使用荧光剂进行染色之后在紫外激发的情况下使用荧光显微
镜控制组织中的成像深度的系统和方法
技术领域
[0001] 本公开内容涉及用于在短
波长(例如，紫外光)激发下、使用荧光
显微镜来对人和动物组织的结构和分子进行成像的系统和方法，并且更具体地涉及以下系统和方法，该系统和方法能够对厚组织样本进行光学切片以获得近表面组织微结构的高
分辨率图像，而不需要福尔
马林固定和
石蜡包埋(FFPE)，然后对组织样本进行切片机切片、或冷冻和切片，并且该系统和方法还能够与常规或新型的荧光染色剂和标记物一起使用，以使得能够对组织进行有效分析以用于诊断、组织成分和/或手术指导，例如监测活检样本的手术切缘区域是否存在
肿瘤细胞。
背景技术
[0002] 本节中的陈述仅提供与本公开内容相关的背景信息，而可能不会构成
现有技术。
[0003] 可以在细胞
水平对组织提供功能和结构成像的技术在各个领域中是非常重要的。特别地，在临床实践领域，长期以来被认为是金标准的
组织病理学诊断是基于对活检或手术
切除物的薄的、染色的组织样本、尸体剖验或尸检得到的样本进行成像，完成该过程可能需要数小时到几天。理想地，能够在体内或在移除样本后非常快速地获得
组织学、遗传或表型信息。我们将讨论快速显微系统的若干潜在应用领域，包括手术切缘评估、活检
质量控制、快速诊断和快速分子表征。这些特征对于临床病理学应用很重要，并且在
生物学、药理学和毒理学研究方面也很重要。此外，组织样本仍然可以在活生物体中原位存在，如对于
皮肤或
口腔粘膜，只要适当的成像光学元件可以接近其即可。
[0004] 手术切缘评估：对手术期间获得的活检的冷冻切片进行评估会是临床护理的常规部分，但是充满困难。这些困难包括取向、包埋、冷冻、切割、染色和观察所得染色切片所涉及的时间。对于每个样本而言，该过程可能需要10分钟或更长的时间。此外，大多数冷冻的样本的质量可能不是最佳的，并且通常低于福尔马林固定石蜡包埋(“FFPE”)的样本的质量。所造成的延误和分析挑战限制了术中活检或手术切缘评估的使用。因此，如果没有在术中进行切缘评估，则可能需要另外的手术。例如，20％至40％的
乳腺癌手术必须重新进行以去除：手术切缘处或手术切缘附近存在的残留癌；理想地在最初手术过程期间会被检测到的癌
沉积物。
[0005] 良好地认识到了对冷冻切片替换的需求并且许多团体和公司已在这方面做出努
力。技术包括线扫描共焦系统、宽场OCT、多
光子显微技术以及包括光散射、
光谱学、
电阻抗等的其他基于非成像的方法。
[0006] 活检质量控制是本公开内容旨在解决的另一方面。重要的是，活检，尤其是小的、相对非侵入性的针活检，含有目的组织。对于肾脏诊断，针活检必须含有肾小球；对于癌诊断，当然病变必须被适当
采样，等等。在出于各种目的(例如组织病理学、流式细胞术、核酸提取)而必须分割样本的情况下，期望组织的每个等分试样均具有目的细胞或结构。此外，在一些情况下，重要的是估计可以表示肿瘤相对于基质的百分比为多少。具有快速检查活检组织以确保存在合适内容物的非破坏性方法会是有用的。
[0007] 移除的组织样本的快速诊断也是重要的。在进行确定诊断之前大多数移除的组织经历了常规FFPE处理，取决于工作流程，该处理引起几天或甚至几周的延迟。具有在活检或手术时进行诊断的能力能够减少延迟，减轻患者的痛苦，促进同日临床计划，并且降低总成本。
[0008] 移除的组织样本的快速分子表征也是重要的。类似地，许多分子测试，例如用于癌标志物或伴随诊断的免疫组织化学法或免疫荧光检验法(immunofluorescence)，直到初始组织诊断之后才被安排，并且引起几天至几周的额
外延迟。拥有能够与同时进行的分子染色或者随后进行但快速的分子染色一起提供形态学确认的显微镜系统，则能够在同一天内生成所有必要的基于组织的信息，这对患者会是非常有益的，并且为服务提供者节省成本。
[0009] 劳伦斯利弗莫尔国家实验室(Lawrence Livermore National Laboratory)和加利福尼亚戴维斯分校以前的工作引起了对用于解决这些问题(包括在体内成像中的应用)的新成像方法的开发。描述由该联合工作产生的主题的
专利是Demos等人的美国专利第7,945,077号“Hyperspectral Microscope for In-vivo Imaging of Microstructures and Cells in Tissues”。授予Demos、转让给劳伦斯利弗莫尔国家安全有限责任公司的并且题为“In-vivo Spectral Micro-Imaging of Tissue”的美国专利第8,320,650号也与组织中的微结构和细胞的体内成像有关。这两项专利通过引用并入本公开内容。在这两项美国专利中描述的技术使得能够使未经处理的组织样本中的细胞尺度的组织和组织结构
可视化。
该成像技术利用两种物理机制或特性。第一种是使用仅浅表地穿透组织的紫外(UV)光。更具体地，取决于组织类型和波长，UV光仅穿透组织几微米到几十微米的量级。因此，在该浅表组织层中产生的荧光
信号可以包含在与显微镜的景深相当的厚度内。斜
角照射也用作限制处于任何给定波长的激发的光子穿透深度的手段。可以以各种方式定义穿透深度，例如以下深度，到达该深度的光剂量为入射光量的1/e(或另一预定分数量，例如10％)。
[0010] 第二种主要物理机制或特性是使用被分析的组织的细胞区室内的天然荧光团。包含在细胞室区内的提供天然的“染色”方法的天然荧光团(例如色
氨酸、
胶原蛋白、弹性蛋白、NADH)的浓度存在足够的可变性。此外，可以获得基于
造影剂的发射的图像，并且基于造影剂的发射的图像可以与天然荧光团的图像组合以提供附加的分子信息。
[0011] 本公开内容的方法提供了几个能力，包括：1)使用天然组织荧光生物分子以及外源性染料和标记物进行图像获取；2)短图像获取时间(毫秒量级)；以及3)有助于结合到广泛的仪器设计中，包括手持式装置。重要的是，与在先使用的技术相比，本公开内容的方法简单得多且便宜得多。当与其他新兴技术相比时，这些是显著的优点。
[0012] 因此，在临床环境中，仍然需要减小或消除对活检的人和动物组织的冷冻切片评估的需要的系统和方法。更具体地，需要以下系统和方法，该系统和方法非常适合于对新鲜切除的组织样本的术中活检和/或手术切缘评估，而不需要对相对较大的组织样本进行耗时且昂贵的冷冻和物理切片，并且该系统和方法还非常适用于与常规荧光染色剂和标记物一起使用，以用于进一步对组织样本进行辅助评估、诊断和手术切缘分析。在动物研究领域，为了对身体功能进行基本了解，为了研究
疾病的发作和进展，在药物发现及其他领域，需要以下仪器，该仪器能够提供对组织样本的快速且便宜的评估，而且该仪器不需要执行常规的耗时、技术上具有挑战性且相对昂贵的组织病理学评估。此处讨论的
发明解决了许多上述需要。
发明内容
[0013] 在一方面，本公开内容涉及一种用于分析组织的方法。该方法可以包括获取组织样本以及将组织样本暴露于一种或更多种荧光团，一种或更多种荧光团包括优先在组织或细胞成分中积累的荧
光标记的分子探针或
荧光染料。可以使用照射激发源照射组织样本的表面，该照射激发源具有波长位于约200nm至约400nm之间的紫外(UV)
光源。波长可以被选择为有助于将UV光对组织样本的穿透限制在表面下方仅约所选择的深度。可以使用显微镜光学系统来对组织样本进行成像。可以使用从显微镜光学系统接收光学信息的图像获取系统来记录一个或更多个图像。可以使用与图像获取系统通信的显示系统来处理并且显示图像，以用于分析。
[0014] 在另一方面，本公开内容涉及一种用于分析组织样本的系统，其中，组织样本已被暴露于一种或更多种荧光团，一种或更多种荧光团包括优先在组织或细胞成分中积累的荧光标记的分子探针或荧光染料。系统可以包括照射激发源，该照射激发源被配置成利用紫外(UV)光照射组织样本的表面。照射源可以具有以下波长，该波长被选择为有助于将UV光对组织样本的穿透限制在表面下方仅约所选择的深度。可以包括显微镜，该显微镜提供关于组织样本的光学信息。还可以包括图像获取系统，该图像获取系统根据由显微镜提供的光学信息来产生一个或更多个图像。可以包括显示系统，该显示系统与图像获取系统通信以处理并且显示一个或更多个图像，以用于分析。
[0015] 根据本文提供的描述，可适用的另外的领域将变得明显。应当理解，描述和具体示例意在仅用于说明的目的，而非意在限制本公开内容的范围。
附图说明
[0016] 本文描述的附图仅用于说明的目的，而非意在以任何方式限制本公开内容的范围。
[0017] 图1是用于实现本公开内容的方法的系统的一个示例的高层级
框图；
[0018] 图2A是短暂地暴露于标准即用型组织学曙红溶液、在405nm(蓝光，可见光范围)以及还有275nm(UV)处被激发、并且使用图1所示的显微镜系统成像的未固定的羊肾的相同视场的一对图像。405nm的激发光穿透进入组织估计几十微米，并且引起来自多个细胞层的发射。275nm的激发光穿透得浅得多，并且使得能够区分最靠近组织表面的小管。
[0019] 图2B是使用长工作距离透镜和自动x-y-z显微镜载物台(stage)以10倍成像的曙红染色的羊肾(与图2A中的样本相同的样本)的10倍场的画面剪辑(montage)。该合成图像的各个面是平场的并且自动拼接以创建所示的画面剪辑。小管和集尿管的3D外观源于它们不是完全共面的事实，而倾斜照射产生了指示其3D外观的阴影。阴影恢复形状(shape-from shading)
软件，特别是在附加激发角度的情况下，可以用于生成3D量化数据并且可以突出或排除期望图像平面上方或下方的区域。
[0020] 图3A是用标准透射
光学显微镜观察的、被常规固定和染色的小鼠心肌的图像。图3B显示用曙红和核染色剂DAPI两者染色并且用激发光中心处于275nm的LED激发的新鲜小鼠心肌组织。图像是用所示系统以10倍放大倍率拍摄的，并且曙红和DAPI波段是使用合适的发射带通滤光片分别收集的。所得图像被重新着色以模拟传统的亮场透射H&E染色。插图表示细胞核特征可以被可视化。
[0021] 图4A显示了如上所述用曙红和DAPI染色，在275nm处被激发并且以低倍率(5倍)成像的正常乳腺小叶和周围组织的图像。组织已经被福尔马林固定，但没有切片，表明该方法可以应用于固定的且新鲜的组织。图像被重新着色以模拟标准H&E亮场染色。图4B：未固定(新鲜)、未切片并用DAPI和曙红染色，被成像并且重新着色以类似于H&E的乳腺基质和脂肪(10倍)。插图示出了可以观察到的染色质纹理特征。
具体实施方式
[0022] 以下描述本质上仅是示例性的，而不意在限制本公开内容、应用或用途。应当理解，贯穿附图，相应的附图标记指示类似或相应的部件和特征。
[0023] 对于传统病理学方法，病理样本必须被物理地切割，以将组织薄片呈现到标准显微镜。相反，如果组织可以被光学切片，则冷冻、或者固定和石蜡包埋，随后进行切片并不是必需的。如美国专利第7,945,077号和第8,320,650号中所公开的用于低成本且有效地对厚样本进行光学成像的那样，本文所讨论的先前方法的中心在于：在短UV光(通常为266nm)激发的情况下，使用组织固有的荧光生物分子来对组织进行倾斜宽场荧光成像。本公开内容通过公开如下新方法来扩展美国专利第7,945,077号和美国专利第8,320,650号的教导，该新方法使用荧光染色剂和标记物，但是仍然不需要对大组织样本进行冷冻和物理地切片。这样的染色剂和标记物广泛可用并且被设计成在组织成分、包括良性与恶性的细胞类型、特定亚细胞区室和外源性病原体中积累，并且发射不同波长的光，因此其在成像期间可以分离。因此，本公开内容的方法的这个特定方面类似于传统组织病理学中组织细胞的经FFPE处理的染色。然而，通常未认识到的是，不管发射波长范围如何，许多(可能大多数)荧光染料都可以在330nm及以下的UV范围内被激发。本公开内容还通过公开使得能够控制被成像的
组织切片的深度的新方法以及减小源于较大深度处的不期望的信号分量的技术而扩展了美国专利第7,945,077号和美国专利号第8,320,650号的教导，这两个专利通过引用并入本文。
[0024] 本公开内容的方法使得例如当抵靠透明(例如，熔融
二氧化
硅或
石英、蓝
宝石或UV透射塑料)窗口轻微压缩时，可以评估手术活检材料的切面，唯一的组织准备是短暂暴露于荧光组织染料或分子标记物，或者其他组织准备方法，例如，短暂暴露于
固定剂比如甲
醛、多聚甲醛、各种醇、丙
酮、温和
洗涤剂等，以按照最佳组织标记所需来控制渗透性、pH、渗透状态、离子成分等。标记可以经由基于组织化学与组织相互作用的传统或非传统染色剂进行，或者可以是与用于检测的荧光团偶联的分子特异性
试剂，例如
抗体、适体或核酸探针等。与组织准备和标记试剂的相互作用可以在几秒至几分钟的时间间隔内发生，因为仅需要暴露组织的最浅表的几微米，所以样本的大部分不会受影响。
[0025] 荧光组织染料可以包括例如曙红和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(“DAPI”)。染料有助于向被成像的组织样本的表面提供类似H&E水平的对比。可以在350nm至200nm的光谱范围内充分激发并且具有在350nm至950nm的光谱范围内的有用发射波段的一组另外的示例性染色剂和荧光团包括但不限于以下：曙红染料家族、
甲苯胺蓝O、亚甲基蓝、DAPI、吖啶橙、DRAQ 5、Hoechst 33342和33528、
钙黄绿素AM、碘化丙啶、尼罗蓝、尼罗红、油红O、刚果红、固绿FCF、Dil、DiO、DiD等、 YO- 等、中性红、核固红、焦宁Y、酸性品红、阿司屈拉崇家族(astrazon-family)染料、MitoTracker和其他线粒体染料、LysoTracker和其他溶酶体染料、番红染料、硫黄素染料、荧光毒伞素、质膜染色剂例如CellMaskTM、Evans蓝、绿等，以及与感染性媒质结合的荧光化合物，例如金胺。
[0026] 此外，可以使用分子探针，包括但不限于以下：抗体和相关分子、适体、SomamersTM、核酸寡聚物、LNA等。这些探针可以与荧光标记物直接或间接复合，该荧光标记物可以包括但不限于以下标记物类别的成员：
碳纳米管、碳
量子点、有机荧光标记物(例如荧光素、罗丹明、Alexa染料、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5等、德克萨斯红、香豆素基荧光团、IRDye800、吲哚菁绿、氟
硼吡咯(bodipy)、DyLight染料、俄勒冈绿、藻红蛋白)、稀土元素、
半导体量子点、有机量子点、
聚合物点(pDot)、荧光纳米颗粒(例如
二氧化硅珠、聚合物囊泡、卟啉基胶束和脂质体)以及FRET基染料缀合物。
[0027] 或者，在活检、手术、尸体剖验或尸检之前，可能由于施用于患者或动物模型体内的标记物而出现荧
光信号，并且随后可以使用系统10来检测该荧光信号。
[0028] 或者，如果通过例如在具有合适的
温度和充氧性质的组织培养基中孵育而使组织维持存活状态，并且使组织暴露于会在细胞中生成荧光标记物的试剂(细胞有效吸收它们或适当地处理它们)，则可以发生离体功能性标记。然后可以使用系统10来检查这些离体标记的组织。
[0029] 参考图1，示出了根据本公开内容的一个实施方式的系统10。系统10可以类似于美国专利第7,945,077号中描述的系统，其教导已通过引用并入本
申请中。系统10可以包括用于用UV光照射组织样本14的紫外(UV)照射源12。UV源12可以来自包括如下源的源列表：具有固定或可调发射的一个或更多个LED、
激光器；具有光谱选择能力的连续激光器；常规或
激光点火电弧灯或氪-溴准分子灯；或在期望光谱范围内具有足够
亮度的其他源。
[0030] 组织样本可以在对激发光透明的非荧光或低荧光窗口16的下面或顶部轻微压缩，或者可替选地在没有窗口16的情况下直接成像。此外，为了容易地获得活检样本的4个侧面，可以将组织引入由UV透明塑料制成的可能是一次性的矩形横截面比色杯中。当组织被牢固
定位时，4个成像面全部应当与可贴合的组织表面直接
接触。为了对4个面全部进行成像，可以手动或自动地重新定位比色杯，或者可以设想例如使用反射镜的其他光学布置以允许在不移动样本的情况下对一个以上的面进行成像。也可以使用其他组织处理方法。至少一个成像相机18a(在一个示例中为CCD相机)形成图像获取系统18的一部分，并且用于记录通过合适的显微镜20(用作光学系统)成像的组织样本14的图像。图像获取系统18还可以包括数字差分
图像处理子系统18b，其将在以下段落中进一步讨论。
[0031] 因为在350nm至220nm范围内的UV光可以激发许多不同的荧光染料，所以可以一次利用多种试剂(复用)进行染色。例如，DAPI和曙红可以同时存在并且会生成在蓝色和绿色范围中的信号。添加以红色发射的另一染料或标记物会提供第三信号，并且因此，或者，相机18a可以是能够捕获所产生的发射的不同
颜色的彩色相机。如果包括另外的标记物，或者如果期望相比可以通过常规彩色(RGB)相机所获得的分离要好的对标称的红色、绿色和蓝色标记物的分离，则进一步，可以使用一个或更多个单色相机或单色相机和彩色相机的组合来同时或顺序地获取组织样本14的图像，并且一个或更多个单色相机或单色相机和彩色相机的组合总体上可以由相机18a表示。可选地，可以包括被设计成仅传递预定的发射光谱的一个或更多个光学滤光片19。这样的滤光片19可以定位在常规滤光片保持器中，或者被沉积在
传感器中的各个
像素之上，或者被结合到采用光场技术的具有微透镜或其他单获取设计的快照成像系统中。或者，可以采用基于可调滤光片的多光谱成像系统。更一般地，可以使用可以生成光谱和空间信息的任何激发和/或发射侧系统。
[0032] 相机18a将图像数据传送到数字差分图像处理子系统18b，以用于在必要时进行处理，并且将所得图像传送到显示系统22。在颜色或光谱分离或其他处理之后，可以生成对应于不同的标记物分布和丰度模式的各个分量图像。或者，可以以真彩色或伪彩色的形式生成并且呈现包含组合的染料或荧光团信息的融合的单个图像。在该示例中，显示系统22由具有监测器的台式
计算机系统形成，尽管显示系统22也可以是膝上型计算机、
电子平板计算机、智能电话或能够显示数字图像的任何其他装置。所获得的图像还可以从显示系统22传送到远程设备24，以用于检查。或者，图像可以从系统10直接(即，绕过显示系统22)传送到远程设备24。在任一情况下，受过培训的人员几乎可以在使用天然组织荧光来获取之后以及/或者在组织已经暴露于所选择的荧光染料或分子标记物之后立即检查所获得的图像。(一个或更多个)所获得的图像还可以被保存到显示系统22的合适的存储系统和/或远程数字介质存储子系统。此外，如下文简单描述的，还可以使用自动或半自动
计算机程序来对图像进行诠释或量化。
[0033] 本公开内容的系统10和方法的特定优点在于处于本文所述的波长的光被组织成分(诸如，
蛋白质和核酸)强烈地吸收。结果，大部分激发光仅穿透到组织样本表面下方恰好一个或几个细胞深的水平。这消除了对物理切片的需要。另一显著优点在于几乎所有荧光染料都可以被本公开内容的方法所采用的UV光谱区域中的
光激发。这显著地简化了对多种荧光造影剂的使用，包括对分子探针的使用。
[0034] 另一优点在于照射是倾斜的，而不是在轴线上，并且提供了提供某些3维信息的明暗或阴影信息。这种光学效果在直接获取的图像中是明显的，以用于生成可察觉的形状或深度感觉，或者这种光学效果可以输入到各种数学
算法(例如
层析成像)中，以通过计算创建获取的深度信息或附加的轴向切片，或其他分辨率增强。
[0035] 结合不需要对组织样本进行冷冻和物理切片的方法使用荧光染色剂和探针使得能够快速成像，通常使得能够在一分钟或更短的时间内建立宽视场和高分辨率图像。此外，利用直接标记的抗体或核酸探针(其可以快速杂交，例如使用RNA荧光原位杂交(“Turbo RNA FISH”))对组织进行染色也是可能的，并且通过同时使用靶向和非靶向探针可以容易地区分特异性和非特异性染色。通过谨慎和适当的光学和后处理操作可以实现病理学家可接受的图像质量。图像质量甚至可以适用于初步诊断工作。本申请的方法和系统10与上述其他方法相比成本低。这部分是因为实现该方法不需要激光器或甚至分色镜。因为在该范围内的UV光不会被常规的显微镜光学元件传输，因此不需要激发阻挡滤光片。在一个实例中，本公开内容的方法可以仅使用一个或更多个UV-LED照射源、显微镜透镜、合适的彩色相机以及合适的显示/计算系统来实现。通过合适的光学机制，很明显，手机相机也可以提供有用的传感器，并且可以集成到低成本、可现场配置的系统中。
[0036] 本公开内容的方法和该系统10进一步教导了如何使用广泛可用的造影剂来优化对组织样本的成像，使得可以在相比利用包括对组织样本进行冷冻和物理切片的常规方法可能花费的时间段要短的时间段内获得对扩展的样本的高质量扫描。在实现本公开内容的教导时，应当考虑多个技术考虑。这些技术考虑包括但不限于：a)选择和/或发现合适地优化的造影剂和染色方法；b)使仪器成本最小化的方法；c)使对大样本进行成像所需的时间最少化的方法；d)选择执行特定任务的仪器和配置；e)图像存储、传输和处理；以及f)控制成像深度的方法。接下来将以与上述相同的顺序讨论上述考虑中的每个，这是因为上述每个考虑都与本发明相关。
[0037] A)选择和/或发现合适地优化的造影剂
[0038] 使用的造影剂应当能够对新鲜组织样本的亚细胞和细胞内区室提供染色(有或没有短暂暴露于通过例如改变pH、离子强度、细胞和亚细胞结构的渗透性、水合状态、
溶剂、蛋白质和核酸结构以及交联、
抗原可用性等来优化染色的调理溶液，以使组织的微结构和构造可视化，所述可视化适合用于组织病理学诊断或表征。造影剂应当在用于激发的UV光谱范围内吸收并且以较长波长(例如在可见光谱中)发射。造影剂应当在物理暴露时尽可能快地对组织进行染色，以使处理时间最小化。造影剂不应当实质性改变或损坏组织的宏观结构或微观结构。可以使组织暴露于含有造影剂的溶液的时间最优化。
[0039] 造影剂可以包括固定或沉淀蛋白质以及使细胞透化的成分，例如醇、洗涤剂或甲醛。这些可能仅需要作用几秒钟，这是因为只有组织的最上面几微米必须要受到影响。(一种或更多种)所选择的造影剂与成像技术和适当的后处理相结合可以生成类似于当前诊断图像并且符合如执业的外科病理学家判断的主观质量标准的类似H&E图像。然而，即使所得到的图像在光学上具有高质量，它们也可能与通
过冷冻切片或FFPE技术所获得的图像不同，因为在未冷冻、未固定且未石蜡包埋的样本中可能不存在这些方法的常见伪像(例如回缩、核清除和染色质聚集)。此外，用于使分子探针的检测和结合最优化的方法对于对抗原、基因或经表达的RNA分子的可视化而言是必需的。存在使用直接标记的抗体的、使得能够经由TURBO FISH等对例如各种RNA分子或HER2蛋白质进行快速检测的快速技术。
[0040] B)使仪器的成本最小化的方法
[0041] 仪器的成本与成像和处理方法直接相关，而且与诊断所需的信息量和所捕获的图像的质量直接相关。在这些操作参数的某一集合中，可以选择合适的仪器来使成本最小化。这样的成本将取决于包括显微镜物镜和滤光片的光学元件的获取成本、光源的成本以及相机/检测器的成本。根据这些部件的可用性和成本，可以设计特定的仪器架构。特别地，可以使用单个单色相机来获取多光谱图像，但这将造成更长的扫描大样本的时间。另一方面，多个相机可以与亮光源结合使用，以使扫描大样本的时间最小化，但这会增加仪器的成本。或者，如果分辨率和光强度足够，即使是消费级RGB相机也可以是合适的。这可以允许在单次曝光的情况下全色成像捕获不同荧光成分(内在的或外来的)的发射。或者，快照光谱相机，例如使用经滤波的像素掩模或具有小透镜阵列和可配置的滤光插片的光场成像的相机，可以在单次曝光中生成多波长图像。
[0042] 可以通过这种一般途径、使用各种方法来对大样本进行成像，诸如：a)拼接较小部分的高分辨率区域照射图像，如图2B所示；b)使用扫描方法逐点扫描UV光；或c)使用一行UV光进行行扫描。使
用例如结构化照射和单像素检测器的压缩感测也可以是合适的。或者，可以采用可以在观察大视场的同时保持分辨率的方法，例如高NA低倍率透镜、高像素数量相机以及使用来自多个图像的信息来产生高质量图案(rendering)的计算方法。必要时，可以通过将检测器组件的样本保持器模
块附接到机动化的载物台来促进样本移动，或者可以手动移动样本或载物台，并且可以自动将所得到的图像拼接在一起。因此，对适当的仪器的选择将基于各种技术规范以及在组装时获取零件的成本。
[0043] C)使扫描大样本所需的时间最小化的方法
[0044] 扫描时间取决于与仪器相关的多个参数，例如检测系统的灵敏度、透镜系统的数值孔径、任何滤光片的透射效率、激发强度、相机和/或检测器的
量子效率以及造影剂的浓度。还存在限制因素，例如在造影剂的
光漂白之前的最大激发强度、或实际组织光损伤或组织
消融。
[0045] 所需的空间分辨率在扫描速度中起关键作用。图像获取期间的
信噪比应当保持足够高，使得图像质量不受损。由于可能需要每个
站点的不同发射波段的多个图像，因此使用多个相机或用于并行图像获取的其他方法会实现更快的扫描速度。或者，也可以使用标准全色(RGB)传感器来减少所需的曝光次数，或者可以采用用于快拍多光谱成像的各种技术。
[0046] D)选择执行特定任务的仪器和配置
[0047] 上面在A、B和C部分关于各种技术考虑的讨论突出了可以用于实现本系统和方法的教导的各种可能的配置和仪器的类型。这些与图像捕获设备和扫描速度及方法相关。另一方面来自于下面将在技术考虑F)中讨论的照射几何形状。总体来说，成像方法需要用于照射、光收集和滤光、图像获取、扫描大样本、创建合成数字图像和
图像分析以及增强的设备。利用手机或类似的传感器以及计算和通信平台可以设计特别低成本的实现方式，以用于在资源贫乏的环境中与全球健康应用有关的使用。
[0048] E)图像存储、传送和处理
[0049] 样本的图像可以立即被数字化并且保存在各种类型的数字存储介质类型上。可以使用当前和将来的信息技术来立即传送图像文件，使得可以促进远程咨询。添加
机器学习(或其他模式)的
图像分割、分类和定量能力可以提高本系统和方法的性能和效用，并且可能有助于进行自动诊断。
[0050] F)控制成像深度的方法
[0051] 控制成像深度对于产生具有用于诊断分析的合适质量的图像是特别重要的。目前的组织病理学分析中的成像深度通过在显微镜下染色和观察之前切割加工组织的薄片来控制。利用本系统和方法，光学地而不是通过对组织样本进行物理切片来实现切片，尽管样本可能必须以如下方式切割：平坦的表面可以被置于光亮的光学样本
支撑件上以提供高质量的图像。样本支撑件表面如在常规盖玻片的情况下一样地必须具有适当的厚度和折射率，以提供最佳图像质量。光学地控制来自照射源12的激发光子进入组织样本14的穿透深度是系统10的重要特征。最佳穿透深度可以稍微变化，但是目前一个优选的穿透深度为约5微米至25微米，并且更优选地为约10微米。该深度表示从组织样本14的表面起会导致照射衰减一定比例的距离。然而，存在可以到达比该深度更深的深度的一些光子，并且因此这些更深的穿透光子会提供在预期成像区域(即，表面与表面下方约10微米之间的区域)之外的信号。排除由来自相比所选择的成像深度要深的层的这样的光子生成的荧光信号会是有益的。
[0052] 还存在可以对本申请中讨论的应用产生类似效果的另一种机制，即，使用荧光造影剂来突出特定组织成分或分子靶标。具体地，利用UV光激发组织生成在近UV中的
自体荧光。荧光造影剂可以被UV激发和近UV自体荧光两者激发。近UV自体荧光会在组织内部生成，并且会在所有方向上均匀地取向，从而引起一些额外的激发，并且因此引起由于更深地进入到组织中而引起的发射。
[0053] 本公开内容的系统和方法解决了所有上述考虑。为了简单起见，以下讨论将分为两个主要问题：A)控制成像区域的深度，以及B)经由图像处理去除不想要的信号分量。
[0054] 可以使用来自UV照射激发源12的信号的激发波长来控制成像区域的深度。该成像方法涉及使用UV激发来提供浅穿透深度。但是，如果必须控制成像区域的精确深度，则必须将激发波长精确地调节为恰当的波长。当将激发光的波长调节为较短值时，成像区域的深度通常减小或近似保持相同。从约370nm向下到约240nm，正是如此。在约240nm以下，随着波长进一步减小，穿透深度急剧下降。因此，可以选择合适的激发波长以便实现预定的穿透深度。这在图2A中示出。
[0055] 可以用于控制成像区域的深度的另一参数是激发的入射角。正入射，即根据组织样本14的成像表面而将UV照射激发源12布置在与平面呈约90度的角度26处，与倾斜入射相比提供更深的穿透。该布置通过图1所示的照射激发源12a示出。在该实例中，激发光可以通过成像装置(例如，显微镜20)的物镜，相对于组织样本的表面以90度照射组织样本14。在照射激发源如由图1中的照射激发源12所示的那样被布置在关于组织样本14的上表面的倾斜角处的情况下，穿透深度会小于在照射激发源12被布置在相对于组织样本14的表面的90°处的情况下的穿透深度。穿透深度随着入射角26增加(即，朝向相对于组织样本14的表面的90度移动)而减小。通过仔细地控制入射角26，可以选择UV光进入组织样本14的相对精确的穿透深度。
[0056] 图像处理也可以用于去除不想要的图像分量。这样的分量可以是失焦的和/或成像区域外的图像分量。为了去除这些不需要的分量，可以采用经由合适的数字差分图像处理子系统22a(图1)实现的差分成像方法。术语“差分”用作通用术语来描述可以由子系统22a执行的一个或更多个成像操作，其增强特定信号分量，同时其抑制不想要的信号分量。
这样的操作可以包括但不限于图像相减、图像划分或者经由逐像素操作或其他方式进行的其他类型的数学图像处理。
[0057] 这种类型的图像处理需要具有想要的信号相对于不想要的信号分量的不同相对贡献的至少两个图像。可以采用接下来将要列出的多种不同的方法，但是可以制定与其中描述的方法相似的、呈现相同的逻辑的其它方法。
[0058] 这两个或更多个图像可以通过以下方式来获得：
[0059] 1)使用两个或更多个激发波长或光谱带、使用相同的成像用发射光谱带；
[0060] 2)使用两个或更多个不同的发射波长或光谱带、使用相同激发波长；
[0061] 3)使用两个或更多个激发波长或光谱频，以及使用两个或更多个不同的成像用发射光谱带；
[0062] 4)使用两个或更多个光激发入射角、使用相同激发波长或光谱带；
[0063] 5)使用两个或更多个光激发入射角、使用不同激发波长或光谱带；
[0064] 6)使用两个或更多个光激发入射角、使用相同的成像用发射光谱带；
[0065] 7)使用两个或更多个光激发入射角、使用不同的成像用发射光谱带；
[0066] 8)使用两个或更多个极化态的激发、使用相同的极化态的成像用发射；
[0067] 9)使用单个极化态的激发、使用不同极化态的成像用发射；
[0068] 使用各种入射角和/或各种旋转角的激发光所捕获的图像阵列，各种入射角和/或各种旋转角的激发光被设计成提供可以用于根据需要、经由图像处理和/或数学重建来排除更深的信号或浅表信号的图像。
[0069] 10)使用上述的另外组合；
[0070] 11)使用不同空间调制的照射(激发)图案获取的两个或更多个图像；
[0071] 12)使用各种空间调制的照射(激发)配置所捕获的图像阵列，各种空间调制照射(激发)配置被设计为提供可以用于根据需要、经由图像处理和/或数学重建来排除更深的信号或浅表信号的图像。
[0072] 13)显微镜系统被聚焦在组织表面上方和下方的不同深度的情况下的图像阵列可以用于根据需要、经由图像处理和/或数学重建来排除更深的信号或浅表信号。
[0073] 如图2B所示的图像所暗示的，可以使用围绕光轴径向布置的多个倾斜照射源(包括阴影形状分析)来获得来自图像的附加信息。
[0074] 参考图3，示出了小鼠心脏组织的图像。在图3A中，深蓝色圆形特征表示细胞核，并且粉红色表示含有心肌收缩组分的
细胞质。图3A的图像是福尔马林固定的、经FFPE处理的苏木精和署红染色(H&E染色)组织的标准组织学切片的照片。这示出了出于医学诊断目的而对组织样本进行机械地切片和染色的、熟知的且目前使用最广泛的方式。在病理学家能够用显微镜观察组织样本之前，这个熟知的处理需要大约24小时的加工和处理时间(在通常的组织学实验室工作流程的情况下)。图3B所示的组织样本的图像是使用本公开内容的系统10和方法、结合荧光染色剂和标记物获得的。将图3A的组织样本浸入含有曙红和DAPI的溶液中30秒。然后通过显微镜(例如，图1中的透镜子系统20)、分别使用以450nm和550nm为中心的滤光片选择性地映射DAPI(其与核蛋白结合)和曙红的定位而获得两个荧光图像。使用商用软件来创建模拟常规组织病理学的H&E外观的合成图像(图3B)。在约1分钟内(包括对组织样本进行染色)获取图3B的图像。由于图3B的图像是数字图像，因此其可以通过有线或无线数字传输子系统立即传送到远程诊断设备或医院。如果采用无线通信链路，则几乎可以立即将图像转发到在世界任何地方的病理学家。此外，除了短暂暴露于各种溶液而引起的浅表染色或其他表面修饰之外，组织样本保持完整，因为除了可能需要截开以提供用于成像的平面之外，执行分析不需要物理切片。
[0075] 在图3B中，由于对较厚的组织切片进行成像，因此图像中可看见较大浓度的核102。图3A示出了组织样本的约5μm厚的切片的图像，而图3B的图像是从组织样本的顶层约
20μm的成像深度获得的。在改进的光学切片的情况下，例如使用较短的波长照射，本系统10和方法可以生成定性地与使用传统组织病理学方法而生成的图像相似的图像以用于快速组织评估。重要的是要注意，使用冷冻切片方案的传统方法通常由于冷冻伪像和其他问题而提供较低质量的图像，需要大约10分钟至20分钟完成，并且物理上损害被检查的组织样本。
[0076] 图4A和4B示出使用本系统和方法获得的组织样本的附加图像。图4A示出乳腺小叶和周围组织(5倍放大)。组织先前已被福尔马林固定，但没有被切片。图4B示出未固定(新鲜的)、未切片的乳腺基质(大部分为脂肪)(10倍放大)。图4B的组织用DAPI和曙红染色，被成像并且重新着色以类似于H&E。图4B中的插图表示可以观察到细染色质纹理特征。外观与冷冻切片或标准FFPE载片(slide)不同，因为完整的脂肪球仍然存在。
[0077] 因此，本系统和方法使得能够以对组织样本的完整性有有限影响的方式对组织样本进行快速得多的分析和评估，该组织样本可以用于下游处理，包括基于标准FFPE的组织学、遗传物质的提取或其他过程。
[0078] 虽然已经描述了各种实施方式，但是本领域的技术人员会认识到在不偏离本公开内容的情况下可以做出
修改或改变。示例说明了各种实施方式，而非意图限制本公开内容。因此，描述和
权利要求应当不受限制地解释，其中，仅仅具有鉴于相关现有技术而必需的限制。
[0079] G)处理用于图像获取的样本的方法
[0080] 对于在本发明的教导中的成像，强烈优选地将样本的相对平坦的表面呈现到显微镜系统。平坦的表面可以经由各种手段实现。这些手段包括但不限于以下内容：a)表面可以是天然平坦的；b)将样本附接到保持器，该保持器具有在多个取向上旋转和平移样本以使得样本的每个被成像的子部分可以被呈现用于在平坦的(相对于图像平面)取向上进行图像获取的能力；c)使样本与平坦的光学表面接触，该光学表面允许激发穿透并且允许用于图像获取的生成
信号传输，但是其施加足够的压力(由于其自身重量，样本的重量或在施加额外的外部重量或压力的情况下)以产生平坦的表面；d)将样本插入包含平坦的或可能弯曲表面的合适容器(例如比色杯)内，该合适容器允许激发穿透并且允许用于图像获取的生成信号传输，以呈现样本的多个平坦表面，其几乎
覆盖样本的所有暴露表面。
[0081] 用于产生(一个或更多个)平坦表面的样本支撑材料是紫外透射材料，其可以包括石英、熔融二氧化硅、蓝宝石或UV透射塑料，例如 聚甲基戊烯。使样本相对于显微镜的像面平移和/或旋转，使得可以获取具有足够的空间分辨率和光谱分辨率的样本的一系列图像。随后，可以将图像堆叠在一起(图像拼接)，以根据需要提供整个样本或样本的一部分的高分辨率图像。
