一种大岛樱成年优良单株“小乔”樱的高效离体植株再生方法
阅读：96发布：2023-02-25
专利汇可以提供一种大岛樱成年优良单株“小乔”樱的高效离体植株再生方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法。本发明通过基本培养基设置、不同 激素 成份及浓度 水 平配比优化，以成年优株当年生新梢为外植体，经 腋芽 诱导、腋芽增殖和生根培养，形成完整植株，移栽到基质后，得到生长整齐、表型一致的健壮苗木。本发明具有外植体的腋芽速度快；诱导率高、达100％；增殖系数大、达4.5以上，增殖芽伸长生长快，培养15d芽高达3～4cm；生根率可达100％，每株平均根数5条以上；组培生根苗健壮、移栽成活率高。在实际生产应用中可进行周年规模化快速育苗，生产出健壮、整齐一致的‘小乔’樱 幼苗 ，应用前景广阔。，下面是一种大岛樱成年优良单株“小乔”樱的高效离体植株再生方法专利的具体信息内容。
1.一种大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、腋芽诱导：于春季，剪取‘小乔’樱成年优树母株上当年生半木质化新梢作为外植体，经消毒后接种到诱导培养基上培养得到腋芽，所述的诱导培养基为，每升含有6-BA 1.0～
2.0mg、NAA 0.05～0.2mg、蔗糖25～40g、常量的琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～
6.0；
b、增殖培养：将腋芽切下接种到增殖培养基上培养得到增殖苗，所述的增殖培养基为，每升含有6-BA 0.5～1.5mg、NAA 0.05～0.1mg、蔗糖25～40g、常量的琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～6.0；
c、生根培养：从增殖苗中切取嫩茎接种到生根培养基中培养得到生根苗，所述的生根培养基为，每升含有NAA 0.5～1.5mg、蔗糖15～20g、常量的琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～6.0；
将生根苗移到温室中炼苗，然后取出幼苗，洗净黏在苗上的培养基，移植到按体积比泥炭土：黄泥：蛭石＝2:1:1的混合基质中，进行培养管理，得到‘小乔’樱种苗；
所述的XMD 培养基，每升含有NH4NO3800mg、KNO3400mg、CaCl2·2H2O 200mg、Ca(NO3)2·2H2O 200mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4170mg、MnSO4·4H2O 22.3mg、ZnSO4·7H2O
8.6mg、H3BO39.3mg、KI 0.83mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.05mg、CoCl20.025mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2·EDTA·H2O 37.3mg、Myo-Inositol 100mg、Glycine2mg、Thiamine·HCl 0.1mg、Nicotinic·acid 0.5mg、Pyridoxine·HCl 0.5mg，余量为水，pH
5.8。
2.根据权利要求1所述的大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，其特征在于，所述的剪取‘小乔’樱母株上当年生半木质化新梢作为外植体是在剪取外植体前，每隔10d用多菌灵、百菌清交替喷洒所选‘小乔’樱成年优树母株树体4～5次，然后剪取‘小乔’樱母株上当年生半木质化新梢作为外植体，除叶，用纯净水清洗干净作为外植体，低温保湿备用。
3.根据权利要求1所述的大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，其特征在于，所述的消毒为：将外植体用质量分数0.5％～1％新洁尔灭溶液浸泡7～8min，倒掉新洁尔灭溶液后，用无菌水冲洗3～4次，再用体积分数70～75％的酒精水溶液浸泡
20～30s，倒掉酒精水溶液后，加入质量分数0.05％～0.1％升汞溶液中，依据外植体幼嫩程度浸泡1～5min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液，再用无菌水冲洗5～6次，得到消毒后的外植体。
4.根据权利要求1所述的大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，其特征在于，所述的消毒后接种到诱导培养基上是将消毒后的外植体用无菌刀片切除叶柄、茎段两端受伤部位后，再接种到诱导培养基上。
5.根据权利要求1所述的大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，其特征在于，所述的步骤b的增殖培养是将腋芽切下，接种到增殖培养基上培养，腋芽分化形成新芽丛，将新芽丛中的芽高≥3cm的幼嫩枝条切割成1.0～1.5cm的茎段转再接入到新的增殖培养基中培养得到增殖苗，所述的增殖培养基为，每升含有6-BA 0.5～1.5mg、NAA0.05～0.1mg、蔗糖25～40g、常量的琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～6.0。
一种大岛樱成年优良单株“小乔”樱的高效离体植株再生
方法
技术领域：
[0002] 大岛樱(Cerasus lannesiana var.speciosa)隶属蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)，原产日本，主要分布在伊豆半岛。大岛樱既是良好的观赏植物，亦是传统食材。其叶片具有特殊芳香气味，是日本人喜爱的传统食品材料，市场供不应求，寄望于通过进口樱叶满足本国市场需求。鉴于大岛樱的经济价值，广东佛山市林科所和都江堰市先后从日本引种栽培，用于园林观赏和收叶加工成半成品返销日本。由于引种环境条件、繁殖及栽培技术等因素的影响，一直制约着其栽植规模。‘小乔’樱是广州天适集团有限公司从大岛樱中选育出的适合广东地区种植的优良观赏品种，其春芽绿色，花蕾白色至粉红色、花瓣白色、边缘或带红晕，花径3.0～3.8cm；花芳香，2～5朵一束；花期2月下旬至3月中下旬。
‘小乔’樱喜欢微酸性土壤、喜水、喜肥、喜阳光，但忌积水，最适生长温度为15℃～28℃，在广州、深圳、从化、东莞、清远、韶关等地均能正常越夏，生长正常，花开旺盛，成为华南地区观赏樱花的重要品种，开发前景广阔。
‘小乔’樱喜欢微酸性土壤、喜水、喜肥、喜阳光，但忌积水，最适生长温度为15℃～28℃，在广州、深圳、从化、东莞、清远、韶关等地均能正常越夏，生长正常，花开旺盛，成为华南地区观赏樱花的重要品种，开发前景广阔。
[0003] ‘小乔’樱是从大岛樱中选育出来的优良观赏品种，其繁殖方法可参考大岛樱的繁殖方式。大岛樱常规繁殖采用种子育苗，但由于大岛樱原产日本，结实率低，种子发芽率低、仅为30％左右。其实生苗性状分化大，不稳定，为保证‘小乔’樱的优良特性，不宜通过种子繁殖。大岛樱生产上可以通过扦插进行繁殖，扦插基质、插穗来源、木质化程度、激素处理浓度等对 扦插成活率影响很大，其中插嫩枝扦插成活率大大高于硬枝扦插成活率，如采取组培苗嫩枝进行扦插的生根率(>79％)高于实生苗插条扦插的生根率(47.8％)。‘小乔’樱繁育过程中同样存在扦插成活率极低的问题、扩繁速度慢，严重制约着其快速推广。以‘小乔’樱为母本进行组培规模化育苗，实现良种无性化推广，是‘小乔’樱产业化开发的重要途径。
[0004] 大岛樱的组织培养技术报道很少，目前仅有两篇(大岛樱的组织培养与繁殖，1994，周志坚等；大岛樱的工厂化育苗技术，1996，刘颂颂等)，这两篇报道所述大岛樱的组培技术相同，主要区别在于所用母本材料不同，前者所用母本材料为2株实生小苗，后者所用母本材料为扦插繁殖的大岛樱小苗(穗条来自前者组培出来的一年生组培苗)。从以上研究报道中可见，大岛樱组织培养技术尚存在以下不足：①组培用的母本材料为实生小苗或者扦插繁殖小苗，不是经过长期选择的成年优树；②继代周期长，25～30d；③继代培养的芽小，仅5～10mm高，不能直接用于生根培养。④生根培养过程复杂，效率低，需先将继代小芽进行壮芽培养10～15d，待芽能长到2～3cm，再转入生根培养基中进行生根培养，壮苗率低，仅有60％的继代芽能伸长；⑤继代芽衰退快，继代15～16次后，增殖率减小，继代芽质量下降，需重新更换材料。⑥应用该技术进行组培快繁，速度慢，成本高，难以实现规模化。⑦由于幼树与成年大树的生理状态不同，以幼树为母本材料的组培方案不一定能适用于成年大树，这在很多树种上都存在。经验证，利用该组织培养方案对‘小乔’成年优树当年生半木质化嫩枝进行组织培养，增殖培养的芽伸长慢、质量差、增殖倍率低，玻璃化现象严重、生根率低，技术不稳定。
发明内容：
发明内容：
[0005] 本发明的目的是针对‘小乔’樱现有组织培养技术中存在的成年优树组培繁殖无菌系建立 困难，增殖培养的芽伸长慢、质量差、玻璃化现象严重、继代周期长，生根培养过程复杂、生根率低，技术不稳定等技术问题，而提供一种大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，该方法具有不定芽诱导快、增殖倍率高、芽粗壮伸长快、生根率高、生根苗根系发达健壮、移栽成活率等特点。
[0006] 本发明以大岛樱成年优良单株‘小乔’樱当年生半木质化嫩枝为外植体，通过基本培养基设计、激素种类、浓度及其配比的优化，建立其高效、稳定的离体植株再生技术，达到增殖芽健壮伸长生长快、继代周期短、增殖率高、生根率高、生根苗健壮、移栽成活率高的目的。通过规模化育苗进行无性化推广，将为广东乃至华南地区园林绿化、美化所需优质樱花种苗的繁殖提供技术支撑，经济效益巨大。
[0007] 本发明的大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008] a、腋芽诱导：于春季，剪取‘小乔’樱成年优树母株上当年生半木质化新梢作为外植体，经消毒后接种到诱导培养基上培养得到腋芽，培养条件为：25±2℃，光照强度-2 -160μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的诱导培养基为，每升含有6-BA 1.0～2.0mg、NAA
0.05～0.2mg、蔗糖25～40g、常量的琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～6.0；
0.05～0.2mg、蔗糖25～40g、常量的琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～6.0；
[0009] b、增殖培养：将腋芽切下接种到增殖培养基上培养得到增殖苗，培养条件为：-2 -1
25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的增殖培养基为，每升含有6-BA
0.5～1.5mg、NAA 0.05～0.1mg、蔗糖25～40g、常量琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～
6.0；
25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的增殖培养基为，每升含有6-BA
0.5～1.5mg、NAA 0.05～0.1mg、蔗糖25～40g、常量琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～
6.0；
[0010] c、生根培养：从增殖苗中切取嫩茎接种到生根培养基中培养得到生根苗，培养条-2 -1件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的生根培养基为，每升含有NAA 0.5～1.5mg、蔗糖15～20g、常量琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～6.0；
[0012] 所述的XMD培养基，每升含有NH4NO3800mg、KNO3400mg、CaCl2·2H2O 200mg、Ca(NO3)2·2H2O 200mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4170mg、MnSO4·4H2O 22.3mg、ZnSO4·7H2O8.6mg、H3BO39.3mg、KI 0.83mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.05mg、CoCl20.025mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2·EDTA·H2O 37.3mg、Myo-Inositol 100mg、Glycine2mg、Thiamine·HCl 0.1mg、Nicotinic·acid 0.5mg、Pyridoxine·HCl 0.5mg，余量为水，pH
5.8。该XMD培养基是根据‘小乔’樱成年大树生理状态、离体培养的营养需求而设计的XMD基本培养基。
5.8。该XMD培养基是根据‘小乔’樱成年大树生理状态、离体培养的营养需求而设计的XMD基本培养基。
[0013] 所述的剪取‘小乔’樱母株上当年生半木质化新梢作为外植体优选在剪取外植体前，每隔10d用多菌灵、百菌清交替喷洒所选‘小乔’樱成年优树母株树体4～5次，然后剪取‘小乔’樱母株上当年生半木质化新梢作为外植体，除叶，用纯净水清洗干净作为外植体，低温保湿备用。
[0014] 所述的消毒优选为：将外植体用质量分数0.5％～1％新洁尔灭溶液浸泡7～8min，倒掉新洁尔灭溶液后，用无菌水冲洗3～4次，再用体积分数70～75％的酒精水溶液浸泡20～30s，倒掉酒精水溶液后，加入质量分数0.05％～0.1％升汞溶液中，依据外植体幼嫩程度浸泡1～5min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液，再用无菌水冲洗5～6次，得到消毒后的外植体。
[0015] 所述的消毒后接种到诱导培养基上优选是将消毒后的外植体用无菌刀片切除叶柄、茎段两端受伤部位后，再接种到诱导培养基上。
[0016] 所述的增殖培养优选是将腋芽切下，接种到增殖培养基上培养，腋芽分化形成新芽丛，将新芽丛中的芽高≥3cm的幼嫩枝条切割成1.0～1.5cm的茎段转再接入到新的增-2 -1殖培养基中培养得到增殖苗，培养条件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间
12h/d，所述的增殖培养基为，每升含有6-BA 0.5～1.5mg、NAA 0.05～0.1mg、蔗糖25～
40g、常量琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～6.0。
12h/d，所述的增殖培养基为，每升含有6-BA 0.5～1.5mg、NAA 0.05～0.1mg、蔗糖25～
40g、常量琼脂，余量为XMD培养基，pH为5.8～6.0。
[0017] 本发明通过基本培养基(XMD培养基，专门针对根据‘小乔’樱成年大树生理状态、离体培养的营养需求而设计的)设置、不同激素成份及浓度水平配比优化，以成年优株当年生半木质化新梢为外植体，经腋芽诱导、腋芽增殖和生根培养，形成完整植株，移栽到基质后，得到生长整齐、表型一致的健壮苗木。本发明具有外植体的腋芽速度快；诱导率高、达100％；增殖系数大、达4.5以上，增殖芽伸长生长快，培养15d芽高达3～4cm；生根率可达
100％，每株平均根数5条以上；组培生根苗健壮、移栽成活率高。在实际生产应用中可进行周年规模化快速育苗，生产出健壮、整齐一致的‘小乔’樱幼苗，应用前景广阔。
100％，每株平均根数5条以上；组培生根苗健壮、移栽成活率高。在实际生产应用中可进行周年规模化快速育苗，生产出健壮、整齐一致的‘小乔’樱幼苗，应用前景广阔。
[0018] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：诱导速度快、诱导率高；增殖系数大、丛芽粗壮、伸长生长快；生根率高，根系发达，生根苗粗壮、移栽成活率高，苗木生长健壮整齐。通过规模化育苗，将为‘小乔’樱无性化推广提供技术支持，为广东乃至华南地区园林绿化供优质种苗保障，有着极其重大的意义。附图说明：
[0019] 图1和图2是优树无菌材料的不定芽芽诱导；
[0020] 图3是增殖培养基中的增殖芽；
[0021] 图4是增殖芽的芽高测量；
[0022] 图5是生根培养基中的生根苗根系；
[0023] 图6是组培生根苗；
[0024] 图7是生根苗移栽5周后。具体实施方式：
[0025] 下面结合实施例对本发明进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所述技术领域的普通实验人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0026] 以下实施例中的XMD培养基，其组成成份如表1所示。
[0027] 表1XMD培养基的组成成分一览表
[0028]
[0029] 所述的XMD培养基，每升含有NH4NO3800mg、KNO3400mg、CaCl2·2H2O 200mg、Ca(NO3)2·2H2O 200mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4170mg、MnSO4·4H2O 22.3mg、ZnSO4·7H2O8.6mg、H3BO39.3mg、KI 0.83mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.05mg、 CoCl20.025mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2·EDTA·H2O 37.3mg、Myo-Inositol 100mg、Glycine 2mg、Thiamine·HCl 0.1mg、Nicotinic·acid 0.5mg、Pyridoxine·HCl 0.5mg，余量为水，pH
5.8。其配制方法是按照上述配方的成分和含量，将上述成分混合均匀，调pH 5.8、121℃灭菌15～20min，得到XMD培养基，备用。
5.8。其配制方法是按照上述配方的成分和含量，将上述成分混合均匀，调pH 5.8、121℃灭菌15～20min，得到XMD培养基，备用。
[0030] 实施例1：
[0031] 一种大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，包括如下步骤：
[0032] (1)外植体采集：3～5月份天气晴朗的上午10时左右，从‘小乔’樱母株(树龄十年以上的成年优树)上剪取当年生生长健壮、无病虫害的半木质化新梢，保湿处理后带回实验室，将采集后的半木质化新梢除叶，用纯净水清洗干净后作为外植体置4℃冰箱保存备用。采集外植体前，每隔10d用多菌灵、百菌清交替喷洒萌枝4～5次。
[0033] (2)外植体表面消毒：将枝条(外植体)剪成4cm左右长的带叶腋茎段，在超净工作台上先用无菌水摖洗干净，再用质量分数0.5％新吉尔灭溶液浸泡7min，倒掉新吉尔灭溶液后，用无菌水冲洗3次，加入体积分数70％的酒精水溶液中浸泡20s，倒掉酒精水溶液后，再加入质量分数0.1％升汞溶液，视幼嫩程度浸泡1～5min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后，再用无菌水冲洗6次。无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，用无菌刀片切除叶柄、茎段两端受伤部位后，再将茎段切成2cm带叶腋切断备用，得到消毒好的带叶腋切断。
[0034] (3)腋芽诱导：将消毒好的带叶腋切断(外植体)接种到诱导培养基上培养，培养-2 -1条件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，每瓶接种一个外植体，3～4d之后，叶柄开始松动脱落，腋芽萌动，15d左右一个叶腋能萌出多个腋芽(图1、图2)，诱导率为100％， 所述的诱导培养基为，每升含有6-BA 1.5mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂6g(激素购自Sigma-Aldrich公司)，余量为XMD培养基，pH为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，由此得到腋芽。
[0035] (4)增殖培养：将诱导出的腋芽截成1.0～1.5cm的茎段转接入增殖培养基上培-2 -1养，培养条件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的增殖培养基，每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g、琼脂6g，余量为XMD培养基，pH为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，15d后，单芽形成芽丛，芽伸长生长快，增殖系数(芽高≧2cm)高达4.5(图3、图4)，由此得到增殖苗。
[0036] (5)生根培养：从增殖苗选取健壮的有效芽(芽高超过2cm)切取转接到生根培养-2 -1基中培养，培养条件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的生根培养基为，每升含有NAA 1.0mg、蔗糖15g、琼脂6g，余量为XMD培养基，pH为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，15d后，不定根的诱导率为100％，每株平均生根数达5条以上(图5、图6)。
[0037] (6)炼苗与移栽：将生根瓶苗移到温室中适应外界环境5～7d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗1d，炼苗后将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满泥炭土:黄泥:蛭石＝2:1:1(体积比)混合基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1cm，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水。
[0038] (7)幼苗培育：移植后，对幼苗进行水分、肥及防病菌的管理：
[0040] B、肥及防病菌的管理：在移植后第三天用质量分数0.1％百菌清或多菌灵溶液喷雾消毒灭菌，之后每隔10d喷雾一次，百菌清和多菌灵交替使用；当有新芽萌发、新根长出时，喷施1500倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔15d喷施一次；
[0041] C、待生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，移栽后一个月成活率高于90％(图7)，待幼苗长至15cm高时(‘小乔’樱种苗)，可移至大田培育大苗。
[0042] 实施例2：
[0043] 一种大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，包括如下步骤：
[0044] (1)外植体采集：3～5月份天气晴朗的上午10时左右，从‘小乔’樱母株(树龄十年以上的优树)上剪取当年生生长健壮、无病虫害的半木质化新梢，保湿处理后带回实验室，将采集后的半木质化新梢除叶，用纯净水清洗干净后作为外植体置4℃冰箱保存备用。采集外植体前，每隔10d用多菌灵、百菌清交替喷洒萌枝4～5次。
[0045] (2)外植体表面消毒：将枝条(外植体)剪成4cm左右长的带叶腋茎段，在超净工作台上先用无菌水摖洗干净，再用质量分数1％新吉尔灭溶液浸泡8min，倒掉新吉尔灭溶液后，用无菌水冲洗4次，加入体积分数75％的酒精水溶液中浸泡30s，倒掉酒精水溶液后，再加入质量分数0.05％升汞溶液，视幼嫩程度浸泡1～5min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后，再用无菌水冲洗5次。无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，用无菌刀片切除叶柄、茎段两端受伤部位后，再将茎段切成2cm带叶腋切断备用，得到消毒好的带叶腋切断。
[0046] (3)腋芽诱导：将消毒好的带叶腋切断(外植体)接种到诱导培养基上培养，培-2 -1养条件 为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，每瓶接种一个外植体，
7d后，叶柄开始松动脱落，腋芽萌动，15d左右一个叶腋能萌出一个或多个腋芽，诱导率为
84％，所述的诱导培养基为，每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖25g、琼脂6g(激素购自Sigma-Aldrich公司)，余量为XMD培养基，pH为6(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，由此得到腋芽。
7d后，叶柄开始松动脱落，腋芽萌动，15d左右一个叶腋能萌出一个或多个腋芽，诱导率为
84％，所述的诱导培养基为，每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖25g、琼脂6g(激素购自Sigma-Aldrich公司)，余量为XMD培养基，pH为6(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，由此得到腋芽。
[0047] (4)增殖培养：将诱导出的腋芽截成1.0～1.5cm的茎段转接入增殖培养基上培-2 -1养，培养条件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的增殖培养基，每升含有6-BA 0.5mg、NAA 0.1mg、蔗糖25g、琼脂6g，余量为XMD培养基，pH为6(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，15d后，单芽形成芽丛，芽伸长生长较快，增殖系数(芽高≧2cm)达3.2，由此得到增殖苗。
[0048] (5)生根培养：从增殖苗选取健壮的有效芽(芽高超过2cm)切取转接到生根培养-2 -1基中培养，培养条件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的生根培养基为，每升含有NAA 0.5mg、蔗糖20g、琼脂6g，余量为XMD培养基，pH为6(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，15d后，不定根的诱导率为86％，每株平均生根数达5条以上。
[0049] (6)炼苗与移栽：将生根瓶苗移到温室中适应外界环境5～7d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗1d，炼苗后将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满泥炭土:黄泥:蛭石＝2:1:1(体积比)混合基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水。
[0050] (7)幼苗培育：移植后，对幼苗进行水分、肥及防病菌的管理：
[0051] A、水分管理：瓶苗在移植后基质保持湿润，空气相对湿度在80％～90％为宜，前5d可通过盖膜保湿，之后通过喷雾补水，控制培养温度25℃左右，荫棚用70％的遮阳网遮光；
[0052] B、肥及防病菌的管理：在移植后第三天用质量分数0.1％百菌清或多菌灵溶液喷雾消毒灭菌，之后每隔10d喷雾一次，百菌清和多菌灵交替使用；当有新芽萌发、新根长出时，喷施1500倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔15d喷施一次；
[0053] C、待生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，移栽后一个月成活率高于90％，待幼苗长至15cm高时(‘小乔’樱种苗)，可移至大田培育大苗。
[0054] 实施例3：
[0055] 一种大岛樱成年优良单株‘小乔’樱的高效离体植株再生方法，包括如下步骤：
[0056] (1)外植体采集：3～5月份天气晴朗的上午10时左右，从‘小乔’樱母株(树龄十年以上的优树)上剪取当年生生长健壮、无病虫害的半木质化新梢，保湿处理后带回实验室，将采集后的半木质化新梢除叶，用纯净水清洗干净后作为外植体置4℃冰箱保存备用。采集外植体前，每隔10d用多菌灵、百菌清交替喷洒萌枝4～5次。
[0057] (2)外植体表面消毒：将枝条(外植体)剪成4cm左右长的带叶腋茎段，在超净工作台上先用无菌水摖洗干净，再用质量分数0.5％新吉尔灭溶液浸泡7min，倒掉新吉尔灭溶液后，用无菌水冲洗3次，加入体积分数70％的酒精水溶液中浸泡30s，倒掉酒精水溶液后，再加入质量分数0.1％升汞溶液，视幼嫩程度浸泡1～5min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后，再用无菌水冲洗6次。无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，用无菌刀片切除叶柄、茎段两端受伤部位后，再将茎段切成2cm带叶腋切断备用，得到消毒好的带叶腋切断。
[0058] (3)腋芽诱导：将消毒好的带叶腋切断(外植体)接种到诱导培养基上培养，培-2 -1养条件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，每瓶接种一个外植体，7d之后，叶柄开始松动脱落，腋芽萌动，15d左右一个叶腋能萌出一个或多个腋芽，诱导率为
82％，所述的诱导培养基为，每升含有6-BA 2.0mg、NAA 0.05mg、蔗糖40g、琼脂6g(激素购自Sigma-Aldrich公司)，余量为XMD培养基，pH为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，由此得到腋芽。
82％，所述的诱导培养基为，每升含有6-BA 2.0mg、NAA 0.05mg、蔗糖40g、琼脂6g(激素购自Sigma-Aldrich公司)，余量为XMD培养基，pH为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，由此得到腋芽。
[0059] (4)增殖培养：将诱导出的腋芽截成1.0～1.5cm的茎段转接入增殖培养基上培-2 -1养，培养条件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的增殖培养基，每升含有6-BA 1.5mg、NAA 0.05mg、蔗糖40g、琼脂6g，余量为XMD培养基，pH为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，15d后，单芽形成芽丛，芽伸长生长较快，增殖系数(芽高≧2cm)达3.5，由此得到增殖苗。
[0060] (5)生根培养：从增殖苗选取健壮的有效芽(芽高超过2cm)切取转接到生根培养-2 -1基中培养，培养条件为：25±2℃，光照强度60μmol.m .s ，光照时间12h/d，所述的生根培养基为，每升含有NAA 1.5mg、蔗糖15g、琼脂6g，余量为XMD培养基，pH为5.8(其配制方法为：将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)，15d后，不定根的诱导率为79％，每株平均生根数达4条以上。
[0061] (6)炼苗与移栽：将生根瓶苗移到温室中适应外界环境5～7d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗1d，炼苗后将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满泥炭土:黄泥:蛭石＝2:1:1(体积比)混合基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水。
[0062] (7)幼苗培育：移植后，对幼苗进行水分、肥及防病菌的管理：
[0063] A、水分管理：瓶苗在移植后基质保持湿润，空气相对湿度在80％～90％为宜，前5d可通过盖膜保湿，之后通过喷雾补水，控制培养温度25℃左右，荫棚用70％的遮阳网遮光；
[0064] B、肥及防病菌的管理：在移植后第三天用质量分数0.1％百菌清或多菌灵溶液喷雾消毒灭菌，之后每隔10d喷雾一次，百菌清和多菌灵交替使用；当有新芽萌发、新根长出时，喷施1500倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔15d喷施一次；
[0065] C、待生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，移栽后一个月成活率高于90％，待幼苗长至15cm高时(‘小乔’樱种苗)，可移至大田培育大苗。
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