一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法
专利汇可以提供一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法，属动物 生物 技术领域。在猪 胎儿 成 纤维 细胞 的 基础 上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合 体细胞 核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的异种移植供体基础猪，在此基础猪上再定点插入hCD39、hTBM、REN三个修饰基因，构建多基因修饰的肾脏异种移植供体猪，再对该供体猪进行功能验证，获得适合肾脏异种移植的供体猪。本发明为适合异种肾脏移植供体猪的开发提供了科学的理论基础，为肾脏衰竭患者的移植 治疗 提供了希望。，下面是一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法专利的具体信息内容。
1.一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法，其特征在于：具体步骤为：
1）除引起抗原抗体免疫排斥反应的三个主要抗原基因
在猪成纤维细胞系的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除能够引起抗原抗体免疫排斥反应的GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个抗原特异基因；
2）定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因
在前期获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO三基因修饰的基础上，再定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰基础供体猪；
3）体细胞核移植和胚胎移植
利用体细胞核移植技术，将经筛选获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因细胞系进行体细胞核移植，待妊娠时取出胎儿鉴定基因的编辑情况，分离培养获得六基因修饰基础猪胎儿猪成纤维细胞系；
4）在此基础猪胎儿成纤维细胞的基础上，再定点插入hCD39、hTBM、REN三个特异修饰基因，构建出多基因修饰的肾脏异种移植供体猪；
5）对上述所获得的多基因修饰的肾脏异种移植供体猪进行功能验证，获得适合肾脏异种移植的供体猪。
2.根据权利要求1所述的一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法，其特征在于：步骤
5）中，功能验证包括人血清介导的细胞毒性实验、人补体介导的细胞毒性实验、补体激活实验、抗原抗体结合分析、细胞免疫组化分析、凝血相关检测和淋巴细胞活性检测。
一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法
技术领域
背景技术
发明内容
1）敲除引起抗原抗体免疫排斥反应的三个主要抗原基因
在上述猪成纤维细胞系的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个能引起抗原抗体免疫排斥反应的抗原基因；
2）定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因
在上述GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO三基因修饰的基础上，再定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的猪成纤维细胞系；
3）体细胞核移植和胚胎移植
利用体细胞核移植技术，将筛选获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因细胞系进行体细胞核移植和胚胎移植，待妊娠时取出胎儿鉴定胎儿基因的编辑情况，分离培养获得七基因修饰的异种移植基础供体猪胎儿成纤维细胞系；
4）在上述基础猪胎儿成纤维细胞上再定点插入hCD39、REN、hTBM三个肾脏特异的修饰基因，经细胞筛选、体细胞核移植和胚胎移植后获得多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪；
5）对上述所获得的多基因修饰的肾脏异种移植供体猪进行功能验证，获得适合心脏异种移植的供体猪。
具体实施方式
1）敲除引起免疫排斥反应的三个主要抗原基因
在猪成纤维细胞系的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个引起免疫排斥反应的抗原基因；
2）定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因
在上述GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO三基因修饰的基础上，再定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，构建获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的猪成纤维细胞系；
3）体细胞核移植和胚胎移植
利用体细胞核移植技术，将筛选获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因细胞系进行体细胞核移植和胚胎移植，待妊娠时取出胎儿鉴定基因编辑情况，分离培养获得六基因修饰的异种移植基础供体猪胎儿成纤维细胞系；
4）在上述分离培养的基础猪胎儿成纤维细胞的基础上再定点插入hCD39、REN和hTBM三个肾脏特异修饰的基因，筛选获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46/hCD39/REN/hTBM猪成纤维细胞系再进行体细胞核移植和胚胎移植后，构建获得多基因修饰的肾脏异种器官移植供体猪。
1）敲除引起免疫排斥反应的三个主要抗原基因
在猪成纤维细胞系的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个引起免疫排斥反应的抗原基因；
2）定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因
在上述GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO三基因修饰的基础上，再定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，构建获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的猪成纤维细胞系；
3）体细胞核移植和胚胎移植
利用体细胞核移植技术，将筛选获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因细胞系进行体细胞核移植和胚胎移植，待妊娠30天时取出胎儿鉴定基因编辑情况，分离培养获得六基因修饰的异种移植基础供体猪成纤维细胞系；
4）在上述分离培养的基础猪胎儿成纤维细胞系的基础上再定点插入hCD39、REN和hTBM三个肾脏特异修饰的基因，筛选获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46/hCD39/REN/hTBM多基因修饰的猪成纤维细胞系再进行体细胞核移植和胚胎移植，构建获得多基因修饰的肾脏异种器官移植供体猪；
5）对获得的多基因修饰的肾脏异种器官移植供体猪进行主要包括人血清介导的细胞毒性实验、人补体介导的细胞毒性实验、补体激活实验、抗原抗体结合分析、细胞免疫组化分析、凝血相关检测和淋巴细胞活性检测等的功能验证。
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