一种水稻育种方法
阅读：504发布：2021-10-29
专利汇可以提供一种水稻育种方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 水 稻育种方法。本发明保护一种在不影响农艺性状的前提下降低水稻籽粒镉含量的水稻育种方法，包括如下步骤：使水稻基因组中OsNramp5基因的特异外显子中发生移码突变；所述特异外显子为第9外显子或第10外显子或第11外显子或第12外显子或第13外显子。本发明证明OsNramp5移码突变导致突变体产量降低、品质下降与OsNramp5移码突变的 位置 有关；OsNramp5基因中第9外显子以及后续外显子的移码突变，在常规大田可以使突变体的产量和品质等重要性状保持野生型的水平。，下面是一种水稻育种方法专利的具体信息内容。
1.一种在不影响农艺性状的前提下降低水稻籽粒镉含量的水稻育种方法，包括如下步骤：使水稻基因组中OsNramp5基因的特异外显子中发生移码突变；所述特异外显子为第9外显子或第10外显子或第11外显子或第12外显子或第13外显子。
2.一种制备转基因水稻的方法，包括如下步骤：对出发水稻进行基因编辑，得到转基因水稻；所述基因编辑的靶标位于出发水稻的基因组中OsNramp5基因的特异外显子中；所述特异外显子为第9外显子或第10外显子或第11外显子或第12外显子或第13外显子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述基因编辑是通过Crispr/Cas9系统实现的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Crispr/Cas9系统的靶标如序列表的序列10所示。
5.如权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于：与出发水稻相比，所述转基因水稻的镉含量降低，其他农艺性状无显著差异。
6.用于对水稻进行基因编辑的物质在制备转基因水稻中的应用；所述基因编辑的靶标位于出发水稻的基因组中OsNramp5基因的特异外显子中；所述特异外显子为第9外显子或第10外显子或第11外显子或第12外显子或第13外显子。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述特异Crispr/Cas9系统的靶标如序列表的序列10所示。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于：与出发水稻相比，所述转基因水稻的镉含量降低，其他农艺性状无显著差异。
9.一种sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列10所示。
10.权利要求9所述sgRNA在制备转基因水稻中的应用。
一种水稻育种方法
技术领域
背景技术
[0002] 水稻是我国主要的粮食作物，同时是一种容易积累镉的植物。镉伴随水分和营养物质一起被水稻植株吸收，从而水稻中的镉含量增加，从而所产大米的镉含量也增加。人食用镉含量高的大米后，容易发生肾功能损伤、骨痛等病症。目前，稻米镉污染已严重挑战了食品安全，培育可以生产低镉含量籽粒的水稻具有重大的产业价值。
[0003] 垩白是稻米胚乳中白色不透明的部分，为胚乳淀粉粒之间存在空隙引起透光性改变所致。垩白度为稻米外观品质的重要指标之一，是稻米中垩白部位的面积占米粒投影面积的百分比；GB/T17891-2017国家标准规定：一级优质米垩白度≤2％，二级≤5％，三级≤8％，垩白度在8％以上为非优质稻谷。垩白粒率是指米粒中有垩白米粒的比率，为稻米重要品质指标，不仅关系到外观好看与否，而且对加工品质、蒸煮品质有很大影响；GB/T17891-
1999国家标准规定：一级优质米垩白粒率≤10％，二级≤20％，三级≤30％，垩白粒率在
30％以上为非优质稻谷。
1999国家标准规定：一级优质米垩白粒率≤10％，二级≤20％，三级≤30％，垩白粒率在
30％以上为非优质稻谷。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种水稻育种方法。
[0005] 本发明保护一种在不影响农艺性状的前提下降低水稻籽粒镉含量的水稻育种方法，包括如下步骤：使水稻基因组中OsNramp5基因的特异外显子中发生移码突变；所述特异外显子为第9外显子或第10外显子或第11外显子或第12外显子或第13外显子。
[0006] 本发明还保护一种制备转基因水稻的方法，包括如下步骤：对出发水稻进行基因编辑，得到转基因水稻；所述基因编辑的靶标位于出发水稻的基因组中OsNramp5基因的特异外显子中；所述特异外显子为第9外显子或第10外显子或第11外显子或第12外显子或第13外显子。
[0007] 所述基因编辑是通过Crispr/Cas9系统实现的。
[0009] 所述Crispr/Cas9系统的sgRNA具体如序列表的序列9所示。
[0010] 与出发水稻相比，所述转基因水稻的镉含量降低，其他农艺性状无显著差异。
[0011] 本发明还保护用于对水稻进行基因编辑的物质在制备转基因水稻中的应用；所述基因编辑的靶标位于出发水稻的基因组中OsNramp5基因的特异外显子中；所述特异外显子为第9外显子或第10外显子或第11外显子或第12外显子或第13外显子。
[0012] 所述用于对水稻进行基因编辑的物质为特异Crispr/Cas9系统。
[0013] 所述特异Crispr/Cas9系统的靶标(即sgRNA的靶序列)如序列表的序列10所示。
[0014] 所述特异Crispr/Cas9系统的sgRNA具体如序列表的序列9所示。
[0015] 与出发水稻相比，所述转基因水稻的镉含量降低，其他农艺性状无显著差异。
[0016] 本发明还保护一种sgRNA，其靶序列结合区如序列表的序列10所示。
[0017] 所述sgRNA具体如序列表的序列9所示。
[0018] 本发明还保护所述sgRNA在制备转基因水稻中的应用。与出发水稻相比，所述转基因水稻的镉含量降低，其他农艺性状无显著差异。
[0019] 所述水稻具体可为水稻品种黄华占。
[0020] 以上任一所述无显著差异指的是在统计学上无显著差异。
[0021] 以上任一所述无显著差异是基于EXCEL上的函数“T-TEST”来判断的。
[0022] 以上任一所述OsNramp5基因为编码OsNramp5蛋白的基因。
[0023] 所述OsNramp5蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
[0024] (a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
[0025] (a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0026] (a3)来源于水稻且与(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
[0027] 所述OsNramp5基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
[0028] (b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
[0029] (b2)序列表的序列3所示的DNA分子；
[0030] (b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述OsNramp5蛋白的DNA分子；
[0031] (b4)来源于水稻且与(b1)或(b2)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述OsNramp5蛋白的DNA分子。
[0032] 所述第9外显子如序列表的序列3第3245-3418位所示。
[0033] 所述第10外显子如序列表的序列3第3701-3805位所示。
[0034] 所述第11外显子如序列表的序列3第4792-4923位所示。
[0035] 所述第12外显子如序列表的序列3第5520-5615位所示。
[0036] 所述第13外显子如序列表的序列3第6575-6907位所示。
[0037] 以上任一所述特异Crispr/Cas9系统具体可为重组质粒TS3-4。
[0038] 重组质粒TS3-4的构建方法包括如下步骤：
[0039] ①用限制性内切酶BsaI酶切序列表的序列8所示的DNA分子，回收酶切产物；②用限制性内切酶BsaI酶切pYLCRISPR/Cas9-MH载体，回收载体骨架；③将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒TS3-4。
[0040] 以上所述其他农艺性状为：千粒重、穗粒数、结实率、单株籽粒产量、单株稻草产量和籽粒品质。
[0041] 以上所述其他农艺性状为：千粒重(g)、穗粒数、结实率(％)、单株籽粒产量(g)、单株稻草产量(g)和籽粒品质。
[0042] 所述籽粒品质为：糙米率、精米率、整精米率、粒长、长宽比、直链淀粉含量、胶稠度、蛋白质含量、垩白度和垩白粒率。
[0043] 所述籽粒品质为：糙米率(％)、精米率(％)、整精米率(％)、粒长(mm)、长宽比(％)、直链淀粉含量(％)、胶稠度、蛋白质含量(％)、垩白度(％)和垩白粒率(％)。
[0044] 本发明证明OsNramp5不同位置的移码突变均可以极显著降低突变体籽粒Cd含量；而移码突变的位置与突变体产量降低、品质下降有关，随着OsNramp5序列移码突变位置的前移，产量呈现下降趋势，稻米品质中的垩白性状呈现上升趋势；OsNramp5第9外显子的移码突变，不仅可以极显著降低突变体籽粒的Cd含量，而且对突变体的产量和品质等重要性状没有显著的影响。由于在第9外显子中发生的移码突变可以产生上述效果，那么第9外显子以后的第10外显子、第11外显子、第12外显子或第13外显子中发生的移码突变理论上可能产生相同的效果。
[0045] 本发明证明OsNramp5不同位置的移码突变均可以极显著降低突变体籽粒Cd含量，而移码突变的位置与突变体产量降低、品质下降有关；OsNramp5第9外显子的移码突变，在常规大田可以使突变体的产量和品质等重要性状保持野生型的水平。
具体实施方式
[0046] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0047] 水稻品种黄华占，简称黄华占(籼稻)，属于感温型常规稻品种，用CK表示。
[0048] 黄华占中的OsNramp5蛋白如序列表的序列1所示。黄华占的cDNA中，编码OsNramp5蛋白的开放阅读框如序列表的序列2所示。黄华占的基因组DNA中OsNramp5基因如序列表的序列3所示(存在13个外显子，依次为序列表的序列3中第96-206位、第475-553位、第662-702位、第1001-1079位、第1162-1266位、第2264-2373位、第2600-2781位、第2885-2954位、第3245-3418位、第3701-3805位、第4792-4923位、第5520-5615位、第6575-6907位)。
[0049] pYLgRNA-U3载体和pYLCRISPR/Cas9-MH载体均记载于如下文献：水稻穗发育基因OsD1功能的初步分析，邓尧等，杂交水稻(HYBRID RICE)，2018，33(5)：44-50。
[0050] 实施例1、转基因水稻的制备
[0051] 一、靶点的选择以及重组质粒的构建
[0052] 1、靶点的选择
[0053] 共选择了3个用于Crispr/Cas9编辑的靶位点：靶位点1(TS1)位于第2外显子，序列为TTCCTTGCCCATGTTGGTCC，在Nramp结构域的前面；靶位点2(TS2)位于第6外显子，序列为GCACTCTACTGCTTCTTGGC，在Nramp结构域的前部；靶位点3(TS3)位于第9外显子，序列为GTACGAGAGCGGGTTCGCGC，在Nramp结构域的中部。
[0054] 2、重组质粒TS1-4的构建
[0055] (1)单链DNA分子TS1-F和单链DNA分子TS1-R退火，得到具有粘末端的双链DNA分子，将其命名为DNA分子TS1-1。
[0056] TS1-F：5′-ggcaTTCCTTGCCCATGTTGGTCC-3′；
[0057] TS1-R：5′-aaacGGACCAACATGGGCAAGGAA-3′。
[0058] (2)将DNA分子TS1-1与经限制性内切酶BsaI酶切后的pYLgRNA-U3载体连接，得到重组质粒，将其命名为重组质粒TS1-2。
[0059] (3)以重组质粒TS1-2为模板，采用引物Uctcg-B1和引物gRcggt-BL组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA分子TS1-3。经测序，DNA分子TS1-3如序列表的序列4所示。
[0060] Uctcg-B1：5′-TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′；
[0061] Rcggt-BL：5′-AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3。
[0062] (4)经限制性内切酶BsaI酶切后的DNA分子TS1-3与经限制性内切酶BsaI酶切后的pYLCRISPR/Cas9-MH载体连接，得到重组质粒，将其命名为重组质粒TS1-4。重组质粒TS1-4已进行测序验证。重组质粒TS1-4表达序列表的序列5所示的sgRNA。
[0063] 3、重组质粒TS2-4的构建
[0064] (1)单链DNA分子TS2-F和单链DNA分子TS2-R退火，得到具有粘末端的双链DNA分子，将其命名为DNA分子TS2-1。
[0065] TS2-F：5′-ggcaGCACTCTACTGCTTCTTGGC-3′；
[0066] TS2-R：5′-aaacGCCAAGAAGCAGTAGAGTGC-3′。
[0067] (2)将DNA分子TS2-1与经限制性内切酶BsaI酶切后的pYLgRNA-U3载体连接，得到重组质粒，将其命名为重组质粒TS2-2。
[0068] (3)以重组质粒TS2-2为模板，采用引物Uctcg-B1和引物gRcggt-BL组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA分子TS2-3。经测序，DNA分子TS2-3如序列表的序列6所示。
[0069] (4)经限制性内切酶BsaI酶切后的DNA分子TS2-3与经限制性内切酶BsaI酶切后的pYLCRISPR/Cas9-MH载体连接，得到重组质粒，将其命名为重组质粒TS2-4。重组质粒TS2-4已进行测序验证。重组质粒TS2-4表达序列表的序列7所示的sgRNA。
[0070] 4、重组质粒TS3-4的构建
[0071] (1)单链DNA分子TS3-F和单链DNA分子TS3-R退火，得到具有粘末端的双链DNA分子，将其命名为DNA分子TS3-1。
[0072] TS3-F：5′-ggcaGTACGAGAGCGGGTTCGCGC-3′；
[0073] TS3-R：5′-aaacGCGCGAACCCGCTCTCGTAC-3′。
[0074] (2)将DNA分子TS3-1与经限制性内切酶BsaI酶切后的pYLgRNA-U3载体连接，得到重组质粒，将其命名为重组质粒TS3-2。
[0075] (3)以重组质粒TS3-2为模板，采用引物Uctcg-B1和引物gRcggt-BL组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA分子TS3-3。经测序，DNA分子TS3-3如序列表的序列8所示。
[0076] (4)经限制性内切酶BsaI酶切后的DNA分子TS3-3与经限制性内切酶BsaI酶切后的pYLCRISPR/Cas9-MH载体连接，得到重组质粒，将其命名为重组质粒TS3-4。重组质粒TS3-4已进行测序验证。重组质粒TS3-4表达序列表的序列9所示的sgRNA。
[0077] 二、转基因水稻的制备
[0078] 将重组质粒TS1-4导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。将重组农杆菌与黄华占的胚性愈伤组织共培养，然后进行两轮筛选(均采用50mg/L浓度的潮霉素进行筛选)，然后依次进行分化和生根，得到再生植株(T0代植株)。提取再生植株幼苗的基因组DNA，通过PCR扩增靶点周边区段(采用dTS1-F和dTS1-R组成的引物对；dTS1-F：5’-CTTTCAGTCATTCAGTGCGTAA-3’；dTS1-R：5’-GCATGGCATTCATTGCTC-3’)，然后通过测序获知靶点区域的基因编辑情况。从T0代植株中筛选得到靶点区域发生移码突变的纯合突变体，命名为hhz1-T0植株。对于hhz1-T0植株，TS1的PAM前第四个碱基处插入T，导致OsNramp5蛋白在第49个氨基酸后发生变化，并在第76个氨基酸处终止，整个结构域完全缺失，也未保留一个完整的跨膜域。hhz1-T0植株自交并收获种子，将种子培育为植株即为T1代植株，从T1代植株中筛选不携带CAS9基因的植株。筛选不携带CAS9基因的植株的方法：以T1代植株的基因组DNA为模板，采用Cas9引物对(Cas9-F：5’-AGAATGGGCGGGATATGT-3’；Cas9-R：5’-GTGGGCGTGGTGGTAGTT-3’；靶序列约为506bp)进行PCR扩增，如果得到扩增产物、结果为阳性、植株携带CAS9基因，如果没有得到扩增产物、结果为阴性、植株不携带CAS9基因。不携带CAS9基因的T1代植株自交并收获种子，将种子培育为植株即为T2代植株，命名为LChhz1植株。
[0079] 将重组质粒TS2-4导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。将重组农杆菌与黄华占的胚性愈伤组织共培养，然后进行两轮筛选(均采用50mg/L浓度的潮霉素进行筛选)，然后依次进行分化和生根，得到再生植株(T0代植株)。提取再生植株幼苗的基因组DNA，通过PCR扩增靶点周边区段(采用dTS2-F和dTS2-R组成的引物对；dTS2-F：5’-ACTTGACAATCGATCCAACTAGC-3’；dTS2-R：5’-CGAAGCTTTGCTGATCGGG-3’)，然后通过测序获知靶点区域的基因编辑情况。从T0代植株中筛选得到靶点区域发生移码突变的纯合突变体，命名为hhz2-T0植株。对于hhz2-T0植株，TS2的PAM前第四个碱基处插入AA，导致OsNramp5蛋白在第164个氨基酸后发生变化，并在第176个氨基酸处终止，结构域剩余100aa，并保留了3个完整的跨膜域。hhz2-T0植株自交并收获种子，将种子培育为植株即为T1代植株，从T1代植株中筛选不携带CAS9基因的植株。筛选不携带CAS9基因的植株的方法：以T1代植株的基因组DNA为模板，采用Cas9引物对(Cas9-F：5’-AGAATGGGCGGGATATGT-3’；Cas9-R：5’-GTGGGCGTGGTGGTAGTT-3’；靶序列约为506bp)进行PCR扩增，如果得到扩增产物、结果为阳性、植株携带CAS9基因，如果没有得到扩增产物、结果为阴性、植株不携带CAS9基因。不携带CAS9基因的T1代植株自交并收获种子，将种子培育为植株即为T2代植株，命名为LChhz12植株。
[0080] 将重组质粒TS3-4导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。将重组农杆菌与黄华占的胚性愈伤组织共培养，然后进行两轮筛选(均采用50mg/L浓度的潮霉素进行筛选)，然后依次进行分化和生根，得到再生植株(T0代植株)。提取再生植株幼苗的基因组DNA，通过PCR扩增靶点周边区段(采用dTS3-F和dTS3-R组成的引物对；dTS3-F：5’-AGGAAGGAGGAGGTGTCGAG-3’；dTS3-R：5’-CTATCGAGGAAGACACCGGC-3’)，然后通过测序获知靶点区域的基因编辑情况。
从T0代植株中筛选得到靶点区域发生移码突变的纯合突变体，命名为hhz3-T0植株。对于hhz3-T0植株，TS3的PAM前第四个碱基处插入G，导致OsNramp5蛋白在第264个氨基酸处提前终止，结构域剩余200aa，并保留了6个完整的跨膜域。hhz3-T0植株自交并收获种子，将种子培育为植株即为T1代植株，从T1代植株中筛选不携带CAS9基因的植株。筛选不携带CAS9基因的植株的方法：以T1代植株的基因组DNA为模板，采用Cas9引物对(Cas9-F：5’-AGAATGGGCGGGATATGT-3’；Cas9-R：5’-GTGGGCGTGGTGGTAGTT-3’；靶序列约为506bp)进行PCR扩增，如果得到扩增产物、结果为阳性、植株携带CAS9基因，如果没有得到扩增产物、结果为阴性、植株不携带CAS9基因。不携带CAS9基因的T1代植株自交并收获种子，将种子培育为植株即为T2代植株，命名为LChhz3植株。
从T0代植株中筛选得到靶点区域发生移码突变的纯合突变体，命名为hhz3-T0植株。对于hhz3-T0植株，TS3的PAM前第四个碱基处插入G，导致OsNramp5蛋白在第264个氨基酸处提前终止，结构域剩余200aa，并保留了6个完整的跨膜域。hhz3-T0植株自交并收获种子，将种子培育为植株即为T1代植株，从T1代植株中筛选不携带CAS9基因的植株。筛选不携带CAS9基因的植株的方法：以T1代植株的基因组DNA为模板，采用Cas9引物对(Cas9-F：5’-AGAATGGGCGGGATATGT-3’；Cas9-R：5’-GTGGGCGTGGTGGTAGTT-3’；靶序列约为506bp)进行PCR扩增，如果得到扩增产物、结果为阳性、植株携带CAS9基因，如果没有得到扩增产物、结果为阴性、植株不携带CAS9基因。不携带CAS9基因的T1代植株自交并收获种子，将种子培育为植株即为T2代植株，命名为LChhz3植株。
[0081] 实施例2、镉含量以及农艺性状的检测
[0082] 供试材料为：黄华占植株、LChhz1植株、LChhz2植株、LChhz3植株，均为T2代植株。
[0083] 一、镉处理
[0084] 处理组甲：将培养20-30天的供试材料移栽到装有土壤甲的花盆中(取田间土壤，干燥至恒重，然后与氯化镉充分混匀，每0.8mg镉元素配比1kg干重的土壤，然后放置25天，即为土壤甲，每个花盆装入10kg土壤甲)，每种供试材料种植3盆，每盆3株，正常培养。
[0085] 处理组乙：将培养20-30天的供试植株移栽到装有土壤乙的花盆中(取田间土壤，干燥至恒重，然后与氯化镉充分混匀，每4.0mg镉元素配比1kg干重的土壤，然后放置25天，即为土壤乙，每个花盆装入10kg土壤乙)，每种供试材料种植3盆，每盆3株，正常培养。
[0086] 二、金属含量的检测
[0087] 步骤一的两个处理组，植株结实后，收取成熟籽粒，去壳，得到糙米。检测糙米中的镉元素含量(电感耦合等离子体质谱法)，即为籽粒镉含量。
[0088] 步骤一的两个处理组，植株结实后，收取成熟籽粒，剩余植株取地上部分，烘干至恒重，检测锰元素含量(电感耦合等离子体质谱法)，即为稻草锰含量。
[0089] 在0.8mg/kg土壤镉浓度处理下(处理组甲)，黄华占植株得到的糙米的镉含量为0.526mg/kg，LChhz1植株得到的糙米的镉含量为0.023mg/kg、LChhz2植株得到的糙米的镉含量为0.019mg/kg、LChhz3植株得到的糙米的镉含量为0.020mg/kg；3个突变体的籽粒镉含量远低于国家标准(≤0.2mg/kg)。
[0090] 在4.0mg/kg土壤镉浓度处理下(处理组乙)，黄华占植株得到的糙米的镉含量为1.248mg/kg，LChhz1植株得到的糙米的镉含量为0.053mg/kg、LChhz2植株得到的糙米的镉含量为0.056mg/kg、LChhz3植株得到的糙米的镉含量为0.045mg/kg；3个突变体的籽粒镉含量远低于国家标准(≤0.2mg/kg)。
[0091] 在0.8mg/kg土壤镉浓度处理下(处理组甲)，黄华占植株的稻草锰含量极显著高于LChhz1植株、LChhz2植株、LChhz3植株；而且LChhz1植株、LChhz2植株、LChhz3植株的稻草锰含量呈升高趋势。
[0092] 在4.0mg/kg土壤镉浓度处理下(处理组乙)，黄华占植株的稻草锰含量显著或极显著高于LChhz1植株、LChhz2植株、LChhz3植株；而且LChhz1植株、LChhz2植株、LChhz3植株的稻草锰含量呈升高趋势。
[0093] 三、产量性状
[0094] 步骤一的两个处理组，植株结实后，收取成熟稻穗进行考种。
[0095] 对于千粒重：LChhz1植株、LChhz2植株、LChhz3植株与黄华占植株相比均没有显著的差异。
[0096] 对于穗粒数、结实率、单株籽粒产量、单株稻草产量：LChhz1植株、LChhz2植株均比黄华占植株低，且达到了显著或极显著差异；LChhz3植株与黄华占植株相比没有显著差异。
[0097] 四、籽粒品质的影响
[0098] 步骤一的两个处理组，植株结实后，收取成熟籽粒，检测籽粒品质。
[0099] 籽粒品质包括：糙米率、精米率、整精米率、粒长、长宽比、直链淀粉含量、胶稠度、蛋白质含量、垩白度、垩白粒率。直链淀粉含量、胶稠度、蛋白质含量、垩白度的检测方法均见中华人民共和国国家标准GB/T17891-2017。垩白粒率的检测方法见中华人民共和国国家标准GB/T17891-1999。
[0100] 在0.8mg/kg土壤镉浓度处理下(处理组甲)：黄华占植株和LChhz1植株、LChhz2植株、LChhz3植株在糙米率、精米率、整精米率、粒长、长宽比、直链淀粉含量、胶稠度和蛋白质含量等指标上均没有显著差异。
[0101] 在4.0mg/kg土壤镉浓度处理下(处理组乙)：黄华占植株和LChhz1植株、LChhz2植株、LChhz3植株在糙米率、精米率、整精米率、粒长、长宽比、直链淀粉含量、胶稠度和蛋白质含量等指标上均没有显著差异。
[0102] 对于垩白度：在两种土壤镉浓度处理下，LChhz1植株分别比黄华占植株增加了1.35倍和1.17倍，LChhz2植株均明显高于黄华占植株且达到显著性差异，LChhz3植株未达到显著性差异。
[0103] 对于垩白粒率：在两种土壤镉浓度处理下，LChhz1植株分别比黄华占植株增加了2.28倍和2.17倍，LChhz2植株均明显高于黄华占植株且达到显著性差异，LChhz3植株低未达到显著性差异。
[0104] 处理组甲步骤二、步骤三、步骤四和步骤五的数据结果见表1(如果与黄华占植株相比差异显著，用粗体表示)。表1中，各个单元格中为3个数据和一个平均值，3个数据对应三个花盆(每个数据为该花盆中三株植株的平均值)，一个平均值为三个数据的平均值。
[0105] 处理组乙步骤二、步骤三、步骤四和步骤五的数据结果见表2(如果与黄华占植株相比差异显著，用粗体表示)。表2中，各个单元格中为3个数据和一个平均值，3个数据对应三个花盆(每个数据为该花盆中三株植株的平均值)，一个平均值为三个数据的平均值。
[0106] 利用3个重复的数据，根据EXCEL上的函数“T-TEST”来判断是否达到显著性差异。
[0107] 表1
[0108]
[0109] 表2
[0110]
[0111]
[0112] 以上研究表明，随着OsNramp5序列移码突变位置的前移，产量呈现下降趋势，垩白呈现上升趋势。由于OsNramp5第9外显子的移码突变，不仅可以极显著降低突变体籽粒Cd含量，而且未对突变体产量、品质产生明显的影响，因此第9-13外显子的序列可作为获得籽粒Cd低积累新品种突变OsNramp5靶位置的首选区间。
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