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一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法

阅读：617发布：2020-05-16

专利汇可以提供一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，将手术或活检标本用中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切多张白片，选择其中一张白片行HE 染色，在光学显微镜下观察HE染色片的肿瘤组织细胞分布，并标记出靶细胞的分布区域；剩余白片经烤片后再进行二甲苯脱蜡，然后对照标记好的HE染色片将白片上富含靶细胞的组织刮下富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取。该方法能够提高靶细胞的核酸浓度，达到40%至60%以上，从而提高分子病理检测阳性率，减少假阴性率，不需要昂贵的仪器设备和专门复杂的技术，几乎无明显的时间消耗，适宜在所有检验病理科和生物实验室推广应用，对临床诊断治疗提供更为准确的分子诊断。，下面是一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于：将手术或活检标本用中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切多张白片，选择其中一张白片行HE染色，在光学显微镜下观察HE染色片的肿瘤组织细胞分布，并标记出靶细胞的分布区域；剩余白片经烤片后再进行二甲苯脱蜡，然后对照标记好的HE染色片将白片上富含靶细胞的组织刮下富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取，即可。
2.根据权利要求1所述的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将手术或活检标本先用中性福尔马林固定，然后进行组织脱水、浸蜡、石蜡包埋和切片；
（2）控温60～95℃，考片15~60min，使蜡片牢固地粘附在玻片上；
（3）用二甲苯对切片脱蜡；
（4）选择其中一张切片行病理标准程序上的HE染色，并在常规光学显微镜下观察，标记出靶细胞分布范围；
（5）剩余白片用乙醇水溶液由高浓度逐级下行至低浓度乙醇水溶液清洗二甲苯，接着将白片置于清水中清洗掉乙醇；
（6）对照标记好的HE染色片，将清洗掉乙醇的剩余白片上富含靶细胞的组织用刀片刮下，富集靶细胞，并立即转到离心管内；
（7）按常规方法提取靶细胞核酸。
3.根据权利要求2所述的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，巨大器官组织要切开固定8～24h，小块组织的固定时间3.5~4.5h。
4.根据权利要求2所述的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，由低浓度逐级上行至高浓度乙醇水溶液脱水，乙醇水溶液的浓度为70～100%。
5.根据权利要求2所述的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，用于浸蜡的石蜡熔点为56～58℃。
6.根据权利要求2所述的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，石蜡包埋时，把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。
7.根据权利要求2所述的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，切片的厚度为4-10μm。
8.根据权利要求2所述的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于，所有操作步骤，禁止细胞片裸露在空气中。
9.根据权利要求2所述的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于，所述的HE染色片为：从手术病理石蜡包埋组织、穿刺组织、胃肠镜活检以及细胞涂片中通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。
10.根据权利要求1或2所述的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，其特征在于，所述的核酸包括DNA、RNA和miRNA。

说明书全文

一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及核酸的提取方法，具体涉及一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法。

背景技术

[0002] 现有的提取石蜡组织切片核酸的方法，先采用石蜡切片机对石蜡组织块切片（又称切白片或切卷片）中包含的菲薄组织细胞脱蜡，酒精溶解至水，然后进行蛋白酶消化，冷冻离心纯化后用酚氯法或试剂盒提取核酸。由于切片组织中共同生长不同良恶性质的组织细胞以不同成份比例存在并各有差异，导致所提取的细胞总核酸成份是上述不同性质组织细胞的混合体，影响实现目标数据的真实性。为达到实验观察准确反应目标组织细胞核酸的目的，从而使实验结果真实反应目标核酸数据的科学性、准确性、重复性，对目标核酸实验结果应用到医学基因检测应用，在提取核酸前分离富集目标核酸，然后提取，可以真实反应白片中全部细胞中的靶细胞核酸质量，具有重要的临床评估意义，产生关键临床诊疗应用价值。

[0003] 比如，肺癌白片中由不同比例的肺组织和癌组织共同存在，肺组织细胞核中只具有没有EGFR基因突变的野生型细胞，亚洲人癌组织中约60%以上是同样EGFE野生型细胞。如果不在提取总核酸前去除肺组织野生型细胞，他们与癌组织中60%以上的野生型细胞混在一起提取核酸，将大大增加EGFR野生型核酸数量和比例，导致突变型肺癌细胞含量可能下降到25%比例以下，这时有些基因检测方法和技术很难检测出该白片组织中有EGFR突变的肺癌细胞，导致临床医师依据EGFR基因突变假阴性结果制定不采用靶向治疗方案，患者失去对存在少量突变型肺癌细胞治疗而获益的机会。反之，如果先将正常肺组织EGFR野生型细胞剔除只剩下肺癌组织，其中EGFR突变型癌细胞所含核酸浓度比例上升易于检出。

[0004] 目前国内少数提取石蜡组织核酸的技术，基本没有应用切白片并经HE染色对照富集并保护脱蜡切片后核酸再提取，而是未经HE染色病理观察标本靶细胞区域，用囫囵机械破碎或沸水煮化石蜡组织或卷片后，在离心管内直接脱蜡的方法。例如：常明等，肾穿刺活检石蜡组织切片DNA的提取和PCR扩增[J]，中华肾脏病杂志，2007，23（11）：740-743；王丽江等，石蜡组织提取DNA4种方法的比较[J]，诊断病理学杂志，2004，11（1）：57-58。

发明内容

[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，该方法以HE染色片为模板，将白片上的靶细胞经光镜下富集并提取靶细胞核酸。

[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0007] 一种从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，将手术或活检标本用中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切5-15张白片，选择其中一张白片行HE染色，在光学显微镜下观察HE染色片的肿瘤组织细胞分布，并标记出靶细胞的分布区域。白片烤片后二甲苯脱蜡，然后对照标记好的HE染色片将白片上富含靶细胞的组织刮下以富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取即可。

[0008] 上述从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，具体步骤包括：

[0009] （1）将手术或活检标本用中性福尔马林固定。巨大器官组织要切开固定8～24h，小块组织的固定时间约4h左右。

[0010] （2）组织脱水。由低浓度逐级上行至高浓度乙醇脱水（一般70～100%的浓度），逐步置换组织内的水份。

[0011] （3）浸蜡。用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低（56～58℃）。根据脱水机配有的蜡缸数量，设定标准浸蜡程序，浸蜡采用二级至四级。不同大小和厚薄的组织浸蜡时间有所不同，一般为1～3h。

[0012] （4）石蜡包埋。组织经浸蜡后即进行包埋。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。

[0013] （5）切片。切片的厚度应为4-10μm。

[0014] （6）烤片。切出的蜡片标号后放入约60～95℃的烤箱内或65℃以上恒温热板上烤烘15～60分钟，使蜡片牢固地粘附在玻片上。烤烘切片的温度一般比包埋石蜡的熔点高5℃左右。

[0015] （7）切片脱蜡脱蜡一般用分析纯或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为0.5-12h。如果脱蜡剂使用多次或室温较低，或组织致密均需延长脱蜡时间。

[0016] （8）选择一张切片行病理标准程序上的HE染色。并在常规光学显微镜下观察，用标记笔画出靶细胞分布范围，耗时在2min之内。

[0017] （9）其他白片用乙醇由高浓度逐级下行至低浓度乙醇清洗二甲苯（一般70%～100%的浓度）。接着将片子置于清水中清洗掉乙醇。

[0018] （10）对照标记好的HE染色片，将剩余白片上富含靶细胞的组织用干净的刀片刮下以富集靶细胞，使靶细胞成份比例达到白片总组织细胞成份40～60%以上，并立即转到离心管内。

[0019] （11）按说明书提取靶细胞核酸即可。

[0020] 操作全过程中，禁止细胞片裸露在空气中。

[0021] 所述的HE染色片为：从手术病理石蜡包埋组织、穿刺组织、胃肠镜活检以及细胞涂片中通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。

[0022] 所述的核酸包括DNA、RNA和miRNA。

[0023] 步骤（11）中，采用常规方法或采用常规试剂盒进行核酸提取。

[0024] 近年来，随着核酸提取技术方法及试剂盒质量的进步，对石蜡残微核酸的提取纯化有了极大地进步，但还不能满足靶细胞石蜡白片提取靶细胞目标核酸的需求。本发明通过创造，根据HE染色片的组织分布情况富集石蜡白片的靶细胞，然后再从富集的靶细胞中提取高浓度肿瘤细胞成份核酸，能够获得临床真正需要的，有针对性突变的核酸等，可以极大地减少或消除基因检测假阴性实验数据，为临床应用提供准确数据。

[0025] 有益效果：与现有技术相比，本发明的从标本中快速富集并提取靶细胞核酸的方法，先对手术标本的常规HE染色片进行靶细胞范围标记，然后再根据标记范围刮取石蜡白片上的靶细胞，对富集的靶细胞进行核酸的提取，能够提高靶细胞的核酸浓度，达到40%至60%以上，从而提高分子病理检测阳性率，减少假阴性率，不需要昂贵的仪器设备和专门复杂的技术，几乎无明显的时间消耗，适宜在所有检验病理科和生物实验室推广应用，对临床诊断治疗提供更为准确的分子诊断，能够产生很好的社会效应。
附图说明

[0026] 图1是未作镜检富集选择靶区大肠癌组织细胞提取核酸进行敏感度参比测序图；

[0027] 图2是作镜检富集选择靶区大肠癌组织细胞提取核酸进行敏感度参比测序图。

具体实施方式

[0028] 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。

[0029] 以下实施例所使用的材料为：从各种手术获取的细胞学和病理石蜡包埋组织（FFPE）、穿刺组织、胃肠镜活检标本，通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。

[0030] 各材料的正常病理步骤切片、染色可以为：

[0031] （1）手术石蜡组织切片染色：各种组织标本经大体观察，取材，记录登记后，针对病理部位切取的小于2cm边长及2mm厚组织块，进入甲醛类固定，顺序酒精脱水和二甲苯—石蜡浸蜡流程，按包埋成石蜡组织块，用切片机切成4-10um厚白片，烤化1h，脱蜡至水后进入HE染色流程（苏木素染色，水洗后盐酸分化，热水和自来水流水漂洗，酒精二甲苯顺序脱水），中性树胶封片，镜检病理诊断后，HE切片归档保存及二次会诊分子病理检测应用。

[0032] （2）穿刺或内镜活检染色：各种组织标本经大体观察，取材，记录登记后，进入甲醛类固定，顺序脱水和二甲苯—石蜡浸蜡流程，按记录单包埋成石蜡组织块，用切片机切成4-10um厚白片，烤化1h，脱蜡至水后进入HE染色流程（苏木素染色，水洗后盐酸分化，热水和自来水流水漂洗，酒精二甲苯顺序脱水），中性树胶封片，镜检病理诊断，HE切片归档保存或二次会诊分子病理检测应用。

[0033] 实施例1白片的脱蜡

[0034] 将白片视标本大小选择数张（2-15张）浸入二甲苯浸泡8～12h，充分溶解石蜡；更换新的二甲苯溶解石蜡，浸泡15～20min；再次更换二甲苯，浸泡15min；取出白片立即用无水乙醇浸泡10min以上，充分溶解二甲苯；更换入新的无水乙醇，浸泡10min，然后依次进行95%乙醇浸泡5min；80%乙醇浸泡5min；70%乙醇浸泡2min；自来水稍洗2min，蒸馏水洗2min，吸干，然后滴加核酸保护液50uL。显微镜下将HE染色片上靶细胞用记号笔圈选出来，并在HE片的指导下在白片的相同位置也将靶细胞用记号笔圈选出来，将靶细胞刮下富集并立即转到离心管内。细胞刮片的全过程中，禁止细胞刮片裸露在空气中。

[0035] 脱蜡前白片要经60℃以上烘烤，这样使组织与玻璃片粘贴牢固。组织切片脱蜡应彻底，脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间，所有的时间都是指新的二甲苯在室温25℃以下时，如果二甲苯是用过一段时间，切片又比较厚，室温低应增加脱蜡时间。

[0036] 实施例2大肠癌（病理号082379）HE染色片指导下的靶细胞的挑选[0037] HE染色切片在提取核酸前必须经过病理或细胞学医师复检诊断，明确含有靶细胞成分，在玻片上标示出靶细胞位置。用实施例1的方法，提取DNA模板，用K-ras-2基因的引物（K-ras-2-U：-aggcctgctgaatttgactg-，K-ras-2-L：-catgattttggtcagagaaacc-；）进行PCR扩增（QIAGEN HotStar DNA polymerase Kit10×扩增缓冲液2uL，dNTP2U，上2+
下游引物各10pmol，模板DNA0.1～2ug Taq DNA聚合酶2.5u，Mg 1.5mmol/L加双蒸水至
20ul。PCR热循环条件：95℃10min，95℃40s，60℃1min，72℃45s，30个循环，72℃45min，
4℃保温）后，对产物进行纯化并测序（常规方法），结果如图1和图2所示，发现通过镜检选择靶区大肠癌组织细胞提取核酸，可以明显提高k-ras基因突变率和基因检测准确性。图
1为正常细胞和肿瘤细胞混合的DNA测序结果，其中并没有发现k-ras基因的突变，图2为在镜下选取肿瘤细胞后提取的DNA测序结果，其中检测出30%比例的k-ras基因突变，说明通过镜检选择靶区大肠癌组织细胞提取核酸，可以明显提高k-ras基因突变率和基因检测准确性。

[0038] 实施例2

[0039] （1）目标核酸稀释比例变异与测序检测敏感度关系。

[0040] 以人类大肠癌SW480K-ras G12V突变系与人大肠癌SW116K-ras G12T野生细胞系为目标核酸以梯度稀释比例变异作为敏感度观察对象，二种细胞系混合成25uL DNA模板体系，其中SW480K-ras G12V突变株细胞系分别以20%、15%、10%、5%和0%梯度比例递减与SW110株混合，每梯度设5个复孔混合，按相同常规方法进行PCR和正反向基因测序，以AB3100-avant测序仪记录突变状况（GGT>GTT）和突变峰高值，见下表1。可见，目标核酸需要达到一定量比浓度才能在肿瘤和正常组织突变与野生环境下的共生状态下被检测出来。

[0041] 表1K-ras G12V与K-ras G12T梯度稀释测序敏感度峰高比

[0042]

[0043]

[0044] （2）目标核酸双盲室间参比吻合率与HE片观察白片目标核酸富集与否的关系。

[0045] 1、目标核酸阳性重复性实验：应用10例已经基因测序证实人类大肠癌K-ras突变/野生状态石蜡白片样本，在双盲状态下在甲乙实验室重复测序，重复验证同一蜡块白片，结果如表2所示。实验结果相同，说明，该系统在不同实验室的应用具有适应临床医学标本检测的稳定性和重复性。

[0046] 表2甲乙实验室相同病例大肠癌白片K-ras基因测序重复性双盲对比验证[0047]Specimens ID 甲方coding results 乙方test results Concordance
甲方KRAS#1 Q61H Q61H Matched
甲方KRAS#2 WT WT Matched
甲方KRAS#3 G13D G13D Matched
甲方KRAS#4 WT WT Matched

[0048]甲方KRAS#5 G12D G12D Matched
甲方KRAS#6 WT WT Matched
甲方KRAS#7 WT WT Matched
甲方KRAS#8 G13D G13D Matched
甲方KRAS#9 WT WT Matched
甲方KRAS#10 G12A G12A Matched

[0049] 2、目标核酸富集与不富集处理可靠性对比实验：以10例已经基因测序证实的人大肠癌K-ras突变/野生状态石蜡样本，甲实验室每例均经本方法富集了肿瘤细胞，而乙实验室每例都不经本方法富集而直接提取DNA。在双盲条件下，双方实验室比对目标核酸基因测序结果如表3所示。

[0050] 表3 K-ras基因测序富集/不富集对比验证

[0051]Specimens ID 乙方coding results 甲方test results Concordance
乙方KRAS#1 G12C WT NOT Matched
乙方KRAS#2 G12S WT NOT Matched
乙方KRAS#3 WT WT Matched
乙方KRAS#4 WT WT Matched
乙方KRAS#5 WT WT Matched
乙方KRAS#6 G12V WT NOT Matched
乙方KRAS#7 Q61（END） WT NOT Matched
乙方KRAS#8 G13D WT NOT Matched
乙方KRAS#9 G12D.G13D WT NOT Matched
乙方KRAS#10 WT WT Matched

[0052] 从表3结果可知，在甲乙实验室实验体系重复稳定的情况下，对两家实验室采用富集或不采用本方法富集目标靶细胞核酸方法流程，导致上述6/10例实验数据出现偏差，提示其中6例的不匹配病例存在着k-ras基因突变临界数据的状态，如果不富集会出现假阴性结果。

[0053] 表4甲乙实验室4例富集目的核酸的大肠癌白片K-ras基因检测双盲对比验证[0054]

[0055]Specimens ID 乙方coding results 甲方test results Concordance
乙方KRAS#6 G12V G12V Matched
乙方KRAS#8 G13D G13D Matched
乙方KRAS#11 G12A G12A Matched
乙方KRAS#12 WT WT Matched

[0056] 从表4的结果，可见甲乙实验室双盲条件下采用相同富集技术方法后，对临界性k-ras基因突变石蜡组织白片困难模板抽提目标核酸，均得到完全相同的实验数据，避免了假阴性/假阳性结果。

[0057] 另外国外实验室及科研生物类实验室采用显微切割技术获取目标靶细胞，不仅需要数十万至百万昂贵的进口设备，还要学习掌握复杂的操作技术，每次耗时达4-6h以上，每次切割只能获取3-10个左右的细胞，为满足实验需要，切割动作至少要10-20次以上，且有20%左右的肿瘤间质细胞、炎细胞和血管内皮细胞混入，在干燥的激光辐射发热环境操作下，有破坏核酸、降解核酸的风险。但是，国际上目前尚无其他适用技术有效获取光镜观察到的目标靶细胞核酸成份。所以，本发明的方法，有效、真实，可以大量快捷的获取HE片观察后的靶细胞核糖核酸，实用性好，并且适宜推广应用。

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