用于BNCT的含硼化合物及其制备方法和用途
阅读：430发布：2020-06-22
专利汇可以提供用于BNCT的含硼化合物及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于BNCT的含 硼 化合物及其制备方法和用途，属于医药领域。本发明提供的新的含硼化合物通过缩合、 氨 解、成环及 水 解 反应得到，易于制备、成本低，并具有良好的 生物 性能，在 肿瘤 细胞的摄取、积累和保留方面都优于BPA，并没有出现任何毒性的迹象，在BNCT方面具有良好的应用前景。，下面是用于BNCT的含硼化合物及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种含硼化合物，其特征在于具有如下式（Ⅰ）所示的结构：
其中：R1为H或 ；
R2为H或C1-C3烷基；
及其药学上可接受的盐、立体异构体和同位素产品。
2.制备如权利要求1所定义的式（Ⅰ）化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）缩合反应：
；
（2）氨解反应：
；
（3）成环反应：
（4）水解反应：
。
3.如权利要求1所定义的式（Ⅰ）化合物用于制备肿瘤治疗所用药物中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述肿瘤治疗是肿瘤的硼中子俘获治疗。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述肿瘤是恶性肿瘤或转移性肿瘤进程。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述肿瘤是脑胶质瘤、复发性头颈部肿瘤、恶性黑色素瘤、肉瘤、乳腺癌或转移性肝癌。
用于BNCT的含硼化合物及其制备方法和用途
技术领域
背景技术
[0002] 肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，其死亡率仅次于心血管疾病，居各类疾病死亡率的第二位，而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。根据目前癌症的发病趋势，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。尽管癌症发生的确切机制目前仍不清楚，但是如果能在早期对癌症进行诊断，并尽早采取手术、放疗或化疗(或这几种方法的结合)，大多数肿瘤患者是有存活可能性的。
[0003] 一种有前景的新形式的高LET辐射癌症疗法是硼中子俘获疗法(boron neutron capture therapy,BNCT)。BNCT是一种在细胞尺度上的新型的二元靶向放射疗法，其实现过程为：首先给患者注射靶向性含硼药物，使10B浓聚在肿瘤细胞中，而正常组织细胞10B含量10 7
很少，之后以中子照射肿瘤部位。中子与 B发生俘获反应产生α粒子和Li粒子，而α粒子和
7Li粒子在细胞中的射程分别为9μm和5μm。这些粒子产生的电离辐射损伤作用仅限于摄取
10B的细胞，从而达到选择性杀死目标细胞，对未摄取10B的正常组织细胞损伤极少的目的。
因此，理论上BNCT是治疗癌症的完美手段。
很少，之后以中子照射肿瘤部位。中子与 B发生俘获反应产生α粒子和Li粒子，而α粒子和
7Li粒子在细胞中的射程分别为9μm和5μm。这些粒子产生的电离辐射损伤作用仅限于摄取
10B的细胞，从而达到选择性杀死目标细胞，对未摄取10B的正常组织细胞损伤极少的目的。
因此，理论上BNCT是治疗癌症的完美手段。
[0004] BNCT中一个重要的问题是为硼原子寻找无毒的载体分子，使其在肿瘤细胞中聚集从而确保足够的选择性。为了获得高治疗比，这样的化合物在肿瘤中应当优先释放出15-30μg/g(ppm，即百万分之一)的10B平均浓度以保证其具有高选择性和低毒性。目前处于临床试验的两种硼携带剂是巯基-闭合式-十二烷硼酸二钠(BSH)和1,4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)。虽然BSH和BPA已经在动物模型中被证实是安全有效的，但是这两种试剂仅具有对肿瘤细胞中等的选择性以及在肿瘤细胞中较低的保留时间。
[0005] 因此，需要开发新的化合物，其在肿瘤中具有较长的保留时间，并选择性地靶向和破坏肿瘤细胞而对正常组织具有最小的损伤。
[0006] 3’-脱氧-3’-氟代胸腺嘧啶脱氧核苷(FLT)是一种抗病毒化合物，它被细胞摄取后被胸腺嘧啶激酶(TK-1)磷酸化，与胸腺嘧啶核苷相比不能进一步参与DNA的合成，也不能通过细胞膜返回组织液而被滞留在细胞内，使得它在细胞内被捕集，从而提供了细胞增生的可测性。
[0007] 因此，本发明人根据等电子体原理，尝试对FLT进行修饰，得到一系列FLT的含硼类似物。初步研究表明，该类化合物易于制备、成本低，并具有良好的生物性能，在肿瘤细胞摄取、积累和保留方面都优于BPA，并没有出现任何毒性的迹象，在BNCT方面具有良好的应用前景。
发明内容
[0008] 本发明的第一个目的是提供用于硼中子俘获治疗(BNCT)的化合物。
[0009] 另一个目的是提供具有对肿瘤细胞有高选择性和/或较长保留时间的化合物。再一个目的是提供稳定和/或无毒的化合物。
[0010] 再一个目的是提供由可商业化购买的原料制备所述化合物的方法。
[0011] 本发明进一步目的是提供包含所述化合物的药物组合物，以及提供所述化合物在BNCT中的用途。
[0013]
[0014] 其中：R1为H或
[0015] R2为H或C1-C3烷基；
[0016] 及其药学上可接受的盐、立体异构体和同位素产品。
[0017] 根据式(Ⅰ)的化合物是通过包括以下步骤的制备方法来实现的，具体为：
[0018] (1)缩合反应：
[0019]
[0020] (2)氨解反应：
[0021]
[0022] (3)成环反应：
[0023]
[0025]
[0026] 根据式(Ⅰ)的化合物适用于BNCT中，BNCT可以被用于治疗很多种类的肿瘤。利用上述式(Ⅰ)所定义的化合物使用BNCT所能治疗的肿瘤类型包括源于中枢神经系统的肿瘤，优选神经胶质瘤，例如胶质母细胞瘤、神经胶质肉瘤、间变性星形细胞瘤、低级别星形细胞瘤、毛细胞形星形细胞瘤、少突神经胶质瘤或脑干神经胶质瘤；脑膜瘤；外周神经上皮瘤；原始神经外胚层瘤；神经母细胞瘤；生殖细胞瘤；脑转移瘤。也可以在BNCT中使用如式(Ⅰ)所定义的化合物治疗例如恶性肿瘤或转移性肿瘤进程，优选脑胶质瘤、复发性头颈部肿瘤、恶性黑色素瘤、肉瘤、乳腺癌或转移性肝癌。
[0028] 术语“肿瘤”是指细胞增殖不受控制的并且累进的组织的生长。不受控制的繁殖即一种不同于正常细胞繁殖的状态，例如一种细胞繁殖率明显增加的状态。
[0029] 术语“累进的”是指强烈地进展或增加。
[0030] 术语“肿瘤细胞”是指组织学中的细胞。
[0031] 术语“肿瘤治疗”是指对肿瘤引起或与肿瘤相关的疾病的治疗。
[0032] 本发明的目的还通过根据式(Ⅰ)的化合物在制备用于治疗肿瘤的药物方面的用途实现。
[0033] 在一个实施方式中，所述药物可以用于治疗源于中枢神经系统的肿瘤，优选神经胶质瘤，例如胶质母细胞瘤、神经胶质肉瘤、间变性星形细胞瘤、低级别星形细胞瘤、毛细胞形星形细胞瘤、少突神经胶质瘤或脑干神经胶质瘤；脑膜瘤；外周神经上皮瘤；原始神经外胚层瘤；神经母细胞瘤；生殖细胞瘤；脑转移瘤。
[0034] 或者，该药物可以用于治疗恶性肿瘤或转移性肿瘤进程，优选脑胶质瘤、复发性头颈部肿瘤、恶性黑色素瘤、肉瘤、乳腺癌或转移性肝癌。
[0035] 以上所提到的治疗可以作为单独的治疗而应用，或者除了硼中子俘获治疗之外的其他常规的手术或化学疗法。
[0036] 本发明的优点是：本发明提供了新的含硼化合物，该类化合物通过缩合、氨解、成环及水解反应得到，易于制备、成本低，并具有良好的生物性能，在肿瘤细胞的摄取、积累和保留方面都优于BPA，并没有出现任何毒性的迹象，在BNCT治疗方面具有良好的应用前景。
具体实施方式
[0037] 下文结合具体实施例对本发明的内容做进一步详细地说明，所述的实施例目的仅用于说明和描述本发明当前的最佳模式。本发明的保护范围不以任何方式受此处所述实施例的限制，凡是根据本发明公开的内容或原理，实施的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
[0038] 根据本发明的化合物的制备
[0039] 实施例1化合物Ⅰa的制备
[0040] 反应路线
[0041]
[0042] 1.1中间体3a的制备
[0043] 于50mL的反应瓶中加入1(13.00mg，0.1mmol)与2a(27.53mg，0.1mmol)，加入20mL甲醇溶液于室温下搅拌24h后，停止反应，抽滤得3a(34.87mg，90％)。
[0044] 1H NMR(500MHz，CDCl3)：δppm 5.49(1H，CH)，5.13(1H，CH)，4.94(1H，CH)，4.89(1H，CH)，4.23(2H，CH2)，4.16(2H，CH2)，1.99(9H，CH3)，2.01(1H，NH)，1.91(3H，CH3)，1.27(3H，CH3)。
[0045] 1.2中间体4a的制备
[0046] 于50mL的反应瓶中加入3a(38.74mg，0.1mmol)、浓氨水(30.36mg，0.5mmol)，加入20mL甲醇溶液，常温下搅拌1h，后升温至体系回流6h，反应结束后降温抽滤得4a(28.31mg，
79％)。
79％)。
[0047] 1H NMR(500MHz，CDCl3)：δppm 6.67(1H，CH)，5.96(2H，NH2)，5.49(1H，CH)，5.13(1H，CH)，4.94(1H，CH)，4.89(1H，CH)，4.23(2H，CH2)，1.99(9H，CH3)，1.91(3H，CH3)。
[0048] 1.3中间体5a的制备
[0049] 于50mL的反应瓶中加入4a(35.83mg，0.1mmol)与三氟化硼乙醚溶液(16.22mg，0.1mmol)，加入20mL的四氢呋喃溶液，室温搅拌条件下滴加吡啶(15.82mg，0.2mmol)，滴加完毕，后升温至体系回流6h，待反应结束后降温抽滤除吡啶盐，滤液浓缩得粗品5a[0050] (28.57mg，74％)。此步不经纯化，直接进行下一步反应。
[0051] 1H NMR(500MHz，CDCl3)：δppm 6.27(1H，CH)，5.48(1H，CH)，5.13(1H，CH)，4.92(1H，CH)，4.89(1H，CH)，4.19(2H，CH2)，2.01(9H，CH3)，1.92(3H，CH3)。
[0052] 1.4化合物Ⅰa的制备
[0053] 于50mL的反应瓶中加入5a(38.61mg，0.1mmol)与10％NaOH溶液(160mg，0.4mmol)，升温至50℃下反应6h，反应结束后降温至室温，乙酸乙酯萃取两次，浓缩，并用甲醇重结晶得Ⅰa(17.54mg，68％)。
[0054] 1H NMR(500MHz，CDCl3)：δppm 8.02(1H，NH)，6.27(1H，CH)，4.98(1H，CH)，3.92(1H，CH)，3.89(1H，CH)，3.67(2H，CH2)，3.65(1H，CH)2.02(4H，OH)，1.92(3H，CH3)。
[0055] 实施例2化合物Ⅰb的制备
[0056] 反应路线
[0057]
[0058] 2.1化合物3b的制备
[0059] 于50mL的反应瓶中加入1(13.00mg，0.1mmol)，加入20mL的甲醇溶液于室温下搅拌，通入氨气，待TLC监测反应不再进行时停止反应，抽滤得3b(11.11mg，86％)。
[0060] 1H NMR(500MHz，CDCl3)：δppm 6.97(1H，CH)，4.18(2H，CH2)，2.01(2H，NH2)，1.91(3H，CH3)，1.27(3H，CH3)。
[0061] 2.2化合物4b的制备
[0062] 于50mL的反应瓶中加入3b(12.92mg，0.1mmol)、浓氨水(30.36mg，0.5mmol)，加入20mL甲醇溶液，常温下搅拌1h，后升温至体系回流6h，反应结束后降温抽滤得4b(8.11mg，
81％)。
81％)。
[0063] 1H NMR(500MHz，CDCl3)：δppm 6.68(1H，CH)，6.01(2H，NH2)，2.01(2H，NH2)，1.91(3H，CH3)。
[0064] 2.3化合物5b的制备
[0065] 于50mL的反应瓶中加入4b(10.00mg，0.1mmol)与三氟化硼乙醚溶液(16.22mg，0.1mmol)，加入20mL的四氢呋喃溶液，室温搅拌条件下滴加吡啶(15.82mg，0.2mmol)，滴加完毕，后升温至体系回流6h，待反应结束后降温抽滤除吡啶盐，滤液浓缩得粗品5b(9.84mg，
77％)。此步不经纯化，直接进行下一步反应。
77％)。此步不经纯化，直接进行下一步反应。
[0066] 1H NMR(500MHz，CDCl3)：δppm 8.12(1H，NH)，6.24(1H，CH)，2.01(1H，NH)，1.91(3H，CH3)。
[0067] 2.4化合物Ⅰb的制备
[0068] 于50mL的反应瓶中加入5b(12.79mg，0.1mmol)与10％NaOH溶液(160mg，0.4mmol)，升温至50℃下反应6h，反应结束后降温至室温，乙酸乙酯萃取两次，浓缩，并用甲醇重结晶得Ⅰb(8.18mg，68％)。
[0069] 1H NMR(500MHz，CDCl3)：δppm 8.03(1H，NH)，6.27(1H，CH)，2.01(1H，OH)，1.99(1H，NH)，1.91(3H，CH3)。
[0070] 根据本发明的化合物的体外研究
[0071] 对本实施例1的纯化材料(以下称作Ⅰa)进行的体外试验使用四种不同的来源于人的肿瘤细胞株U343mga、人的肝癌细胞株Hep3B、人的乳腺癌细胞株MCF7和人的肉瘤细胞株4SS。将细胞平铺在未涂覆的组织培养皿上，并且在37℃下在具有用5％CO2平衡的湿润空气的温育器中进行培养(所述培养基中添加了10％的FCS和PEST(青霉素100IU/mL和链霉素
100mg/mL))。为了细胞的通过，将细胞用胰蛋白酶-EDTA(具有0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA、不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS))进行胰蛋白酶化。
100mg/mL))。为了细胞的通过，将细胞用胰蛋白酶-EDTA(具有0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA、不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS))进行胰蛋白酶化。
[0072] 实施例3化合物Ⅰa的细胞摄取
[0073] 将U343mga细胞以75％的细胞密度平铺在Petri培养皿上，并且用溶于组织培养基的1,4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)或Ⅰa温育6小时。两种含硼化合物均以相对于硼含量(5×10-4mol/L硼)的等摩尔浓度加入并溶解在组织培养基中。通过除去含硼组织培养基以及为了从细胞上洗去过量的培养基而加入冷磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)来结束温育。通过使用橡胶淀帚从培养皿上铲下来而即刻收获细胞，它们在冷的PBS中收集并且通过离心形成沉淀。
[0074] 根据Bradford标准程序对细胞样品进行总蛋白分析。通过直流原生质原子发射光谱(DCP-AES)对沉淀细胞进行硼分析。在60℃下用硫酸/硝酸(1/1)对样品(50-130mg)消化。加入Triton X-100和水从而得到50mg组织/mL、15％总酸v/v和5％Triton X-100v/v的浓度。硼浓度是基于已知对照样品的。结果见下表1。由表1可以看出，化合物Ⅰa优于对作为硼苯丙氨酸(BPA)的硼的摄取。
[0075] 表1：不同的硼化合物的细胞摄取
[0076] 对于两个平行试验(试验1和2)中的不同的硼化合物来说，硼含量表示为U343mga细胞中总细胞蛋白的函数(μg硼/g细胞蛋白)(在试验1和试验2中分别为7.2和7.7μg硼/mL培养基)。
[0077]
[0078] 实施例4不同肿瘤细胞对Ⅰa化合物的摄取
[0079] 将四种来源于人的不同肿瘤细胞株：U343mga、Hep3B、MCF7和4SS以40-50％(低)以及90-100％(高)细胞密度平铺在Petri培养皿上，并且如上述用溶于组织培养基的Ⅰa温育6小时。通过除去含硼培养基以及为了从细胞上洗去过量的培养基而加入冷的PBS缓冲液来结束温育。通过使用橡胶淀帚从培养皿上铲下来而即刻收获细胞，它们在冷的PBS中收集并且通过离心形成沉淀。根据Bradford标准程序对细胞样品进行总蛋白分析(如上)。结果见下表2。对于以低和高细胞密度测试的所有四种人的肿瘤细胞株(胶质母细胞瘤(U343mga)、肝癌(Hep3B)、乳腺癌(MCF7)、肉瘤(4SS))对比中，发现Ⅰa是一种高效的硼载体。
[0080] 表2：化合物Ⅰa的细胞摄取。硼含量表示为总细胞蛋白的函数(μg硼/g细胞蛋白)。
[0081]
[0082] 实施例5化合物Ⅰa的细胞内保留
[0083] 将U343mga细胞以75％的细胞密度平铺在Petri培养皿上，并且用于组织培养基中的1,4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)或Ⅰa温育18小时。两种硼化合物均以相对于硼含量(5×10-4mol/L硼)的等摩尔的浓度加入组织培养基中。通过用没有硼的培养基代替含硼培养基而结束温育。细胞样品分别在时间点0、2和7小时进行取样，其中0时间点代表刚好用硼化合物温育18小时。
[0084] 细胞用冷的PBS洗涤，并通过使用橡胶淀帚从培养皿上铲下来而即刻将其收获，它们在冷的PBS中收集并且通过离心形成沉淀。同上述操作对细胞沉淀进行总蛋白和硼含量的分析。结果见下表3。随着细胞内的摄取，在培养基中的Ⅰa完全耗尽后7h时，保留在肿瘤细胞中的式(I)化合物为总摄取的45％。
[0085] 表3：在清除含硼培养基之后的0、2和7h时U343mga细胞中的硼含量(μg硼/g细胞沉淀)。
[0086]
[0087] 综上所述，正如实施例3-5中显示的，化合物Ⅰa已经在体外试验中显示出预期的结果，其在肿瘤细胞摄取、积累和保留方面都优于BPA。
[0088] 实施例6化合物Ⅰa的细胞毒性研究试验
[0089] 将含肽牛血清的细胞培养液置于37℃培养24h。将传代培养的小鼠成纤细胞L-929细胞，用细胞培养液制成1×105个/mL的细胞悬液，将该细胞悬液接种于96孔细胞培养板(100μl/孔)，置37℃二氧化碳培养箱中培养24h。等细胞贴壁生长后，去除上清液，加入对照液(不含化合物Ⅰa)，试验组(Ⅰa的浓度为5mmol/L)的培养液进行交换，置37℃二氧化碳培养箱中继续培养。于2天后取出，加入MTT液继续培养4h。吸除原液，加入DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为630nm下测定其吸光度值，并根据其吸光度按公式计算细胞的相对增殖度(RGR)。结果见下表4。
[0090] 表4：MTT比色法测得的细胞相对增殖度(RGR)结果
[0091]
[0092] 注：
[0093] 根据细胞相对增殖度来评定细胞的毒性反应，见下表5。
[0094] 表5：细胞毒性反应评定
[0095]
[0096] 结论：由表5可以看出，化合物Ⅰa并没有出现任何毒性的迹象。
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