一种用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法
阅读：256发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供了一种用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法，其中所述方法采用超高效液相色谱法(UPLC)进行，用于所述液相色谱法的流动相为乙腈与0.1％ 磷酸 水 溶液的组合，用于所述液相色谱法的对照品为番泻苷类物质，用于所述液相色谱法的待测供试品为含有大黄和/或番泻叶的制剂。本申请的方法避免了通常使用含有四庚基溴化铵的 醋酸 钠缓冲盐溶液或者四氢呋喃的流动相，建立了一种流动相检测条件比较温和、色谱分离度较好的检测方法，能够简单、快速、准确地检测出含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质并易于控制含有大黄和/或番泻叶的制剂的 质量 。，下面是一种用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法，其中所述方法采用超高效液相色谱法进行，用于所述超高效液相色谱法的流动相为乙腈与0.1％磷酸水溶液的组合，用于所述超高效液相色谱法的对照品为番泻苷类物质，用于所述超高效液相色谱法的待测供试品为含有大黄和/或番泻叶的制剂，制备所述对照品和所述供试品时以含有0.1％NaHCO3的40％甲醇水溶液作溶剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述番泻苷类物质选自番泻苷A和/或番泻苷B。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述供试品选自大黄药材、番泻叶药材、大黄饮片或含有大黄、番泻叶的复方制剂。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述供试品选自蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.、药用大黄Rheum offcihale Baill.的干燥根和根茎、豆科植物狭叶番泻Cassia angustifolia Vahl.或尖叶番泻Cassia acutifolia Delile.的干燥小叶。
5.一种采用液相色谱法来检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷A和/或番泻苷B的方法，包括以下步骤：
a.确定色谱条件
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，C18柱；
流动相：以(A)乙腈-(B)0.1％磷酸水溶液为流动相；
流动相流速：0.1-0.4ml/min；
梯度洗脱条件：0～5min：8→12(A)，5～10min：12→13(A)，10～15min：13→15(A)，
15～20min：15→17(A)，20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)；
检测波长：250-410nm；
柱温：25-45℃；
进样量：1.0-4.0μl；
理论塔板数按番泻苷A计算不低于10000；
b.番泻苷A、番泻苷B对照品溶液的配制：
以含有0.1％NaHCO3的40％甲醇水溶液作溶剂；精密称取番泻苷A、番泻苷B对照品置于棕色容量瓶，配制成混合对照品溶液；
c.待测供试品溶液的配制：
取大黄粉末0.20g，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，精密加入含有0.1％NaHCO3的水溶液30ml，称定重量，超声处理40分钟，控制水温在30℃以下，再称定重量，用0.1％NaHCO3水溶液补足减失的重量，离心5分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；
d.供试品含量测定：采用步骤a中的色谱条件对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，根据测得的峰面积按照公式1计算所述供试品中的番泻苷A、番泻苷B的含量；
式中AX为所述供试品溶液的峰面积；AR为所述对照品溶液的峰面积；cX为所述供试品溶液的浓度；cR为所述对照品溶液的浓度。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤a中：
梯度洗脱条件：0～5min：8→12(A)，5～10min：12→13(A)，10～15min：13→15(A)，
15～20min：15→17(A)，20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)。
7.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤a中：
流动相流速：0.2ml/min；
检测波长：340nm；
柱温：30℃；
进样量：2.0μl。
8.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤b中：
所配制的混合对照品溶液的浓度为74μg/ml、46μg/ml。
一种用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类
物质的方法
技术领域
[0001] 本申请涉及一种用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法。
背景技术
[0002] 大黄别名将军、黄良、火参、肤如等，是我国中药“四大金刚”之一。2010版《中国药典》收载的正品大黄药材的3个重要基原包括：蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum offcihale Baill.的[1]干燥根和根茎 ，主产于甘肃东南部、四川西部、青海东部、西藏东部等高寒地区，具有泻下[2]
攻积，泻火解毒，凉血止血，活血祛瘀，清泻湿热的功效 。
攻积，泻火解毒，凉血止血，活血祛瘀，清泻湿热的功效 。
[0003] 但是现有的大黄药材质量控制标准，多数以经过盐酸水解后的游离蒽醌苷元含量[3-4]作为其质量优劣的评价指标，这与大黄泻下通便的临床疗效关联度不强。现有文献 表明大黄中结合性二蒽酮类成分(主要指的是番泻苷A、B、C、D、E、F)是其泻下通便的主要药效成分。由于番泻苷C、D、E、F在大黄中的含量很少(低于万分之一)，很难在常规取样量下达到定量限浓度，检测番泻苷C、D、E、F没有实际意义。由于番泻苷A和番泻苷B独特的化学性质，在水和醇溶液里溶解性小，分离提取效果差；番泻苷A和番泻苷B为同分异构体，[5]
常规高效液相色谱分离效果不理想 。因此检测大黄药材及含有大黄的中药复方制剂中的番泻苷A和番泻苷B的含量对临床安全、合理用药显得尤为重要。
常规高效液相色谱分离效果不理想 。因此检测大黄药材及含有大黄的中药复方制剂中的番泻苷A和番泻苷B的含量对临床安全、合理用药显得尤为重要。
[0004] 现有文献多采用含有四庚基溴化铵的醋酸钠缓冲盐溶液或者四氢呋喃的流动相[6-7]进行分离测定 ，流动相配制方法繁琐，测定条件苛刻：四庚基溴化铵属于离子对试剂，一旦用于色谱柱则对色谱柱的伤害较大，极易降低柱效，且含有四庚基溴化铵的醋酸钠缓冲盐溶液流动相配制操作繁琐，稍有不慎则容易引起色谱保留行为的改变；四氢呋喃属于非质子溶剂，具有刺激性，极度易燃，与空气混合容易爆炸，高浓度吸入对人体损害性较大。很多高效液相色谱仪器的管路和密封垫采用PEEK材料，而这种材料对四氢呋喃很敏感，如果高浓度或者长时间使用，会加快PEEK材料的老化，造成管路变硬变脆，腐蚀密封垫，很容易损坏色谱仪器。
[0005] 文献[8，9，10]虽然涉及了含有磷酸水溶液的流动相，但是在该文献的方法下仍然没有达到很好的色谱分离，分离度和色谱峰形较差，色谱峰纯度低，并且分析时间过长，因此该法实用价值很小。在文献中涉及到样品中番泻苷A和番泻苷B的提取，均采用甲醇作为提取溶剂，但是番泻苷A和番泻苷B由于其独特的化学性质，在甲醇中溶解度极小，因此该提取方法显得不合理，并不能反映出大黄中番泻苷A和番泻苷B的真实含量。
[0006] 因此，需要开发一种检测条件相对温和、简便的用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法。
[0007] 参考文献
[0008] [1]中华人民共和国药典委员会.《中华人民共和国药典》(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010:22.
[0009] [2]张廷模.临床中药学[M].上海科学技术出版社,2006,8:136-137.[0010] [3]牟宜坤,李玛琳,杨为民.大黄对胃肠道作用及其机制探讨[J].医学综述,2003,9(2)：125-126.
[0011] [4]张丹丹.大黄的临床药理研究 [J].中国中医药现代远程教育,2011,9(17):68-69.
[0013] [6]孙佩,李敏,杨小多，等.HPLC法测定大黄药材和饮片中番泻苷A和番泻苷B的含量[J].成都中医药大学学报,2008,31(3):51-53.
[0014] [7]李勉,丁艳霞,詹传红等.HPLC法测定不同产地大黄中番泻苷A和番泻苷B的含量[J].河南大学学报(医学版),2013,32(2):105-108.
[0015] [8]高晓燕,卢建秋.HPLC-DAD法测定大黄中7个蒽醌类化合物的含量[J].药物分析杂志,2010,30(9):1636-1641.
[0016] [9]王哲,许利嘉,何春年等.HPLC法测定不同来源大黄中蒽醌和二蒽酮类成分[J].中草药,2011,6(42):1114-1118.
[0017] [10]程小丽,魏胜利,刘春生等.RP-HPLC-DAD测定大黄中9种有效成分的含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(18):99-102.发明内容
[0018] 本发明的一个目的是提供一种用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法。
[0019] 本发明的另一个目的是提供一种采用液相色谱法来检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷A和/或番泻苷B的方法。
[0020] 本发明的用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法，其中所述方法采用超高效液相色谱法(UPLC)进行，用于所述超高效液相色谱法的流动相为乙腈与0.1％磷酸水溶液的组合，用于所述液相色谱法的对照品为番泻苷类物质，用于所述液相色谱法的待测供试品为含有大黄和/或番泻叶的制剂，制备所述对照品和所述供试品时以含有0.1％NaHCO3的40％甲醇水溶液作溶剂。
[0021] 在本发明中，术语“液相色谱法”包括但不限于液相色谱、高效液相色谱、超高效液相色谱等。
[0022] 在本发明中，术语“含有大黄和/或番泻叶的制剂”指的是大黄原药材、番泻叶原药材、含有大黄和/或番泻叶的饮片、含有大黄和/或番泻叶的复方制剂诸如三黄片、排毒养颜胶囊等。
[0023] 在一个实施方案中，所述番泻苷类物质选自番泻苷A和/或番泻苷B。
[0024] 在一个实施方案中，所述供试品选自大黄药材、番泻叶药材、大黄饮片或含有大黄、番泻叶的复方制剂。
[0025] 在一个更具体的实施方案中，所述供试品选自蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.、药用大黄Rheum offcihale Baill.的干燥根和根茎、豆科植物狭叶番泻Cassia angustifolia Vahl.或尖叶番泻Cassia acutifolia Delile.的干燥小叶。
[0026] 本发明的采用液相色谱法来检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷A和/或番泻苷B的方法，包括以下步骤：
[0027] a.确定色谱条件
[0029] 流动相：以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相；
[0030] 流动相流速：0.1-0.4ml/min；
[0031] 洗脱条件：0～5min：8→12(A)，5～10min：12→13(A)，10～15min：13→15(A)，15～20min：15→17(A)，20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)；
[0032] 检测波长：250-410nm；
[0033] 柱温：25-45℃；
[0034] 进样量：1.0-4.0μl；
[0035] 理论塔板数按番泻苷A计算不低于10000；
[0036] b.番泻苷A、番泻苷B对照品溶液的配制：
[0037] 以含有0.1％NaHCO3的40％甲醇水溶液作溶剂；精密称取番泻苷A、番泻苷B对照品置于棕色容量瓶，配制成混合对照品溶液。
[0038] c.待测供试品溶液的配制：
[0039] 取大黄粉末0.20g，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，精密加入含有0.1％NaHCO3的水溶液30ml，称定重量，超声处理40分钟，控制水温在30℃以下，再称定重量，用0.1％NaHCO3水溶液补足减失的重量，离心5分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
[0040] d.供试品含量测定：采用步骤a中的色谱条件对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，根据测得的峰面积按照公式1计算所述供试品中的番泻苷A、番泻苷B的含量。
[0041] -----公式1
[0042] 式中AX为所述供试品溶液的峰面积；AR为所述对照品溶液的峰面积；cX为所述供试品溶液的浓度；cR为所述对照品溶液的浓度。
[0043] 在一个实施方案中，所述液相色谱法是超高效液相色谱法。
[0044] 在一个实施方案中，在步骤a中：
[0045] 流动相流速：0.2ml/min；
[0046] 检测波长：340nm；
[0047] 柱温：30℃；
[0048] 进样量：2.0μl。
[0049] 本申请的发明人发现340nm具有较强吸收，且杂质峰对目标峰的干扰较少。
[0050] 在一个实施方案中，在步骤b中：
[0051] 所配制的混合对照品溶液的浓度为74μg/ml、46μg/ml。
[0052] 本发明中采用的色谱柱可以是本领域常用的色谱柱，优选Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)。
[0053] 本发明中采用特定的流动相，即以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相，发明人发现采用此特定的流动相与特定的梯度洗脱条件配合，梯度洗脱程序为：0～5min：8→12(A)，5～10min：12→13(A)，10～15min：13→15(A)，15～20min：15→17(A)，
20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)；在此洗脱程序下能够最大限度的将干扰物质与番泻苷A、B分离，得到分离度和色谱峰形都符合要求的色谱峰(见图1)。
20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)；在此洗脱程序下能够最大限度的将干扰物质与番泻苷A、B分离，得到分离度和色谱峰形都符合要求的色谱峰(见图1)。
[0054] 本发明基于用0.1％碳酸氢钠水溶液提取含有大黄和/或番泻叶的制剂、用乙腈和磷酸水作为流动相以及特定的梯度洗脱条件、检测波长、流动相流速、柱温、理论塔板数等因素进行特定的组合，从而创造性提出了一种用于检测含有大黄和/或番泻叶的制剂中的番泻苷类物质的方法，该方法能够达到较好的分离效果(见表2)，分离度较高(＞1.5)，色谱峰形较好，峰纯度符合要求(见图6和7)。
[0055] 本发明的检测方法避免了使用含有四庚基溴化铵离子对试剂的缓冲液流动相体系，也即避免了四庚基溴化铵离子对试剂对色谱柱的损害，同时简化了配制缓冲液的繁琐。
[0056] 本发明的检测方法避免了使用四氢呋喃非质子流动相体系，也即避免了四氢呋喃对色谱仪器及检验人员的危害。
[0058] 本发明的检测方法耐用性好，可以转换成为常规的高效液相色谱法(即HPLC)，适用于具备高效液相色谱仪的质检或药检机构使用。
[0059] 本发明的检测方法简便、实用、准确、快速，通用性好，为含有番泻苷A、番泻苷B成分的原药材(例如大黄、番泻叶)和含有番泻苷A、番泻苷B的复方制剂(三黄片、排毒养颜胶囊)的质量控制提供了参考。
[0061] 图1显示番泻苷A和番泻苷B对照品溶液的色谱图；
[0062] 图2显示大黄供试品溶液的色谱图；
[0063] 图3显示番泻叶供试品溶液的色谱图；
[0064] 图4显示排毒养颜胶囊供试品溶液的色谱图；
[0065] 图5显示本发明所述UPLC法经过转换为高效液相色谱法(HPLC)后的大黄药材供试品溶液的色谱图；
[0066] 图6显示供试品溶液中番泻苷B的色谱峰纯度检测；以及
[0067] 图7显示供试品溶液中番泻苷A的色谱峰纯度检测。
具体实施方式
[0068] 下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。
[0069] 以下实施例中采用的物质，除了注明的之外，其余均为市售。
[0070] 实施例1 本发明的方法学验证
[0071] 按照2010版《中国药典》附录“中药质量标准分析方法验证指导原则”要求对本发明进行方法学验证，确保本发明方法所测得的数据真实可靠。
[0072] a.色谱条件:
[0073] 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；
[0074] 流动相：以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相；
[0075] 流动相流速：0.2ml/min；
[0076] 梯度洗脱条件：0～5min：8→12(A)，5～10min：12→13(A)，10～15min：13→15(A)，15～20min：15→17(A)，20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)；
[0077] 检测波长：340nm；
[0078] 柱温：30℃；
[0079] 进样量：2.0μl；
[0080] 理论塔板数按番泻苷A计算应不低于10000；
[0081] b.番泻苷A、番泻苷B的对照品溶液的配制：
[0082] 以含有0.1％NaHCO3的40％甲醇水溶液作溶剂；精密称取番泻苷A、番泻苷B对照品适量置于棕色容量瓶，配制成浓度为74μg/ml、46μg/ml的混合对照品溶液。
[0083] c.待测供试品溶液的配制：
[0084] 取大黄粉末0.20g(过四号筛)，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，精密加入含有0.1％NaHCO3的水溶液30ml，称定重量，超声处理40分钟(控制水温30℃以下)，再称定重量，用0.1％NaHCO3水溶液补足减失的重量，离心5分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
[0085] ①精密度考察
[0086] 取混合对照品溶液，按上述含量测定方法连续进样6次，每次2μl，记录峰面积，计算RSD％值。结果为番泻苷A峰面积RSD％＝0.33％，番泻苷B面积RSD％＝0.46％，结果表明仪器的精密度良好。
[0087] ②线性关系考察
[0088] 取混合对照品溶液(番泻苷A：70μg/ml、番泻苷B：40μg/ml)，分别精密吸取对照品混合液1.0μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl、3.5μl、4.0μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测得峰面积。以进样量(μg)为横坐标(x)，峰面积(A)为纵坐标(y)绘制标准曲线。结果表明，番泻苷A一次进样量在0.074μg～0.296μg范围内与峰面积呈良好的线6
性关系，回归方程和相关系数为：y＝4.1×10x-2142.46，r＝1.0；番泻苷B一次进样量在0.046μg～0.184μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程和相关系数为：y＝
6
4.1×10x-3079.67，r＝0.9999。
性关系，回归方程和相关系数为：y＝4.1×10x-2142.46，r＝1.0；番泻苷B一次进样量在0.046μg～0.184μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程和相关系数为：y＝
6
4.1×10x-3079.67，r＝0.9999。
[0089] ③重复性考察
[0090] 取同一批供试品粉末0.20g，共6份，精密称定，按2.3项下制备供试品溶液，进样测定，每次2μl，记录峰面积，计算含量。结果样品中番泻苷A含量为7.02mg/g、7.11mg/g、7.03mg/g、7.06mg/g、7.07mg/g、7.01mg/g，RSD％＝0.53％，番泻苷B含量为3.13mg/g、3.22mg/g、3.14mg/g、3.26mg/g、3.17mg/g、3.25mg/g，RSD％＝1.76％，表明供试品含量测定重复性良好。
[0091] ④准确度考察
[0092] 取50ml棕色容量瓶6个，精密称取上述已知含量供试品(番泻苷A含量为7.05mg/g，番泻苷B含量为3.20mg/g)，各称取约0.10g，分别精密加入新配制的番泻苷A对照品溶液(C＝52μg/ml)15ml，番泻苷B对照品溶液(C＝100μg/ml)3.5ml，再用0.1％NaHCO3水溶液补足至25ml，分别精密称定，按c项下制备供试品溶液。进样2μl测定，按公式2计算回收率。
[0093] ---公式2
[0094] 测定结果为6份番泻苷A、番泻苷B的平均加样回收率为101.79％和97.43％，RSD％分别为3.24％和4.65％，表明本方法具有较好的回收率，测定方法可靠。
[0095] ⑤供试品溶液稳定性考察
[0096] 取供试品溶液，间隔0、2、4、8、16、24小时测定一次，进样4μl，记录峰面积，计算RSD％。结果番泻苷A的RSD％为0.13％，番泻苷B的RSD％为0.66％，由此可知供试品溶液在24小时内稳定，能满足测定需要。
[0097] 通过以上方法学考察，可以看出本发明所述方法具有较好的准确性，可以真实的反映样品中的含量，方法可靠。
[0098] 实施例2 检测大黄原药材中的番泻苷A和番泻苷B的含量
[0099] 供试品：大黄原药材，产地：四川省阿坝州理塘县；
[0100] 对照品：番泻苷A(批号13122701，供含量测定用以98.58％计)，番泻苷B(批号13062606，供含量测定用以98.35％计)，由成都普瑞法生物科技公司提供；
[0101] Waters Acquity超高效液相色谱仪(美国沃特世公司)，配有Waters PDA Detector(二极管阵列检测器)，自动进样器，Empower 2色谱工作站，Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)，XS-205电子天平(METTLER TOLEDO)，AL-204电子天平(METTLER TOLEDO)，超声仪(南京新辰生物科技有限公司，40KHz)。
[0102] a.确定色谱条件:
[0103] 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；
[0104] 流动相：以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相；
[0105] 流动相流速：0.2ml/min；
[0106] 梯度洗脱条件：0～5min：8→12(A)，5～10min：12→13(A)，10～15min：13→15(A)，15～20min：15→17(A)，20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)；
[0107] 检测波长：340nm；
[0108] 柱温：30℃；
[0109] 进样量：2.0μl；
[0110] 理论塔板数按番泻苷A计算应不低于10000；
[0111] b.番泻苷A、番泻苷B的对照品溶液的配制：
[0112] 以含有0.1％NaHCO3的40％甲醇水溶液作溶剂；精密称取番泻苷A、番泻苷B对照品置于棕色容量瓶，配制成浓度为74μg/ml、46μg/ml的混合对照品溶液。
[0113] c.待测供试品溶液的配制：
[0114] 取大黄粉末0.20g(过四号筛)，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，精密加入含有0.1％NaHCO3的水溶液30ml，称定重量，超声处理40分钟(控制水温30℃以下)，再称定重量，用0.1％NaHCO3水溶液补足减失的重量，离心5分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
[0115] d.供试品含量测定：
[0116] 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液2.0μl进样测定，结果如图1显示。图1和图2分别显示了对照品溶液和大黄供试品溶液的色谱图：1—番泻苷B；2---番泻苷A。
[0117] 根据测得的峰面积按照公式1计算供试品中番泻苷A的含量：0.592％、番泻苷B的含量：0.224％。
[0118] -----公式1
[0119] 式中AX为供试品的峰面积；AR为对照品的峰面积；cX为供试品的浓度；cR为对照品的浓度。
[0120] 实施例3 检测番泻叶药材中的番泻苷A和番泻苷B的含量
[0121] 供试品：番泻叶供试品(购买于解放军第三0二医院中药房，产地云南昭通)[0122] 对照品：番泻苷A(批号13122701，供含量测定用以98.58％计)，番泻苷B(批号13062606，供含量测定用以98.35％计)，由成都普瑞法生物科技公司提供；
[0123] Waters Acquity超高效液相色谱仪(美国沃特世公司)，配有Waters PDA Detector(二极管阵列检测器)，自动进样器，Empower 2色谱工作站，Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)，XS-205电子天平(METTLER TOLEDO)，AL-204电子天平(METTLER TOLEDO)，超声仪(南京新辰生物科技有限公司，40KHz)。
[0124] a.确定色谱条件:
[0125] 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；
[0126] 流动相：以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相；
[0127] 流动相流速：0.2ml/min；
[0128] 梯度洗脱条件：0～5min：8→12(A)，5～10min：12→13(A)，10～15min：13→15(A)，15～20min：15→17(A)，20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)；
[0129] 检测波长：340nm；
[0130] 柱温：30℃；
[0131] 进样量：2.0μl；
[0132] 理论塔板数按番泻苷A计算应不低于10000；
[0133] b.番泻苷A、番泻苷B的对照品溶液的制备：
[0134] 以含有0.1％NaHCO3的40％甲醇水溶液作溶剂；精密称取番泻苷A、番泻苷B对照品适量置于棕色容量瓶，配制成浓度为74μg/ml、46μg/ml的混合对照品溶液。
[0135] c.番泻叶供试品溶液制备方法：
[0136] 取番泻叶粉末约0.20g(过四号筛)，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，精密加入0.1％NaHCO3水溶液30ml，称定重量，超声40分钟(控制水温30℃以下)，再称定重量，用
0.1％NaHCO3水溶液补足减失的重量，离心5分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
0.1％NaHCO3水溶液补足减失的重量，离心5分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
[0137] d.供试品含量测定：
[0138] 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，测定色谱峰面积，结果如图3显示。图3显示了番泻叶供试品溶液的色谱图(C)340nm：1—番泻苷B；2---番泻苷A。
[0139] 根据公式I计算即得番泻苷A含量：0.943％；番泻苷B含量：0.572％。
[0140] 实施例4 检测含有大黄的复方制剂-排毒养颜胶囊中的番泻苷A和番泻苷B含量
[0141] 供试品：排毒养颜胶囊供试品(市售，商品名：盘龙云海)
[0142] 对照品：番泻苷A(批号13122701，供含量测定用以98.58％计)，番泻苷B(批号13062606，供含量测定用以98.35％计)，由成都普瑞法生物科技公司提供；
[0143] Waters Acquity超高效液相色谱仪(美国沃特世公司)，配有Waters PDA Detector(二极管阵列检测器)，自动进样器，Empower 2色谱工作站，Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)，XS-205电子天平(METTLER TOLEDO)，AL-204电子天平(METTLER TOLEDO)，超声仪(南京新辰生物科技有限公司，40KHz)。
[0144] a.确定色谱条件:
[0145] 色谱柱：Acquity BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；
[0146] 流动相：以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相；
[0147] 流动相流速：0.2ml/min；
[0148] 梯度洗脱条件：0～5min：8→12(A)，5～10min：12→13(A)，10～15min：13→15(A)，15～20min：15→17(A)，20～25min：17→21(A)，25～30min：21→60(A)；
[0149] 检测波长：340nm；
[0150] 柱温：30℃；
[0151] 进样量：2.0μl；
[0152] 理论塔板数按番泻苷A计算应不低于10000；
[0153] b.番泻苷A、番泻苷B的对照品溶液的制备：
[0154] 以含有0.1％NaHCO3的40％甲醇水溶液作溶剂；精密称取番泻苷A、番泻苷B对照品适量置于棕色容量瓶，配制成浓度为74μg/ml、46μg/ml的混合对照品溶液。
[0155] c.排毒养颜胶囊供试品溶液制备方法：
[0156] 取排毒养颜胶囊粉末约0.20g，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，精密加入0.1％NaHCO3水溶液30ml，称定重量，超声40分钟(控制水温30℃以下)，再称定重量，用0.1％NaHCO3水溶液补足减失的重量，离心5分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
[0157] d.供试品含量测定：
[0158] 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，测定色谱峰面积，结果如图4显示。图4显示了排毒养颜胶囊供试品溶液的色谱图(D)340nm：1—番泻苷B；2---番泻苷A。
[0159] 根据公式I计算即得番泻苷A含量：0.116％；番泻苷B含量：0.072％。
[0160] 实施例5 本发明方法经过转换成为常规高效液相色谱法(UPLC转换为HPLC法)[0161] 鉴于目前多数科研机构和国家药品检验机构使用常规高效液相色谱法(即HPLC法)，本发明所述方法经过Acquiy软件转换成为HPLC法同样具有适用性、准确性、耐用性。方法详述如下：
[0162] 供试品：大黄供试品(购买于解放军第三0二医院中药房，产地：甘肃省礼县铨水乡)
[0163] 对照品：番泻苷A(批号13122701，供含量测定用以98.58％计)，番泻苷B(批号13062606，供含量测定用以98.35％计)，由成都普瑞法生物科技公司提供；
[0164] Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，配有1200 DAD Detector(二极管阵列检测器)，自动进样器，ZORBAX Eclipse Plus C18柱(5μm，4.6×250mm)，XS-205电子天平(METTLER TOLEDO)，AL-204电子天平(METTLER TOLEDO)，超声仪(南京新辰生物科技有限公司，40KHz)。
[0165] a.确定色谱条件：
[0166] 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(5μm，4.6×250mm)；
[0167] 流动相：以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相；
[0168] 流动相流速：1ml/min；
[0169] 梯度洗脱条件：0～12min：8→12(A)，12～25min：12→13(A)，25～37min：13→15(A)，37～50min：50→17(A)，50～62min：17→21(A)，62～75min：21→60(A)；
[0170] 检测波长：340nm；
[0171] 柱温：30℃；
[0172] 进样量：10μl；
[0173] b.番泻苷A、番泻苷B的对照品溶液的制备：
[0174] 以含有0.1％NaHCO3的40％甲醇水溶液作溶剂；精密称取番泻苷A、番泻苷B对照品适量置于棕色容量瓶，配制成浓度为74μg/ml、46μg/ml的混合对照品溶液。
[0175] c.大黄供试品溶液制备方法：
[0176] 取大黄粉末约0.20g(过四号筛)，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，精密加入0.1％NaHCO3水溶液30ml，称定重量，超声40分钟(控制水温30℃以下)，再称定重量，用
0.1％NaHCO3水溶液补足减失的重量，离心5分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
0.1％NaHCO3水溶液补足减失的重量，离心5分钟，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
[0177] d.供试品含量测定：
[0178] 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰面积，结果如图5显示。图5显示了经过转换为高效液相色谱法(HPLC)后大黄供试品溶液的色谱图：1—番泻苷B；2---番泻苷A。
[0179] 根据公式I计算即得番泻苷A含量：0.127％；番泻苷B含量：0.068％。
[0180] 实施例6 本发明的方法与现有方法的比较
[0181] 按照文献[6、7]中的检测方法、本发明实施例2的UPLC法、本发明实施例5的HPLC法对同一批次(一式五份)大黄药材中的番泻苷A、B的含量进行测定，通过比较来考察本发明所述方法的准确性。
[0182] 常规含有四庚基溴化铵的醋酸钠缓冲盐溶液或者四氢呋喃的流动相色谱条件按照文献[6、7]中的记载进行，只是所用色谱仪器和色谱柱为：Agilent 1260series；Eclipse plus C18柱。UPLC法按实施例2的方法进行。HPLC法按实施例5的方法进行。
[0183] 表1 四种方法对5批不同产地大黄药材中番泻苷A、番泻苷B含量测定结果(％)(n＝2)
[0184]
[0185] 从测定结果可以看出，本发明所述UPLC法和经过转换的HPLC法与现有文献报道(文献6、7)的采用四氢呋喃法、四庚基溴化铵法相比，具有更高的准确性(针对同一批次样品，本方法测定得到的含量比文献报道的方法测定的含量更高，本方法的准确性已经在实施例1中得到验证)，可以更好、更真实的反映出大黄药材中番泻苷A、番泻苷B的含量，这对于大黄药材临床安全、合理用药具有重要意义。
[0186] 表2 按照文献[8，9，10]中的方法和本发明实施例2的方法获得的分离参数的对比
[0187]
[0188] 通过表2可以看出：根据2010版《中国药典》附录有关“色谱检测方法的方法学验证”，本发明方法得到的目标色谱峰和杂质色谱峰的分离度＞1.5，色谱峰纯度＜1.0，分离时间＜30分钟；图6、7的色谱峰纯度图进一步证明了本发明所述方法测的番泻苷A、B含量的准确性，这是现有文献报道方法从未证明的。以上图表数据证明本发明的色谱分离参数均符合中国药典相关要求，且比现有文献报道方法较优。
[0189] 以上所述仅为本申请的优选实施例，并非对本申请作出任何形式上和实质上的限制。本领域的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，当可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更改、修饰与演变的等同变化均为本申请的等效实施例；同时，凡依据本申请的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更改、修饰与演变等均在本申请的由权利要求界定的范围内。
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