技术领域
[0001] 本
发明属于长节段外周神经损伤修复技术领域，涉及一种全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法。
背景技术
[0002] 周围神经损伤，尤其是长节段的周围神经缺损的修复以及功能重建一直是再生医学领域研究的重大课题。
[0003] 虽然周围神经具有再生的能
力，但这种再生能力的效能较低，容易被周围的疤痕所阻挡，从而使再生轴突分散，最终形成神经瘤。当前，自体神经移植被认为是
治疗周围神经损伤或病灶
切除后造成缺损的最有效的方法。然而，这种组织移植方法往往伴有供区新的创伤、免疫排斥反应或受到供区或供体其他许多条件的限制，以至于不能达到理想的修复效果。因此，人工组织工程神经
支架则成为了解决这一问题的重要手段之一。
[0004] 众所周知，组织 工程支架、种子细胞和生长因子(或
生物反应器)是组织工程的三大要素。其中，组织工程支架和种子细胞是其中最重要的两个因素。将功能性种子细胞接种到支架中修复组织缺损，往往能达到类似于自体组织移植的良好修复效果。因此，功能性的接种有种子细胞的神经支架具有非常可观的临床应用前景。然而，随着研究的进一步深入，学者们发现当组织的体积达到数立方毫米时，其内部的细胞将难以通过渗透作用获得营养和
氧分的支持。如何才能够保证接种到神经组织工程支架中的功能性细胞既能够大量、均匀的分布，又能够保持良好的活性和功能状态，成为了目前一个急需要解决的问题。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法，解决了现有神经导管联合种子细胞修复长节段神经缺损时出现的早期氧供不足的问题。
[0006] 本发明所采用的技术方案是，全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法，具体按照以下步骤实施:
[0007] 步骤1、制备多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
[0008] 步骤2、采用京尼平和
乙醇混合溶液对经步骤I制得的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行交联及消毒处理；
[0009] 步骤3、种子细胞的培养与纯化；
[0010] 步骤4、制备无菌的全氟三乙胺乳液；
[0011] 步骤5、将经步骤4配制的全氟三乙胺乳液与经步骤3得到的种子细胞混合，并用双筒等量
注射器注射到步骤2得到的消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，得到本发明的全氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。
[0012] 本发明的特点还在于，
[0013] 步骤I具体按照以下步骤实施:[0014] 步骤1.1、分别称取I型
胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳聚糖的
质量比为I 〜8:1 ;
[0015] 步骤1.2、将经步骤1.1称取的I型胶原蛋白放入
冰醋酸中，将壳聚糖放入配制的醋
酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解后形成两种悬浊液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；
[0016] 步骤1.3、将经步骤1.2.4配制的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液倒入神经导管成形模具中，进行注模和冷淋固形处理；
[0017] 步骤1.4、制备出多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管。
[0018] 步骤1.2具体按照以下步骤实施:
[0019] 步骤1.2.1、配制质量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；
[0020] 步骤1.2.2、按步骤1.1中称取的I型胶原蛋白的质量取冰醋酸，每克I型胶原蛋白加入IOml的冰醋酸溶液，将量取的冰醋酸与I型胶原蛋白混合，经22h〜26h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰醋酸的悬浊液；
[0021] 按步骤1.1中称取的壳聚糖的质量取步骤1.2.1中配制的醋酸溶液，每克的壳聚糖加入37ml的冰醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚糖混合，经22h〜26h的溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；
[0022] 步骤1.2.3、将经步骤1.2.2得到的I型胶原蛋白和醋酸的悬浊液与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于2V〜6°C条件下，恒温搅拌处理70min〜llOmin，得到混合悬浊液；
[0023] 步骤1.2.4、将经步骤1.2.3得到的混合悬浊液先进行抽
真空处理，之后再静置IOh〜14h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液。
[0024] 步骤1.3具体按照以下步骤实施:
[0025] 步骤1.3.1、将经步骤1.2.4得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入神经导管成形模具中，以小
铁夹固定神经导管成形模具的两端；
[0026] 步骤1.3.2、在微型调速仪作用下，以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以1.2X IO-Vs的速度缓慢浸入液氮中，对注入神经导管成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液进行冷淋固形处理，待神经导管成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留IOh 〜14h ；
[0027] 步骤1.3.3、经步骤1.3.2，将神经导管成形模具连同内部注入的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-90°C〜_70°C的
冰箱中冷藏。
[0028] 步骤1.4具体按照以下步骤实施:
[0029] 步骤1.4.1、将神经导管成形模具从-90°C〜-70°C的冰箱取出，迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和
铜管；
[0030] 步骤1.4.2、经步骤1.4.1，将神经导管成形模具放置于预冷好的
冷冻干燥机中冻干46h〜50h，其中
冷冻干燥机设置的预冷参数为:-60°C、IOOmtorr ；
[0031] 步骤1.4.3、将经步骤1.4.2冻干处理后的神经导管成形模先具放置于真空状态下并升温至0°c，保持5.5h〜6.5h，之后再升温至20°C〜24°C，保持30min〜60min，解除真空状态，最后升至常温；
[0032] 步骤1.4.4、经步 骤1.4.2和步骤1.4.3冻干成形处理后，将神经导管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的神经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管。
[0033] 步骤2具体按照以下步骤实施:
[0034] 步骤2.1、分别称取京尼平和无
水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合，配制成质量百分比浓度为0.5%〜1.5%的京尼平和乙醇混合溶液；
[0035] 步骤2.2、将经步骤I制备出的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管放入步骤2.1中配制的京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46h〜50h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要加入20ml的京尼平和乙醇混合溶液；
[0036] 步骤2.3、经步骤2.2交联处理后，将多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精交替清洗25min〜35min ；
[0037] 步骤2.4、将经步骤2.3清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管置于常温下干燥一周，最后用Co60照射多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行消毒处理，得到消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管。
[0038] 步骤3具体按照以下步骤实施:
[0039] 步骤3.1、取鼠龄不超过2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液；
[0040] 步骤3.2、将经步骤3.1培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液进行GFAP及NGFRp75免疫细胞
荧光双重
染色鉴定，确定嗅鞘细胞的纯度:
[0041] 若嗅鞘细胞 的纯度达到95%则进入下一步骤；
[0042] 若嗅鞘细胞的纯度达不到95%，采用细胞差速贴壁的方法进行嗅鞘细胞的纯化，将经步骤3.1得到的嗅鞘细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养瓶，即得到纯度达到95%的嗅鞘细胞。
[0043] 步骤4具体按照以下步骤实施:
[0044] 步骤4.1、称取蛋黄卵磷脂加入到台式液内，配制成质量体积百分比浓度为15.2%〜16.4%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于250W〜350W功率下，超声乳化I〜3次，每次10〜20秒，每两次超声乳化之间间隔I分钟，制备出
基础乳液；
[0045] 步骤4.2、另取全氟三乙胺原液，将经步骤4.1制备出的基础乳液与全氟三乙胺原液按体积比为3:2混合，并于250W〜350W功率下，超声乳化8〜12次，每次10〜20秒，每两次超声乳化之间间隔I分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；
[0046] 步骤4.3、将经步骤4.2制备的全氟三乙胺乳液放入
高压氧舱内8min〜12min,使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气,使其达到饱和状态；
[0047] 步骤4.4、采用滤膜孔径不大于0.65 μ m的滤器对经步骤4.3处理后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液。
[0048] 步骤4.2中全氟三丁胺原液浓度大于98%。
[0049] 步骤5具体按照以下步骤实施:
[0050] 步骤5.1、凝血酶溶液和
纤维蛋白原溶液的制备:
[0051] 将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.02g/ml的凝血酶溶液；
[0052] 将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；
[0053] 步骤5.2、将经步骤4配制的全氟三乙胺乳液加入到步骤5.1制备的凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与凝血酶溶液的体积比是I〜4:8〜1，制备出全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液；
[0054] 步骤5.3、将步骤3中制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到步骤5.2配制的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有IO4〜IO6个嗅鞘细胞的混合溶液A ；
[0055] 步骤5.4、量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白原溶液，将混合溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将纤维蛋白原溶液置于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的顶部，混合溶液A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反应，形成胶状混合物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入经步骤2得到的消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。
[0056] 本发明的有益效果在于，
[0057] (I)本发明的神经导管制备方法中选择多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管、全氟三丁胺(Perf luorotributylamine, PFTBA)乳液及种子细胞,构建“种子细胞早期增氧系统”，其中将全氟三丁胺作为增氧剂，为植入多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内的种子细胞提供早期的氧供，提高了种子细胞的存活率，保持了种子细胞的活性和功能，从而最大限度的发挥功能性神经支架的修复能力，促进了神经再生和功能的恢复。
[0058] (2)采用本发明的神经导管在受损神经修复再生的过程中，种子细胞扮演着重要
角色，发挥着至关重要的作用，失去必要和充足的种子细胞的支持，神经再生几乎无法获得成功。
[0059] (3)本发明的神经导管制备方法通过改善功能性种子细胞种植入神经导管内早期的存活效率，提高功能性神经导管的促进神经再生和功能恢复，提高伤患的
生活质量，具有很高的经济和社会效益。
附图说明
[0060] 图1是本发明中用到的神经导管成形模具的结构图。
[0061] 图中，1.铜管，2.中空
硅胶管，3.实心不锈
钢管，4.填充的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液。
具体实施方式
[0062] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
[0063] 本发明的全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法，具体按照以下步骤实施:
[0064] 步骤1、制备多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管:
[0065] 步骤1.1、分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳聚糖的质量比为I 〜8:1 ;
[0066] 步骤1.2、将经步骤1.1称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将壳聚糖放入配制的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解后形成两种悬浊液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液:
[0067] 步骤1.2.1、配制质量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；
[0068] 步骤1.2.2、按步骤1.1中称取的I型胶原蛋白的质量取冰醋酸，每克I型胶原蛋白加入IOml的冰醋酸，将量取的冰醋酸与I型胶原蛋白混合，经22h〜26h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰醋酸的悬浊液；
[0069] 按步骤1.1中称取的壳聚糖的质量取步骤1.2.1中配制的醋酸溶液，每克的壳聚糖加入37ml的醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚糖混合，经22h〜26h的溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；
[0070] 步骤1.2.3、将经步骤1.2.2得到的I型胶原蛋白和醋酸的悬浊液与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于2V〜6°C条件下，恒温搅拌处理70min〜llOmin，得到混合悬浊液；
[0071] 步骤1.2.4、将经步骤1.2.3得到的混合悬浊液先进行抽真空处理，之后再静置IOh〜14h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；
[0072] 步骤1.3、将经步骤1.2.4配制的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液倒入神经导管成形模具中，进行注模和冷淋固形处理:
[0073] 制备多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管所采用的神经导管成形模具，如图1所示，包括有中空硅胶管2，中空硅胶管2的两端各连接有一个大小相同的中空铜管1，中空硅胶管2内的空腔为一个实心
不锈钢管3，实心不锈钢管3与中空硅胶管2之间填充有I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液，其中，中空铜管I的尺寸为:长2cm，横截面外径为2.5mm,横截面内径为1.5mm ;中空娃胶管2的尺寸为:长IOcm,横截面外径为3.0mm,横截面内径为2.5mm ；实心不锈钢管3的尺寸为:长10cm，横截面直径为1.5mm。
[0074] 步骤1.3.1、将经步骤1.2.4得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入神经导管成形模具中，以小铁夹固定神经导管成形模具的两端，防止I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液流出；
[0075] 其中铁夹上面有个洞，线可以传过去，所以可以固定神经导管成形模具，然后将神经导管成形模具放入液氮中；
[0076] 步骤1.3.2、在微型调速仪作用下，以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以1.2X IO-Vs的速度缓慢浸入液氮中，对注入神经导管成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液进行冷淋固形处理，待神经导管成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留IOh 〜14h ；
[0077] 步骤1.3.3、经步骤1.3.2，将神经导管成形模具连同内部注入的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-90°C〜_70°C的冰箱中冷藏；
[0078] 步骤1.4、制备出多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管:
[0079] 步骤1.4.1、将神经导管成形模具从-90°C〜-70°C的冰箱取出，迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管；
[0080] 步骤1.4.2、经步骤1.4.1，将神经导管成形模具放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干46h〜50h，其中冷冻干燥机设置的预冷参数为:-60°C、IOOmtorr ；
[0081] 步骤1.4.3、将经步骤1.4.2冻干处理后的神经导管成形模先具放置于真空状态下并升温至0°c，保持5.5h〜6.5h，之后再升温至20°C〜24°C，保持30min〜60min，解除真空状态，最后升至常温；
[0082] 步骤1.4.4、经步骤1.4.2和步骤1.4.3冻干成形处理后，将神经导管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的神经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管。
[0083] 步骤2、采用京尼平和乙醇混合溶液对经步骤I制得的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行交联及消毒处理:
[0084] 步骤2.1、分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合，配制成质量百分比浓度为0.5%〜1.5%的京尼平和乙醇混合溶液；
[0085] 步骤2.2、将经步骤I制备出的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管放入步骤2.1中配制的京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46h〜50h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要加入20ml的京尼平和乙醇混合溶液；
[0086] 步骤2.3、经步骤2.2交联处理后，将多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精交替清洗25min〜35min ；
[0087] 步骤2.4、将经步骤2.3清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管置于常温下干燥一周，最后用Co60照射多 微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行消毒处理，获得消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管。
[0088] 步骤3、种子细胞的培养与纯化:
[0089] 步骤3.1、取鼠龄不超过2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液；
[0090] 步骤3.2、将经步骤3.1培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液进行GFAP及NGFRp75免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定嗅鞘细胞的纯度:
[0091] 若嗅鞘细胞的纯度达到95%则进入下一步骤；
[0092] 若嗅鞘细胞的纯度达不到95%，采用细胞差速贴壁的方法进行嗅鞘细胞的纯化，将经步骤3.1得到的嗅鞘细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养瓶中，即得到纯度达到95%的嗅鞘细胞。
[0093] 其中，细胞差速贴壁的方法就是利用不同细胞贴壁的时间不同的原理，
成纤维细胞会提前贴壁，而嗅鞘细胞会在12小时后才完全贴壁，所以，只需将细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养瓶就可以得到比较纯的嗅鞘细胞，因为成纤维细胞在前12个小时基本贴到第一个培养瓶底部了。
[0094] 步骤4、制备无菌的全氟三乙胺乳液:
[0095] 步骤4.1、称取蛋黄卵磷脂加入到台式液内，配制成质量体积百分比浓度为15.2%〜16.4%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于250W〜350W功率下，超声乳化I〜3次，每次10〜20秒，每两次超声乳化之间间隔I分钟，制备出基础乳液；
[0096] 步骤4.2、另取全氟三乙胺原液(全氟三乙胺原液的浓度要大于98%)，将经步骤4.1制备出的基础乳液与全氟三乙胺原液按体积比为3:2混合，并于250W〜350W功率下，超声乳化8〜12次，每次10〜20秒，每两次超声乳化之间间隔I分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；
[0097] 步骤4.3、将经步骤4.2制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内8min〜12min,使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气,使其达到饱和状态；
[0098] 步骤4.4、采用滤膜孔径不大于0.65 μ m的滤器对经步骤4.3处理后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液。
[0099] 步骤5、将经步骤4配制的全氟三乙胺乳液与经步骤3得到的种子细胞混合，并用双筒等量注射器注射到步骤2得到的消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，得到本发明的全氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管:
[0100] 步骤5.1、凝血酶溶液和纤维蛋白原溶液的制备:
[0101] 将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.02g/ml的凝血酶溶液；
[0102] 将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；
[0103] 步骤5.2、将经步骤4配制的全氟三乙胺乳液加入到步骤5.1制备的凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与凝血酶溶液的体积比是I〜4:8〜1，制备出全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液；
[0104] 步骤5.3、将步骤3中制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到步骤5.2配制的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有IO4〜IO6个嗅鞘细胞的混合溶液A ；
[0105] 步骤5.4、量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白原溶液，将混合溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将 纤维蛋白原溶液置于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的顶部，混合溶液A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反应，形成胶状混合物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入经步骤2得到的消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。
[0106] 其中，制备多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管用到的主要原料为I型胶原蛋白和壳聚糖。其中I型胶原蛋白主要由成纤细胞或与其来源相类似的细胞如:成骨细胞、成软骨细胞合成，生物体内胶原的合成,一般包括一系列的过程,其通过在胞内合成胶原蛋白分子形成前胶原，进而在胞外进一步聚合成胶原纤维和胶原束，I型胶原蛋白作为体外细胞培养支架时，有促进细胞黏附和诱导生长分化的作用，是良好的培养黏附剂。胶原与不同的细胞之间存在很强的亲和力，与在创伤的愈合过程中起到关键作用的生长因子间也有着特殊的亲和力，在血液
凝固后，还可以通过刺激组织的再生与修复来防止再次发生出血。
[0107] 壳聚糖是甲壳素N-脱乙酰基的产物，具有无毒性、无免疫原性、无热源反应、不溶血等特性，其可
生物降解性和良好的
生物相容性、成膜性，使其成为一种理想的安全可靠的天然生物活性支架材料。
[0108] 本发明中采用广州倍秀公司生产的猪源纤维蛋白水凝胶产品；该产品主要由A、B两个部分组成，A部分包括有纤维蛋白原干粉、X III因子及
磷酸盐缓冲液(即纤维蛋白原溶解液)，B部分包括有凝血酶原(即凝血酶冻干粉)及CaCl2溶液(凝血酶溶解液)。将A和B两个部分混合后形成了纤维蛋白
单体，纤维蛋白单体在氢键及静电引力的作用下，聚合成不稳定的可溶性纤维蛋白，纤维延长、变粗、形成具有凝胶外观的三维结构，形成纤维蛋白水凝胶，反应时间5〜10秒，3〜5分钟后产生明显强化，产生理想的
止血、封闭、粘合作用。[0109] 采用本发明的全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的仿生神经支架的制备方法制备出的神经支架在SD大鼠体内进行实验，将实验分成五组:自体神经移植组(A)，空管组(CF)，空管与种子细胞组(CFO)，空管与PFTBA组(CFP)，空管、种子细胞与PFTBA组(CFOP)。通过术后4，8，12周分别对各组大鼠坐骨神经指数(SFI)，再生轴突面积，肌纤维百分比，微血管计数，以及术后1，2周，CFO与CFOP组中存活细胞数等相关指标的比较，本发明的全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的仿生神经支架的坐骨神经指数(SFI)比其他的组都高、再生轴突面积和肌纤维百分比都较大，只比自体神经移植组略低。
[0111] 分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳聚糖的质量比为1:1;将称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将壳聚糖放入配制的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解后形成两种悬浊液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液:配制质量体积百分比浓 度为140mg/ml醋酸溶液；按I型胶原蛋白的质量取冰醋酸,每克I型胶原蛋白加入IOml的冰醋酸，将量取的冰醋酸与I型胶原蛋白混合，经22h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰醋酸的悬浊液；按壳聚糖的质量取配制的醋酸溶液，每克的壳聚糖加入37ml的醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚糖混合，经22h的溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；将得到的I型胶原蛋白和醋酸的悬浊液与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于2°C条件下，恒温搅拌处理70min，即得到混合悬浊液；将经得到的混合悬浊液先进行抽真空处理，之后再静置10h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；将得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入神经导管成形模具中，以小铁夹固定神经导管成形模具的两端；在微型调速仪作用下，以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以1.2X IO-Vs的速度缓慢浸入液氮中，对注入神经导管成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液进行冷淋固形处理，待神经导管成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留IOh ;将神经导管成形模具连同内部注入的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-90°C的冰箱中冷藏；将神经导管成形模具从_90°C的冰箱取出，迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管；将神经导管成形模具放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干46h，其中冷冻干燥机设置的预冷参数为:-60°C、lOOmtorr ;将冻干处理后的神经导管成形模先具放置于真空状态下并升温至0°C，保持5.5h之后再升温至20°C，保持30min，解除真空状态，最后升至常温；将神经导管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的神经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
[0112] 分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合，配制成质量百分比浓度为0.5%的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管放入京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为46h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要加入20ml的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精反复清洗25min ;将清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管置于常温下干燥一周，最后用Co60照射多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行消毒处理，获得消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
[0113] 取鼠龄不超过2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液；将培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液进行GFAP及NGFRp75免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞的纯度:若种子细胞的纯度达到95%则进入下一步骤；若种子细胞的纯度达不到95%，则采用细胞差速贴壁的方法进行种子细胞的纯化，将嗅鞘细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养瓶，即得到纯度达到95%的嗅鞘细胞；
[0114] 将蛋黄卵磷脂加入到台式液内配制成质量体积百分比浓度为15.2%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于250W功率下，超声乳化I次，每次10秒，制备出基础乳液；将基础乳液与全氟三丁胺PFTBA原液(浓度大于98%)混合，基础乳液和全氟三丁胺原液的体积比是3:2，并于250W功率下，超声乳化8次，每次超声乳化10秒，每两次超声乳化之间的时间间隔为lmin，得到全氟三丁胺乳液；将全氟三丁胺乳液放入高压氧舱内Smin ;采用滤膜孔径不大于0.65 μ m的滤器对全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液；
[0115] 将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.02g/ml的凝血酶溶液；将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；将无菌的全氟三丁胺乳液加入到凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与凝血酶溶液的体积比是1:8，制备出的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液；将制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有IO4个嗅鞘细胞的混合溶液A ;量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白原溶液，将混合溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将纤维蛋白原溶液置于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的顶部，混合溶液A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反应，形成胶状混合物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。
[0116] 实施例2
[0117] 分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳聚糖的质量比为4:1 ;将称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将壳聚糖放入配制的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解后形成两种悬浊液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液:配制质量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；按I型胶原蛋白的质量取冰醋酸，每克I型胶原蛋白加入IOml的冰醋酸溶液，将量取的冰醋酸与I型胶原蛋白混合，经24h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰醋酸的悬浊液；按壳聚糖的质量取配制的醋酸溶液，每克的壳聚糖加入37ml的冰醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚糖混合，经24h的溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；将得到的I型胶原蛋白和醋酸的悬浊液与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于4°C条件下，恒温搅拌处理90min，即得到混合悬浊液；将经得到的混合悬浊液先进行抽真空处理，之后再静置12h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；将得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入神经导管成形模具中，以小铁夹固定神经导管成形模具的两端；在微型调速仪作用下，以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以1.2X IO-Vs的速度缓慢浸入液氮中，对注入神经导管成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液进行冷淋固形处理，待神经导管成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留12h ;将神经导管成形模具连同内部注入的 I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-80°C的冰箱中冷藏；将神经导管成形模具从_80°C的冰箱取出，迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管；将神经导管成形模具放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干48h，其中冷冻干燥机设置的预冷参数为:-60°C、100mtorr ;将冻干处理后的神经导管成形模先具放置于真空状态下并升温至0°C，保持6h之后再升温至22°C，保持45min，解除真空状态，最后升至常温；将神经导管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的神经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
[0118] 分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合，配制成质量百分比浓度为1%的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管放入京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为48h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要加入20ml的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精交替清洗30min ;将清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管置于常温下干燥一周，最后用Co60照射多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行消毒处理，获得消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
[0119] 取鼠龄不超过2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液；将培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液进行GFAP及NGFRp75免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞的纯度:若种子细胞的纯度达到95%则进入下一步骤；若种子细胞的纯度达不到95%，则采用细胞差速贴壁的方法进行种子细胞的纯化，将嗅鞘细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养瓶，即得到纯度达到95%的嗅鞘细胞；
[0120] 将蛋黄卵磷脂加入到台式液内配制成质量体积百分比浓度为15.8%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于300W功率下，超声乳化2次，每次15秒，每两次之间的间隔为lmin，制备出基础乳液；将基础乳液与全氟三丁胺PFTBA原液(浓度大于98%)混合，基础乳液和全氟三丁胺原液的体积比是3:2，并于300W功率下，超声乳化10次，每次超声乳化15秒，每两次超声乳化之间的时间间隔为lmin，得到全氟三丁胺乳液；将全氟三丁胺乳液放入高压氧舱内IOmin ;采 用滤膜孔径不大于0.65 μ m的滤器对全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液；
[0121] 将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.02g/ml的凝血酶溶液；将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；将无菌的全氟三丁胺乳液加入到凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与凝血酶溶液的体积比是1:2，制备出的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液；将制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有IO5个嗅鞘细胞的混合溶液A ;量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白原溶液，将混合溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将纤维蛋白原溶液置于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的顶部，混合溶液A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反应，形成胶状混合物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。
[0122] 实施例3
[0123] 分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳聚糖的质量比为8:1 ;将称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将壳聚糖放入配制的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解后形成两种悬浊液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液:配制质量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；按I型胶原蛋白的质量取冰醋酸，每克I型胶原蛋白加入IOml的冰醋酸溶液，将量取的冰醋酸与I型胶原蛋白混合，经26h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰醋酸的悬浊液；按壳聚糖的质量取配制的醋酸溶液，每克的壳聚糖加入37ml的醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚糖混合，经26h的溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；将得到的I型胶原蛋白和醋酸的悬浊液与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于6°C条件下，恒温搅拌处理llOmin，即得到混合悬浊液；将经得到的混合悬浊液先进行抽真空处理，之后再静置14h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；将得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入神经导管成形模具中，以小铁夹固定神经导管成形模具的两端；在微型调速仪作用下，以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以1.2X IO-Vs的速度缓慢浸入液氮中，对注入神经导管成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液进行冷淋固形处理，待神经导管成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留14h ;将神经导管成形模具连同内部注入的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-70°C的冰箱中冷藏；将神经导管成形模具从_70°C的冰箱取出，迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管；将神经导管成形模具放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干50h，其中冷冻干燥机设置的预冷参数为:-60°C、lOOmtorr ;将冻干处理后的神经导管成形模先具放置于真空状态下并升温至0°C，保持6.5h之后再升温至24°C，保持60min，解除真空状态，最后升至常温；将神经导管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的神经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
[0124] 分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合，配制成质量百分比浓度为1.5%的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管放入京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交联时间为50h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要加入20ml的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精交替清洗35min ;将清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管置于常温下干燥一周，最后用Co60照射多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行消毒处理，获得消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
[0125] 取鼠龄不超过 2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液；将培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液进行GFAP及NGFRp75免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞的纯度:若种子细胞的纯度达到95%则进入下一步骤；若种子细胞的纯度达不到95%，则采用细胞差速贴壁的方法进行种子细胞的纯化，将嗅鞘细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养瓶，即得到纯度达到95%的嗅鞘细胞；
[0126] 将蛋黄卵磷脂加入到台式液内配制成质量体积百分比浓度为16.4%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于350W功率下，超声乳化3次，每次20秒，每两次之间的间隔为lmin，制备出基础乳液；将基础乳液与全氟三丁胺PFTBA原液(浓度大于98%)混合，基础乳液和全氟三丁胺原液的体积比是3:2，并于350W功率下，超声乳化12次，每次超声乳化20秒，每两次超声乳化之间的时间间隔为lmin，得到全氟三丁胺乳液；将全氟三丁胺乳液放入高压氧舱内12min ;采用滤膜孔径不大于0.65 μ m的滤器对全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液；
[0127] 将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.02g/ml的凝血酶溶液；将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混合，制成质量体积百分比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；将无菌的全氟三丁胺乳液加入到凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与凝血酶溶液的体积比是1: 1，制备出的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液；将制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有IO5个嗅鞘细胞的混合溶液A ;量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白原溶液，将混合溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将纤维蛋白原溶液置于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的顶部，混合溶液A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反应，形成胶状混合物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全氟三丁胺乳液与种子细 胞复合的神经导管。
