断受试者是否有失血过多的危险。例如，在外科或牙科手术之前该测试是必须的。例如，所述方法可用于在患者拔牙或拔掉智齿之前确定是否有失血过多的危险。
[0080] 本发明还提供了本发明的微流体设备在诊断患有血小板或其前体功能或活性异常的相关性症状或障碍性疾病或具有患上该疾病的风险的受试者的方法中的用途。
[0081] 根据一个实施例，在通过所述设备进行灌注之前，可将试剂添加至生物样品。或者在从受试者获取生物样品之前，可将试剂施加给受试者。
[0082] 在另一实例中，试剂可施加到微通道的壁上，这样在样品通过所述设备的微通道时，该试剂被添加到该生物样品中。
[0083] 例如，对从服用抗血小板药物氯吡格雷(clopogrel)的患者取得的血液样品来说，利用试剂P2Y1(ADP)受体拮抗剂MRS2179对生物样品进行预处理，以便使系统对氯吡格雷(clopidogrel)的作用敏感。
[0084] 本领域的技术人员应了解，在通过微流体设备进行灌注之前选择适当剂量的试剂对样品进行预处理。预处理过程中使用的抑制剂浓度可由下面的方法确定：响应于将外源ADP加入该血小板样品的标准化血小板聚集试验(standardised platelet aggregometry)、基于通过将外源ADP加入该血小板样品引起的血小板整合素αIIbβ3活化的荧光激活细胞分类术、或微流体设备本身的多种重复中的剂量响应测量法(dose respose measurement)。
[0085] 本发明还提供了一种对利用试剂疗法的受试者的治疗进行监测的方法，该方法包括：
[0086] (i)在确定的流条件下且在足以判断在本发明的设备内是否发生血小板聚集的时间内，使来自该受试者的第一生物样品通过该设备，该第一生物样品在给该受试者施用该试剂之前获得；以及
[0087] (ii)在确定的流动条件下且在足以判断在本发明的设备内是否发生血小板聚集的时间内，使来自该相同受试者的第二生物样品通过该设备，该第二生物样品在给该受试者施用该试剂之后获得；以及
[0088] (iii)将步骤(i)中获得的结果与步骤(ii)中获得的结果作比较。
[0089] 在根据本发明的另一实施例中，第一样品和第二样品都是在对受试者施用试剂后获得的，以便随时监测该试剂的作用。例如，该第二生物样品可在第一样品后规定的时间段提取，例如，1天后、5天后、1周后、1个月后、4个月后，以便逐步监测患者的治疗。
[0090] 相应地，本发明还提供了一种用于对使用试剂疗法的受试者的治疗进行监测的方法，该方法包括：
[0091] (i)在确定的流条件下且在足以判断在本发明的设备内是否发生血小板聚集的时间内，使来自受试者的第一生物样品通过该设备，该第一生物样品在给该受试者施用该试剂的第一剂量之后获得；以及
[0092] (ii)在确定的流动条件下且在足以判断在本发明的设备内是否发生血小板聚集时间内，使来自该相同受试者的第二生物样品通过该设备，该第二生物样品在给该受试者施用该试剂的第二剂量之后获得；以及
[0093] (iii)将步骤(i)中获得的结果与步骤(ii)中获得的结果作比较。
[0094] 通过试剂疗法后随时比较血小板聚集行为，临床医生有可能减轻给受试者施用的试剂的剂量，并作出准确判断是否停止该试剂治疗或是否改变所施用的试剂。
[0095] 本发明还提供了根据本发明的设备监测受试者抗血小板治疗的用途。在一个实例中，所述设备可用于识别具有阿司匹林和氯吡格雷的“抗药性”或治疗失败的其他表现的受试者。
[0096] 术语“足以判断是否发生血小板聚集的时间”是生物样品流过所述设备的一段时间，这段时间为本发明领域的技术人员所熟知。在一个实例中，时间段至少为10分钟左右。在另一实例中，至少为20分钟左右。
[0097] 本发明还提供了一种根据本发明的微流体设备监测生物样品中血小板功能和/或活性的用途。
[0098] 例如，所述设备可用于筛选以及作为血小板分离和制备的质量控制形式，该质量控制形式用于对患有血小板相关性出血病症的患者的临床治疗(例如输液)。所述设备还可用于在血小板输注产品在向患者施用之前评估其可行性和有效性。所述设备还可用于评估血小板在长期存储后的存活率(viability)和有效性。
[0099] 本发明还提供了根据本发明的微流体设备用作出血病症筛选装置的用途。
[0100] 在一个实例中，从受试者获得的生物样品可利用一种或多种血小板抑制剂进行预处理，并通过该微流体设备的多个限定的几何体，在该设备中观察到的血小板聚集程度可能与出血病症相关。
[0101] 所述设备可用于确定先天性(例如血管性血友病(von Willebrand’disease))和获得性出血缺陷(例如药物，获得性血小板病(acquired thrombocytopathies))中出血的原因。先天性出血病症可包括下列疾病：
[0102] -血管性血友病、血小板无力症、巨大血小板综合症、斯科特综合症；
[0103] -α-颗粒缺陷，例如灰色血小板综合症、魁北克血小板综合症(Quebec Platelet)、α-SPD(存储池缺陷)、α，δ-SPD；
[0104] -致密颗粒缺陷，例如赫曼斯基-普德拉克综合症、塞迪埃克-东综合症、格里塞利综合症、δ-SPD；
[0105] -细胞骨架缺陷，例如威斯科特-奥尔德里奇综合症以及相关巨大血小板综合症。
[0106] 所述设备还可用于评估病人间对药物反应的差异，且可用于识别出血高风险患者。
[0107] 本发明还提供了根据本发明的微流体设备用于分析儿科受试者出血病症的用途。例如，所述设备可用于筛选患者中的新生儿和儿科人群，其中只有少数血液样品可用。在另一实例中，所述设备可用于检测患颅内出血风险的婴儿和/或新生儿。所述设备可用于确定出血是否主要与血小板功能障碍有关。
[0108] 在本发明其他实施例中，本发明结合范围并行在6-300几何变异之间的不同几何体阵列作为第一通过测定设备(first assay device)。广谱阵列的结果然后用于限定一组特定几何体，该特定几何体最适合于有问题的血小板样品。这被视为校准步骤，重点在于对一部分几何体的测定。所述设备的阵列形式在高通量筛选方案(protocol)中比较实用。
[0109] 相应地，本发明还提供了本发明的微流体设备用作抗血小板治疗药物开发的实验高通量筛选工具的用途。在一个实施例中，利用一系列小分子或多肽抑制剂处理多种血小板样品，并使该样品通过该微流体设备进行分析。这样，可从大型化合物库迅速有效地识别新型抗血小板药物。分析具有抗血小板活性的分子或多肽，并与通过定义的一系列微通道几何体灌注的未处理的对照样品作比较。
[0110] 本发明还提供了一种用于高通量筛选多种候选抗血小板化合物的方法，该方法包括：
[0111] (i)将从受试者获得的至少一种生物样品与该多种候选抗血小板化合物的至少第一种化合物(member)接触；
[0112] (ii)在确定的流动条件下且在足以判断在根据本发明的微流体设备内是否发生血小板聚集的时间内，使该至少一种样品通过该设备；
[0113] (iii)检测该多种候选抗血小板化合物的该第一种化合物对该至少一种生物样品的血小板聚集的影响；以及
[0114] (iv)将步骤(iii)中观察到的影响与不与该候选化合物接触的对照样品作比较。
[0115] 本发明领域的技术人员应了解，所述候选抗血小板化合物可包括可检测的标记组，便于检测和观察设备中的血小板聚集。
[0116] 同样应了解上述高通量筛选方法的优点在于筛选来自转基因动物(如转基因小鼠)的多种血小板样品是否具有剪切依赖性(shear dependent)血小板缺陷的筛选工具。所述设备的高通量阵列形式快速筛选来自经重整或化学突变的小鼠的大量样品是否具有血小板缺陷。所述方法还可用于筛选大量转基因小鼠的样品。
[0117] 本发明还提供了一种新型抗血小板试剂，通过高通量筛选法获得的所述试剂包含根据本发明的微流体设备。
[0119] (i)根据本发明的微流体设备；以及
[0120] (ii)用来说明该微流体设备在监测血小板功能的系统中如何使用的说明书。
[0121] 提出的实施例发现到局部剪切微梯度(local shear microgradient)促使剪切减速区发生血小板聚集，该剪切减速区紧接高剪切加速区。因此，该剪切加速区之后接着便是与之紧密耦合的剪切减速区(剪切梯度)，是有助于稳定的血小板聚集体发展的环境。附图说明
[0122] 现在参照附图对本发明的实例进行描述，其中：
[0123] 图1为总体示出了通过限定血小板聚集区域的球状突起部的样品流动的示意图；
[0124] 图2a为血管损伤处及其下游血小板聚集的显微序列(micrograph sequence)，图2b和图2c为血管损伤周围三个区域中血小板聚集的程度，图2d为根据剪切率的血小板聚集的程度；
[0125] 图3a为一系列差分相差图像，图3b包括扫描电子显微图像，每张图像为血小板系链；
[0126] 图4a为根据本发明一个实施例的具有屏障的通道的总体透视图，图4b为本发明某些实施例中选择的可变通道参数的顶视图，图4c为根据本发明第二实施例制造的设备的显微照片；
[0127] 图5a为根据本发明实施例制造的具有屏障台阶几何微通道的块体材料的截面端视图，图5b为图5a的块体材料通道部分的放大部分端视图，图5c为图5a和图5b的块体材料的顶视图，以及图5d为图5a-5c的块体材料的放大部分顶视图；
[0128] 图6a为本发明实施例，其中突起部包含通道的包含球体，图6b-6d为这样的球状几何体的变形；
[0129] 图7a为根据本发明另一实施例的制造有球状几何微通道的块体材料的截面端视图，图7b为图7a的块体材料的通道部分的放大部分端视图，图7c为图7a和图7b的块体材料的顶视图，图7d为图7a-7c的块体材料的放大部分侧视图，以及图7e为图7a-7d的块体材料的放大部分顶视图；
[0130] 图8为本发明的一个实施例，其中突起部包括通道内的立柱；
[0131] 图9a为根据本发明另一实施例的制造有立柱几何微通道的块体材料的截面端视图，图9b为图9a的块体材料的通道部分的放大部分端视图，图9c为图9a和图9b的块体材料的顶视图，图9d为图9a-9c的块体材料的放大部分侧视图，图9e为图9a-9d的块体材料的放大部分顶视图；
[0132] 图10a为聚二甲硅氧烷(PDMS)块体材料的透视图，其内部根据本发明实施例制造了微通道设备，图10b为差分干涉相差图像，示出了并行阵列配置中设备设计的几种物理实施例，图10c为PDMS块体材料的顶视图，其内部根据本发明另一优选实施例制造了微通道设备；
[0133] 图11a-11e为在本发明第一实例中获得的结果；
[0134] 图12a-12e为在本发明第二实例中获得的结果；
[0135] 图13(i)和13(ii)都有图像(a)-图像(f)，分别为本发明第三实例中获得结果的彩色及黑白图像；
[0136] 图14a为未抑制的全血在三种通道微观几何体中的血小板聚集，其中三种通道微观几何体的扩张角b各不相同，分别为90度、60度和30度；A＝c90e90g20w15100-700μm几何体，B＝c90e60g20w15100-700μm几何体，以及C＝c90e30g20w15100-700μm几何体；
[0137] 图14b为经抑制剂处理的全血在三种与图14a中相同的几何体中的血小板聚集；A＝c90e90g20w15100-700μm几何体，B＝c90e60g20w15100-700μm几何体，以及C＝c90e30g20w15100-700μm几何体；
[0138] 图15a-15d为选择的台阶几何体应变率以及加速度分析；
[0139] 图16a-16d为承受侧壁压力的代表性小鼠肠系膜微动脉的结构及CFD模拟结果，图16e-16f为对应于图16a-16d的黑白图；
[0140] 图17描述了三种选择的对称微通道设计案例；
[0141] 图18(i)和图18(ii)中的每个表示图像(a)-(d)分别示出了肠系膜微动脉和c60g20e60模拟血管中计算的应变率分布的彩色及黑白图像；
[0142] 图19(i)和图19(ii)中的每个表示图像(a)-(d)分别示出了该设备的流体动力学性能的彩色及黑白图像；
[0143] 图20a和图20b分别表示实时落射荧光图像显示聚集的彩色及黑白图像；
[0145] 图22为包含c85g30e85100-100μm几何体的微流体设备中抗血小板抑制剂作用的比较；
[0146] 图23为包含c85g30e85100-100μm几何体的微流体设备中正常健康供体样品与血管性血友病患者样品进行比较；
[0147] 图24为在包含cX g20e85100-100μm几何体的微流体设备中比较减小的收缩角对血小板聚集反应的影响，其中cX＝收缩角；
[0148] 图25为在包含c85g20eX 100-100μm几何体的微流体设备中比较减小的扩张角对血小板聚集反应的影响，其中eX＝扩展角；
[0149] 图26为分析了在包含c75gX e75100-100μm几何体的微流体设备中间隙宽度对血小板聚集反应的影响，其中gX＝可变间隙宽度；
[0150] 图27为分析了在包括c75g20e75100-100μm几何体的微流体设备中间隙长度对血小板聚集反应的影响。
具体实施方式
[0151] 本发明人确定了血液流变学(blood rheology)的突然改变在血管损伤部位引发血小板聚集以及血栓生长方面的重要作用。尤其是，本发明人已经表明微尺度的剪切梯度在诱导盘状血小板(discoid platelet)聚集方面的关键作用，聚集体的稳定依赖于独特的膜粘附结构(称为膜系链重组(membrane tether restructuring))的形成。因此，响应于局部剪切微梯度，发展中的血栓主要由盘状血小板构成，可溶性血小板激动剂，例如凝血酶、ADP以及TXA2的生成在稳定形成的聚集体方面起着次要作用。这些新发现对长期认为可溶性激动剂的生成是血小板聚集和血栓生长的主要因素的观点提出了质疑。
[0152] 图1为总体示出了通过限定血小板聚集区域的球状突起部的样品流动的示意图。该图剪切梯度依赖性血小板聚集(shear gradient-depedent platelet aggregation，S.G.A)的工作模型，用以支持下文中进一步描述的微剪切梯度技术。由血管壁几何尺寸的改变或部分管腔阻塞(即形成血栓)引起的局部血流障碍构成了局部剪切梯度，其特征为剪切加速的狭窄区域，之后是剪切减速的紧密耦合区域(tightly coupled zone)。沿着与剪切加速区相交路线流动的盘状血小板在剪切峰值(peak shear)区域(区域2)形成丝状膜系链交互(filamentous membrane tethering interaction)。随后血小板转运到减速剪
2+
切区域(区域3)，导致膜系链活性(Ca -依赖型)重组，特征在于整体系链增厚，粘附力增强。持续的盘状血小板补充以及系链重组促进了血管损伤部位下游的稳定盘状聚集体和血栓的生长。
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切区域(区域3)，导致膜系链活性(Ca -依赖型)重组，特征在于整体系链增厚，粘附力增强。持续的盘状血小板补充以及系链重组促进了血管损伤部位下游的稳定盘状聚集体和血栓的生长。
[0153] 图2a为发生在小鼠肠系膜动脉壁有化学损伤的部位上，盘状血小板聚集的代表性微成像序列(micro-imaging sequence)。注意，不断生长的血小板聚集体名义上已被分割成上游象限(upstream quadrant)(区域1)，横向象限(lateral quadrant)(区域2)以及下游象限(downstream quadrant)(区域3)。黑箭头表示化学处理引起的病变。白箭头表示观察到初始血小板补充的点。白色虚线限定盘状血小板聚集体的外部边缘。比例尺为5μm。图2b为体外血小板血栓表面的不同剪切区域(区域1、2和3)中的盘状血小板凝聚寿命的图(n＝24次实验)。注意，凝聚寿命在较低剪切区域(区域3)中显著变大。
[0154] 图2c为体外体内发展中的小鼠血栓的不同剪切区域(区域1、2和3)内盘状血小板系链的相对分数的图。体外血栓(in vitro thrombi)-体外血栓表面上的凝聚频率(cohesion frequency)(n＝24次实验)；体内血栓(in vivo thrombi)-C57B 1/6野生型小鼠的体内血栓表面上的凝聚频率；ADP、TXA2拮抗剂+水蛭素(体内)-口服200mg/kg阿-/-司匹林、50mg/kg氯吡格雷(clopidogrel orally)+静脉注射50mg/kg水蛭素的P2Y1 小鼠的体内血栓表面上的凝聚频率(n＝14)。注意，血小板补充的主要区域在减速区域(区域3)内。
[0155] 图2d为根据应用的体积剪切率(bulk shear rate)(γ)[n＝3]，体外预成型的血小板单层表面上盘状血小板凝聚寿命的图。该数据集表示利用系链形成的血小板补充在剪-1切率为300s 或以下时是最有效的，该剪切率接近体内外血栓的区域3中发现的值。
[0156] 总的来说，该数据集表明其余盘状血小板粘附和凝聚互动对发生在体内外血栓下游面的剪切减速区敏感。这是基础观察，构成设备设计的生物学基础，并刊登在Nesbitt W.S. 等“A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation”.Nat Med.2009Jun；15(6)：665-73。
[0157] 图3a为一系列差分相差图像(differential contrast image)，图3b包括扫描电子显微图像，每张图像为根据微剪切梯度应用的血小板动态结构重组。图2a为表示血栓下游面的动态血栓系链行为的差分干涉相差(DIC)成像，该血栓预形成在固定的1型纤维胶-1原蛋白上(应用的体积剪切率＝1800.s )[比例尺＝2μm]。白色选取框突出显示了盘状血小板系链的发展：初始血小板相互作用导致了短系链的形成(144sec)，该短系链迅速变粗(161-188sec)产生接近盘状体(白色箭头：191sec)的球状膜结构。图2b为盘状血小-1
板扫描电子显微镜(SEM)成像(以300.s 的速率流动)[比例尺＝1μm]，展示了在粘附到展开的血小板单层表面的过程中的丝状重组膜系链。
板扫描电子显微镜(SEM)成像(以300.s 的速率流动)[比例尺＝1μm]，展示了在粘附到展开的血小板单层表面的过程中的丝状重组膜系链。
[0158] 识别新型剪切梯度依赖性血小板聚集机制的研究开发出了微流控流设备(microfluidics-based flow device)，该设备利用时间剪切梯度来诱导血小板聚集和血栓生长。
[0159] 图4a-4c分别为具有台阶几何体(step geometry)的微剪切梯度设备(micro-shear gradient device)的示意图。图4a为微剪切梯度设备的示意图，描述了台阶几何配置的总原理。血液样品通过微剪切梯度室从左至右进行灌注。样品与微尺度台阶几何体的相互作用导致屏障上的初始剪切加速度，紧接着是屏障和台阶下游处的紧密耦合减速阶段，这样促使在聚集区域内盘状血小板的聚集。图4b为在该实施例中，台阶几何体由6个主要参数限定：i.流入通道宽度(100-1000μm)，将初始血液剪切率限定并限制到生理-1
范围(150-10,000s )；ii.内流角或收缩角(θc)，范围在0°至90°之间(更优选地，30°至90°)，限定血流加速速率；iii.台阶间隙高度，范围在10μm至40μm，限定加速阶段后的剪切峰值；iv.扩张角(θe)，范围在0°至90°之间(更优选地，30°至90°)，将血流减速临界速率限定至扩张几何体(expansion geometry)，限定血小板聚集区域；v.扩张通道宽度，范围在100-1000μm之间，限定减速阶段大小；以及vi.间隙宽度，范围在0.5-20μm之间，限定突起部的宽度。图4c为制造的微剪切梯度设备的显微照片(40倍的放大倍率)，该设备由100μm流入宽度、θc＝90°、10μm间隙高度、θe＝30°以及700μm扩张宽度组成(图中仅部分可见)。
范围(150-10,000s )；ii.内流角或收缩角(θc)，范围在0°至90°之间(更优选地，30°至90°)，限定血流加速速率；iii.台阶间隙高度，范围在10μm至40μm，限定加速阶段后的剪切峰值；iv.扩张角(θe)，范围在0°至90°之间(更优选地，30°至90°)，将血流减速临界速率限定至扩张几何体(expansion geometry)，限定血小板聚集区域；v.扩张通道宽度，范围在100-1000μm之间，限定减速阶段大小；以及vi.间隙宽度，范围在0.5-20μm之间，限定突起部的宽度。图4c为制造的微剪切梯度设备的显微照片(40倍的放大倍率)，该设备由100μm流入宽度、θc＝90°、10μm间隙高度、θe＝30°以及700μm扩张宽度组成(图中仅部分可见)。
[0160] 图5a-5d分别示出了具有图4中描述类型的台阶几何体的微剪切梯度设备的示意图。图5a和图5b为微通道聚二甲硅氧烷(PDMS)块体材料(block)500的横截面视图，示出了矩形微通道510的位置和尺寸。图5c为具有台阶几何体的微通道设备500的顶视图，示出了直径为16mm的入口520以及直径为2mm的出口522。图5d为块体材料500的台阶几何体的详细顶部示意图，示出了相对于微通道512的台阶几何体的位置。如图5d所示，入口520的流入通道(feed channel)516宽725微米，微通道512宽100微米，台阶屏障(barrier of step)514在微通道512的下游端保留宽度在10-40μm之间的间隙，流出通道518宽在100-1000微米的范围内。台阶屏障514的上游面与流动方向呈现角度θc，该角度θc为0-90度之间(更优选地，30°至90°)选取的角；台阶屏障514的下游面呈现角度θe，该角度θe为在0-90度之间(更优选地，30°至90°)选取的角。
[0161] 图6a-6d为其中使用球状几何体的微剪切梯度设备的实施例。图6a为微剪切梯度设备的示意图，示出了球状几何配置的总体原理。箭头610表示血液样品从左至右进行灌注通过微剪切梯度室612。样品与微尺度台阶几何体614相互作用导致接近球体614上游的横向和轴向剪切加速度，接着导致接近球体614下游的紧密耦合的减速阶段，后者促使球状几何体614下游面的盘状血小板聚集。球状几何体由两个主要参数限定：i.通道宽度(100-200μm)，根据流量限定并限制初始血液剪切率；以及ii.球体直径，范围在0.5-100μm之间，该球体直径限定了球体进入基本为层流剖面(laminar flow profile)的峰值流量区域的穿透能力，并限定了剪切梯度的大小、空间分布以及变化率。图6b-6d描述了可能出现在本发明的选择性实施例中的球状几何体的总体变化。这些三维几何体或特征可有下述变化：半球体(例如图6(b)中所示的624)，更像是原位血栓形状的泪珠形状(tear drop shape)(例如图6(c)所示的634)，和/或具有不同拱度的凸形(例如图6(d)所示的644)。
[0162] 图7a-7d为根据本发明另一实施例的聚二甲硅氧烷(PDMS)块体材料700的示意图，该块体材料700中制造有具有球状几何微通道的微剪切梯度设备。图7a和7b给出了微通道块体材料700的截面视图，示出了矩形微通道710的位置和尺寸。图7c为具有球状几何体的微通道设备700的顶视图，示出了直径为16mm的入口720以及直径为2mm的出口722。图7d和图7e分别给出了球状几何体714的详细侧视图和顶视图，示出了相对于微通道712的球状几何体714的位置。如图7d所示，微通道712高100-200微米，球体714保留有宽度在50-99.75微米之间的顶上间隙(overhead gap)，以及流出通道718高为100-200微米。球体714直径在0.5-100微米之间。如图7e的顶视图所示，球体714位于通道712底部的中央，保留有在50-99.75微米范围内的相同大小的侧间隙。微通道712上游的流入通道716宽725微米。
[0163] 图8为本发明的一个实施例，其中突起部包括通道812内的立柱(post)814。箭头810表示血液样品通过微剪切梯度室812从左至右进行灌注。样品与微尺度立柱几何体814的相互作用导致接近立柱814上游和其周围的横向剪切加速，接着导致立柱814周围和接近其下游的紧密耦合的减速阶段，后者促使立柱几何体814下游面的盘状血小板聚集。这样的立柱几何体由三个主要参数限定：i.通道宽度(100-200μm)，根据流量限定并限制初始血液剪切率；ii.立柱高度，范围在0.5-100μm之间，限定立柱进入大致层流剖面的峰值流量区域的穿透能力；以及iii.立柱直径，范围在0.5-100μm之间，限定剪切梯度的大小、空间分布以及变化率。
[0164] 图9a-9e为根据本发明另一实施例，具有立柱几何体的微剪切梯度设备900的截面示意图。图9a和图9b为微通道块体材料900的截面视图，示出了矩形微通道912的位置和尺寸。图9c为具有立柱几何体的微通道设备900的顶视图，示出了直径为16mm的入口920以及直径为2mm的出口922。图9d和图9e分别为立柱几何体的详细侧视图和顶视图，示出了相对于微通道912的立柱914的位置。如图9d所示，微通道912高100-200微米，立柱914保留有50-99.75微米之间的顶上间隙，以及流出通道918高为100-200微米。立柱914直径在0.5-100微米之间，高度为0.5-100微米之间。如图9e的顶视图所示，立柱914位于通道912底部的中央，保留有在50-99.75微米范围内的相同大小的侧间隙。微通道912上游的流入通道916宽725微米。
[0165] 图10a示意地示出了根据本发明实施例的微流体设备。该微流体设备为一次性暗盒(cartridge)的形式，包括三层：第一外层(未示出)、第二外层1008以及制作的插入层(fabricated interposed layer)1000。该暗盒可位于多用外壳(未示出)内。
[0166] 组合插入层1000具有两个微制造流道1002a和1002b，两个流道除特殊的入口和出口几何体外是相同的。微通道1002a和1002b形成在聚二甲硅氧烷(PDMS)内，块体材料抵靠在盖玻片1008上，密封各微通道。微通道1002a和1002b的各端分别是入口1004和出口1006。
[0167] 每一通道1002a和1002b由5mm长的具有矩形横截面的通道组成，其中心引入不对称台阶或突起部。台阶几何体由六种参数限定，即：
[0168] i)流入通道宽度(100-1000μm)，将初始血液剪切率限定并限制到生理范围-1(150-10,000s )；
[0169] ii)内流角或收缩角(θc)，范围在0°至90°之间(更优选地，30°至90°)，限定血流加速率；
[0170] iii)台阶间隙高度g，范围在10μm至40μm，限定加速阶段后的剪切峰值；
[0171] iv)扩张角(θe)，范围在0°至90°之间(更优选地，30°至90°)，将血流减速临界率限定至限定血小板聚集区域的扩张几何体；
[0172] v)扩张通道宽度，在100-1000μm之间，限定减速阶段的大小；以及[0173] vi)间隙宽度，范围在0.5-20μm之间，限定突起部或屏障的宽度。
[0174] 微通道的制造
[0175] 采用标准软光刻技术(soft-lithography techniques)，将微通道1002a和微通道1002b制造在3英寸硅片上的PDMS(Sylagard，来自KMPR 1025光阻剂(microChem Corp，微化公司)模具)中(Weibel，D.B.，Diluzio，W.R.&Whitesides，G.M.Microfabrication meets microbiology.Nature reviews 5，209-218(2007))。采用高分辨率铬掩模(chrome mask)获得明确的特征，来制造模具。为了获得具有良好均匀性的130μm厚的膜，使用-1 -1300rpm和100rpm s 的传播周期(spread cycle)十秒，1000rpm s 和300rpm的研制周期(development cycle)三十秒，在4英寸硅片上旋压覆盖KMPR 1025(microChem Corp)光阻剂。利用边缘珠粒去除溶剂(edge bead removal solvent)进行一个循环的边缘珠粒去除，时间为三十秒。从23℃开始通过每分钟将温度升高6℃对涂覆有KMPR的晶片进行软性-2
烘烤处理，100℃时保持四分钟，使溶剂干透。在波长为360nm、功率为8mW cm 的MJB3接触式掩膜对准器(contact mask aligner)上，将掩膜图案(mask pattern)与KMPR膜一起在紫外线下曝光两分钟，一分钟曝光两次，以免基板(substrate)过热。曝光后，在100℃(从
23℃开始每分钟将温度升高6℃)在加热板上烘烤四分钟，使图案交联。加热板上的样品与曝光并交联的膜一起缓慢冷却至室温，以免对膜产生热应力并避免由于温度突然改变可能引起的裂缝。曝光后的KMPR显影(develop)12分钟(定期搅拌)，以除去未曝光的材料。
KMPR图案显影后，利用异丙醇和DI水清洗晶片，将样品加热至120℃处理三小时进行最终的硬性烘烤处理，以便提高并加强交联的KMPRO图案。
烘烤处理，100℃时保持四分钟，使溶剂干透。在波长为360nm、功率为8mW cm 的MJB3接触式掩膜对准器(contact mask aligner)上，将掩膜图案(mask pattern)与KMPR膜一起在紫外线下曝光两分钟，一分钟曝光两次，以免基板(substrate)过热。曝光后，在100℃(从
23℃开始每分钟将温度升高6℃)在加热板上烘烤四分钟，使图案交联。加热板上的样品与曝光并交联的膜一起缓慢冷却至室温，以免对膜产生热应力并避免由于温度突然改变可能引起的裂缝。曝光后的KMPR显影(develop)12分钟(定期搅拌)，以除去未曝光的材料。
KMPR图案显影后，利用异丙醇和DI水清洗晶片，将样品加热至120℃处理三小时进行最终的硬性烘烤处理，以便提高并加强交联的KMPRO图案。
[0176] 然后，KMPR图案可用作浇铸PDMS通道的模具。一旦制成模具，PDMS及其固化剂(curing agent)按照10∶1的比例进行定量混合，并脱气(degass)处理三十分钟。混合物浇入先前制造并盛在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)膜的的KMPR模具中。然后在烤箱中100℃对PDMS进行二十分钟固化处理。从KMPR模具上剥下PDMS通道，利用活检穿孔器(biopsy punch)做出6mm的蓄存室入口孔(inlet reservoir hole)1004。使用2mm活检穿孔器将出口连接至灌注器(syringe)和泵。打完两个孔后，直接将PDMS通道放置到65x22mm的载玻片1004上。由于PDMS的低表面能，实现粘附。
[0177] 第一外层包括6mm厚的PDMS细长板(elongate plate)，该板加工成匹配插入层1000的尺寸。第一外层设置有包括进样通道(sample inlet passage)和进样口(sample inlet port)的样品入口(sample inlet)。样品输入通道通过第一外层。样品入口由第一外层的外表面中的样品输入通道限定。样品输入加工为穿过第一外层并轻敲入M5配件，以便将暗盒迅速连接至流体输送系统。第一外层进一步设置有包括出样通道和出样口的出口。
[0178] 通过将第一层压制在插入层1000上并利用压敏胶粘剂将两者粘贴，来装配暗盒。对暗盒定向，使得第一外层形成顶层，盖玻片1004形成暗盒的底层。装配时，第一外层的样品输入通道分别与插入层的入口1004对准。同样地，第一外层的样品输出通道分别与插入层的出口1006对准。因此形成的暗盒可限定流道1002a和流道1002b。因此形成的流道基本上沿直线运转，分别在第一端与样品入口1004连接，在第二端与出口1006连接。
[0179] 在使用设备的过程中，将来自受试者的血液样品或细胞悬液经由各自的入口引入设备，然后在灌注泵(syringe pump)、自流喂送器(gravity feed)、蠕动泵或任何形式的压力驱动泵的控制下以预定流量通过微通道1002a和微通道1002b进行灌注。利用检测装置(例如DIC、落射荧光显微镜或其它光学方法)检测微通道1002a和微通道1002b内的血小板聚集。值得注意的是，虽然微通道1002a和微通道1002b配置相同，且血小板聚集区域离得非常近，仍可光学监测到每个微通道1002a和微通道1002b内的血小板聚集总和(注意，PDMS是透光的)。累积监测法(cumulative monitoring method)提高了血小板聚集测量的可靠性，降低了任意微通道内血小板聚集随机变化的影响。
[0180] 尽管在此显示的实例仅有两个微通道，例如为进一步使测量顺利进行，更多的微通道可适当地设置在PDMS块体材料中(例如3、4、5、6或更多)。
[0181] 图10b为差分干涉相差图像(differential interference contrast image)(10×放大倍率)，示出了并行阵列配置中设备设计的几种物理实施例。使用cXgYeZ命名，其中cX为突起部上游面的角度，gY为间隙的长度(单位为微米)，eZ为突起部下游面的角度。图中示出了六个重复实验，但是阵列可由多达300个不同的重复(iteration)或300个相同的通道构成，其中每个通道具有独立的流量(泵)控件。
[0182] 图10c为根据本发明实施例的供选择设备1040的示意图。与图10a所示的设备1000相比，微剪切梯度设备1040的台阶几何体配置包括微制造流通道1042a、微制造流通道1042b和微制造流通道1042c，每个微制造流通道具有唯一的入口储存室1044和出口储存室1046。各个入口储存室1044的几何体直径为8mm，具有相同的清晰应变率微梯度几何体(same defined strain rate micro-gradient geometry)。各个出口储存室1046的几何体直径为1.5mm。
[0183] 上游阱(trap)1050设置在各个微通道1042a、微通道1042b和微通道1042c中，可至少防止由于抗凝作用不足而在血液样品中形成的颗粒物质和/或微血块(micro-clot)而导致微通道堵塞。阱1050协助血液流过设备达到最大流动效率(flow efficiency)。该设备设置有供给通道(feeder channel)1052，该供给通道1052经由单一微收缩装置(micro-contraction)1054将各个阱1050与各个微通道连接起来。
[0184] 在使用如图10a所示设备的过程中，将来自受试者的血液样品或细胞悬液经由各自的入口1020引入设备，然后在灌注泵、自流喂送器、蠕动泵或任何形式的压力驱动泵的控制下以预定流量通过微通道1012进行灌注。利用DIC、落射荧光显微镜或其它光学方法检测微通道1012内的血小板聚集。值得注意的是，虽然微通道1012配置相同，且血小板聚集区域离得非常近，仍可光学监测每个微通道1012内的血小板聚集总和(注意，PDMS是透光的)。累积监测法提高了血小板聚集测量的可靠性，降低了任意微通道内血小板聚集随机变化的影响。为进一步使测量顺利进行，更多的微通道可适当地设置在PDMS块体材料1000中。
[0185] 台阶配置构成大量微尺度几何体，其中已对一个或所有参数进行了修改。台阶的全部尺寸是关键限制，为满足此要求使长度和高度为0-100μm。在0μm高的台阶或扩张几何体的情况下，通道包括100μm宽的通道，该通道按照给定的扩张角扩张为200-1000μm宽的直通道。
[0186] 人们认识到血小板粘附过程在止血和血栓形成中具有关键作用，发展相对简单可靠的诊断测试(可对血小板体外粘附功能进行准确评估)具有重要的临床需求，因此开发了本发明的这些实施例。传统使用血小板功能测试的目的是识别血小板缺陷，用于风险增高患者的出血病症及监测止血(monitoring haemostatic)治疗，确保围手术(peri-operative)期正常的血小板功能。然而，认识到越简单可靠的血小板功能测试对监测抗血小板治疗的有效性有潜在的作用，开发了上述实施例，以便识别具有血小板反应过度和血栓风险增强的患者，便于对血小板集中进行质量控制，筛选血小板供者，还有可能预测手术出血的风险。认识到理想的血小板功能测试应易于操作，提供迅速、容易解释的测试结果，使用少量血液(天然或抗凝的)，能够在大范围血流条件下评估血小板功能，能够评估生理相关血栓表面上的血小板粘附和聚集，可再生性好，可靠性高，开发了本发明的上述实施例。
[0187] 本发明上述实施例提供设备以及结合设备使用的方法，用于评估从受试者获得的生物样品的血小板聚集。实施例利用血流中的微小变化(剪切梯度)代表体内血栓发展(thrombus development)的一般特征。通过提供包括一个或多个微毛细管或微通道(每个都具有明确的几何体)的体外用设备，这些实施例模拟一系列条件(例如体内较为典型的流量和壁剪切应力)来近似模拟体内的自然环境。因此，这样的设备具有评估受试者血栓发展(或凝血活性)的用途，受试者被怀疑具有诸如发生在血栓形成、心脏病、中风或其它血管疾病(包括深静脉血栓形成(DVT))的病人体内的血小板活性或功能异常，或者表现出对在疾病治疗过程中使用的标准疗法(例如肝素或其它血栓溶解剂)缺乏反应。
[0188] 生物样品
[0189] 此处使用的术语“生物样品”旨在包括任何包含血小板的样品，包括但不限于处理和未处理的生物样品，例如全血(自然或抗凝)、血浆、血小板或红色球。在优选实施例中，样品包括血小板或其前体。
[0190] 因为不希望受理论的约束，而利用注射器提取的生物样品会导致血液样品发生剪切。因此为了获得准确结果，建议以最大限度减小剪切的方式获得样品。一个实例是使用更大号的针头例如16号针头来提出血液样品。其它最大限度减小剪切的方法为本领域的技术人员所熟知。
[0191] 本发明的生物样品优选来源于人类或灵长类动物。生物样品还可来源于家畜或宠物。
[0192] 受试者
[0193] 此处使用的术语“受试者”旨在包括健康受试者以及血小板活性或功能存在已知或可疑异常的受试者。受试者包括上文描述的任意一种。优选受试者为人类。
[0194] 根据本发明的受试者包括患可疑或已知出血风险的受试者，例如血管性血友病患者、巨大血小板综合症患者、血小板无力症患者以及维生素K缺乏患者。
[0195] 根据本发明的其他适合的受试者为患可疑或已知凝血风险的受试者，例如中风患者、糖尿病患者、吸烟者、心脏病患者、最近接受手术的患者、或将要接受治疗或牙科手术但可能会出现失血过多风险的患者。
[0196] 术语“流量(flow rate)”在整个说明书中也指等效术语“灌注量(perfusin rate)”。生物样品可利用任何流量调节装置(例如单速泵(single speed pump)、变速泵、灌注泵或重力)单向穿过微毛细管或微通道。可利用任何适合的方法(例如改变泵速)来调节流量。
[0197] 流量定义为每分钟流过多少毫升的流体。剪切是流动过程中流体平面相对平行运动的结果，因此血管中，靠近血管壁的流体速度比接近中心位置的速度低。这种流体同心层之间流量的差值产生“剪切”效应。剪切定义为剪切率(shear rate)或剪切应力。剪切率-1 -1 2表示为cm/s per cm (或秒的倒数-s )。剪切应力为单位面积的力(表示为Dyn/cm 或帕斯卡(Pascals))，等同于剪切率x粘度。
[0198] 本发明上下文中使用的术语“剪切微梯度”旨在指由生物材料流量的变化引起的剪切效应。通过将微毛细管或微通道具体设计为具有不同的流入和流出几何体，本实施例检测剪切微梯度的差异对血小板聚集的影响。
[0199] 值得注意的是，在小于应用于图10的实施例约250μl/min的流量时，流过微通道的流体雷诺数(Reynolds number)小于26。在该方案中，血液的流量是稳定的，没有流分离(flow separation)或涡流(vortex)形成。在本发明的特别优选实施例中，流量约为8μl/min，雷诺数大约为0.86，与依赖导致流分离或涡流形成的其他设备相比，绝对不会有分离或涡流形成的机会。本发明实施例反而利用了减速流和由此产生的剪切梯度。
[0200] 更特别地，在认识到局部剪切微梯度促使血小板聚集在紧接高剪切加速出现剪切减速的区域，而提出本实施例。因此，剪切加速区之后接着便是使剪切减速的紧密耦合区(剪切梯度)是有助于稳定血小板聚集体发展的条件。
[0201] 应了解对血小板功能进行准确的评估，有助于诊断和对受试者治疗的恰当管理。进一步地，持续的血小板功能监测同样有助于评估受试者对特殊治疗方案的反应。
[0202] 特别是，本发明方法特别适用于确定受试者发生血凝块或血小板血栓的风险。受试者发生血凝块的风险可以通过比较不同组的受试者来确定。例如，在指定流量和温度的标准化指定时间段内，将来自正常健康受试者的血液样品和来自有发生血凝块历史或增加风险的受试者的血液样品分别通过多个不同微毛细管或微通道几何体，然后对上述样品的血小板聚集行为进行比较。
[0203] 同样应了解本发明的装置和方法还可用于辨别不同的血小板缺陷。
[0204] 进一步应了解本发明的装置和方法还可用于测定特殊药物或物质的有效性。例如，发明人发现在来自人类血液的经依替巴肽(integrilin，一种常见的抗血小板药物)处理样品和正常样品的特定微通道几何体上观察到具有不同外观的血小板聚集。
[0205] 本发明方法涵盖的临床情况包括(但不限于)以下几种：对其他健康受试者进行的完整心血管风险评估；对患血栓的患者进行评估；监测指定的抗血小板治疗的有效性；对要进行大手术的患者的出血或凝血情况进行评估；对具有心血管疾病高风险患者进行凝血风险情况评估，该患者包括糖尿病患者、高血压患者、高血脂患者、具有强大家族凝血病史的患者、吸烟者以及带可识别血栓形成标志的患者；对患外周血管疾病的患者进行凝血风险评估；以及对出血病症患者情况的研究。
[0206] 试剂
[0207] 根据本发明的试剂可为药物或其他非医药物质。例如，试剂可以选择抗血小板药物、抗凝血剂、溶栓药(thrombolytic drug)/纤溶剂(fibrinolytics)，或非医药物质例如柠檬酸、EDTA或草酸盐。
[0208] 适用的抗血小板药物的实例包括：糖蛋白ILb/IIIa抑制剂，例如阿昔单抗(abciximab)、依替巴肽和替罗非班(tirofiban)；ADP受体/P2Y12抑制剂，例如噻氯吡啶(thienopyridine)(氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、噻氯匹定(ticlopidine))和替卡格雷(ticagrelor)；前列腺素类似物，例如贝前列素(beraprost)、前列环素(prostacyclin)、伊洛前列素(iloprost)、曲前列环素(treprostinil)、COX抑制剂例如乙酰水杨酸/阿司匹林、阿洛普令(aloxiprin)、卡巴匹林钙(carbasalate)以及其他，例如地他唑(ditazole)、氯克罗孟(cloricromen)、双嘧达莫(dipyridamole)、吲哚布芬(indobufen)、匹可托安(picotamide)以及三氟柳(triflusal)；维生素K拮抗剂，例如香豆素(coumarin)：苊香豆醇(acenocoumarol)、杀鼠迷(coumatetralyl)、双香豆素(dicoumarol)、醋酸乙基双香豆素酯、苯丙香豆素(phenprocoumon)，以及华法林(warfarin)、1，3-茚满二酮(Indandione)：氯茚二酮(clorindione)、二苯茚酮(diphenadione)、苯茚二酮(phenindione)，以及其他，例如噻氯香豆素(tioclomarol)。
[0209] 适用抗凝血剂的实例包括因子Xa抑制剂(Factor Xa inhibitor)例如肝素：贝米肝素钠(bemiparin)、舍托肝素钠(certoparin)、达肝素钠(dalteparin)、依诺肝素钠(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕肝素(parnaparin)、瑞维肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin)；低聚糖例如磺达肝癸钠(fondaparinux)以及艾卓肝素(idraparinux)；沙班(xaban)例如阿哌沙班(apixaban)、奥米沙班(otamixaban)以及利伐沙班(rivaroxaban)。
[0210] 其他适用抗凝血剂包括凝血酶直接抑制剂例如水蛭素(比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin))、阿加曲班(argatroban)、达比加群(dabigatran)、美拉加群(melagatran)、希美加群(ximelagatran)以及其他例如REGl、去纤苷(defibrotide)、雷马曲班(ramatroban)、抗凝血酶III、蛋白质C。
[0211] 适用的溶栓药/纤溶剂的实例包括TPA(阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替 奈 普 酶(tenecteplase))、UPA(尿 激 酶(urokinase)、沙 芦 普酶(saruplase))、链激酶(streptokinase)、阿尼普酶(anistreplase)、孟替普 酶(monteplase)以及丝氨酸肽链内切酶(serine endopeptidase)例如安克洛酶(ancrod)和纤溶酶(fibrinolysin)。
[0213] 试剂可为活化血小板的制剂，例如胶原蛋白、ADP、凝血酶、血栓素A2、血清素和肾上腺素。
[0214] 试剂例如可为已知的抗血小板制剂。或者，物质可为筛选出对血小板或其前体或其他细胞具有调节作用的物质。
[0215] 术语“调节”此处用来指物质对生物样品中的血小板或其前体的血小板聚集活性的任何影响。相应地，该术语包含对血小板聚集活性的增强或抑制。
[0216] 值得注意的是，本系统在血小板聚集区域的突起部下游面提供剪切微梯度，从而覆盖大范围的剪切率，更加恰当地模拟体内的自然环境。进一步地，本系统不要求在测定之前对血液样品进行操作。更进一步地，本系统可以在血液量少的情况下使用。这对从婴儿或幼童获得的血液量较少和/或困难的儿科尤其重要。更进一步地，本系统不依赖于阻塞率(rate of occlusion)，但允许血小板聚集进入动态平衡，从而提供最大血栓尺寸的信息。更进一步地，本系统允许实时测量血栓的稳定性。
[0217] 本系统某些实施例的另一优点在于本设备允许对待实时监测的血小板聚集的可视化(visualisation)和分析。更进一步地，本系统能够提供有关血小板聚集速率和程度的动力学数据。
[0218] 本领域的技术人员应了解在不背离本发明大致描述的范围的情况下可对本发明进行许多变化和/或修改(如具体实施例所述)。因此本实施例被视为在所有方面都是说明性的，而不具有限制性。
[0219] 在整个说明书中，术语“包括(comprise)”，或变体，例如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，被理解为暗示包括一个所陈述的元件、整体(integer)或步骤，或一组元件、整体或步骤，但不排除任何其他元件、整体或步骤或一组元件、整体或步骤。
[0220] 本发明的其他特征在下列的详细说明和实例中被更全面的描述。然而应理解，所包括的实例仅仅是为了举例证明本发明。不应理解为是以任何方式限制以上对本发明的广泛描述。
[0221] 实例
[0222] 方法
[0223] 血液样品的采集
[0224] 采用配有19号针头、含有作为抗凝剂的800U/ml水蛭素的10ml注射器，通过肘前静脉切开术(venisection of the antecubital vein)从受试者提取血液样品。
[0225] 血液样品的处理
[0226] 从同意的人类供体身上提取全血，使用水蛭素(800U/ml)抗凝该全血，继而将经抗凝处理的全血通过该设备进行血液灌注研究。全血样品与亲脂膜染料(lipophylic membrane dye)DiOC6(1μg/ml)或DiIC12(1μg/ml)在37℃孵育10分钟，使细胞通过该设备更容易的显现出来。
[0227] 微通道制造
[0228] 采用标准软光刻技术，将微通道制造在3英寸硅片上的聚二甲硅氧烷(PDMS，Sylagard)(来自KMPR 1025光阻剂(microChem Corp)模具)中(Weibel，D.B.，Diluzio，W.R.&Whitesides，G.M.Microfabrication meets microbiology.Nature reviews 5，209-218(2007))。采用高分辨率铬掩模获得明确的特征，以制造模具。采用Su8显影剂使KMPR显影。构成了通道的逆模(inverse mould)。整体通道深度为80μm。构建好模具后，聚二甲硅氧烷(PDMS)和固化剂按照10∶1的比例混合，并脱气处理20分钟，浇入厚度大约为4mm的模具中。90℃，PDMS固化20分钟。最后将PDMS通道直接粘合到160μm厚的高硼硅盖玻片(borosilicate cover glass)上。
[0229] 为了实现所需的耐受性(tolerance)，光刻工艺的各个阶段都需要高度的质量控制。例如，由于当前制造工艺的限制，严格限定的角(corner)是初步设计的一部分；将圆角制造成半径大约为5微米(其为CFD建模过程中要考虑的因素)。尽管该限制不会严重影响血小板反应，制造方法的进一步完善可能会最终导致对血液动力学和由此产生的血小板聚集的更精确的控制。尽管PDMS具有成本低和制造方便的优点，但能够提供更精确几何体的其他材料可能在本发明其他实施例中具有优势。
[0230] 液体流的数值模拟(CFD)
[0231] 利用不可压缩液体流的质量守恒定律和动量方程解出流速场(velocity field)后，利用基于有限体积格式(finite volume scheme)的计算流体学(Computational Fluid Dynamics，CFD)软件包FLUENT 6.0(Fluent USA，黎巴嫩，NH)来预算应变率(strain rate)，更多实施细节可参阅FLUENT手册。连续统假设(continuum hypothesis)和无滑移边界条件(no-slip boundary condition)被假定为保持有效。流动被视为三维的、稳定3
的、层流的(laminar)以及不可压缩的。流体介质被视为具有998.2km/m 的恒定密度以及
0.00345Pa.s(帕.秒)的粘度。离散格式压力(discretization scheme pressure)是标准压力，计算中允许二阶迎风动量选择(second order upwind momentum option)。
的、层流的(laminar)以及不可压缩的。流体介质被视为具有998.2km/m 的恒定密度以及
0.00345Pa.s(帕.秒)的粘度。离散格式压力(discretization scheme pressure)是标准压力，计算中允许二阶迎风动量选择(second order upwind momentum option)。
[0232] 实例1通过台阶几何体的血液灌注
[0233] 图11a为通过微剪切梯度设备的人类(水蛭素抗凝结)血液灌注的一系列代表性显微照片(40×放大倍率)，该设备由100μm流入(入口)宽度、90°收缩角θc、10μm间隙高度、60°扩张角θe、700μm扩张/出口宽度组成。灰色箭头表示初始聚集点[t＝12sec]，黑色箭头表示扩张区域血栓生长的范围(n＝3次实验)。
[0234] 图11b为由计算流体学(CFD)模拟得出的结果(速度v位移(displacement)图)，表示血小板(颗粒)从(a)中的微通道壁几何体表面移动1μm(1/2盘状血小板直径)速-1度发生的变化。对直线微通道部分(1,800.s 层流)来说，血小板在其整个路径长度上匀速运动。血小板经过剪切梯度几何体时，快速加速阶段连接快速加速阶段。
[0235] 图11c包括代表性聚集记录(trace)，表示通过图11a所述的PDMS微通道设备进-1行的全血灌注的反应。台阶几何体，表示以1,800.s 的输入(前狭窄)剪切率进行的水蛭素抗凝全血灌注(n＝3次实验)；抗-αIIbβ3，水蛭素抗凝全血在进行血液灌注之前用
30μg/ml c7E3Fab处理10分钟(n＝2次实验)。注意，不存在整合素αIIbβ3时，在狭窄顶点处的初始补充受到显著延迟并抑制整体聚集；抗-GPIb，水蛭素抗凝全血用50μg/ml的抗-GPIb封闭IgG ALMA12处理10分钟(n＝3次实验)。注意，不存在GPIb/V/IX参与时，完全不存在血小板的相互作用。
30μg/ml c7E3Fab处理10分钟(n＝2次实验)。注意，不存在整合素αIIbβ3时，在狭窄顶点处的初始补充受到显著延迟并抑制整体聚集；抗-GPIb，水蛭素抗凝全血用50μg/ml的抗-GPIb封闭IgG ALMA12处理10分钟(n＝3次实验)。注意，不存在GPIb/V/IX参与时，完全不存在血小板的相互作用。
[0236] 图11d为代表性聚集记录，表示与不引起剪切梯度的直微流体设备相比，通过图-111a所述的微通道进行的全血灌注的反应；台阶几何体，表示以1,800.s 输入(前狭窄)-1
剪切率进行的水蛭素抗凝全血灌注(n＝3次实验)；直通道，表示以20,000.s 体积剪切率通过100μm直微通道进行的水蛭素抗凝全血灌注(n＝3次实验)。
剪切率进行的水蛭素抗凝全血灌注(n＝3次实验)；直通道，表示以20,000.s 体积剪切率通过100μm直微通道进行的水蛭素抗凝全血灌注(n＝3次实验)。
[0237] 图11e包括代表性聚集记录，示出了可溶性激动剂(agonist)与通过图(a)所述的微剪切梯度设备进行的与全血灌注的血小板聚集反应无关；台阶几何体，表示以1,800.-1s 输入(前狭窄)剪切率进行的水蛭素抗凝全血灌注；+ADP/TXA2拮抗剂+水蛭素，表示水蛭素抗凝全血用MRS2179(100μM)、2-MeSAMP(10μM)以及吲哚美辛(Indomethacin)(10μM)处理10分钟(n＝3次实验)。
[0238] 在提出的台阶几何体样品中，使用水蛭素(50mg/kg)抗凝全血的试验血液流动(trial blood flow)实验表明按照血小板聚集的剪切梯度模型，血小板血栓只形成在台阶几何体下游面已识别的流减速区域内(见图11a)。对照研究表明不具有台阶几何体的直微-1通道中的持续升高的层流剪切力(laminar shear)(20,000.s )不能诱导血小板前聚集表型(图11b-d)。根据血小板聚集的剪切梯度模型，化学血小板激动剂(ADP和TXA2)的抑制不会阻止台阶几何体的剪切梯度依赖性聚集(图11e)。然而，聚集过程主要依赖于血小板整合素αIIbβ3的参与。
[0239] 实例2两种台阶几何体相互作用的流量依赖性(flow rate dependency)[0240] 图12a包括代表性聚集记录，取决于通过微剪切梯度设备的流量(Q＝2、4、6、8μl/min)，该设备由100μm流入/入口宽度，90°收缩角(θc)，20μm间隙高度，30°扩张角(θe)，700μm扩张/出口宽度组成。
[0241] 图12b为代表性聚集记录，取决于通过微剪切梯度设备的流量(Q＝2、4、6、8μl/min)，该设备由100μm流入宽度，90°收缩角θc，20μm间隙高度，90°扩张角θe，700μm扩张宽度组成。
[0242] 在扩张角为30°和90°的两种台阶几何体配置中检测流量(Q＝2、4、6、8μl/min)依赖性的分析(分别见图12a和图12b)。在两种几何体配置中，随着流量降低到8μl/min以下，聚集体的尺寸明显减小。θe＝90°的第二几何体配置中观察到初始聚集的时间缩短(图12b)，表明人类血液血小板聚集的发生主要依赖于扩张角几何体(expansion angle geometry)。
[0243] 实例3球状几何体
[0244] 图13a包括DIC图像框，示出了以使用的10,000.s-1γ进行人类全血(用100μM MRS2179、10μM 2-MeSAMP以及10μM吲哚美辛预处理)灌注之后，涂覆有VWF的球状几何体的下游面盘状血小板聚集的性质和程度(n＝5)。
[0245] 图13b为平均盘状血小板聚集体的尺寸(表面积以μm2表示)，取决于下游低τx，2
y凹坑(区域3的表面积，以μm 表示)，显示τ≤30.4Pa(n＝3)。
y凹坑(区域3的表面积，以μm 表示)，显示τ≤30.4Pa(n＝3)。
[0246] 图13c为在使用10,000.s-1的γ，涂覆有5μmVWF的球状几何体的下游面平均盘状血小板聚集体的尺寸；对照，水蛭素抗凝全血；抗-αIIbβ3，在进行血液灌注之前用30μg/ml c7E3Fab处理10分钟的水蛭素抗凝全血；抗-GPIb，用50μg/ml的抗-GPIb封闭IgGALMA12处理10分钟的水蛭素抗凝全血。
[0247] 图13d为在使用10,000.s-1的γ，球状几何体周围的血液平面剪切应力(τx，y)的CFD模拟的结果。
[0248] 图13e和图13f为对距离2μm和15μm球状几何体的侧面1μm(1/2血小板直径)处的单个血小板轨迹的CFD分析结果。
[0249] 在提出的球状几何体样品中，使用水蛭素抗凝全血的试验血液流动实验表明按照血小板聚集的剪切梯度模型，血小板血栓只形成在球状几何体下游面已识别的流减速区域内(图13a)。
[0250] 值得注意的是，已证明血小板聚集的程度主要依赖于球面直径(spherical diameter)和输入流量。如图13d所示，取决于球体下游面的直径和低τx，y区域(区域3)的球体侧的剪切应力(τx，y)增加；该区域的尺寸直接依赖于球面直径。平面剪切应力(τx，y)表示自由流动血小板承受的预测应力(predicted stress)，该应力垂直于珠子表面(bead surface)且与之距离与1/2血小板直径相同。
[0251] 依赖于相对于球体表面的位置，血小板将承受τx，y不同大小和变化率。位于珠子赤道处的粒子路径线(particle path line)的τx，y增加(接近100Pa(15μm的珠子))，随后在区域3中降到小于30.4Pa。值得注意的是，在珠子更小(2μm)的情况下，变化率(τx，yv时间)、空间分布(τx，yv路径长度)以及峰值τx，y都明显降低，然而其剪切梯度仍然能够诱导强烈的聚集反应。
[0252] 实例4三种微通道几何体中血小板聚集动力学
[0253] 图14a为通过通道几何体进行水蛭素抗凝人类全血灌注的结果，该通道几何体由100微米流入段、90°收缩角(c90)、20×15微米峰间隙、700微米流出段、90°-30°间变化-1
的扩张角(e90、e60、e30)组成。以输入应变率1,800.s 进行全血灌注10分钟后确定平-1
均血小板聚集体的尺寸(画面(panel)1)，微观几何体顶点的峰值应变率接近20,000.s 。
组合数据来自独立的血液供体(n＝5)(SEM显示)。画面2-4为13分钟的时间范围内三种具体微观几何体中的血小板聚集动力学结果。轨迹为来自独立血液供体(n＝5)(SEM显示)结果的组合。
的扩张角(e90、e60、e30)组成。以输入应变率1,800.s 进行全血灌注10分钟后确定平-1
均血小板聚集体的尺寸(画面(panel)1)，微观几何体顶点的峰值应变率接近20,000.s 。
组合数据来自独立的血液供体(n＝5)(SEM显示)。画面2-4为13分钟的时间范围内三种具体微观几何体中的血小板聚集动力学结果。轨迹为来自独立血液供体(n＝5)(SEM显示)结果的组合。
[0254] 图14b为水蛭素抗凝全血用MRS2179(100μM)、2-MeSAMP(10μM)以及吲哚美辛(10μM)处理10分钟以抑制血小板放大信号传递(platelet amplification signalling)的结果。这些数据集示出了血流参数对血小板聚集反应的直接影响，而血小板分泌的复合作用(compounding effect)与血小板聚集反应无关。血液样品通过由100微米流入段、90°收缩角(c90)、20微米峰间隙、15微米间隙长度、700微米流出段、90°-30°间变化的-1
扩张角(e90，e60，e30)组成的通道几何体进行灌注。以输入应变率1,800.s 进行全血灌注10分钟后确定平均血小板聚集体的尺寸(画面1)，微观几何体顶点的峰值应变率接近-1
20,000.s 。组合数据来自独立血液供体(n＝5)(SEM显示)。画面2-4为13分钟的时间范围内三种具体微观几何体中的血小板聚集动力学结果。轨迹为来自独立血液供体(n＝
5)(SEM显示)结果的组合。
扩张角(e90，e60，e30)组成的通道几何体进行灌注。以输入应变率1,800.s 进行全血灌注10分钟后确定平均血小板聚集体的尺寸(画面1)，微观几何体顶点的峰值应变率接近-1
20,000.s 。组合数据来自独立血液供体(n＝5)(SEM显示)。画面2-4为13分钟的时间范围内三种具体微观几何体中的血小板聚集动力学结果。轨迹为来自独立血液供体(n＝
5)(SEM显示)结果的组合。
[0255] 实例5四种微通道几何体的加速度和应变率分析
[0256] 图15a为对由100微米流入段、90°收缩角(a90)、10×15微米峰间隙、60°扩张角(e60)、700微米流出段组成的台阶几何体的应变率和加速度的分析。画面2和画面3示-1出了相关应变率(γ.s )以及加速度大小的CFD分析，证明了微观几何体对血流的影响。
[0257] 图15b为对由100微米流入段、90°收缩角(c90)、20微米峰间隙、15微米间隙长度、90°扩张角(e90)、700微米流出段组成的台阶几何体的应变率和加速度分析。画面2-1和画面3示出了相关应变率(γ.s )以及加速度大小的CFD分析，证明了微观几何体对血流的影响。
[0258] 图15c为对由100微米流入段、90°收缩角(c90)、20微米峰间隙、15微米间隙长度、60°扩张角(e60)、700微米流出段组成的台阶几何体的应变率和加速度分析。画面2-1和画面3示出了相关应变率(γ.s )以及加速度大小的CFD分析，证明了微观几何体对血流的影响。
[0259] 图15d为对由100微米流入段、90°收缩角(c90)、20微米峰间隙、15微米间隙长度、30°扩张角(e30)、700微米流出段组成的台阶几何体的应变率和加速度分析。画面2-1和画面3示出了相关应变率(γ.s )以及加速度大小的CFD分析，证明了微观几何体对血流的影响。这表明在血流量为11μl/min时，通道几何体上建立的应变率(剪切)梯度，为-1
该特殊制造的几何体所需的剪切率，以便实现1,800.s 输入剪切(input shear)。注意，按照前面的定义，建立的三个明显不同的剪切区域为：区域1-剪切加速区；区域2-剪切峰值区；区域3-剪切减速区。
该特殊制造的几何体所需的剪切率，以便实现1,800.s 输入剪切(input shear)。注意，按照前面的定义，建立的三个明显不同的剪切区域为：区域1-剪切加速区；区域2-剪切峰值区；区域3-剪切减速区。
[0260] 为了了解在模型条件下改变壁几何体(wall geometry)对血小板经受的应变率环境的影响，对于四种不同程度的狭窄症，对1μm(1/2血小板直径)的血管壁内血元素(blood elements)的应变率历程进行分析，结果如图16a-d所示。
[0261] 图16为承受侧壁压力的代表性小鼠肠系膜微动脉的结构及CFD模拟结果。图16a为从活体视频片段(intravital video footage)中取得的显微照片，示出了小鼠肠系膜微动脉(直径为42m)狭窄症(断面减缩率(area reduction)为～80％)，该微动脉承受玻璃微针(虚线)引起的血管侧壁压力并产生挫伤(crush iniury)。血小板聚集体的形成限定在图16a的黄色阴影区内(由图16e相应的黑白图中的箭头指示的区域限定)，流向为从左至右。当针头接触血管壁时，血液的主流向和壁之间产生一个角度。相关示意图为结构模型，预测了造成30％、65％和80％狭窄时的逐步血管侧壁压力。注意，根据狭窄程度不同，预测收缩角和扩张角逐渐从35°增加到55°。黑色箭头表示血流方向。
[0262] 图16b表示65％和80％狭窄时(如图16a所示)预测的应变率分布的等值线图(contour plot)。注意，液压面积(hydraulic area)减小会使流体变形率从深蓝区域(最低值)至红色区域(最高值)逐渐增大/减小。这些变化显然取决于由针头造成的几何形状和角度，可局部影响血管中移动粒子所承受的应力。
[0263] 图16c为取决于狭窄程度(血管压缩)的小鼠血管壁的最大应变率。注意，最大血管壁应变率和狭窄程度之间呈指数关系，以获得恒定流量。
[0264] 图16d给出了针对四种不同程度的狭窄症(面积的30％、65％、80％和90％)，预测(CFD)的血小板应变率的历程，该血小板在距微针压力变形的侧壁1微米(1/2血小板直径)处移动。注意，一旦血小板进入该收缩处(contraction)，应变率就明显增加。该流线(streamline)上移动的颗粒在几毫秒内经历剪切加速、剪切峰值区域以及剪切减速过程。研究发现对65％狭窄症(面积)来说，预测应变率适度增加；然而对80％狭窄症来说，当通过狭窄收缩处时，血小板的应变率增加2倍。进一步地，该模型预测在重度狭窄症(高于-1
80％)中每增加5％(2.1μm)会导致应变率增加3倍(40,000-120,000.s )，暗示在80％或大于80％的狭窄症中，轻微修改血管侧壁就会对流过血管的血小板的应变率历程产生重大影响。
80％)中每增加5％(2.1μm)会导致应变率增加3倍(40,000-120,000.s )，暗示在80％或大于80％的狭窄症中，轻微修改血管侧壁就会对流过血管的血小板的应变率历程产生重大影响。
[0265] 结合研究者进行的体内研究，图16的数值模拟结果预测靠近血管壁的血小板在6 -1
穿过狭窄部位时会经历迅速极端的剪切加速和剪切减速阶段，峰值应变率接近1×10s 。
尽管这些值非常高，如果应力持续时间在1-5毫秒内，则表明血小板能够承受升高的大约
5 -1
1000Pa(剪切率2.6×10s )剪切应力。该分析使我们能够识别在研究者血管模拟设计的环境中可显著影响血小板功能和聚集的三个原理性几何参数：
穿过狭窄部位时会经历迅速极端的剪切加速和剪切减速阶段，峰值应变率接近1×10s 。
尽管这些值非常高，如果应力持续时间在1-5毫秒内，则表明血小板能够承受升高的大约
5 -1
1000Pa(剪切率2.6×10s )剪切应力。该分析使我们能够识别在研究者血管模拟设计的环境中可显著影响血小板功能和聚集的三个原理性几何参数：
[0266] i.收缩角及相关的血流加速速率(rate of blood flow acceleration)；
[0267] ii.狭窄间隙直径(％狭窄)及相关的应变率峰值(peak strain rate)；以及[0268] iii.扩张角及相关的血流减速速率。
[0269] 图17为三种对称的微通道设计案例，选自研究者概念验证研究中所有可能的案例。此外，使用cXgYeZ命名，其中eX为突起部上游面的角度，gY为间隙的长度(单位为微米)，eZ为突起部下游面的角度。进行数值(CFD)模拟来预测流速场(velocity field)、产生的应变率分布并研究设备内选择的血流流线内的粒子行为。
[0270] 图18a-18d分别表示肠系膜微动脉和c60g20e60模拟血管中计算应变率分布。图18a为小鼠肠系膜微动脉(42微米)狭窄部位(侧壁压力)上游，血流的计算应变率分布彩色图。注意，由于粘滞效应(viscous effect)和圆柱几何体，而使流体流产生均匀的侧壁应变率。
[0271] 图18b为c60g20e60模拟血管确定的收缩几何体上游内，血流的计算应变率分布彩色图。注意，由于矩形通道几何体和较低纵横比(aspect ratio)，微通道内侧的流体沿壁形成抛物线分布，中心位置应变率最大，角边处应变率最小。选择距盖玻片30微米处的平-1面用于所有成像实验，以便该位置的流体和粒子经受～1700.s 的应变率。65微米的中平-1
面(mid-plane)的最大值为接近1960.s 的应变率。
面(mid-plane)的最大值为接近1960.s 的应变率。
[0272] 图18c为小鼠肠系膜微动脉中80％面积狭窄处，血流的计算应变率分布彩色图。收缩区域内血管的几何形状由平针头的形状和血管侧壁的弹性效应共同压制形成。形成的-1
不规则表面特征，引起三维空间内非均匀应变率分布，具有两个峰值为44,600.s ，且在接近扩张区域时迅速减小。
不规则表面特征，引起三维空间内非均匀应变率分布，具有两个峰值为44,600.s ，且在接近扩张区域时迅速减小。
[0273] 图18d为c60g20e60模拟血管中确定的收缩几何体处，血流的计算应变率分布彩色图。注意，在模拟血管中产生更大的纵横比，导致形成更均匀的应变率分布。所示流线表示在距微通道壁1微米(1/2血小板直径)处运动的颗粒的计算轨迹；注意，在此距离上产-1生最大值41,200.s ，尽管通道壁可能会经受更高的应变率，但流量为零。
[0274] 图18a和图18b分别表现出血管模型和c60g20e60微通道结构的比较(comparative)应变率分布(收缩部位上游)。注意在血管中，预测应变率分布为轴对称/均匀，然而由于微通道结构的矩形几何形状和较低纵横比(宽-高＝1.3)，流体沿侧壁呈抛物线分布，壁中心为最大值，角处为最低值(图18b)。然而，如果血流观察平面局限于位于-130-65微米之间的流体体积(flow volume)，则血小板将具有1,500-1,960s 之间的均匀应变率，正好属于报道的肠系膜动脉和微动脉的标称生理范围。通过增加通道的纵横比(增加设计的掩膜给定的宽度或增加光阻剂厚度给定的高度)来实现整个通道(光阻剂厚度限定的整个尺寸)更均匀的应变率分布，然而这可能会影响液力直径(hydraulic diameter)(影响收缩部位的雷诺数以及血小板暴露在变率梯度的时间)。在本研究中，研究者有兴趣在收缩部位在具有相似停留时间(residence time)的条件下维持可能的最低雷诺数，以便构建与体内环境具有类似惯性效果(inertia effect)的高应变率区域的模型(体内收缩部位的雷诺数为0.45，微通道内的雷诺数Re为2.4)。
[0275] 图18c和图18d分别呈现在微动脉模型(80％狭窄)和c60g20e60微通道结构的收缩区域内的应变率分布的计算结果。注意，在血管案例中，微针压力的非均匀性导致不均匀的侧壁形状，由此产生不规则应变率分布，收缩区域上游和下游边缘具有两个高剪切局-1部区域(～44,660s )(图18c)。相反，人造c60g20e60微通道结构的主要优点在于收缩部位的几何形状是均匀的(具有更大纵横比)，由此产生更均质的(homogeneous)应变率分布(图18d)。此外，图18d表示，对于距c60g20e60微通道壁1微米的流线，血小板将在靠近血-1
管的收缩几何体的中心处承受预计的峰值应变率41,200s 。总的来说，研究者的模拟表明c60g20e60微通道结构显示出与已公布的体内模型内产生的血流动力学环境良好理想化的拟合。
管的收缩几何体的中心处承受预计的峰值应变率41,200s 。总的来说，研究者的模拟表明c60g20e60微通道结构显示出与已公布的体内模型内产生的血流动力学环境良好理想化的拟合。
[0276] 图19a-19d分别示出了该设备的流体动力学性能(hydrodynamic performance)。图19a表示c30g20e30、c60g20e60和c90g20e90模拟血管中预测应变率分布的等高线图(contour plot)。注意，液压面积减小会使流体变形率逐渐增大，然后减小，变化从深蓝区域(最低值)至红色区域(最高值)。然而在各几何体中“连续”增加至减小的速率不同。
[0277] 图19b为CFD图，表示在距三种指定微通道几何体的台阶壁(step-wall)1微米处移动的模型血小板经历的随时间变化的预测应变率“历程”。
[0278] 图19c为CFD图，表示在距三种指定微通道几何体的台阶壁1微米处移动的模型血小板经历的随距离变化的预测应变率“历程”。0微米参考点位于限定收缩几何体的中线上。
[0279] 图19d为CFD图，表示距台阶壁1微米的流线分别在距限定收缩几何体中线10微米和30微米处的应变率梯度的比较。
[0280] 图19a-19d为关键流体动力学变量(variable)提供了理解，研究者的目的是通过将扩张角改变60°来对研究者概念证明的几何体进行修改，即最初处于收缩区域内的血小板经历的整体减速梯度。图19c是当转换到三种微通道结构扩张区域时，扩张角对血小板经历的应变率减速的影响进行的分析。对距台阶壁1微米的血小板在距收缩区域(峰值阶段)中心10微米和30微米处应变率瞬时值的研究表明，血小板在三个角等距离上的应变率减速大小明显不同，因此在扩张区域第一个10微米内应变率减小分别为：θe＝30°减-1 -1少35％(41,000-28,000s )，θe＝60°时减小46％(41,000-22,200s )，θe＝90°时减-1
小65％(41,000-14,400s )(图19c)。
小65％(41,000-14,400s )(图19c)。
[0281] 实例6取决于微通道设计的血小板聚集
[0282] 图20a表示在10分钟时间内以16μL/min(输入应变率＝1,800s-1)的恒定流量通过c60g20e60几何结构进行的DiOC6标记的全血灌注实时落射荧光成像照片，灌注之前用下面物质预处理10分钟：血小板抑制剂腙苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)(0.02U/ml)、N6-甲基-2’-脱氧腺苷-3’，5’-二磷酸(100μM MRS2179)以及2-甲硫基-AMP(10μM2-MeSAMP)以阻断ADP，用吲哚美辛(10μM)以阻断TXA2，用水蛭素(800U/ml)以阻断凝血酶。通过c60g20e60微通道结构进行的灌注产生剧烈的血小板聚集(图20a)，该聚集始发生在剪切峰值(收缩)区域的下游边缘。重要的是，随后发生在下游应变率减速(扩张)区域的血小板聚集形成了相对大而稳定的血小板聚集体。对三种独立供体样品进行比较表明整体聚集动力学和闭塞时间紧密一致。全血样品用抗-整合素αIIbβ3Fabc7E3(20μg/ml)预处理以阻断血小板整合素αIIbβ3或用抗GPIb IgG Almal2(50μg/ml)预处理以阻断血小板VWF与GPIb/V/IX连接，以便研究介导聚集反应的血小板粘附受体。如图21a所示，在整合素或GPIb阻断剂存在时，c60g20e60几何体内的血小板聚集完全被抑制，表明这些主要的血小板粘附受体在聚集过程中是必需的。
[0283] 实例7取决于微通道几何体的血小板聚集的调节
[0284] 如前面讨论，研究者对该设备的设计理念的首要目的是通过修改关键的几何参数以限定应变率微梯度的大小和程度，从而能够可控地调节血小板聚集。图21a和图21b示出了一系列测试用例实验，其中对微通道几何体的收缩角和扩张角进行对称修改。对c60g20e60和c90g20e90几何结构的比较结果表明血小板聚集的整体大小没有明显差异，-1其中输入前狭窄应变率保持恒定，为1,800s (图21b)。然而，c90g20e90几何体会提高由于随时间聚集体尺寸的变化整体减小而突出显示的形成的聚集体的稳定性(图21b)。相反，收缩角和扩张角从60°减小到30°(c30g20e30结构)显著减少了血小板聚集的初始速率和大小(图21a和图21b)。有趣的是，c30g20e30结构中初始血小板聚集的位点从下游移至狭窄部位的顶点，表明在血小板聚集明显稳定之前必须使应变率整体减速(图21a和图21b)。
[0285] 概念证明的研究清楚表明研究标准(prototype)设备中对应变率几何体和由此产生的应变率分布修改可直接用于以可控方式调节血小板的聚集动力学机制。基于研究者当前的工作假设以及研究者详细的CFD模拟结果，可以通过正在形成的聚集体(被迫发生在更高流量区域)承受的整体较高的应变率以及扩张区域内应变率的变化率整体减小来解释c30g20e30结构不能支持稳定的血小板聚集。相反，可以通过更快的应变率减速以及更高流量区域对形成的聚集体的保护来解释c90g20e90结构中聚集体稳定性的提高。
[0286] 更详细地，图21a表示通过c90g20e90微通道结构和c30g20e30微通道结构进行的血液灌注的代表性落射荧光图像组。注意，在所有情况下，血液样品在进行灌注之前都用扩增循环阻断剂(Amplification Loop Blocker，ALB)、腙苷三磷酸双磷酸酶(0.02U/ml)、MRS2179(100μM)以及2-MeSAMP(10μM)、吲哚美辛(10μM)以及水蛭素(800U/ml)预处理10分钟(表示每次模拟n＝3次实验)。
[0287] 图21b为代表性聚集轨迹，示出了通过c60g20e60、c90g20e90和c30g20e30ALB微通道结构进行经ALB处理的全血灌注的反应(n＝3次实验)。
[0288] 实例8比较微通道阵列中抗血小板抑制剂的作用
[0289] 本实例描述了利用一种微观几何体设计的一次重复实验证明各种单独的抗血小板药物或几种抗血小板药物的组合对血小板聚集的影响，使用的抗血小板药物针对特定的血小板受体激活通路(receptor activation pathway)。所研究的抗血小板药物为ADP受体/P2Y12拮抗剂。ADP是活化的血小板释放的颗粒中的一种，该活化的血小板反过来可以活化其他血小板。颗粒中的内容物激活Gq-连接蛋白受体级联反应(Gq-linked protein receptor cascade)，导致血小板细胞质中钙离子浓度升高。
[0290] 本实例使用的微观几何体设备的收缩角(θc)为85°、扩张角(θe)为85°，间隙宽度为30μm、间隙长度为15μm、通道入口和出口宽度者为100μm(c85g30e85100-100μm结构)。
[0291] 单独或组合使用下列抗血小板药：
[0292] 1.水蛭素：经水蛭素(800U/ml)进行抗凝处理的人类全血作为对照组。
[0293] 2.水蛭素+MRS：用100μM P2Y1腺苷-5’-二磷酸(ADP)拮抗剂N6-甲基-2’-脱氧腺苷-3’，5’-二磷酸(MRS2179)预处理10分钟的人类全血(经水蛭素抗凝处理)。
[0294] 3.水蛭素+2Me：用10μM P2Y12(ADP)拮抗剂2-甲硫基-AMP(2MeSAMP)预处理10分钟的人类全血(经水蛭素抗凝处理)。
[0295] 4.水 蛭 素 +MRS+2Me：用P2Y1(ADP)、P2Y1(ADP) 拮 抗 剂MRS2179(100μM) 和2MeSAMP(10μM)预处理10分钟的人类全血(经水蛭素抗凝处理)。
[0296] 数据如图22所示，表明P2Y12(ADP)受体抑制剂(氯吡格雷 的实验等效物)导致设备内血小板的整体聚集减小50％。
[0297] P2Y1(ADP)受体阻断剂MRS对设备内聚集有更显著的效果，然而与2Me组合使用时聚集被严重抑制。抑制剂的效果似乎取决于所使用的几何体类型。例如，当微观几何体为90°收缩角、60°扩张角以及10μm间隙宽度、微通道的入口段和出口段分别设置为100μm和700μm(c90g10e60100-700μm结构)时，血小板聚集不受这些抑制剂的影响。该数据在图11e中示出，其中在按照上述相同浓度使用ADP拮抗剂的情况下，P2Y1、P2Y12、凝血酶及TXA2抑制剂的组合效应不会对聚集反应产生影响。
[0298] 这些数据表明可通过改变角度和收缩部位的尺寸来特别定制血小板的聚集反应。这样可使用多种设备设计来评估临床环境中不同的抗血小板药物。
[0299] 实例9比较来自正常健康供体的血液样品与血管性血友病患者的血液样品[0300] 本实例证明了这样的概念证明，即微观几何体设备可用于区分来源于正常供体的血液样品和来源于III型血管性血友病(vWB)患者(其临床测量的vWF血液水平在测定时为正常人的7％)的血液样品。血管性血友病是最常见的遗传出血性疾病(bleeding disorder)，具有常染色体隐性或显性遗传的特点。这种疾病的患者的vWF有缺陷，vWF介导糖蛋白Ib(GPIb)与胶原蛋白结合，从而帮助介导血小板活化和初期止血形成。
[0301] 使用包括85°收缩角(θa)、85°扩张角(θb)、30微米间隙宽度、15微米间隙长度、100微米通道宽度(c85g30e85100-100μm结构)的微通道几何体。
[0302] 将用水蛭素和各种抗血小板药物预处理的健康血液样品与用水蛭素和各种抗血小板药物预处理的血管性血友病样品进行如下比较：
[0303] 对照组：人类全血(经水蛭素抗凝处理)用P2Y1(ADP)和P2Y12拮抗剂MRS2179(100μM)和2MeSAMP(10μM)，以及血栓素A2抑制剂吲哚美辛(10μM)预处理10分钟。
[0304] vWD：血管性血友病患者全血样品(经水蛭素抗凝处理)用P2Y1(ADP)和P2Y12拮抗剂MRS2179(100μM)和2MeSAMP(10μM)，以及吲哚美辛(10μM)预处理10分钟。
[0305] 数据如图23所示，表明在该vWF水平，来自血管性血友病患者的血液样品不能在包含上述几何体的设备中聚集。
[0306] 实例10比较减小的收缩角对血小板聚集反应的影响
[0307] 该实例探讨了收缩(加速)角在设备一次重复中所起的作用。该设备由20μm间隙宽度、15μm间隙长度、85°扩张角(减速角)、以及100μm微通道入口和出口宽度(cX g20e85100-100μm结构，其中cX＝收缩角)组成。人类全血分别用800U/ml水蛭素和P2Y1(ADP)和P2Y12拮抗剂MRS2179(100μM)和2MeSAMP(10μM)，以及吲哚美辛(10μM)预处理10分钟。样品灌注通过收缩角分别为0°、60°、75°和85°的设备。在该重复中，当收缩角小于60°时能有效消除聚集(见图24)。
[0308] 实例11比较减小的扩张角对血小板聚集反应的影响
[0309] 该实例探讨了扩张(减速)角在设备一次重复中所起的作用。该重复由20μm间隙宽度、15μm间隙长度、85°收缩角(加速角)、100μm微通道入口和出口宽度(c85g20eX100-100μm结构，其中eX＝扩张角)组成。人类全血分别用800U/ml水蛭素，P2Y1(ADP)和P2Y12拮抗剂MRS2179(100μM)和2MeSAMP(10μM)，以及吲哚美辛(10μM)预处理10分钟。样品灌注通过扩张角分别为15°、60°、75°和90°的设备。在该重复中，扩张角小于
30°时能有效消除聚集(见图25)。
30°时能有效消除聚集(见图25)。
[0310] 实例12分析间隙宽度对血小板聚集反应的影响
[0311] 该实例展示了在该设备的一个重复中间隙宽度以及据此的剪切峰值因素的聚集反应中所起的作用。该重复由75°收缩角、75°扩张角以及100μm微通道入口和出口宽度(c75g20gX e75100-100μm，其中gX＝可变间隙宽度)组成。人类全血分别用800U/ml水蛭素和P2Y1(ADP)和P2Y12拮抗剂MRS2179(100μM)和2MeSAMP(10μM)，以及吲哚美辛(10μM)预处理10分钟。样品灌注通过间隙宽度分别为10μm、20μm、30μm和40μm的设备。该数据表明可通过在30-10μm范围内缩小间隙来修改聚集的速率和程度。当间隙宽度降至小于30μm时血小板聚集停止(见图26)。
[0312] 实例13分析间隙长度对血小板聚集反应的影响
[0313] 该实例展示了在设备的一次重复中间隙长度以及据此的剪切峰值因素持续时间对聚集反应所起的作用。该重复由75°收缩角、75°扩张角以及100μm微通道入口和出口宽度(c75g20e75100-100μm，其中间隙长度分别为10μm、15μm、20μm50μm和70μm)组成。人类全血分别用800U/ml水蛭素和P2Y1(ADP)和P2Y12拮抗剂MRS2179(100μM)和2MeSAMP(10μM)，以及吲哚美辛(10μM)预处理10分钟。样品灌注通过间隙长度在10μm和70μm之间变化的设备。该数据表明当间隙长度小于10μm大于70μm时聚集停止。此外，数据集表明聚集的速率和程度可通过在15-50μm范围内改变间隙长度进行修改(见图
27)。
27)。
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