技术领域
[0001] 本
发明属于转基因作物生态
风险评价技术领域,具体涉及一种转基因抗虫水稻对捕食性天敌黑肩绿盲蝽安全性评价方法。
背景技术
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有30多亿人口以稻米为食。同时水稻又是虫害最多的粮食作物之一，每年由于稻纵卷叶螟、钻蛀性螟虫等鳞翅目昆虫的为害，造成重大的产量损失（Cheng，1996；Nathan，2006）。在生产实际中，鳞翅目
害虫的防治长期依赖于化学
农药，
化学农药的滥用不但增加了水稻的生产成本，而且污染环境，还容易使害虫产生抗性，降低农药的药效（Su et al，2003）。因此，高抗鳞翅目的抗性品种是一种经济、有效、环保的防治手段。然而，在水稻及野生稻中，难以找到高抗鳞翅目昆虫的抗源。要培育高抗鳞翅目害虫的水稻品种，需借助于外源抗虫基因。Bacillus thuringiensis(Bt)杀虫蛋白被用作
生物源
杀虫剂已经有五十多年的历史，对鳞翅目害虫有稳定的防治效果。目前是转Bt基因抗虫水稻是控制鳞翅目害虫的主要抗虫水稻。
[0003] 然而，抗虫转基因
植物的利用给人类带来利益的同时，也存在一定潜在的生态风险。转基因抗虫植物的生态安全性评价集中在：对靶标害虫的抗性治理、对非靶标生物和
生物多样性的影响、基因漂移问题和对
土壤微生物的影响等。转基因抗虫植物对非靶标生物的潜在影响是有关转基因作物环境风险评价的重要部分。目前，国际上的风险评价工作者以及转基因植物相关管理部
门广泛采用“分层次评价体系”开展转基因植物对非靶标生物影响方面的研究工作（Romeis et al.，2008；王圆圆等，2011）。该评价体系就是选择合适的受试生物，然后依次开展从实验室试验到半田间试验，再到田间试验分层次分阶段进行的系统评价。
[0004] 褐飞虱Nilaparvata lugens 是温带和热带水稻田间最主要的害虫之一，是转Bt基因水稻种植过程中重要的非靶标植食性昆虫。黑肩绿盲蝽是稻飞虱卵期与若虫期重要的捕食性天敌，能明显降低稻飞虱的种群数量（Chen et al.，1992；Lou et al.，2013；Sigsgaard，2007），其通过捕食过程能够摄取到Bt杀虫蛋白，有存在生态风险的可能性，那么，建立一套系统评价转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽是否安全的方法尤为重要。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种安全有效、操作简便、成本低廉的转基因抗虫水稻对捕食性天敌黑肩绿盲蝽安全性评价方法。
[0006] 本发明目的的实现方式为，转基因抗虫水稻对捕食性天敌黑肩绿盲蝽安全性评价方法，包括如下5个部分：
[0007] (1)Tier-1毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物黑肩绿盲蝽的潜在毒性；
[0008] 用人工饲育器饲养黑肩绿盲蝽，接入黑肩绿盲蝽试虫，饲养时饲育器用黑布罩住，仅露出有
饲料的端口，且朝光照方向，保持
相对湿度达90%以上，再置于
温度28±1℃、光周期L:D=14:10h，湿度90±5%的智能人工
气候箱内培养；
[0009] 用三种形式的全纯人工饲料作为黑肩绿盲蝽的饲料即：全纯人工饲料、含有转基因水稻叶鞘组织表达的Bt蛋白浓度10倍以上及含有40μg/ml砷酸二氢
钾的全纯人工饲料；用含有褐飞虱卵的稻苗将黑肩绿盲蝽饲养至2龄若虫，单头接入饲养装置中，每个处理各接黑肩绿盲蝽若虫36头，每日更换饲料并观察记录黑肩绿盲蝽
蜕皮及存活情况，直至
羽化，新羽
化成虫在24小时内，2～3头相同性别成虫合并后用万分之一
电子天平称重；
[0010] 试验中通过ELISA和敏感昆虫生测技术全程监测杀虫蛋白的浓度、
稳定性以及生物活性；
[0011] 选择黑肩绿盲蝽的若虫发育历期、若虫存活率、雌性率以及初羽化体重作为评价参数指标，对其进行统计分析，以评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对黑肩绿盲蝽的毒性影响；
[0012] (2)三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—黑肩绿盲蝽的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对黑肩绿盲蝽的安全性影响；
[0013] ①以褐飞虱卵作为食物
[0014] 向装有6～7根15日龄稻苗的玻璃管中接入2头已过产卵前期的褐飞虱雌成虫，产卵2天，分别以不同水稻品种、系的产卵苗饲养黑肩绿盲蝽的若虫至成虫；每个玻璃管内接入孵化24h以内，来自非转基因亲本水稻的黑肩绿盲蝽若虫1头，每个品种、系各接黑肩绿盲蝽若虫32头，在黑肩绿盲蝽的1～3龄若虫期，每2天更换1次产卵苗，在4龄至成虫期每天更换1次产卵苗；每天上午观察记录黑肩绿盲蝽若虫的存活和蜕皮情况，直至若虫羽化，新羽化成虫24小时内，2～3头相同性别成虫合并后用万分之一电子天平称重；
[0015] 选择黑肩绿盲蝽的若虫发育历期、若虫存活率、雌性率以及初羽化体重作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱卵介导的转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽的安全性影响；
[0016] ②以褐飞虱若虫作为食物
[0017] 每日提供在不同水稻品种、系上孵化并取食24～48小时的褐飞虱若虫作为食物饲喂黑肩绿盲蝽，具体操作如下：用含有褐飞虱卵的稻苗将黑肩绿盲蝽饲养至2龄若虫，再喂以不同水稻品种、系的褐飞虱若虫，2～3龄黑肩绿盲蝽若虫期每日每头提供10头褐飞虱若虫，4龄黑肩绿盲蝽到成虫期每日每头提供20头褐飞虱若虫，黑肩绿盲蝽若虫单头饲养于底部铺有湿海
棉保湿的指型管中，每个品种、系各接黑肩绿盲蝽若虫80头，每天上午观察记录黑肩绿盲蝽若虫的存活和蜕皮情况，直至若虫羽化，新羽化成虫24小时内，3～5头相同性别成虫合并后用万分之一电子天平称重；
[0018] 选择黑肩绿盲蝽的若虫发育历期、若虫存活率、雌性率以及初羽化体重作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱若虫介导的转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽的安全性影响；
[0019] (3)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定黑肩绿盲蝽暴露于Bt蛋白的途径和程度；
[0020] 于玻璃罐中分别放入15日龄不同水稻品种、系的稻苗，接入对应水稻材料饲养的20头怀卵褐飞虱雌成虫，产卵2天后接入3～4龄黑肩绿盲蝽，取食3天后，分别对水稻叶鞘，褐飞虱卵，黑肩绿盲蝽进行取样，每个处理重复4～5次；
[0021] 将不同水稻品种、系饲养孵化后24～48小时的褐飞虱若虫与3～4龄黑肩绿盲蝽同时接入含有对应稻苗的玻璃罐中，每日更换褐飞虱，取食3天后，分别对水稻叶鞘，褐飞虱若虫以及黑肩绿盲蝽进行取样，每个处理重量4～5次；
[0022] 采用ELISA技术，分别对以上样品中Bt蛋白的含量进行检测，确定通过不同的食物链黑肩绿盲蝽暴露于Bt蛋白的程度；
[0023] (4)捕食功能反应：通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照品种饲养的黑肩绿盲蝽捕食功能参数，评判转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物的影响；
[0024] 黑肩绿盲蝽分别于不同水稻材料饲养一代，羽化后2天且已交配的雌虫用于试验，试验前饥饿处理24小时，将黑肩绿盲蝽单头放入底部铺有海棉且含有稻苗的指形试管，1龄褐飞虱若虫作为猎物；5个猎物
密度处理，分别为10、20、30、40、50头，每个密度处理重复5次，24小时后计录被捕食的褐飞虱若虫数；
[0025] 选择黑肩绿盲蝽的瞬时攻击率和处理猎物时间作为评价参数指标，并进行统计分析，评价转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽捕食功能反应的影响；
[0026] (5)种群密度与种群动态比较：通过比较，转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照稻田黑肩绿盲蝽的发生动态，评价转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标生物种群的影响；
[0027] 采用对
角线取样法，每小区面积为150m2，每次取5个样，每样0.25m2，约6丛稻株；水稻移栽后30天开始用吸虫器取样，至水稻收割前10天，共取样5～7次；取样立即用75%的酒精保存，在体视镜下进行鉴定并计数，以统计黑肩绿盲蝽种群密度及种群动态，并对不同水稻稻田之间参数的差异性进行统计分析，评价转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽田间种群的安全性影响。
[0028] 本发明通过Tier-1毒性测定试验评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物黑肩绿盲蝽的潜在毒性；通过水稻—褐飞虱—黑肩绿盲蝽的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对黑肩绿盲蝽的影响；采用ELISA检测手段鉴定黑肩绿盲蝽暴露于Bt蛋白的途径和程度；通过对黑肩绿盲蝽捕食功能参数的比较，评价转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物捕食功能是否产生不利影响；通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照稻田黑肩绿盲蝽的发生动态，评价转Bt基因抗虫水稻对黑肩绿盲蝽种群的影响。最终，根据5个方面的研究数据综合分析转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标生物产生的生态后果。
[0029] 本发明建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转Bt基因抗虫水稻对非靶标生物的影响研究具有重要意义，对确定转Bt基因抗虫水稻种植的生态安全性具有重要意义。
附图说明
[0030] 图1为黑肩绿盲蝽人工饲育器结构示意图，
[0031] 图2为取食纯人工饲料以及加入Cry2Aa蛋白与PA人工饲料的黑肩绿盲蝽生存曲线图，
[0032] 图3、4为T2A-1水稻叶鞘组织，褐飞虱卵及取食褐飞虱卵的黑肩绿盲蝽体内Cry2Aa蛋白含量图，
[0033] 图5、6为T2A-1水稻叶鞘组织，褐飞虱若虫及取食褐飞虱若虫的黑肩绿盲蝽体内Cry2Aa蛋白含量图，
[0034] 图7、8为T2A-1、明恢63水稻材料饲养的黑肩绿盲蝽的功能反应图，[0035] 图9、10、11、12为吸虫器法孝感2011年、2012年、2013年、随州2011年采集的转基因水稻与对照水稻田黑肩绿盲蝽种群动态图。
具体实施方式
[0036] 本发明的转Bt基因抗虫水稻选择转cry2Aa基因水稻T2A-1，其对鳞翅目害虫有很高的抗性，非转基因亲本选择对照明恢63水稻，水稻
种子均由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。水稻于栽培盘（长×宽×高=25cm×20cm×3cm）中以Yoshida
营养液培育至大约15cm高后用于评价试验。稻苗培育条件为温度（26±2℃），相对湿度（80%）。
[0037] 本发明的供试褐飞虱采自湖北武汉稻田，并在室内分别于T2A-1与明恢63的稻苗建立种群，饲养10代以上。黑肩绿盲蝽采自湖北孝感稻田，在室内用带有褐飞虱卵的明恢63稻苗饲养6代以上用于试验。饲养条件为温度（28±1℃），相对湿度（70±5%），光暗比（L14h:D10h）。
[0038] 本发明的评价方法由Tier-1毒性测定试验，三级营养试验，蛋白传递规律，捕食功能反应以及种群密度与种群动态比较5个关键部分组成。下面分别进行详细说明。
[0039] 1、Tier-1毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物黑肩绿盲蝽的潜在毒性。
[0040] 用人工饲育器饲养黑肩绿盲蝽，黑肩绿盲蝽人工饲育器为直径×高=2cm×12cm的双通玻璃管2（见图1），其一端为饲料室，饲料室由双层Parafilm膜(3)
中间包裹饲料而成。接入黑肩绿盲蝽试虫后，用橡皮筋将质地细腻的尼龙纱布1扎于玻璃管另一端。饲养时饲育器用黑布罩住，仅露出有饲料的端口，且朝光照方向，保持相对湿度达90%以上，再置于温度28±1℃，光周期L:D=14:10h，湿度90±5%的智能人工气候箱内培养。
[0041] 用三种形式的全纯人工饲料作为黑肩绿盲蝽的饲料即：全纯人工饲料（阴性对照）、含有300μg/ml Cry2Aa蛋白人工饲料、含有40μg/ml PA人工饲料（砷酸二氢钾，阳性对照）；用含有褐飞虱卵的稻苗将黑肩绿盲蝽饲养至2龄若虫（因从1龄开始饲养，死亡率很高），单头接入饲养装置中，每个处理各接黑肩绿盲蝽若虫36头，每日更换饲料并观察记录黑肩绿盲蝽蜕皮及存活情况，直至羽化，新羽化成虫在24小时内，2～3头相同性别成虫合并后用万分之一电子天平称重。
[0042] 所述全纯人工饲料为
专利号99108791.7
实施例2公布的饲料，所述
氨基酸含有以下组分：半脱氨酸80；胱氨酸20；天冬酰胺230；谷酰胺240；精氨酸175；异亮氨酸100；谷氨酸250；丝氨酸400；组氨酸100；亮氨酸240；赖氨酸240；苯丙氨酸200；苏氨酸130；
酪氨酸10；缬氨酸300；蛋氨酸110；γ-氨基丁酸10；甘氨酸30；丙氨酸130；脯氨酸100；
色氨酸105；天冬氨酸100。所述维生素含有以下组分：生物素0.025；泛酸
钙5.0；氯化胆
碱50.0；叶酸1.0；肌醇50；烟酸15；烟酸哔哆辛2.5；核黄素5.0；
盐酸硫胺素2.0；维生素C100。所述无机盐含有以下组分：CaCl2﹒2H2O3.115；CuCl2﹒2H2O0.268；FeCl3﹒
6H2O2.228；MnCl2﹒4H2O0.793；ZnCl20.396；MgCl2﹒6H2O200；KH2PO4500。所述
蔗糖浓度
9000。以上浓度单位为mg/100ml。
[0043] 取食三种食物的黑肩绿盲蝽生命表参数如表1所示，
[0044] 表1
[0045]
[0046] 注：表中数据为平均数±标准误差，括号中数字表示观测样本数。a b c **
[0047] U检验；卡方检验；学生t检验。数值后跟 表示与对照相比差异显著（P<0.01）。
[0048] 从表1可见，与对照处理相比，含300μg/ml Cry2Aa蛋白食物处理的黑肩绿盲蝽各龄期发育历期、若虫存活率、雌性率以及初羽化体重均无显著性差异；而阳性对照处理中，只有2龄发育历期与对照相比没有显著性差异，其它发育历期参数与对照相比均显著延长，并且没有黑肩绿盲蝽发育至成虫。Kaplan-Meier生存分析结果表明：取食含有300μg/ml Cry2Aa蛋白人工饲料的黑肩绿盲蝽与对照处理之间的存活率无显著性差异（P=0.640）；而取食含40μg/ml PA人工饲料的黑肩绿盲蝽与对照相比，其存活率显著下降（P<0.001）（图2）。此外，利用ELISA技术检测黑肩绿盲蝽取食前后，含Cry2Aa蛋白人工饲料中Cry2Aa蛋白含量分别为98.39±3.15μg/ml和91.09±3.71μg/ml，下降了7.42%，但其含量远高于水稻叶鞘组织的表达量。
[0049] 将不同处理的人工饲料进行适当稀释，按0.1%比例加入Triton X-100混匀后，用毛笔涂抹到玉米
叶片表面，自然晾干后，每个处理接稻纵卷叶螟2龄幼虫15头，重复4次，48小时后记录死亡情况。结果表明，取食前后，含Cry2Aa蛋白的人工饲料对稻纵卷叶螟幼虫的致死率分别为90%和80%，远高于纯人工饲料13.3%，整个取食过程中，Cry2Aa蛋白都具有较高的
杀虫活性。
[0050] 综上所述，黑肩绿盲蝽暴露于高剂量且具有杀虫活性的Cry2Aa蛋白，表明其对Cry2Aa蛋白不敏感。
[0051] 2、三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—黑肩绿盲蝽的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对黑肩绿盲蝽的安全性影响。
[0052] ①以褐飞虱卵作为食物
[0053] 向装有6～7根15日龄稻苗的，直径×高=3cm×25cm的玻璃管中接入2头已过产卵前期的褐飞虱雌成虫，产卵2天，分别以两个水稻品种、系的产卵苗饲养黑肩绿盲蝽的若虫至成虫；每个玻璃管内接入孵化24h以内，来自非转基因亲本水稻的黑肩绿盲蝽若虫1头，并用100目纱布封口。每个品种、系各接黑肩绿盲蝽若虫32头，在黑肩绿盲蝽的1～3龄若虫期，每2天更换1次产卵苗，在4龄至成虫期每天更换1次产卵苗。每天上午观察记录黑肩绿盲蝽若虫的存活和蜕皮情况，直至若虫羽化，新羽化成虫24小时内，2～3头相同性别成虫合并后用万分之一电子天平称重。
[0054] 以不同水稻材料饲养的褐飞虱卵为食物的黑肩绿盲蝽生命表参数如表2所示，[0055] 表2
[0056]
[0057] 注：表中数据为平均数±标准误，括号中数字表示观测样本数。
[0058] 同一行中，转Bt基因抗虫水稻T2A-1与对照水稻明恢63进行统计学比较，a b c
[0059] U检验；卡方检验；学生t检验。
[0060] 由表2可见，转Bt基因抗虫水稻T2A-1与亲本对照相比，黑肩绿盲蝽的各项生命表参数均无显著性差异。
[0061] ②以褐飞虱若虫作为食物
[0062] 每日提供在两个水稻品种、系上孵化并取食24～48小时的褐飞虱若虫作为食物饲喂黑肩绿盲蝽，具体操作如下：用含有褐飞虱卵的稻苗将黑肩绿盲蝽饲养至2龄若虫（以褐飞虱若虫为食物时，1龄若虫有较高的死亡率，故选择2龄黑肩绿盲蝽作为起始试验对象），再喂以不同水稻品种、系的褐飞虱若虫，2～3龄黑肩绿盲蝽若虫期每日每头提供10头褐飞虱若虫，4龄黑肩绿盲蝽到成虫期每日每头提供20头褐飞虱若虫，黑肩绿盲蝽若虫单头饲养于底部铺有湿海棉保湿，2cm×12cm指型管中，每个品种、系各接黑肩绿盲蝽若虫80头，每天上午观察记录黑肩绿盲蝽若虫的存活和蜕皮情况，直至若虫羽化，新羽化成虫24小时内，3～5头相同性别成虫合并后用万分之一电子天平称重。
[0063] 以不同水稻材料饲养的褐飞虱若虫为食物的黑肩绿盲蝽生命表参数如表3所示，[0064] 表3
[0065]
[0066] 注：表中数据为平均数±标准误，括号中数字表示观测样本数。
[0067] 同一行中，转Bt基因抗虫水稻T2A-1与对照水稻明恢63进行统计学比较，[0068] a U检验；b卡方检验；c学生t检验。
[0069] 由表3可见，转Bt基因抗虫水稻T2A-1与亲本对照相比，黑肩绿盲蝽的各项生命表参数均无显著性差异。
[0070] 3、Cry2Aa蛋白在水稻—褐飞虱—黑肩绿盲蝽食物链的传递规律；
[0071] 于2L玻璃罐中分别放入15日龄不同水稻品种、系的稻苗，接入对应水稻材料饲养的20头怀卵褐飞虱雌成虫，产卵2天后接入3～4龄黑肩绿盲蝽，取食3天后，分别对水稻叶鞘，褐飞虱卵，黑肩绿盲蝽进行取样，水稻叶鞘30mg左右，褐飞虱卵200粒左右，黑肩绿盲蝽20头；每个处理重复4～5次。
[0072] 将不同水稻品种、系饲养孵化后24～48小时的褐飞虱若虫与3～4龄黑肩绿盲蝽同时接入含有对应稻苗的2L玻璃罐中，每日更换褐飞虱，取食3天后，分别对水稻叶鞘，褐飞虱若虫以及黑肩绿盲蝽进行取样，水稻叶鞘30mg左右，褐飞虱若虫30mg左右，黑肩绿盲蝽20头；每个处理重量4～5次。
[0073] 分别以褐飞虱卵和若虫为食物的两条食物链，其Cry2Aa蛋白传递规律如图3，图4，图5，图6所示，T2A-1叶鞘组织中Cry2Aa蛋白含量远远高于褐飞虱若虫以及黑肩绿盲蝽体内的含量；取食褐飞虱卵及若虫的黑肩绿盲蝽体内检测到较高浓度的Cry2Aa蛋白，远高于褐飞虱若虫；褐飞虱卵内未检测到Cry2Aa蛋白的存在。对照品种明恢63的所有处理均未检测到Cry2Aa蛋白。
[0074] 以上结果表明，Cry2Aa蛋白在两条食物链不同营养级中并不是逐级递减的，黑肩绿盲蝽暴露于较高浓度的Cry2Aa蛋白。
[0075] 5、转cry2Aa基因水稻对黑肩绿盲蝽捕食功能反应的影响。
[0076] 黑肩绿盲蝽分别于两种水稻材料T2A-1和明恢63饲养一代，羽化后2天且已交配的雌虫用于试验，试验前饥饿处理24小时。将黑肩绿盲蝽单头放入底部铺有海棉且含有稻苗的指形试管，1龄褐飞虱若虫作为猎物。5个猎物密度处理，分别为10、20、30、40、50头，每个密度处理重复5次，24小时后计录被捕食的褐飞虱若虫数。结果如图7，图8所示。
[0077] 来自不同水稻材料的黑肩绿盲蝽对褐飞虱若虫的功能反应均符合HollingⅡ型反应。对HollingⅡ型反应圆盘方程中2个参数的统计分析表明，来自转Bt基因水稻T2A-1与对照品种水稻明恢63饲养的黑肩绿盲蝽对褐飞虱捕食功能反应的参数，瞬时攻击率和处理猎物时间都无显著性差异（表4）。
[0078] 表4
[0079]
[0080] 注：a：瞬时攻击率；Th：处理猎物时间。相同参数比较采用学生t检验。
[0081] 以上结果表明：由褐飞虱介导的Cry2Aa蛋白对黑肩绿盲蝽捕食功能反应无显著性影响。
[0082] 6、转cry2Aa基因水稻对黑肩绿盲蝽田间种群的影响
[0083] 试验设计与田间管理
[0084] 试验地点选择湖北省内稻作区具有代表意义的两个地点：孝感及随州，分别于2
2011～2013年进行田间试验，采用完全随机区组设计，每小区150m（10m×15m），每个水稻材料重复4次。单本插秧，小区间留有1米宽的隔离带，整个试验区四周种留有保护行（0.5m）。肥水管理按常规操作，但整个水稻生育期不施用任何农药。
[0085] 取样与物种鉴定：
[0086] 吸虫器：利用华盛泰山背负式超低量喷雾机，仿照刘雨芳等（1999）改装而成，其中附加结构由进风口导罩、集虫网、两根软管（Ф60cm×100cm）、
采样框（50×50×120cm）组成，集虫网为市售100目尼龙纱网，置于出风口。
[0087] 调查方法：改装的吸虫器由两人进行操作，一人背负吸虫器，另一人卸装集虫网和2 2
安置采样框。采用对角线取样法，每小区面积150m，每小区每次调查5个样，每样0.25m，约6丛稻株。从水稻移栽后约30天开始调查，每10天左右取样1次，至水稻收割前10天左右，一般调查5～7次。
[0088] 分类和鉴定：取样立即用75%的酒精保存，携回室内后，除去杂物，挑出的
节肢动物再用80%酒精保存，然后在体视镜下进行鉴定并计数。在此
基础上，统计黑肩绿盲蝽种群密度及种群动态，并对两种水稻稻田之间参数的差异性进行统计分析。
[0089] 种群密度比较结果如表5所示，湖北稻区稻飞虱捕食性天敌黑肩绿盲蝽发生量并不大，两种水稻上种群密度差异均不显著（P>0.05）。从不同取样时段的种群发生动态也可以看出，黑育绿盲蝽在两种水稻稻田的发生趋势相似，所有取样时间点差异均不显著；Repeated measures ANOVA分析结果同样表明两种水稻稻田黑肩绿盲蝽种群动态无显著性差异（图9、孝感2011年；图10.孝感2012年；图11.孝感2013年；图12随州2011年）。
[0090] 可见，转Bt基因抗虫水稻T2A-1的种植对田间黑肩绿盲蝽种群无负面效应。
[0091] 表5
[0092]
[0093] 注：表中数据为平均数±标准误。相同地点相同年份采用学生t检验。
[0094] 种群密度即整个水稻生育期所采集黑肩绿盲蝽数量的平均数。
[0095] 综合高剂量Cry2Aa蛋白喂食试验结果，三级营养生命表参数，蛋白传递规律，捕食功能反应以及田间调查结果分析，证明了转cry2Aa基因水稻对黑肩绿盲蝽的生态安全性。
