肌营养不良的治疗方法
阅读：209发布：2020-05-27
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1. 在受试者中治疗肌营养不良的方法，所述方法包括向患有肌营养不良的受试者给药 治疗有效量的化合物(I)或其药学上可接受的盐
从而治疗所述受试者。
2. 权利要求1的方法，其中所述肌营养不良选自迪谢纳营养不良、贝克肌营养不良、埃- 德肌营养不良、肢带型肌营养不良、面-肩-化型肌营养不良、强直型肌营养不良、眼咽型肌 营养不良、远端型肌营养不良或先天型肌营养不良。
3. 权利要求2的方法，其中所述肌营养不良是迪谢纳营养不良。
4. 前述任一项权利要求的方法，其中所述方法包括部分或完全减轻笨拙的行走、步进 或跑步的方式;频繁摔倒;疲劳;运动技能困难;肌纤维崎形;假性肥大;骨骼崎形;低耐力； 独自站立困难或无法上楼梯;运动丧失；擁痕；屯、肌病；充血性屯、力衰竭的发展；和屯、律不 齐。
5. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法提高(例如，增加、延长)寿命。
6. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法包括改善至少一种症状，例如，本文所 述的症状。
7. 权利要求6的方法，其中所述症状为疲劳、学习困难、智力障碍、肌无力、运动技能困 难、行走困难、呼吸困难、屯、脏病、屯、肌病、充血性屯、力衰竭、屯、律失常、脊柱侧凸、假性肥大、 肌萎缩、肌肉李缩、肌肉崎形和呼吸障碍(例如，肺炎）。
8. 前述任一项权利要求的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐W多剂量进行 给药，例如，W预定的时间间隔给药。
9. 前述任一项权利要求的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐经长期给药(例 如，每1、2、3、4、5、6天、每1、2、3、4、5、6、7、8、9周、每1、2、3、4、5、6、7、8、9个月或更久给药1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10次）（例如，持续1、2、3、4、5、6天、1、2、3、4、5、6、7、8、9周、1、2、3、4、5、 6、7、8、9个月或更久）。
10. 权利要求9的方法，其中化合物(I)或其药学上可接受的盐每天给药一次。
11. 权利要求9或10的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐W单次剂量进行给 药。
12. 前述任一项权利要求的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐W每名受试者 约 O.lmg 至约 Img(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1111旨)的剂量进行给药。
13. 前述任一项权利要求的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐W每名受试者 不超过Img、0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.25mg、0.2mg或0.1 mg的剂量 进行给药。
14. 权利要求12或13的方法，其中所述剂量为每名受试者0.1 mg。
15. 权利要求12或13的方法，其中所述剂量为每名受试者0.25mg。
16. 权利要求12或13的方法，其中所述剂量为每名受试者0.5mg。
17. 权利要求12或13的方法，其中所述剂量为每名受试者Img。
18. 权利要求12或13的方法，其中所述剂量为例如，约0.2mg至约0.8mg、约0.3mg至约 0.7mg 或约 0.4mg 至约 0.6mg。
19. 权利要求1-11中任一项的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐W每千克受 试者体重约化g至约lOOOyg的剂量进行给药。
20. 权利要求1-11中任一项的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐W每千克受 试者体重不超过 lOOOyg、800yg、500yg、400yg、300yg、200yg、1 OOyg、30yg、20yg、1 扣g、lOyg、 7yg或化g的剂量进行给药。
21. 权利要求19或20的方法，其中所述剂量为每千克受试者体重化g。
22. 权利要求19或20的方法，其中所述剂量为每千克受试者体重化g。
23. 权利要求19或20的方法，其中所述剂量为每千克受试者体重15yg。
24. 权利要求19或20的方法，其中所述剂量为每千克受试者体重30yg。
25. 权利要求19或20的方法，其中所述剂量为约化g至约lOOOyg、约扣g至约80化g、约10 yg 至约 500yg、约 1 Oyg 至约 300yg、约 1 Oyg 至约 200yg或约 1 Oyg 至约 1 OOyg。
26. 前述任一项权利要求的方法，其中化合物(I)或其药学上可接受的盐在餐后给药。
27. 权利要求26的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐在餐后至少60分钟给 药。
28. 权利要求26的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐在餐后约10分钟至约 120分钟进行给药。
29. 权利要求26的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐在餐后约10分钟、约20 分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约105分钟或约120分钟给药。
30. 权利要求1-25中任一项的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐在餐前给 药。
31. 权利要求30的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐在餐前约10分钟至约60 分钟给药。
32. 权利要求30的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐在餐前约10分钟、约20 分钟、约30分钟或约45分钟给药。
33. 权利要求30的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐在餐前60分钟至餐后2 小时进行给药。
34. 权利要求1的方法，其中所述化合物在体内转化成化合物（II)或其药学上可接受的 盐或其代谢物，
35. 前述任一项权利要求的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐或其组合物通 过口服、皮下、静脉内、肌内、鼻内、经皮、经粘膜、含服、舌下或肺部进行给药。
36. 权利要求35的方法，其中化合物（I)或其药学上可接受的盐或其组合物通过口服进 行给药。
37. 前述任一项权利要求的方法，其中所述受试者为人。
38. 权利要求37的方法，其中所述受试者是男性。
39. 权利要求38的方法，其中所述受试者是儿童。
40. 权利要求38的方法，其中所述受试者是在青春期前。
41. 权利要求38的方法，其中所述受试者约1岁至约18岁。
42. 权利要求38的方法，其中所述受试者具有患病的肌肉（例如，萎缩、纤维变性）。
43. 前述任一项权利要求的方法，其中化合物(I)基本上不含任何盐或杂质。
44. 前述任一项权利要求的方法，其中所述化合物为至少95 %对映体过量。
45. 前述任一项权利要求的方法，其中所述化合物为至少98 %对映体过量。
46. 前述任一项权利要求的方法，其中所述化合物为至少99 %对映体过量。
47. 前述任一项权利要求的方法，其中在所治疗的受试者中的睾酬水平与治疗前该受 试者的睾酬水平相比没有实质变化。
48. 前述任一项权利要求的方法，其中所述治疗方法基本上无任何副作用，例如，肥胖、 行为问题、更薄和/或更脆的骨头(骨质疏松症）；青春期延迟、胃病（胃食管反流或GERD)、白 内障、易于感染;性腺功能减退、肌萎缩和骨质疏松症;屯、血管风险(例如，屯、血管疾病、冠屯、 病、高血压、屯、律不齐、充血性屯、力衰竭、屯、脏病发作、屯、脏巧死）；前列腺癌风险、性腺机能 减退和与荷尔蒙失调有关的病症(例如，男性青春期的诱导、男子乳腺发育、睾丸萎缩和精 子生成减少）。
49. 前述任一项权利要求的方法，其中所述化合物的特征在于W下的一种或两种： (a) 相比于蛋白同化酱类的治疗，对受试者的肌肉和骨骼的活性更高;和 (b) 相比于蛋白同化酱类的治疗，对受试者的前列腺的活性更高。
50. 药物组合物，其包含化合物(I)或其药学上可接受的盐、代谢物或其前药，
其中所述药物组合物包含约O.lmg至约Img的化合物（I)或其药学上可接受的盐。
51. 权利要求50的药物组合物，其包含0.1、0.2、0.25、0.3、0.4或0.5mg的化合物（I)或 其药学上可接受的盐。
52. 权利要求50或51的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。
53. 权利要求50-52中任一项的药物组合物，其中将所述药物组合物配制成单位剂型。
54. 权利要求50-53中任一项的药物组合物，其中将所述药物组合物配制成固体剂型 (例如，胶囊、片剂）。
55. 权利要求54的药物组合物，其中所述固体剂型选自片剂、胶囊、囊剂、粉末、颗粒和 锭剂。
56. 权利要求50-53中任一项的组合物，其中将所述药物组合物配制成液体剂型。
57. 权利要求50-56中任一项的药物组合物，其还包括给药其他治疗剂。
58. 权利要求57的药物组合物，其中所述其他治疗剂是酱体化合物。
59. 权利要求58的药物组合物，其中所述酱体化合物是皮质类固醇，例如，泼尼松龙。
60. 权利要求57的药物组合物，其中所述其他治疗剂是非酱体化合物。
61. 试剂盒，其包含权利要求50的药物组合物，和W每千克受试者体重约0 .化g至约 lOOOyg的剂型向受试者口服给药所述药物组合物的使用说明书。
62. 试剂盒，其包含W下的一种或多种:化合物（I)、包含化合物（I)的组合物和用于治 疗患有MD(例如，DMD)的受试者的使用说明书。
63. 在受试者中治疗肌营养不良的方法，所述方法包括： 确定受试者是否患有或易患肌营养不良； 基于该确定结果选择受试者进行治疗； 给药治疗有效量的化合物（I)其药学上可接受的盐，从而治疗该受试者中的肌营养不 良。
64. 权利要求63的方法，其中所述确定包括将观测值与参照值相比较。
65. 权利要求63的方法，其中评估所述受试者的本文所述参数，例如，在本文所述的诊 断方法中所述的参数。
66. 权利要求63的方法，其中所述确定包括测量肌萎缩，例如，行走测试、爬楼梯测试。
肌营养不良的治疗方法
[0001 ]优先权权益
背景技术
[0003] 肌营养不良（MD)是一组超过30种以控制运动的骨骼肌的进行性无力和退化为特 征的遗传疾病。MD削弱肌肉骨骼系统并阻碍运动。MD是由骨骼肌纤维的进行性退化引起的。 所述疾病的特征在于肌肉蛋白的缺陷以及肌肉细胞和组织的死亡。
[0004]抗肌萎缩蛋白病(dystrophinopathy)是一组由抗肌萎缩蛋白基因的突变造成的 肌营养不良，其位于X染色体的短臂，在Xp21区域中[Kunkel等人1985 !Monaco等人1985;Ray 等人1985]。在这些中，迪谢纳营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD)是最常见的 抗肌萎缩蛋白病，其由抗肌萎缩蛋白基因产物(肌膜下蛋白抗肌萎缩蛋白）的完全缺失造成 [Hoffman等人1987a;Koenig等人1987 ;Hoffman等人1988]。它的等位基因变体，贝克肌营养 不良（Becher's muscular dystrophy,BMD)更罕见些，其具有不同的严重性和呈现时间。
[0005] 迪谢纳营养不良（DMD)是不间断进行性的骨骼肌障碍，随着其天然病程，导致十八 九岁、二十出头的青年由于呼吸衰竭而夭折。DMD的发病率在男婴中大约为I :3300 [Jeppesen等人2003;CDC 2007]至l:4700[Dooley2010]。尽管遗传的常见模式是X-连锁隐 性遗传的（即，母亲是携带者），这种障碍与高自发突变率有关，产生大约30%的病例 [Brooks和Emery 1977 ; van Essen等人1992]。由于极大的迪谢纳基因尺寸[Hoffman和 Kunkel 1989]，这种突变率估计是任何其他遗传病的10倍[Hoffman等人1992]。构成该基因 的250万碱基对(恰为该X染色体的1%)为随机突变事件提供一个大的靶标。由于这种高突 变率，通过遗传咨询来消灭该疾病已被证明是很难的。
[0006] 目前针对MD，例如，DMD的治疗方法包括使用蛋白同化药物(anaboI iC drug)，例 如，甾类，例如泼尼松龙、地夫可特和丹曲洛林，其通常导致适度的有益效果。但是，使用蛋 白同化药物的治疗也会伴有严重的副作用，包括骨质疏松症、高血压、库欣综合征、体重增 长、白内障、身材矮小症、胃肠道症状、行为变化和肝损伤。这便需要针对MD，例如DMD的新的 和改善的治疗。发明内容
[0007] 本发明包括以下认识：用于治疗MD(例如，DMD)的蛋白同化药物（例如，甾类）的不 希望的副作用可归因于它们对除骨骼肌之外的雄激素敏感组织的相关作用，伴有以下可能 性，即有益效果被所述留类对靶标外(off-target)位点的作用所掩盖。除其他之外，本发明 提供了本文所述组合物，例如，包含化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药 的组合物，其例如相比于蛋白同化药物而言对骨和骨骼肌具有更特异性的作用，且可作为 用蛋白同化药物（例如，甾类）的治疗的替代治疗。本发明的至少一部分提供了治疗MD(例 如，DMD)的方法和用包含化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的组合物来 评估、鉴别和/或治疗受试者(例如，患有或易感于MD的受试者，例如，患有或易感于DMD的受 试者）的方法和试剂盒。提供了具有降低的相关副作用的允许治疗MD(例如，DMD)的组合物 和方法。
[0009]
[0010] 从而治疗该受试者。在一些实施方案中，所述肌营养不良选自迪谢纳营养不良、贝 克肌营养不良、埃-德肌营养不良（Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy)、肢带型肌营养 不良（Limb-Girdle Muscular Dystrophy)、面-肩-胧型肌营养不良（Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy)、强直型肌营养不良（Myotonic Dystrophy)、眼咽型肌营养不良 (Oculopharyngeal Muscular Dystrophy)、远端型肌营养不良（Distal Muscular Dystrophy)或先天型肌营养不良（congenital Muscular Dystrophy)。在一些实施方案中， 所述肌营养不良是迪谢纳营养不良。
[0011] 在一些实施方案中，所述方法包括部分或完全缓解笨拙的走路、踏步或跑步方式； 频繁摔倒;疲劳;运动技能困难;肌纤维畸形;假性肥大;骨骼畸形;低耐力;独自站立困难或 无法上楼梯;运动丧失;瘫痪；心肌病；充血性心力衰竭的发展;和心律不齐。在一些实施方 案中，所述方法提高了（例如，增加了，延长了）寿命。在一些实施方案中，所述方法包括改善 至少一种症状例如，本文所述症状。在一些实施方案中，所述症状是疲劳、学习困难、智力障 碍、肌无力、运动技能困难、行走困难、呼吸困难、心脏病、心肌病、充血性心力衰竭、心律失 常、脊柱侧凸、假性肥大、肌萎缩、肌肉挛缩、肌肉畸形和呼吸障碍(例如，肺炎）。
[0012] 在一些实施方案中，将化合物（I)或其药学上可接受的盐以多剂量进行给药，例 如，以预定的时间间隔。在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐经长期给药 (例如，每1、2、3、4、5、6天、1、2、3、4、5、6、7、8、9周、1、2、3、4、5、6、7、8、9个月或更久给药1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10次）（例如，持续1、2、3、4、5、6天、1、2、3、4、5、6、7、8、9周、1、2、3、4、5、6、 7、8、9个月或更久）。在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐每日给药一次。 在一些实施方案中，化合物(I)或其药学上可接受的盐以单次剂量给药。
[0013] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐以每名受试者约0.1 mg至约 Img(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或111^)的剂量进行给药。在一些实施方 案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐以每名受试者不超过lmg、0.9mg、0.8mg、0.7mg、 0 · 6mg、0 · 5mg、0 · 4mg、0 · 3mg、0 · 25mg、0 · 2mg或0 · Img的剂量进行给药。在一些实施方案中，该 剂量为每名受试者O.lmg。在一些实施方案中，所述剂量为每名受试者0.25mg。在一些实施 方案中，所述剂量为每名受试者〇.5mg。在一些实施方案中，所述剂量为每名受试者lmg。在 一些实施方案中，所述剂量为例如，约0.2mg至约0.8mg、约0.3mg至约0.7mg、或约0.4mg至约 0.6mg 〇
[0014] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐以每千克受试者体重约2yg 至约1000 yg的剂量进行给药。在一些实施方案中，化合物(I)或其药学上可接受的盐以每千 克受试者体重不超过 lOOOng^OOygdOOygdOOygdOOygJOOyg、IOOyg、30yg、20yg、15yg、 IOyg、7yg或2yg的剂量进行给药。在一些实施方案中，所述剂量为每千克受试者体重2yg。在 一些实施方案中，所述剂量为每千克受试者体重7yg。在一些实施方案中，所述剂量为每千 克受试者体重15yg。在一些实施方案中，所述剂量为每千克受试者体重3〇yg。在一些实施方 案中，所述剂量为约2yg至约1000yg、约5yg至约800yg、约IOyg至约500yg、约IOyg至约300μ g、约 I Oyg至约 200yg、或约 I Oyg至约 I OOyg。
[0015] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐在餐后给药。在一些实施方 案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐在餐后至少60分钟给药。在一些实施方案中，化合 物（I)或其药学上可接受的盐在餐后约10分钟至约120分钟给药。在一些实施方案中，化合 物（I)或其药学上可接受的盐在餐后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、 约75分钟、约90分钟、约105分钟、或约120分钟给药。在一些实施方案中，化合物（I)或其药 学上可接受的盐在餐前给药。在一些实施方案中，化合物(I)或其药学上可接受的盐在餐前 约10分钟至约60分钟给药。在一些实施方案中，化合物(I)或其药学上可接受的盐在餐前约 10分钟、约20分钟、约30分钟、或约45分钟给药。在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上 可接受的盐在餐前60分钟至餐后2小时给药。
[0016] 在一些实施方案中，所述化合物在体内转化成化合物（II)，或其药学上可接受的 盐或其代谢物，
[0017]
[0018] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐或组合物通过口服、皮下、 静脉内、肌内、鼻内、经皮、经粘膜、口腔、舌下或肺给药进行给药。在一些实施方案中，化合 物(I)或其药学上可接受的盐或组合物，通过口服给药进行给药。
[0019] 在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是男性。在一些 实施方案中，所述受试者是儿童。在一些实施方案中，所述受试者是青春期前的。在一些实 施方案中，所述受试者的年龄为约1岁至约18岁。在一些实施方案中，所述受试者具有患病 的肌肉（例如，萎缩、纤维变性）。
[0020] 在一些实施方案中，化合物（I)基本上不含任何盐或杂质。在一些实施方案中，所 述化合物至少95 %对映体过量。在一些实施方案中，所述化合物至少98 %对映体过量。在一 些实施方案中，所述化合物至少99%对映体过量。
[0022] 在一些实施方案中，所述治疗方法基本上没有任何副作用，例如，肥胖、行为问题、 更稀松和/或更弱的骨头(骨质疏松症）；青春期延迟、胃病（胃食管反流或GERD)、白内障、易 于感染;性腺功能减退、肌萎缩和骨质疏松症;心血管风险(例如，心血管疾病、冠心病、高血 压、心律不齐、充血性心力衰竭、心脏病发作、心脏猝死）；前列腺癌风险、性腺机能减退 (hypogondism)和有关荷尔蒙失调的病症(例如，男性青春期的诱导、男子乳腺发育、睾丸萎 缩和精子生成减少）。
[0023] 在一些实施方案中，所述化合物的特征在于以下的一种或两种：（a)相比于蛋白同 化甾类治疗，更多地作用于受试者的肌肉和骨骼;和(b)相比于蛋白同化留类治疗，更少地 作用于受试者的前列腺。
[0024] 在一个方面，本发明提供了包含化合物(I)或其药学上可接受的盐、代谢物或前药 的药物组合物
[0025]
[0026] 其中所述药物组合物包含约0.1 mg至约Img的化合物（I)或其药学上可接受的盐。 在一些实施方案中，所述药物组合物包含0.1、0.2、0.25、0.3、0.4或0.5mg的化合物（I)或其 药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。
[0027] 在一些实施方案中，将所述药物组合物配制成单位剂型。在一些实施方案中，将所 述药物组合物配制成固体剂型（例如，胶囊、片剂）。在一些实施方案中，所述固体剂型选自 片剂、胶囊、囊剂、粉末、颗粒和锭剂。在一些实施方案中，将所述药物组合物配制成液体剂 型。
[0028] 在一些实施方案中，所述药物组合物还包括给药其他治疗剂。在一些实施方案中， 所述其他治疗剂是留体化合物。在一些实施方案中，所述留体化合物是皮质类固醇，例如， 泼尼松龙(prednilosone)。在一些实施方案中，所述治疗剂是非留体化合物。
[0029] 在一个方面，本发明提供了包含化合物(I)或其药学上可接受的盐的药物组合物，
[0030]
[0031] 其被配制成每剂型中包含不超过约0.1 mg至约Img的化合物（I)或其药学上可接受 的盐的剂型。
[0034] 在一个方面，本发明提供了在受试者中治疗肌营养不良的方法，所述方法包括:确 定受试者是否患有或易患肌营养不良；基于所述确定选择进行治疗的受试者;给药治疗有 效量的化合物（I)或其药学上可接受的盐，从而治疗该受试者的肌营养不良。在一些实施方 案中，所述确定包括比较观测值和参照值。在一些实施方案中，所述受试者用本文所述的参 数进行评估，例如，按本文所述诊断方法中所述。在一些实施方案中，所述确定包括测量肌 萎缩，例如，行走测试、爬楼梯测试。
[0036] 本发明在本文中参考附图，仅通过举例的方式进行描述。
[0037] 图1描述的是所述药物治疗对横隔膜的收缩性质(抽搐张力）的示例性影响。
[0038] 图2描述的是所述药物治疗对横隔膜的收缩性质(强直张力）的示例性影响。
[0039] 图3描述的是所述药物治疗对横隔膜的收缩性质（到达峰值的时间）的示例性影 响。
[0040] 图4描述的是所述药物治疗对横隔膜的收缩性质(松弛时间）的示例性影响.
[0041]图5描述的是所述药物治疗对横隔膜的收缩性质(抽搐张力与强直张力的比率)的 示例性影响。
[0042]图6描述的是所述药物治疗对横隔膜的收缩性质的示例性影响。
[0043]图7描述的是所述药物治疗对横隔膜的收缩性质(疲劳)的示例性影响。
[0044]图8描述的是所述药物治疗对EDL的收缩性质(抽搐张力）的示例性影响。
[0045] 图9描述的是所述药物治疗对EDL的收缩性质(强直张力）的示例性影响。
[0046] 图10描述的是所述药物治疗对EDL的收缩性质(到达峰值的时间）的示例性影响。
[0047] 图11描述的是所述药物治疗对EDL的收缩性质(松弛时间）的示例性影响。
[0048]图12描述的是所述药物治疗对EDL的收缩性质(抽搐张力与强直张力的比率)的示 例性影响。
[0049]图13描述的是所述药物治疗对EDL的收缩性质的示例性影响。
[0050]图14描述的是所述药物治疗对EDL的收缩性质(疲劳)的示例性影响。
[0051]图15描述的是所述药物治疗对机械阈限的示例性影响。
[0052]图16描述的是所述药物治疗对机械阈限的示例性影响。
[0053]图17描述的是所述药物治疗对机械阈限的示例性影响。
[0054]图18描述的是单一药物治疗对mdx小鼠的EDL肌纤维的总膜离子导电性的影响。 [0055]图19描述的是所述药物治疗对肌酸激酶水平的示例性影响。
[0056]图20描述的是所述药物治疗对乳酸脱氢酶水平的示例性影响。
[0058] 图22描述的是横隔膜和GC肌肉的组织学剖面的代表性图片。
[0059] 图23描述的是药物治疗后的代表性形态测定分析。
[0060] 图24描述的是在使用和不使用化合物（I)、NAND和PDN的起始和4周治疗之后的野 生型和mdx小鼠的示例性体内参数。[0061 ]图25描述的是在使用和不使用0.3、3、和30mg/kg的化合物（I)治疗长达12周的野 生型和mdx小鼠的示例性体内参数。
[0062] 图26描述的是使用化合物（I)的治疗对雄激素敏感和其他潜在靶组织的重量的示 例性影响。
[0063] 图27描述的是化合物(I)对雄激素敏感组织和其他潜在的靶组织的重量的示例性 剂量-和时间-依赖性的影响。
[0064]图28显示的是经各种药物治疗的wt和mdx小鼠的横隔膜肌肉的最大等长抽搐和强 直张力的示例值。
[0065]图29描述的是从使用和不使用化合物（I)治疗的野生型和mdx小鼠中分离的EDL肌 肉的示例性的等长和离心收缩。
[0066] 图30显示的是在使用和不使用化合物（I)和NAND、和PDN治疗的野生型和mdx小鼠 中的EDL肌肉的示例性的功能性细胞参数。
[0067] 图31描述的是在使用和不使用化合物（I)治疗的野生型和mdx小鼠中的EDL肌肉的 示例性的功能性细胞参数。
[0068] 图32描述的是使用和不使用化合物（I)治疗的mdx小鼠的横隔膜和腓肠肌的示例 性苏木精-曙红染色。
[0069]图33显示的是对使用和不使用化合物（I)、NAND和PDN治疗的mdx小鼠的纤维化标 记物的示例性影响。
[0070]图34描述的是皮下递送化合物至小鼠后8小时的化合物（I)的示例性血浆水平。 [0071]图35显示的是使用和不使用化合物（I)治疗的锻炼或未锻炼的野生型和mdx小鼠 的示例性血清睾酮水平。
[0072]图36描述的是在使用和不使用化合物（I)治疗后靶基因相比于持家基因 GADPH的 示例性水平。
[0073]发明详述
[0074] 定义
[0075] 如本文所用，冠词"一 (a)"和"一个(an)"是指一个或多个(例如，至少一个)该冠词 的语法对象。
[0076] "约"和"大约"通常应理解为在该测量给定的性质或精度下所测量的量的可接受 的误差程度。示例性的误差程度在给定值或数值范围的百分之20(%)以内，通常，在10%以 内，且更通常在5%以内。
[0077] "样品"、"组织样品"、"受试者或患者样品"、"受试者或患者的细胞或组织样品"或 "标本"各自指的是获自受试者或患者的组织(例如，体液）的生物样品。所述组织样品的来 源可为作为来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活检或抽吸物的固体组织;血液或 任意血液组分(例如，血清、血浆）；体液，例如脑脊髓液、全血、血浆和血清。所述样品可包括 非细胞部分(例如，血浆、血清或其他非细胞体液）。在一个实施方案中，所述样品是血清样 品。在其他实施方案中，从获自个体的样品得到的体液包括血液(例如，全血）。在一些实施 方案中，所述血液可被进一步加工得到血浆或血清。在一些实施方案中，所述样品含有组 织、细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC))。在一个实施方案中，所述样品包括NK细胞。例如， 所述样品可为细针活检样品、存档样品（例如，具有已知的诊断和/或治疗史的存档样品）、 组织切片(例如，冷冻或福尔马林固定的截面，例如，在长期储存后），等等(例如，肌肉组织 截面，所述肌肉组织例如为骨骼肌、心肌、平滑肌）。所述术语样品包括从生物样品中获得 和/或衍生出的任何材料，包括通过从所述样品纯化或加工得到的多肽和核酸(例如，基因 组0嫩、(^嫩、1?嫩）。纯化和/或加工所述样品可涉及以下中的一种或多种 ：萃取、浓缩、抗体 分离、分类、浓缩。固定、添加试剂等。所述样品可含有并非天然地与天然组织混合的化合 物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。
[0078] 如本文所用，"调节剂"或"调节"是指通过与配体(例如，化合物、药物）的结合来调 节蛋白（例如，酶、受体(例如，雄激素受体））。结合可以是在活性位点或在变构结合位点处 例如，不可逆的、可逆的、完全或部分的。调节剂包括拮抗剂、激动剂、激动剂-拮抗剂、部分 拮抗剂、部分激动剂。"激动剂"是化学制品，例如，配体、化合物、药物，其结合和/或上调细 胞的一些受体(例如，雄激素受体)并触发细胞响应，该响应通常模拟天然存在物质的作用。 例如，针对特定受体的内源性激动剂是指结合并活化该受体的机体产生的天然存在的化合 物，例如，针对雄激素受体的内源性激动剂是雄激素。"拮抗剂"是一种类型的配体或药物， 其自身在结合至受体后不会引起生物应答，但阻断、减弱或下调激动剂介导的响应。拮抗剂 通常对其相应的受体具有亲和力而不具有疗效，但破坏激动剂或反向激动剂与受体间的相 互作用并抑制激动剂或反向激动剂对受体的作用。取决于拮抗剂-受体复合物的寿命，拮抗 剂可为可逆的或不可逆的。本领域技术人员将理解，作为拮抗剂(完全或部分)或激动剂(完 全或部分)的本发明化合物的活性表示连续光谱。因此，即使一些化合物为明显激动剂或明 显拮抗剂，但是一些化合物仍将表现激动剂和拮抗剂活性。
[0079] 治疗方法
[0080] 本发明尤其涉及治疗MD (例如，DMD)的方法，其包括给药组合物，其包含本文所述 化合物(例如，化合物（I))或其药学上可接受的盐、代谢物或前药。本发明所提供的组合物 和方法可，例如，增加骨骼肌质量和/或力量、提高蛋白合成以及增强再生和/或代谢有效 性。
[0081] 肌营养不良
[0082] MD是一组超过30种以控制运动的骨骼肌的进行性无力和退化为特征的遗传疾病。 MD削弱肌肉骨骼系统并阻碍运动。一些形式的MD在婴儿期或儿童期出现，而其他的会直至 中年或更后期才出现。该障碍根据肌无力的分布和程度(一些形式的MD也影响心肌）、发病 年龄、进展速率和遗传方式而不同。MD是由骨骼肌纤维的进行性退化所致。MD的特征在于肌 肉蛋白的缺陷以及肌肉细胞和组织的死亡。在最严重的形式中，例如DMD，再生作用衰竭且 骨骼肌逐渐被脂肪和纤维组织代替。DMD通常会导致患者的进行性无力并由于呼吸和/或心 脏的衰竭最终导致死亡。
[0083] 抗肌萎缩蛋白病是一组由抗肌萎缩蛋白基因的突变造成的肌营养不良，该基因位 于X染色体的短臂，在Xp21区域中[Kunkel等人1985 ;Monaco等人1985;Ray等人1985]。在这 些中，迪谢纳营养不良（DMD)是最常见的抗肌萎缩蛋白病，其由抗肌萎缩蛋白基因产物(肌 膜下蛋白抗肌萎缩蛋白）的完全缺失造成[Hoffman等人1987a;Koenig等人1987;Hoffman等 人1988]。它的等位基因变体，贝克肌营养不良（BMD)更罕见些，其具有不同的严重性和呈现 时间。
[0084] 抗肌萎缩蛋白基因是迄今为止分离出的最大的人类基因。大约90%的男孩不存在 涉及干扰正常抗肌萎缩蛋白转录的"无序(〇ut-〇f-frame)"突变的抗肌萎缩蛋白[Gillard 等人1989]。这些突变可造成过早停止密码子和mRNA转录的提前终止。因此，可产生不稳定 的RNA，其经历快速衰变并导致产生几乎检测不到浓度的截短蛋白。如果该突变维持翻译阅 读（"框内"缺失），则存在BMD表型，其具有不同程度降低量的异常分子量抗肌萎缩蛋白 [Hoffman等人1988]。这个阅读框假说支持大约90%的案例并通常用作抗肌萎缩蛋白病的 诊断确认和DMD和BMD的鉴别诊断。这两种典型情况的例外发生在大约10-13%的患者中。 [Nevo等人2003]，[Muntoni等人1994]。大约60%的迪谢纳和贝克患者呈现该缺失型的结构 重排[Kunkel 1986;den Dunnen等人1987]。两个缺失热点包括外显子45-55和外显子2-19 [Den Dunnen等人1989;Oudet等人1992;NobiIe等人1995]。剩余40%的患者归因于小突变 (导致移码或无义突变的点突变)或复制。由于该基因缺陷是X-连锁隐性遗传性状，因此抗 肌萎缩蛋白病主要表达在男孩和年轻男性中。但是，如果女孩也呈现出X-倾斜失活，则她们 可表现DMD的症状[Lesca等人2003]。
[0085] 抗肌萎缩蛋白位于骨骼肌和心肌的肌膜区域并构成总的肌肉蛋白的0.002% [Hoffman等人1987a]; [Hoffman等人1987b]。抗肌萎缩蛋白结合细胞骨架肌动蛋白和跨膜 抗肌萎缩蛋白糖蛋白复合物(DGC)蛋白α-抗肌萎缩蛋白聚糖(dystroglycan)的胞质尾区， 并因此形成细胞骨架至细胞外基质的连接。抗肌萎缩蛋白在前缘脉节(costamer)中构成并 且相比于其他肌肉区域，其在肌腱和神经肌肉接头的量更大。在心脏中，其还与T小管（T tubule)相关。在平滑肌中，其在膜上不连续，与粘着斑蛋白交替。
[0086] 在肌营养不良中的肌肉细胞死亡（由于细胞凋亡和坏死)会是条件性的并反映了 一种倾向，其在肌肉之间是不同的且随年龄变化[Rando 2001a]。在DMD中相邻肌肉群可以 是完全正常的而其他的正处于主动坏死这一事实表明进展不是不可避免的且是可治疗的。 如果内源性生化机制改变肌肉细胞对生存或死亡的敏感性而遗传和生化缺陷保持不变，那 么这些路径的药理学调节可导致成功地治疗DMD和其他肌营养不良[Rando 2001b] JD的征 兆和症状包括进行性肌萎缩、平衡能力差、眼睑下垂、萎缩、脊柱侧凸、无法行走、频繁摔倒、 蹒跚步态、小腿变形、活动范围受限、呼吸困难、关节挛缩、心肌病、心律失常和肌痉挛。症状 还包括疲劳、学习困难、智力障碍、肌无力、运动技能困难、行走困难、呼吸困难、心脏病、心 肌病、充血性心力衰竭、心律失常、脊柱侧凸、假性肥大、肌萎缩、肌肉挛缩、肌肉畸形和呼吸 障碍(例如，肺炎）。
[0088] MD的现有治疗方法可涉及甾类，例如，泼尼松龙、地夫可特和丹曲洛林，其得到适 度的有益效果，并通常伴有严重的副作用，包括骨质疏松症、高血压、库欣综合征、体重增 长、白内障、身材矮小症、胃肠道症状、行为变化(在留类的情况下）、和肝损伤。
[0089] MD包括，例如，迪谢纳肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、先天型、 面-肩-肱型肌营养不良、强直型肌营养不良、眼咽肌营养不良、远端肌营养不良和埃-德型 肌营养不良。在具体实施方案中，一些类型的MD的特征至少部分在于，蛋白抗肌萎缩蛋白的 缺失或功能障碍。这种肌营养不良包括DMD和贝克肌营养不良（BMD)。所述各种MD在下文中 进行进一步地详细讨论。
[0090]迪谢纳营养不良（DMD) AMD是不间断进行性的骨骼肌障碍，随着其天然病程，导致 十八九岁、二十出头的青年由于呼吸衰竭而夭折。DMD的发病率在男婴中大约为1:3300 [Jeppesen等人2003;CDC 2007]至l:4700[Dooley 2010]。尽管遗传的常见模式是X-连锁隐 性遗传的（即，母亲是携带者），这种障碍与高自发突变率有关，造成大约30%的病例 [Brooks和Emery 1977 ; van Essen等人1992]。由于极大的杜氏基因尺寸[Hoffman和 Kunkell989]，这种突变率估计是任何其他遗传病[Hoffman等人1992]的突变率的10倍。构 成该基因的250万碱基对(恰为该X染色体的1 % )为随机突变事件提供一个大的靶标。由于 这种高突变率，通过遗传咨询来消灭该疾病已被证明是很难的。
[0091] 虽然抗肌萎缩蛋白缺乏可为DMD的主要原因，但是多个二级路径对肌肉坏死的进 展、异常纤维化和再生作用的失效负有责任，其导致逐渐恶化的临床状况。有证据支持氧化 自由基对肌纤维化[Rando 2002]、炎症[Spencer和Tidball 2001 ;Porter等人2002]、异常 钙稳态[Allen 2010;Millay 2009]、肌红细胞核细胞（myonuclear)凋亡[Rando 2001b; Sandri等人2001 ;Tews 2002]、异常纤维化和再生作用的失效[Rando 2001b;Bernasconi 1995]; [Melone 2000;Morrison 2000;Luz 2002]的损伤。文献的主体是通过全基因组的横 断面方法确认的，从而允许全面分析DMD中的多个缺陷机制[Chen等人2000 ;Porter2003]。 DMD的主要症状是与先在随意肌(例如，臀部、骨盆区、大腿、肩部和小腿的肌肉）中出现的肌 萎缩相关的肌无力。肌无力还发生在例如，手臂、颈部和其他区域，但其出现晚于该机体的 下半部分。症状还包括行走、步进或跑步方式笨拙(例如，患者由于增加的小腿肌肉性强直， 会用他们的足前段行走，或者用脚趾走路以弥补膝伸肌无力）。此外，频繁摔倒、疲劳、运动 技能(例如，跑步、单脚跳、跳跃）困难、增加的腰椎前凸（例如，导致臀屈肌缩短）、由于结缔 组织中发生的肌纤维缩短和纤维化导致的跟腱的肌肉挛缩和胭绳肌腱的功能性损伤、进行 性行走困难、肌纤维畸形、舌头和小腿肌肉的假性肥大（增大）、较高风险的神经行为障碍 (例如，注意力缺陷伴多动障碍、学习障碍（阅读障碍)和在特定认知技能上的非进行性无 力）、最终丧失行走能力和骨骼畸形会与DMD患者相关。
[0092] 症状通常出现在6岁前的男性儿童中且会在婴儿期早期是可见的。即使症状在婴 儿期早期之前并未出现，实验室测试能够确定在出生时携带该敏感突变的儿童。用于早期 诊断DMD(例如在症状出现之前）的示例性的基因检测在本文中和在例如，Prior等人，Arch Pathol Lab Med. 19910ct; 115(10) :984-90进行描述。首先观察到与肌肉质量损失相关的 腿和骨盆的进行性近端肌无力，该无力最终蔓延到手臂、颈部和其他区域。早期征兆可包括 小腿肌肉和三角肌的增大(假性肥大）、低耐力和独自站立困难或无法上楼梯。随着所述病 症的进展，肌肉组织出现萎缩并最终被脂肪和纤维变性组织替代(纤维化）。到10岁时，会需 要帮助行走的支架且到12岁时，大多数患者依赖于轮椅。
[0093] 随后的症状可包括异常的骨发育，其导致骨骼畸形，包括脊柱弯曲。肌肉的进行性 恶化导致运动丧失，最终导致瘫痪。DMD患者会或不会出现智力缺陷。当患者存在智力缺陷 时，其通常不会随着年龄逐步恶化。DMD患者的平均寿命是25岁左右。
[0094] 在临床上可通过例如在一个男孩9到12岁之间的时间观察患者行走的分裂能力 (disintegrating ability)来观察DMD。肌萎缩从腿和骨盆起始，进展到肩部和颈部的肌 肉，然后是手臂肌肉和呼吸肌的减少。小腿肌肉增大(假性肥大)可变得明显。心肌病(例如， 扩张型心肌病，DCM)是常见的，且充血性心力衰竭或心律不齐(心律失常）的发展偶尔发生。 DMD儿童通常更容易疲倦、比他们的同龄人具有更小的总体力量、可具有极高水平的肌酸激 酶、在Xp21基因上具有遗传错误和/或具有显示由于肌肉组织的破坏而不是神经损伤造成 的无力的肌电图。肌肉活检或基因测试可确认不存在抗肌萎缩蛋白。
[0095] 在未经治疗的男孩中的DMD的进展可遵循一个可料的过程。但是，该病程可通过积 极的药物(例如，皮质类固醇)和康复性治疗进行改变。以下事件序列在被治疗和未经治疗 的DMD中最终都会发生，但是通常在前者的较大年龄才发生。该疾病在婴儿期出现，具有肌 纤维坏死和高血清肌酸激酶的酶水平；但是，临床表现通常直到3岁或更大年龄才会被识 另IJ。这个"治疗窗"在之前一直未得到足够重视，但是其本身提供早期治疗干预的发展，从而 可预防或延迟继发于先前的肌肉退化的症状的发作。行走会由于增加的跌倒而迟缓。步态 异常通常在3-4岁明显。通常，肌无力最初出现在于颈部屈肌，其力量无法对抗重力。因此， 当该儿童在地板上从仰卧位起来时，通常需要翻个身，这显示出Gower征（Gower ' s maneuver)的最初迹象。通常发生小腿肌肉肥大，往往在3岁或4岁非常突出。髋带肌肉通常 早于肩带骨肌肉受到影响。由于髋伸直肌肉的无力，这些患者走路时往往从一边摇摆到另 一边，产生年长DMD男孩典型的蹒跚步态。由于肌无力造成的前髋关节旋转导致增加的腰椎 前凸，其必须将肩部置于臀部、膝盖和脚踝之前来保持平衡中心的稳定。学龄前儿童会具有 以下行为的困难:从地板爬起来、旋转45度、然后90度和最终180度(取决于颈部屈肌无力的 程度）、和把手放在地板上来站起来。此后，会呈现完全Gower迹象。随着肌肉退化的进展，爬 楼梯会变得困难，需要使用双手扶住栏杆或用四肢爬行。手臂和腿的远端肌肉会随着该疾 病的进展显示出无力。在未经甾类治疗的DMD中，到10岁时会丧失离床活动，而在经甾类治 疗的DMD中，该离床活动的丧失大约错后3至10年。需要有力地每日进行拉伸的跟腱、髂胫带 和髋部屈肌的挛缩会是早在4-5岁便开始的一个主要问题。
[0096]力量和平衡的加速退化通常是并发的疾病或手术引起的固定的结果。当离床活动 不再可能时，会需要轮椅。挛缩会在下肢变得更加明显并很快影响肩部。在离床活动丧失后 会发展脊柱后侧凸。青少年患者表现出越来越无力且无法用他们的手臂、手和手指来进行 日常工作。肺功能可由于肋间肌和横隔膜肌肉的无力和严重的脊柱侧凸而受损，可发生在 无法移动男孩的疾病阶段后期并可为DMD的主要致死原因。延迟到达无法移动状态的时间 可对脊柱侧凸和呼吸功能的发展，因此对存活，具有显著影响，其是用皮质类固醇治疗的情 况[Biggar等人，2004]。在一些国家，使用机械通气和良好的肺和心脏护理已经将25岁的存 活[Gomez-Merino和Bach 2002]提高至约58% (即使是未经治疗的DMD) [Eagle等人2002]。 [0097] DMD男孩会有患心肌病的风险，尤其是如果他们具有外显子48到53的缺失[Nigro 等人1994]。用心电图(ECG)和超声心动图在5-6岁早期筛查心肌病并在10-12岁再次筛查会 在心力衰竭迹象明显之前检测出具有损伤的心输出量的心肌病。在DMD中轻度的心脏受损 可在高达95%的男孩中发生[Melacini等人1996]。慢性心力衰竭可影响高达50% [Melacini等人1996]。可发生突发性心力衰竭，尤其是在青春期。亚临床或临床性心功能不 全通常存在于大约90%的DMD/BMD患者中，但是其仅为20%的DMD和50%的BMD患者的致死 原因 [Me lac ini 等人1996; Finsterer和Sto Ilberger 2003]。
[0098]血清肌酸激酶(CK)水平可以是迪谢纳抗肌萎缩蛋白病的有价值的且普遍使用的 诊断性酶指示剂。CK(肌肉同工酶)在该病程的早期大大升高，通常是正常的10,000至30， 〇〇〇倍。用于DMD和BMD的基因测试被广泛应用，尤其是用于检测在该基因上两个"热点"的缺 失。通过多重PCR仅筛查19外显子鉴定出全部缺失的大约98% [Beggs等人1990]。这些样品 的Southern Blot分析通常可预测是否该缺失（当在杆状结构域)会使读框移位，并因此可 为DMD或BMD的结论性分析。该技术对共同缺失的分子诊断非常有效(60 %的患者）。更多近 期的技术已经能够筛选整个抗肌萎缩蛋白基因，从而寻找特定的分子缺陷，其是剩余40% 的DMD和BMD的原因[Mendell等人2001 ;Dent等人2005]。肌肉活检显示出纤维大小的变化、 退化的和再生的纤维、细纤维簇、肌内膜(endomesial)纤维化和一些分散的淋巴细胞。缺乏 针对具有识别其C-末端、杆状结构域和N-末端的单克隆抗体的抗肌萎缩蛋白的免疫反应性 提供了 DMD的精确诊断。在DMD患者中抗肌萎缩蛋白不到5 %的情况下，通过免疫印迹的定量 抗肌萎缩蛋白分析通常比免疫染色能更准确地进行诊断。
[0099]血浆肌酸激酶的显著升高通常是MD(例如，DMD)的典型诊断标识。
[0100]用于检测突变的抗肌萎缩蛋白基因的肌肉特异性亚型的DNA测试、用于显示抗肌 萎缩蛋白的缺失的肌肉活检、以及用于检验出现在未出生儿童中的最常见的突变的产前检 验将指示儿童是否患有该病症。
[0101]目前并无法治愈DMD。通常旨在控制症状并最大限度地改善生活质量的治疗包括 皮质类固醇(例如，泼尼松龙、地夫可特）、β2-激动剂、温和无刺激性物理活动、物理疗法、矫 形器械(例如，支架、轮椅)和合适的呼吸支架。
[0102] 贝克肌营养不良（BMD) AMD是由基因突变导致的隐性X-连锁形式的肌营养不良， 该基因图片导致所述蛋白抗肌萎缩蛋白的异常产生(例如，不足的抗肌萎缩蛋白或错误的 抗肌萎缩蛋白KBMD是DMD的不太严重的变体，其中所述症状出现较晚且进展更缓慢。BMD仅 影响1:30,000的男性，其症状通常出现在2至16岁且偶尔直到25岁才出现。该病症会导致心 脏病且其严重程度有所不同。BMD患者通常能活到老年。
[0103] 先天型肌营养不良。先天型肌营养不良出现在患者出生时或出生后头几个月、进 展缓慢并同时影响男性和女性。症状包括一般性肌无力和可能的关节畸形。两种经鉴定的 形式(具有肌球蛋白缺乏的福山和先天型肌营养不良）引起肌无力以及严重的和早期的挛 缩(例如，肌肉的缩短或缩小、关节问题）。福山先天型肌营养不良引起脑的异常(例如，癫痫 发作）。先天型MD通常进展缓慢并通常导致寿命缩短。所导致的肌肉退化可以是轻度的或严 重的、可限定在骨骼肌或与对大脑和其他器官系统的影响组合。一些形式的先天型MD是由 蛋白的缺陷所致，所述蛋白涉及抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物以及肌肉细胞和它们周围的 细胞结构的联系。
[0104] 远端型肌营养不良。远端型肌营养不良是肌营养不良的罕见形式，其同时影响成 年男性和女性，通常从大约20岁至60岁，导致远端肌肉（例如，前臂、手、小腿、脚）的无力和 萎缩。远端型肌营养不良不太严重、进展更缓慢且比其他形式的肌营养不良影响的肌肉更 少。远端型MD通常不会危及生命。
[0105] 埃-德肌营养不良。埃-德肌营养不良是罕见形式的肌营养不良，其出现在儿童期 至青少年早期且仅影响男性。肌肉缩短(挛缩)可发生在该疾病的早期，随着肌无力蔓延到 肢带肌肉，例如，胸部以及随后的骨盆肌肉，其进展缓慢。埃-德肌营养不良导致肩部、上臂 和小腿的肌无力和萎缩，但相比于其他形式的肌营养不良引起更轻的肌无力。心脏传导缺 陷和心律失常也可影响患者，如果患者不接受治疗，则中风和猝死的风险增加。
[0106] 存在三种亚型的埃-德MD，通常是由它们的遗传方式进行区别:X-连锁、常染色体 显性和常染色体隐性。所述X-连锁形式是最常见的。该疾病可由LMNA基因的突变(也称为 EMD基因）导致的。这两种基因均编码核被膜的蛋白。
[0107] 面-肩-肱型肌营养不良（FSHD) JSHD是一种形式的肌营养不良，其影响移动脸、肩 胛骨、胸部、上臂骨、手臂和腿的肌肉。FSHD通常起始于青少年至成年早期并可同时影响男 性和女性。该病症通常进展缓慢，其具有短期的快速肌肉退化和无力。其严重性可为非常温 和到完全残废的范围，通常影响行走、咀嚼、吞咽并导致说话问题。大多数FSHD患者活过正 常寿命，大约有一半的患者在他们的整个生命中保持行走的能力。
[0108] 肢带型肌营养不良（LGMD)t3LGMD导致进行性无力，其其起始于臀部并移动到肩部、 手臂和腿。行走会在20年内变得困难或不可能，且LGMD患者通常活到中年至老年。多种形式 的LGMD已经被确定，显示出不同的遗传方式，例如，常染色体隐性、常染色体显性。所述隐性 形式已与抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物的蛋白的缺陷相关。患有LGMD的患者可通过一些帮 助过上正常的生活，但在极端情况下，会死于例如，心肺并发症。
[0109] 强直型肌营养不良。强直型肌营养不良也被称作MMD或Steinert疾病，且其为成人 中最常见的肌营养不良形式。强直型肌营养不良同时影响男性和女性并通常出现在儿童期 早期到成年的任意时间。它有时将出现在新生儿中（例如，先天型MMD)。强直型肌营养不良 的症状是肌肉的长期痉挛或僵硬（或肌强直），其在低温下更糟。该病症还影响中枢神经系 统、心脏、胃肠道、眼和生产激素的腺体。MMD通常并不限制日常生活，但是强直型肌营养不 良患者预期寿命降低。肌强直型营养不良在严重性和表现上是不同的且其除骨骼肌外还影 响许多身体系统，例如，心脏、内分泌器官、眼和胃肠道。丽D的特征在于长期肌痉挛、白内 障、心脏异常和内分泌失调。MMD个体通常具有细长的脸、眼睑下垂和天鹅样脖子。
[0110] Steinert疾病是最常见的MD形式并是由于在强直型肌营养不良蛋白激酶基因的 DNA序列上的短重复序列的扩张导致的。2型肌强直型MD是非常罕见的，并且是在锌指蛋白9 基因上重复的CCTG的扩张导致的，其可干扰重要肌肉蛋白的产生。
[0111] 眼咽型肌营养不良。眼咽型肌营养不良可出现在40多岁、50多岁和60多岁的男性 和女性中并导致眼部和脸部肌肉的无力。眼咽型肌营养不良可导致吞咽困难，通常随后出 现骨盆和肩部肌肉的无力。在这种情况下患者可出现室息和复发的肺炎。
[0112] 本发明的方法可包括给药，例如，化合物(I)、或其药学上可接受的盐、其代谢物或 其前药，或包含化合物(I)、或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的组合物，其例如相 比于其他疗法(例如，蛋白同化药物疗法)可显示出良好的吸收、良好的半衰期、良好的溶解 性、良好的生物利用度、低蛋白结合亲和力、降低的药物-药物相互作用、良好的代谢稳定性 和降低的副作用(例如，较少的靶标外效应）。在一个方面，本发明化合物在药理性质方面呈 现显著改善，例如，提高的生物利用度、改善的疗效、降低的副作用。当本发明化合物呈现这 些改善中的任意一种或多种时，可预期这种化合物将在该化合物的潜在用途中提供优势。 例如，当所提供的化合物呈现改善的生物利用度，则预期该化合物可以低剂量给药，从而降 低会出现的不希望的副作用。
[0113]所提供的方法可用于有效地治疗患有或易患MD(例如，DMD)的个体。本文所用术语 "治疗（treat)"或"治疗（treatment)"是指向受试者（例如，患者)施用或给药化合物和/或 组合物，其单独给药或与一种或多种额外的化合物组合给药，或者向从受试者(例如，患者） 中分离出的组织或细胞(例如，细胞系)施用或给药所述化合物和/或组合物，所述受试者患 有障碍(例如，本文所述的障碍）、障碍的症状或有患障碍的倾向，其目的在于治愈、治疗、缓 和、减轻、改变、补救、改善、提高或影响该障碍、该障碍的一种或多种症状或患障碍的倾向 (例如，为了最小化该障碍的至少一种症状或延迟所述障碍的至少一种症状的发作），和/或 减轻该障碍的一种或多种症状的严重性或频率。MD的示例性症状包括，但不限于，肌肉退 化、肌无力、肌萎缩、笨拙的行走、步进或跑步方式、频繁摔倒、疲劳、运动技能困难、肌纤维 畸形、假性肥大、骨骼畸形、低耐力、独立站立困难或无法爬楼梯、运动丧失、瘫痪、心肌病和 充血性心力衰竭或心律不齐的发展。
[0114] 应理解，MD的症状可用任意可用的方法测量。例如，肌萎缩可用剩余的机能活动的 百分比进行测定，例如通过，离床活动试验(例如，行走测试的持续时间、行走测试的距离）、 计时功能试验(例如，从仰卧位站起的时间、跑/走10米的时间、上楼或下楼的时间）、肌收缩 计(例如，上肢、下肢的肌检测）、健康相关的生活质量(例如，身体、情感、社交功能）、能量消 耗(例如，运动心率减去静息心律除以行走速度）、呼吸功能或电阻抗肌动描记术(ΕΠΟ进行 确定。EIM是可测量肌肉健康的无创技术并通过测量个体肌肉的电阻抗作为诊断工具来追 踪其随时间的变化。
[0115] 在一些实施方案中，治疗是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、延缓发作、降低 肌肉退化、肌无力或肌萎缩的严重性和/或发病率。在一些实施方案中，肌肉退化、肌无力或 肌萎缩的特征在于笨拙的行走、步进或跑步方式、频繁摔倒、疲劳、运动技能困难、肌纤维畸 形、假性肥大、骨骼畸形、低耐力、独立站立困难或无法上楼、运动丧失、瘫痪、心肌病、和充 血性心力衰竭或心律不齐的发展。在一些实施方案中，治疗是指部分或完全减轻、改善、缓 解、抑制、延缓发作、降低笨拙的行走、步进或跑步方式、频繁摔倒、疲劳、运动技能困难、肌 纤维畸形、假性肥大、骨骼畸形、低耐力、独立站立困难或无法上楼、运动丧失、瘫痪、心肌病 和充血性心力衰竭或心律不齐的发展的严重性和/或发病率。在一些实施方案中，治疗是指 提高(例如，增加、延长)寿命。
[0116] 在一些实施方案中，所提供的方法改善在受试者中的MD(例如，DMD)的一种或多种 症状。例如，本发明化合物可按足以降低与MD(例如，DMD)相关的疲劳、学习困难、智力障碍、 肌无力、运动技能困难、行走困难、呼吸困难、心脏病、心肌病、充血性心力衰竭、心律失常、 脊柱侧凸、假性肥大、肌萎缩、肌肉挛缩、肌肉畸形和呼吸障碍(例如，肺炎）的时间和量进行 给药，从而改善MD (例如，DMD)的症状。这种症状的改善可在该受试者中通过本文所述的一 种或多种方法进行确定。
[0117] 在一些实施方案中，相比于对照(例如参照或历史样品、未经治疗的受试者或用安 慰剂进行治疗的受试者），在受试者中的本文所述症状降低大约5%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、100%或 更多。
[0118] 在一些实施方案中，治疗是指延长的生存(例如，存活时间）。例如，治疗可使得患 者的预期寿命延长。在一些实施方案中，相比于患有类似疾病但未接受治疗的一或多个对 照个体的平均预期寿命而言，本发明的治疗可引起患者的预期寿命提高超过约5%、约 10%、约 15%、约 20%、约 25%、约30%、约35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约60%、约 65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约100%、约105%、约 110%、约 115%、约120%、约125%、约130%、约135%、约140%、约145%、约150%、约155%、约 160%、约165%、约170%、约175%、约180%、约 185%、约 190%、约200%或更多。在一些实 施方案中，相比于患有类似疾病但未接受治疗的一或多个个体的平均预期寿命而言，本发 明的治疗引起患者的预期寿命增加超过约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约 11个月、约12个月、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年或更久。 在一些实施方案中，本发明的治疗使得患者长期生存。如本文所用，术语"长期生存"是指存 活时间或预期寿命超过约40年、45年、50年、55年、60年或更久。
[0119] 靶组织
[0120]如本文所用，术语"祀组织"是指受到MD(例如，DMD)影响的任意组织。示例性靶组 织包括骨、骨骼肌(例如，患病的骨骼肌）、随意肌(例如，臀部、骨盆区、大腿）、上半身的肌肉 (例如，手臂、颈部、肩部）、下半身的肌肉（例如，臀屈肌、小腿肌肉、跟腱、胭绳肌腱）。在一些 实施方案中，靶组织为心肌。在一些实施方案中，靶组织为横隔膜。在一些实施方案中，靶组 织包括那些不存在抗肌萎缩蛋白或异常存在抗肌萎缩蛋白的组织(例如，抗肌萎缩蛋白缺 乏或功能障碍）。靶组织可，例如，指骨骼肌，例如，患病的骨骼肌。在一些实施方案中，本发 明的方法影响骨骼肌。骨骼肌是三种主要肌肉类型(骨骼肌、心肌和平滑肌)之一。骨骼肌是 横纹肌组织的一种形式且由躯体神经系统控制（其自发地被控制）。骨骼肌通过腱与骨相 连，所述腱是胶原纤维束。
[0121] "靶标外组织"是指任意不是靶组织的组织，例如，心脏、性别相关的器官、涉及生 殖的器官(例如，前列腺）。
[0122] 在一些实施方案中，本文所述的方法优选地施用于一种或多种靶组织。在一些实 施方案中，本文所述化合物(例如，化合物（I))是以结合靶标外组织的例如，2、3、4、5、6、7、 8、9、10或更多倍的亲和力结合至靶组织。在一些实施方案中，本文所述化合物(例如，化合 物（I))是以结合至靶标外组织的例如，100%、150%、200%、250%、300%或更高的亲和力 结合至靶组织的。
[0123] glj 作用
[0124] 可由于使用现有疗法(例如，蛋白同化药物)治疗患有MD (例如，DMD)的受试者而导 致的不良副作用包括肥胖、行为问题、更薄和/或更脆的骨头(骨质疏松症）、青春期延迟、胃 病（胃食管反流或GERD)、白内障和易于感染。所提供的组合物和方法可在靶组织中起作用， 例如，发挥生物学效应，例如，调节雄激素受体，例如，特异性地减轻或降低不良副作用。雄 激素(例如，睾酮和二氢睾酮)通过细胞内雄激素受体来控制广泛的生理过程。雄激素或雄 激素受体调节的循环水平的改变，例如，动态细胞内雄激素受体复合物中的突变或变化，可 导致疾病，例如性腺功能减退、肌肉萎缩和骨质疏松症。因此，用睾酮的治疗与潜在的心血 管风险(例如，心血管疾病、冠心病、高血压、心律不齐、充血性心力衰竭、心脏病发作、心脏 猝死)和前列腺癌风险密切相关。
[0125] 蛋白同化留类(例如，诺龙、氧雄龙)是留体药物，其在机体内具有与睾酮类似的效 果。除骨骼肌之外，蛋白同化留类还可对雄激素敏感组织产生效果，所述骨骼肌掩盖了甾类 在靶组织中的有益效果。由蛋白同化留类产生的不希望的副作用可归因于所述留类在靶标 外位点（靶组织之外的位点）上的作用并包括心血管风险、前列腺癌风险、和性腺机能减退。 副作用还包括涉及荷尔蒙失调的病症(例如，男性青春期的诱导、男子乳腺发育、睾丸萎缩 和精子生成减少）、胆固醇水平上的有害变化(例如，增加的低密度脂蛋白和降低的高密度 脂蛋白）、座疮、尚血压、肝损伤和心脏的左心室结构的危险变化。副作用将视使用持续时间 而变化，可破坏免疫系统、提高血压（例如，尤其是在已经患有高血压的那些个体中）、产生 早年脱发、导致肝损伤、降低性功能并导致暂时不育。特别是在青少年中，副作用可包括提 前终止骨骼的拉长（由于增加的雌激素代谢物水平导致的过早的骨骺融合）、发育障碍、加 速的骨成熟、增加的勃起频率和持续时间、和过早的性发育。精神病副作用包括与健康相关 的较差的态度、攻击性、暴躁、躁狂、精神不正常、情绪障碍和自杀。
[0126] 所提供的方法会使得所治疗的受试者的睾酮水平与该受试者治疗前的睾酮水平 相比没有实质的变化。在一些实施方案中，所提供的方法在所治疗的受试者中引起在相同 性别和年龄的未接受治疗的受试者的正常参考范围内的睾酮水平。在一些实施方案中，该 治疗方法在受试者中基本上没有任何副作用。
[0127] 受试者
[0128] 经所提供的组合物和/或方法治疗的受试者患有或易患MD，例如贝克肌营养不良、 先天型肌营养不良、迪谢纳营养不良、远端型肌营养不良、埃-德肌营养不良、面-肩-肱型肌 营养不良、肢带型肌营养不良、强直型肌营养不良或眼咽型肌营养不良。待治疗的受试者可 具有患病的肌肉（例如，萎缩、纤维变性），其例如，通过肌肉活检或其他诊断方法确定。如本 文所用，术语"受试者"旨在包括人和非人动物，例如，脊椎动物、大型动物和灵长类动物。在 一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物受试者，且在具体实施方案中，所述受试者是人受 试者。虽然施用于人是明显可预知的，而兽医施用，例如，施用于非人动物在本文中也是可 以理解的。本文术语"非人动物"包括所有的脊椎动物，例如，非哺乳动物(例如鸡、两栖动 物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类动物、家养和/或农用动物(例如，羊、狗、猫、牛、 猪J等等)。
[0129] 在一些实施方案中，所述受试者是男性。在一些实施方案中，所述受试者是儿童， 例如，从出生至约21岁。例如，所述受试者可为21岁或更年轻，例如，18岁、16岁、14岁、12岁、 10岁、8岁、6岁、4岁、2岁、1岁或更小。在一些实施方案中，所述受试者是青春期前的，例如， 在男性中，青春期通常开始于大约11岁或12岁。通常，男性青春期到16岁至17岁完成。例如， 所述受试者可为10岁至18岁、11岁至17岁、12岁至16岁、13岁至15岁的男性。
[0130] 示例性人受试者包括患有障碍(例如本文所述障碍)的人受试者或正常受试者。 [0131]如上文所述，MD (例如，DMD)是指肌膜或肌肉蛋白具有缺陷的一组肌肉疾病，其特 征部分在于导致进行性的肌无力的持续的肌肉退化和再生作用、对肌肉损伤增加的易感性 以及肌肉细胞和组织的退化和死亡。判定受试者是否患有MD，以及判定MD的特定类型，可通 过本领域技术人员公认和采用的任意措施进行。例如，受试者的诊断可包括针对性的病史 和检查、生化评估、肌肉活检、和/或基因检测。
[0132] 受试者的病史可用于诊断MD(例如，DMD)。例如，DMD受试者通常在其5岁前出现症 状且经历跑步、跳跃和爬楼梯困难。近端无力导致个体使用他们的手臂才能从地板上起来 (即Gowers迹象）。独立的离床活动通常到14岁时丧失，随后有呼吸功能退化以及挛缩和脊 柱侧凸的发展。受试者普遍遭受静态认知损伤(static cognitive impairment)。大约三分 之一的DMD男孩到14岁时发展心肌病，且绝大多数是在18岁之后。充血性心力衰竭和心律失 常通常在DMD末期。大多数患有DMD的年轻人在他们十八九岁或二十出头死于呼吸功能不全 或心力衰竭。
[0133] 生化评估，例如，酶活性和表达水平(例如，血清肌酸激酶水平、乳酸脱氢酶水平） 的测定，可用于诊断患有肌营养不良（例如，DMD)的受试者。增加的血清肌酸激酶水平指示 增加的肌肉损伤。本发明提供了对患有肌营养不良的受试者的治疗，所述患者具有高的或 升高的血清肌酸激酶水平。在一些实施方案中，适用于使用本发明方法进行治疗的人受试 者是具有高的或升高的血清肌酸激酶水平的MD(例如，DMD)受试者，特别是当所述受试者患 有本文所述的病症时。增加的血清乳酸脱氢酶水平指示增加的代谢困难。本发明提供了对 患有MD(例如，DMD)受试者的治疗，所述受试者具有高的或升高的乳酸脱氢酶水平。在一些 实施方案中，适用于使用本发明方法进行治疗的人受试者是具有高的或升高的血清乳酸脱 氢酶水平的MD(例如，DMD)受试者，特别是当所述受试者患有本文所述病症时。在一些实施 方案中，所述血清肌酸激酶，以每升中酶活性(U/L)为单位进行测量，大于5000、6000、7000、 8000、9000、10000或11000。在一些实施方案中，所述血清肌酸激酶，以每升中酶活性(U/L) 为单位进行测量，在5000至25000、7500至20000,或10000至20000之间。在一些实施方案中， 所述血清肌酸激酶水平是出生时的血清肌酸激酶水平的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100或更多倍。
[0134] 肌肉活检也可用于诊断患有MD (例如，DMD)的受试者。例如，DMD患者的肌肉活检显 示出纤维尺寸的退化、再生和变化，伴有肌肉被脂肪和结缔组织所替代。本发明提供了在具 有降低或低的肌肉抗肌萎缩蛋白水平的受试者中治疗MD(例如，DMD)的方法。
[0135] 基因测试也可用于诊断患有肌营养不良的受试者。用于基因测试的技术包括聚合 酶链反应(PCR)、Sourthern印迹、突变扫描法和/或序列分析。在65%的DMD患者和85%的 BMD患者中检测到所述抗肌萎缩蛋白基因的缺失。抗肌萎缩蛋白的定量测定可用于预测表 型（例如，DMD患者具有不足正常量的5%的抗肌萎缩蛋白，BMD患者具有正常抗肌萎缩蛋白 水平的至少20%)。涉及控制肌肉质量的基因分析，（例如，肌肉再生或肌肉生长的标记物， 例如，肌形成蛋白、IGF-1、卵泡抑素）；肌肉代谢和动力传导信号的调节剂(例如，过氧化物 酶体增殖物受体γ -辅激活因子(PGC)-Iα)可用于诊断患有MD(例如，DMD)的受试者。例如， 为了进行基因测试，可收集单个常规血液样品，其可用于分析在所述抗肌萎缩蛋白DNA上的 突变。该试验也可测定突变的类型（例如，缺失、复制、插入、错义、无义)并确定其在该抗肌 萎缩蛋白基因中的位置。在所述抗肌萎缩蛋白DNA上的缺失和复制可首先被试验，然后进行 涉及基因测序和序列分析的第二试验，其可确定例如，基因变化、插入、错义、无义突变。
[0136] 生化评估，例如，例如，代谢物分布或代谢物水平的测定，例如，睾酮水平(例如，游 离的、总的），可用于确定化合物、组合物或治疗方法对MD(例如，DMD)受试者的靶标外效应。 睾酮水平可由例如，血液试验、唾液试验、尿检确定，且睾酮水平可通过例如电化学发光免 疫测定(ECLIA)、液相色谱-质谱(LC/MS)方法进行分析。
[0137] 在一些实施方案中，本文所述方法导致相比于未经治疗的受试者，受试者的靶组 织(例如，骨骼肌，例如，患病的骨骼肌)相对于靶标外组织(例如，前列腺)具有增加的睾酮 水平。除其他之外，本发明提供对患有肌营养不良的受试者的治疗，该治疗产生靶标外组织 中睾酮的正常水平(例如，生理水平）。在一些实施方案中，在经治疗的受试者中的睾酮水平 相比于该受试者在治疗前存在的睾酮水平而言没有实质的变化。在一些实施方案中，所提 供的组合物和方法的特征在于以下的一种或两种:a)相比于蛋白同化药物（例如，留类治 疗），在受试者的肌肉和骨中的活性更高，b)相比于蛋白同化药物(例如，留类治疗），在该受 试者的前列腺中的活性更低。
[0138] 患者的选择和监控
[0139] 本文提供的是在受试者中治疗MD(例如DMD)的组合物和方法。还提供了确定受试 者是否患有MD(例如，DMD)的方法;基于所述确定（例如测量肌萎缩、肌肉纤维化)选择进行 治疗的受试者;给药有效量的化合物（I)或其药学上可接受的盐，从而治疗该受试者中的MD (例如，DMD)。本文还描述了预测有发展成MD(例如，DMD)风险的受试者的方法(例如，通过生 化评估，例如，测定酶活性和表达水平，例如，血清肌酸激酶水平、乳酸脱氢酶水平;通过基 因测试，例如，定量测定抗肌萎缩蛋白、肌形成蛋白、ICF-1、卵泡抑素和或(PGC)-la)。
[0140]在一些实施方案中，基于通过例如受试者的病史、基因测试、肌肉活检、生化评估 诊断受试者患有MD (例如，DMD)的确定选择进行治疗的受试者。
[0141]在一些实施方案中，所述受试者先前已经用留类、沙丁胺醇、血管紧张素转换酶抑 制剂、β-阻断剂、利尿药、质子栗抑制剂、氨基酸、肉碱、辅酶Q10、肌酸、鱼油、绿茶提取物或 维生素 E中的一种或多种来治疗MD，例如，DMD。
[0142] 在一个方面，本发明是在受试者中评估治疗MD (例如，DMD)的方法，其包括:获得该 受试者的MD (例如，DMD)状况值;根据所获得的MD (例如，DMD)值，向该受试者给药包含化合 物（I)的药物组合物；以一种或多种预设的时间间隔检测该受试者中MD(例如，DMD)状况值 的变化;从而评估对该受试者的MD(例如，DMD)的治疗。在一些实施方案中，该方法包括进行 以下中的一种或多种：以相同的时间表、时间过程或剂量持续给药所述药物组合物;给药改 变剂量的所述药物组合物;改变给药所述药物组合物的时间表或时间过程;或给药替代的 治疗，从而治疗所述受试者的MD，例如，DMD。
[0143] 化合物
[0144] 化合物（1)(也称为GLPG0492、G100192)是可影响（例如调节)雄激素受体(AR)的活 性的化合物。所述活性剂为化合物(I):
[0145]
[0146] 或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药，例如，公开于W02010/029119中。在一 些实施方案中，所述活性剂是化合物（I)的前药。在一些实施方案中，所述活性剂是化合物 (I)的代谢物》在一·®实施方案中，化合物（I)在体内被代谢(例如，氧化)成化合物（Π ):
[0147]
[0148] 或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述活性剂是化合物（II)。在一些实 施方案中，所述活性剂是化合物(I I)的前药。
[0149] 如本文所用，术语"代谢物"是指已经被加工(例如在受试者的体内）成药物的化合 物。代谢物是代谢的中间体和产物，例如，随着化合物的降解和消除的一部分天然生化过程 所形成的。在一个实施方案中，所述加工包括键(例如，共价键)的断裂和形成。在一些实施 方案中，所述加工包括化合物的氧化。在一些实施方案中，所述加工包括化合物的化学修 饰，例如，葡萄苷酸化、糖基化。
[0150] 纯度
[0151] 组合物的"对映体过量"或"％对映体过量"可使用下文所示等式进行计算。在下文 所示实例中，组合物含有90%的一种对映异构体(例如，R型对映异构体)和10%的另一种对 映异构体(即，S型对映异构体）。
[0152] ee = (90_10)/100 = 80%。
[0153] 因此，含有90 %-种对映异构体和10 %另一种对映异构体的组合物被称为具有 80 %对映体过量。
[0154] 在一些实施方案中，所提供的组合物含有至少50%、75%、90%、95%或99%对映 体过量的例如，化合物（I)的R-对映异构体。换句话说，相对于S对映异构体，所述组合物含 有对映体过量的R对映异构体。
[0155] 药物组合物
[0156] 如本文所用，有效治疗障碍的组合物或化合物的量，或"治疗有效量"是指将所述 组合物或化合物以单剂量或多剂量给药至受试者后，超过未使用该治疗所预期地有效地治 疗组织、或有效地治愈、缓和、缓解或改善患有疾病的受试者的量。
[0157] 如本文所用术语"药学上可接受的载体或佐剂"是指载体或佐剂，其可与本发明化 合物一起给药至受试者，并且当将其以足够递送治疗量的所述化合物的剂量给药时，不会 破坏本发明化合物的药理学活性且是无毒的。
[0158] 如本文所用术语"药学上可接受的盐"，是指所公开的化合物的衍生物，其中通过 将现有的酸或碱部分转化成其盐形式而对该母体化合物进行修饰。药学上可接受的盐的实 例包括，但不限于，碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐;酸性残基(例如羧酸)的碱盐或有 机盐;等。本发明的药学上可接受的盐包括母体化合物(例如，化合物(I)或其药学上可接受 的盐、其代谢物或其前药)的常规的无毒盐，其由例如，无毒无机酸或有机酸形成。本发明的 药学上可接受的盐可通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物(例如，化合 物（I)或其药学上可接受的盐，其代谢物或其前药)合成。通常，这种盐可通过以下方式制 备:将这些化合物的游离酸或游离碱形式与化学计量量的适当的碱或酸在水中或在有机溶 剂中或在二者的混合物中反应;通常，非水介质（例如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈)是 优选的。合适的盐的列表见于Remington's Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa·，1985，第1418页和Journal of Pharmaceutical 3以61«^，66,2(1977)，将其全部引入本文作为参考。
[0159] 如本文所用短语"药学上可接受的衍生物或前药"是指化合物的任意药学上可接 受的盐、酯、酯的盐或其它衍生物(例如，盐酸盐），一旦将其给药至接受者便能够(直接或间 接)提供治疗剂。例如，前药可以指在受试者体内加工成药物的化合物。在一个实施方案中， 所述加工包括键(例如，共价键)的断裂或形成。在一个实施方案中，所述加工包括化合物的 氧化，例如，"-OH"基团的羟基化或加成。示例性衍生物和前药包括:相对于母体类型，当将 本发明化合物给药至哺乳动物(例如，提供口服给药的化合物使得更易吸收进入血液)时提 高该化合物的生物利用度或增强母体化合物到生物学隔室(biological compartment)(例 如，脑或淋巴系统）的递送的那些。前药包括衍生物，其中提高水溶性或跨肠膜的主动转运 的基团列于本文所述的结构式中。
[0160] 口服制剂
[0161] 如本文所用术语"口服剂型"是指用于向受试者给药药物(例如，化合物(I)或其药 学上可接受的盐、其代谢物或其前药)的组合物或介质。通常，口服剂型是通过口腔给药的， 但是，"口服剂型"旨在涵盖任意给药至受试者并经过跨膜(例如，胃肠道(包括，例如，口腔、 食道、胃、小肠、大肠和结肠)的粘膜)吸收的物质。例如，" □服剂型"包括通过饲管给药至胃 中的溶液。"口服剂型"可通过含服给药或舌下给药。口服剂型除化合物(I)或其药学上可接 受的盐、其代谢物或其前药之外可包含药学上可接受的载体、一种或多种药学上可接受的 赋形剂，例如，粘合剂、稳定剂、稀释剂、表面活性剂、调味剂和芳香剂。
[0162] 本文所用术语"可溶的"是指化合物或组合物，其中当将所述化合物或组合物置于 数量上占优势的溶剂中，例如，将所述化合物或组合物置于溶剂:化合物或组合物的比例至 少是10:1^1:/\¥1:)的溶剂中，在120分钟内，至少50%(¥1:/\¥1:)(例如，70%、例如，80%、例如， 90 %、例如，98 % )的所述化合物或组合物进入该溶液(例如，水溶液）。
[0163] 药学上可接受的载体可为无菌液体，例如，水和油，包括石油、动物、植物或合成来 源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述口服剂型是液体时，则水是优选 的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体。口服剂型可通过本领域 熟知的方法制造，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、表面沉积、制锭、研磨、乳化、包封、包 埋或冻干方法。用于配制和给药活性成分的其他技术可见于" R e m i n g t ο η ' s Pharmaceutical Sciences，"Mack Publishing Co.，Easton，Pa·，最新版，将其引入本文如 同本文中全面阐述。因此，用于本发明的口服剂型可使用一种或多种药学上可接受的载体， 以常规方式进行配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其促进将所述活性成分加工成可药用 的制剂。
[0164] 对于口服给药，所述活性成分(例如，化合物(I)或其药学上可接受的盐、其代谢物 或其前药)可通过将该活性成分与本领域熟知的药学上可接受的载体组合而容易地配制。 这种载体能够将本发明的活性成分制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、衆液、 粉末或颗粒、在水或非水介质中的混悬液或溶液，等等，用于患者口服摄取。口服使用的药 物制剂可通过以下进行制备:使用固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并加工该颗粒混合 物，如果需要的话在加工之前加入合适的助剂，得到片剂或锭剂核心。合适的赋形剂，例如 增稠剂、稀释剂、调味剂、分散助剂、乳化剂、粘合剂或防腐剂可以是期望的。
[0165] 锭剂核心与合适的包衣一起提供。出于此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地 含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的 有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加至该片剂或锭剂包衣中用于辨别或表明活性成 分剂量的不同组合。
[0166] 可口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推合(push-fit)胶囊以及由明胶和 增塑剂(例如甘油或山梨醇）制成的软密封胶囊。所述推合胶囊可含有活性成分，其与填充 剂(例如乳糖）、粘合剂(例如淀粉）、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选地稳定剂混合。在 软胶囊中，可将所述活性成分溶于或混悬于合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚 乙二醇中。此外，可加入稳定剂。用于口服给药的所有制剂应为适于所选给药途径的剂量。
[0167] 所述剂量可根据所采用的剂型和所用的给药途径而变化。确切的制剂、给药途径 和剂量可由个体医生根据患者的病症进行选择。（参见例如，Fingl，等人，1975,在"The Pharmacological Basis of Therapeutics"，第1章第1页）。会需要比上述那些更低或更高 的剂量。对于任意特定受试者的特定剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所用具体化 合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合、疾病、 病症或症状的严重性和病程、受试者患疾病、病症或症状的倾向、和治疗医生的判断。
[0168] -旦受试者的病症得到改善，则如果需要的话可给药维持剂量的本发明化合物、 组合物或组合。因此，当症状已经减轻至所需水平时，根据该症状，可将给药剂量或频率或 二者降低至能够不保持所改善的病症的水平。但是，受试者一旦出现任何疾病症状的复发， 则会需要长期的周期性治疗。
[0169] 口服剂型可以，如果需要的话，以包装或分片器装置来提供，例如Π )Α批准的试剂 盒，其可含有一或多个含所述活性成分的单位剂型。所述包装可，例如，包括金属或塑料箱， 例如泡罩包装。所述包装或分片器装置可配有给药说明书。所述包装或分片器还可配有与 容器相连的注意事项，其形式是由监管药品生产、使用或销售的政府机构规定的，该注意事 项反映的是所述机构批准的组合物的形式或人或兽的给药。这个注意事项，例如，可以是在 美国食品和药品管理局批准的针对处方药的标签上或者是在所批准的产物说明书上。 [0170]如本文所用术语"胃肠外剂型"是指用于以口服或胃肠道之外的方式向受试者给 药药物(例如，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药)的组合物或介质。示 例性胃肠外剂型或给药方式包括鼻内、含服、静脉内、肌内、皮下、胃肠内、粘膜、舌下、眼内 和局部(例如，静脉内或皮下）。
[0171] 当用作药物时，本发明组合物通常以药物组合物的形式给药。这种组合物可以药 物领域熟知的方式进行制备且包含至少一种活性化合物。通常，本发明化合物以治疗有效 量进行给药。所述化合物实际给药的量通常由医生根据相关情况决定，所述相关情况包括 所治疗的病症、所选的给药途径、实际给药的化合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症 状的严重程度。
[0172] 用于口服给药的组合物可以采用散装液体溶液或混悬液，或散装粉末的形式。但 是更常见的是，组合物以单位剂型提供，用以促进精确给药。术语"单位剂型"是指适合以单 一剂量用于人受试者和其他哺乳动物的物理上分散的单元，各单元含有经计算产生所需治 疗效果的预定量的活性物质以及合适的药物赋形剂、载剂或载体。典型的单位剂型包括预 填充的、预测量的液体组合物的安瓿或注射器，或者在固体组合物的情况下是丸剂、片剂、 胶囊等。在这种组合物中，所述活性化合物通常是少量组分(约0.1至约50重量％或优选约1 至约40重量％)而剩余的是各种载剂或载体以及帮助形成所需剂型的加工助剂。
[0173]适用于口服给药的液体形式可包括合适的含水或非水载剂以及缓冲剂、悬浮剂和 分散剂、着色剂、调味剂等。固体形式可包括，例如，任意以下成分，或相似性质的化合物:粘 合剂(例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶）；赋形剂(例如淀粉或乳糖）、崩解剂(例如海藻酸、 Primogel或玉米淀粉）；润滑剂(例如硬脂酸镁）；助流剂(例如胶体二氧化硅）；甜味剂(例如 蔗糖或糖精）；或调味剂(例如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂）。
[0174] 用于口服给药的组合物的上述组分仅仅是代表性的。其他材料以及加工技术等在 Remington's Pharmaceutical Sciences 的第8 部分，第17版，1985，Mack Publishing Company，Easton ,Pennsylvania中阐述，将其引入本文作为参考。
[0175] 本发明化合物还可以缓慢释放形式给药或可从缓慢释放药物递送系统中给药。代 表性的缓释材料的描述可见于Remington's Pharmaceutical Sciences。
[0176] 在一些实施方案中，所述活性剂可与保护所述化合物免于快速释放的载体一起制 备，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解、生物相容的聚合物， 例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多 方法已获得授权或通常是已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
[0177]药物组合物可用医疗装置进行给药。例如，药物组合物可用无针皮下注射装置进 行给药，例如公开于美国专利号 5,399，163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941，880、 4，790，824或4，596，556中的装置。熟知的植入物和模件的实例包括：美国专利号4，487， 603，其公开了以受控速率分散药物的可植入的微量输液栗;美国专利号4，486，194，其公开 了通过皮肤施用药物的治疗装置;美国专利号4,447,233，其公开了用于以准确滴率递送药 物的药物输液栗;美国专利号4，447，224，其公开了用于连续药物递送的流量可变的可植入 输液器;美国专利号4,439,196,其公开了具有多腔区室(multi-chamber compartment)的 渗透性的药物递送系统;和美国专利号4,475,196,其公开了渗透性的药物递送系统。当然， 许多其他的这种植入物、递送系统和模块也是已知的。
[0178]如本文所用的剂量单位形式或"固定剂量"是指适合作为用于待治疗受试者的单 一剂量的物理分散单元;各单元含有经计算产生所需疗效的预定量的活性化合物以及所需 的药物载体以及任选地其他试剂。
[0179] 在一些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方 案中，将所述药物组合物配制成单位剂型。在一些实施方案中，将所述药物组合物配制成固 体剂型（例如，胶囊、片剂）。在一些实施方案中，所述固体剂型选自片剂、胶囊、囊剂、粉末、 颗粒和锭剂。在一些实施方案中，将所述药物组合物配制成液体剂型。在一些实施方案中， 所述药物组合物经口服给药。
[0180] 组合
[0181] 在一些情况下，所提供的组合物(例如，包含化合物(I)或其药学上可接受的盐、其 代谢物或其前药的组合物)还包含额外的试剂（例如，治疗剂），或者将其与包含额外试剂 (例如，治疗剂)的组合物组合给药。
[0182] 在一个实例中，将化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药与额外的 试剂作为组合物提供，并将所述组合物给药至受试者。进一步可以是，例如，在给药组合物 之前或之后至少24小时，单独给药一个剂量的包含化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代 谢物或其前药的组合物，并然后给药一个剂量的包含额外的试剂(例如，治疗剂)的组合物。 在另一实例中，包含化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的组合物和额外 的试剂(例如，治疗剂)作为单独的组合物提供，且给药步骤包括相继给药包含化合物(I)或 其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的组合物和包含所述额外的试剂的组合物。相继 给药可在同一天提供(例如，彼此间隔一小时或至少3、6或12小时的时间内）或在不同天提 供。
[0183] 通常，化合物(I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的组合物和所述额外 的试剂各自以多个单独的剂量经一段时间进行给药。各组合物通常根据方案进行给药。针 对一或两个组合物的方案可具有规律的周期。用于包含所述化合物（I)或其药学上可接受 的盐、其代谢物或其前药的组合物的方案可具有与包含所述额外的试剂的组合物的方案不 同的周期，例如，一种可比另一种给药更频繁。例如，在一个实例中，所述化合物（I)或其药 学上可接受的盐、其代谢物或其前药的组合物和所述额外试剂的组合物一个是每天给药一 次而另一个是每周给药一次。
[0184] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的组合 物和额外的试剂各自以相同的剂量进行给药，如同各自以单一疗法进行配制一样。在其他 实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的组合物以一定剂量进 行给药，所述剂量等于或小于单独给药时达到疗效所需的量。同样地，所述额外的试剂可以 一定剂量进行给药，所述剂量等于或小于单独给药时达到疗效所需的量。
[0185] 与化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药组合来治疗MD(例如， DMD)的额外试剂的非限制性实例包括：
[0186] 额外的试剂，包括雄激素受体调节剂(例如，激动剂、拮抗剂）。示例性的额外的试 剂包括蛋白同化的药物(例如，α-甲基泼尼松龙、诺龙、氧雄龙）、雄激素(例如，睾酮、二氢睾 酮）、肌生成抑制蛋白-阻滞剂、β2_肾上腺素受体激动剂，和/或选择性雄激素受体调节剂 (SARMs)。示例性额外的试剂包括留类，例如，糖皮质类固醇，例如，强的松(也称为泼尼松 龙）、地夫可特。在一些实施方案中，额外的试剂包括肌酸一水合物;谷氨酰胺;结合核糖体 并导致通过提前终止密码子(无义突变)读取的药物，例如氨基糖苷类抗生素，例如，庆大霉 素;导致跳过异常终止密码子的药物，例如，PTC124;或促使细胞的剪接机制跳过含有突变 的抗肌萎缩蛋白基因外显子的药物，例如，反义RNA或吗啉代反义寡核苷酸。
[0187] 额外的试剂还包括补充剂或其他药物，包括辅酶Ql0、肉碱、氨基酸(例如，谷氨酰 胺、精氨酸）、抗炎剂/抗氧化剂(例如，鱼油、维生素 Ε、绿茶提取物、己酮可可碱）、草药或植 物提取物。
[0188] 除了额外的试剂的组合物，也可向受试者递送其他药物。但是，在一些实施方案 中，除了化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药，没有额外的试剂(例如，小 分子治疗剂)作为药物组合物给药至受试者。
[0189] 在一些实施方案中，本发明的组合物与非药理学处理组合施用。例如，随着肌无力 的进展、呼吸肌强度的损失伴随着随后的无效咳嗽(ineffective cough)和通气降低，导致 肺炎、肺不张以及睡眠和清醒时的呼吸功能不全[Gozal 2000]。这些并发症通常用谨慎的 呼吸功能跟进和评估进行预防。DMD患者可进行常规的免疫接种，包括肺炎球菌疫苗和每年 的流感疫苗。年龄较大的非卧床DMD男孩可进行每年的呼吸量测措施。一旦儿童坐轮椅并且 如果他的用力肺活量(FVC)低于预计的80%，和/或该儿童为12岁，则他要每年拜访专门从 事儿科呼吸系统护理的医生两次[Finder等人2004]。需要机械辅助气道清除疗法或机械辅 助通气的更晚期的患者要每3-6个月看一次胸腔内科医生。这些访问的常规评估可包括通 过脉搏血氧定量法、通过呼吸量测定法和测量吸气和呼气压力以及峰值咳嗽流量确定血氧 饱和度[Bach等人1997]。当峰值咳嗽流量小于270L/分钟和/或其最大呼出压力小于60cm H20时，可推荐使用辅助咳嗽技术[Finder等人，2004] AMD患者具有增加的患睡眠呼吸中止 症、夜间呼吸不足和低氧血症的风险。用无创夜间通气治疗这些患者可显著提高生活质量 [Baydur等人 2000] 〇
[0190]虽然高对抗性运动，尤其是那些涉及离心收缩的运动（即举重)会损伤肌肉细胞膜 并应当避免[Ansved 2003]，但久坐的生活会同样有害[McDonald2002]。保持积极的生活方 式，例如，非对抗性运动(例如游泳），可预防过度体重增加，尤其是如果儿童是用留类进行 治疗的话。扭转式助行器可用于提供低能量的离床活动并改善生活质量。
[0191] 跟腱以及之后的其他关节的挛缩是常见的。主动活动度(active range)的运动辅 以被动伸展运动对预防早期挛缩非常重要并保持更好的步态力。无法离床活动的男孩可使 用站立板(standing board)以提供跟腱的恒定拉伸。如果剧烈拉伸效果不好，手术松弛紧 张的跟腱是有益的[Bushby 2010b]。在挛缩纠正后，可提供长的腿部支架以维持一些离床 活动。由于在过去常用于保持稳定的宽式(broad-based)步态，也可绷紧髂胫带。当由于臀 部的前旋转导致仍存在离床活动时，或之后由于长期坐在轮椅上，髋部屈肌会变收缩。臀部 弯曲挛缩可受益于手术松弛然后施用长的腿部支架。切除阔筋膜(Rideau过程)可对一些患 者有益[Do 2002]。
[0192] 许多DMD患者在丧失独立离床活动后发展成脊柱侧凸。在合适订做的轮椅上使用 结实的座位和背部衬垫可通过保持躯干直立姿势从而有助于预防脊柱侧凸。对于一些男 孩，可安装长的腿部支架从而每天直立支撑站立以预防弯曲。使用留类(可能是由于其在青 少年早期的生长刺激期之外延长离床活动）延迟或预防脊柱侧凸，即使是该儿童最终仍要 坐轮椅[Alman等人2004; Yilmaz等人2004]。一旦脊柱侧凸达到30度，其通常随着年龄和生 长发展。无法修复DMD的脊柱侧凸可造成增加的住院率、或肺功能恶化和差的生活质量 [bFinder等人2004]。当肺和心脏功能令人满意(通常当FVCM0%时具有最佳恢复)时可进 行手术干预，但是不存在基于肺功能的脊椎侧凸手术的绝对禁忌症[Finder等人2004]。一 旦在脊柱侧凸片上测量的Cobb角在30至50度之间，通常安排手术[Brook等人1996]。
[0193] 通过超声心动图测量左心室功能障碍来确定涉及DMD预后的心脏相关性[Corrado 等人2002]。目前用于涉及DMD的心脏研究的指导[Bushby 2003;Finsterer和Stollberger 2003 ;Bushby 2010b]推荐在诊断时使用EKG和超声心动图，然后每2年筛查一次至10岁，然 后每年筛查一次。早期预防性地使用ACE抑制剂并且如果需要的话在之后可使用β-阻断剂 [Bushby 2003;Finsterer和Stollberger 2003]〇
[0194] 给药和剂量
[0195] 给药方法
[0196] 本发明方法考虑单次以及多次给药治疗有效量的本文所述组合物。组合物，例如， 本文所述组合物，可根据受试者病症的性质、严重性和程度，以有规律的间隔进行给药。在 一些实施方案中，本文所述组合物以单次剂量进行给药。在一些实施方案中，本文所述组合 物以多剂量进行给药。在一些实施方案中，治疗有效量的组合物，例如，本文所述组合物，可 口服并以有规律的间隔进行周期性地给药(例如，每1、2、3、4、5或6天或每1、2、3、4、5、6、7、8 或9周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9个月或更久给药1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次）。
[0197] 在一些实施方案中，本文所述组合物以预定的时间间隔进行给药(例如，每1、2、3、 4、5或6天或每1、2、3、4、5、6、7、8或9周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9个月或更久给药1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10或更多次）。在一些实施方案中，组合物经长期给药。
[0198] 在一些实施方案中，组合物每天给药一次。
[0199] 每天约0.01至约100mg/kg体重的剂量水平(优选每天约0.01至约10mg/kg体重)有 效用于治疗MD(例如，DMD)。在一些实施方案中，剂量水平为每名受试者(基于以约20kg计算 的受试者的平均尺寸)约0.01至约5g/天，例如约0.025至约2g/天、约0.05至约Ig/天。通常， 本发明的药物组合物将以每天约1至约5次进行给药，优选每天约1至约3次。
[0200] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药经长期 给药。在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药每1、2、3、 4、5或6天、每1、2、3、4、5、6、7、8、9周、每1、2、3、4、5、6、7、8、9个月或更久给药1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10或更多次。在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其 前药每天给药一次。
[0201] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的剂量 可为以下剂量，例如每日约〇 · Img至约IOmg，例如，每日约0 · 25mg或约Img。例如，可将约0 · 5/ 天剂量的化合物(I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药给药至患者，例如，以〇. 5mg 剂量每日一次。在一些实施方案中，所述0.5mg的剂量是在约5mg、10mg、20mg、25mg、30mg、 50mg、75mg、IOOmg、150mg、200mg或更大的片剂中。例如，可将约0 · 5mg/天剂量的化合物⑴ 或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药给药至患者，例如，约〇.25mg每日给药两次。
[0202] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药以每名 受试者约0.1 mg至lmg、每名受试者约0.2mg至约0.8mg、每名受试者约0.3mg至约0.7mg、每名 受试者约0.4mg至约0.6mg的剂量进行给药。
[0203] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐，其代谢物或其前药以每名 受试者不超过lmg、0.5mg、0.25mg或0.1 mg的剂量进行给药。在一些实施方案中，所述剂量为 每名受试者0. lmg。在一些实施方案中，所述剂量为每名受试者0.25mg。在一些实施方案中， 所述剂量为每名受试者〇.5mg。在一些实施方案中，所述剂量为每名受试者Img.
[0204] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药以每千 克受试者体重约〇. Ing至约lg、每千克受试者体重约IOOng至约10mg、每千克受试者体重约1 yg至约l〇〇yg、每千克受试者体重约5yg至约25yg、约IOyg至约20yg或约3yg至约30yg的剂量 进行给药。在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药以每 千克受试者体重不超过250yg、150yg、I OOyg、50yg、30yg、15yg、7yg或3yg的剂量进行给药。
[0205] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药以每千 克受试者体重约3yg的剂量进行给药。在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的 盐、其代谢物或其前药以每千克受试者体重约7yg的剂量进行给药。在一些实施方案中，化 合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药以每千克受试者体重约15yg的剂量进 行给药(例如）。在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药 以每千克受试者体重约3〇yg的剂量进行给药。
[0206] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药以单次 剂量进行给药。
[0207] 在一些实施方案中，本文所述药物组合物以口服剂型提供，例如，本文所述的口服 剂型。在一些实施方案中，所述口服剂型含有至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约 40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至少约80 %、至少约90 %或更多的化合物（I) 或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药。
[0208] 在一些实施方案中，化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药不是 100%有效的或纯的（例如，其效力或纯度为至少约75%、至少约80%、至少约90%、至少约 92%、至少约95 %、至少约98 %、至少约99 %有效），在这种情况下，上述剂量是指给药至患 者的有效或纯的化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的量而不是化合物 (I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药的总量。这些剂量可作为单一疗法和/或作 为组合疗法的一部分(例如上文所述)给药至患者。
[0209] 这种给药可用作长期治疗。可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量可根 据所治疗的受试者而变化。典型的制剂将含有约5%至约95%的活性化合物(w/w)。优选地， 这种制剂含有约20 %至约80 %、约25 %至约70 %、约30 %至约60 %的活性化合物(w/w)。
[0210] 当本公开的组合物涉及化合物（I)或其药学上可接受的盐、其代谢物或其前药与 一种或多种额外的治疗剂或预防剂的组合时，则所述化合物和所述额外的试剂都应以在单 一治疗方案中通常给药的剂量的约10至100%，和更优选约10至80%的剂量水平存在。
[0211] -旦患者的病症改善，如果需要，可给药维持剂量的本文所述组合物。因此，根据 症状，给药的剂量或频率或二者可降低至维持该改善的病症的水平(例如，至约1/2或1/4或 更少的给药剂量或频率），当该症状已经减少至所期望的水平时，治疗应停止。但是，一旦疾 病症状有任何复发，则患者会需要长期基础上的间歇治疗。
[0212] 还应理解，任意具体患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所采用 具体化合物的活性、年龄、体重、一般性健康状况、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合和治 疗医生的判断和所治疗疾病的严重性。活性成分的量还将取决与具体描述的化合物和在该 组合物中是否存在额外的试剂以及该额外的试剂的性质。
[0213]食物影响
[0214] 所提供的组合物和方法可受到所治疗的受试者的进食的影响。例如，进食可导致 治疗的有效性或治疗活性升高或降低。例如，进食可通过例如增加或降低化合物(例如本文 所述化合物)的生物利用度来影响治疗活性;影响化合物(例如，本文所述化合物)调节蛋白 (例如，受体(例如，AR))的能力。将理解，术语"进食"通常是指摄取营养素，例如，摄取含热 量的液体或固体。在一些实施方案中，一餐可为一杯牛奶或其他含蛋白的饮料。通常，随餐 给药的组合物不能在空腹期间摄取，例如，在空腹2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多小时 的期间。在未进餐时给药的组合物将在空腹期间被摄取，例如，在空腹2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12或更多小时的期间。
[0215] 在一些实施方案中，本文所述组合物在进食后给药。在一些实施方案中，本文所述 组合物在进食后至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟、至少90分 钟、至少120分钟、至少3小时、至少4小时、至少6小时给药。
[0216] 在一些实施方案中，本文所述组合物在进食前给药。在一些实施方案中，本文所述 组合物在进食前至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟、至少90分 钟、至少120分钟、至少3小时、至少4小时、至少6小时给药。
[0217] 试剂盒
[0218] 在另一方面，本发明的特征在于用于评估样品，例如，获自MD(例如，DMD)患者的样 品，以检测或确定本文所述的一种或多种基因水平的试剂盒。该试剂盒包括用于检测本文 所述一种或多种基因的设备(例如，特异性检测的试剂）。在一些实施方案中，所述试剂盒包 括MD (例如，DMD)治疗。
[0219] 本文所述的方法、装置、反应混合物、试剂盒和其他发明还可以包括提供或生成， 和/或发送信息(例如，一个报告），其含有通过本文所述的方法、测试和/或试剂盒确定的评 估或治疗数据。该信息可被发送到报告接收方或实体(例如，患者、医疗服务人员、诊断提供 者和/或管理机构，例如，FDA)，或以其他方式向另一方发送有关本文所述方法、测试和试剂 盒的信息。该方法可涉及符合管理机构要求，例如，管理机构(例如，FDA)预批准或后批准的 要求。在一个实施方案中，所述报告接收方或实体可确定预定的要求或参考值是否与该数 据，和，任选地，来自报告接收方或实体(例如医生、患者、诊断提供者)的响应相符。
[0220] 本发明所述化合物可提供在试剂盒中。该试剂盒包含本文所提供的组合物，例如， 包含本文所述的化合物（I)或其药学上可接受的盐、前药或代谢物的组合物以及任选地容 器、药学上可接受的载体和/或信息材料。所述信息材料可以是涉及本文所述方法和/或α4 拮抗剂在本文所述方法中的用途的描述、指导、销售或其他材料。
[0221] 该试剂盒的信息材料并不局限于其形式。在一个实施方案中，所述信息材料可包 括有关以下方面的信息：制备本文所提供的组合物(例如，包含化合物（I)或其药学上可接 受的盐、前药或其代谢物的组合物）、所述化合物的物理性质、浓度、有效期、批次或生产地 址信息等等。在一个实施方案中，所述信息材料涉及例如通过本文所述的给药途径和/或以 本文所述的剂量和/或给药方案给药本文所提供的组合物(例如，包含化合物（I)或其药学 上可接受的盐、前药或其代谢物的组合物)的方法。
[0222] 在一个实施方案中，所述信息材料可包括介绍以实施本文所述方法的合适的方 式，例如，以合适的剂量、剂型或给药方式(例如，本文所述的剂量、剂型、给药方式)给药本 文所提供的组合物(例如，包含本文所述化合物（I)或其药学上可接受的盐、前药或其代谢 物的组合物)的使用说明书。在另一实施方案中，所述信息材料可包括介绍向合适的受试者 (例如，人，例如，患有肌营养不良的人，例如，患有DMD的人)给药本文所述组合物(例如，包 含化合物(I)或其药学上可接受的盐、前药或其代谢物的组合物)的使用说明书。
[0223] 该试剂盒的信息材料并不局限于其形式。在许多情况下，所述信息材料，例如，使 用说明书，以印刷制品提供，例如，印制文本、图片和/或照片，例如，标签或印刷册。但是，所 述信息材料还可以其他形式提供，例如盲文、计算机可读材料、录像或录音。在另一实施方 案中，该试剂盒的信息材料是联络信息，例如，物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码， 其中该试剂盒的使用者可获得有关本文所提供的组合物(例如，包含本文所述化合物(I)或 其药学上可接受的盐、前药或其代谢物的组合物)及/或在本文所述方法中的用途的实质信 息。所述信息材料还可以任意形式的组合提供。
[0224] 除了本文提供的组合物，例如，包含本文所述化合物（I)或其药学上可接受的盐、 前药或其代谢物的组合物，该试剂盒的组合物可包含其他成分，例如表面活性剂、冻干保护 剂或稳定剂、抗氧化剂、抗菌剂、膨胀剂、螯合剂、惰性气体、张度剂和/或粘度剂、溶剂或缓 冲剂、稳定剂、防腐剂、药学上可接受的载体和/或用于治疗本文所述疾病或障碍的第二药 物。或者，所述其他成分可包含在该试剂盒中，但是与本文所提供的组合物(例如，包含本文 所述化合物（I)或其药学上可接受的盐、前药或其代谢物的组合物)在不同的组合物或容器 中。
[0225] 在一些实施方案中，该试剂盒的组分储存在密封的小瓶中，例如，用橡胶或硅酮封 口（例如，聚丁二烯或聚异戊二烯封口）。在一些实施方案中，将该试剂盒的组分在惰性条件 下储存(例如，在氮气或另一惰性气体中，例如氩气）。在一些实施方案中，将该试剂盒的组 分在无水条件下储存(例如，用干燥剂）。在一些实施方案中，将该试剂盒的组分在避光容器 例如琥珀色小瓶中储存。
[0226] 本文所提供的组合物，例如，包含本文所述化合物（I)或其药学上可接受的盐、前 药或其代谢物的组合物可以任意形式提供，例如，液体、冷冻、干燥或冻干形式。优选地是， 包含本文所提供的组合物，例如，包含SARM的组合物，例如，包含本文所述化合物（I)或其药 学上可接受的盐、前药或其代谢物的组合物，是基本上纯的和/或无菌的。当本文所提供的 组合物，例如，包含本文所述化合物（I)或其药学上可接受的盐、前药或其代谢物的组合物 提供在液体溶液中，所述液体溶液优选为水溶液，而无菌水溶液是优选的。在一个实施方案 中，本文所提供的组合物，例如，包含SARM的组合物，例如，包含化合物（I)或其药学上可接 受的盐、前药或其代谢物的组合物与稀释剂或稀释说明书一起提供。所述稀释剂可包括例 如，盐或盐水溶液，例如，具有pH 6至9的氯化钠溶液、乳酸Ringer注射液、D5W或PLASMA-LYTE A注射液pH 7:.4®(Baxter，Deerfield，IL)〇
[0227] 所述试剂盒可包含储存所述组合物的一个或多个容器，所述容器包含本文所述组 合物，例如，包含本文所述化合物(I)或其药学上可接受的盐、前药或其代谢物的组合物。在 一些实施方案中，所述试剂盒含有用于所述组合物和信息材料的单独的容器、分配器或隔 室。例如，所述组合物可包含在瓶、小瓶、IV混合袋、IV输液器、背负式装置或注射器中且所 述信息材料可包含在塑料套或包中。在其他实施方案中，该试剂盒的单独的元件包含在单 个、未分开的容器中。例如，所述组合物包含在瓶、小瓶或注射器中，所述信息材料以标签的 形式附于其上。该试剂盒的容器可为气密性的、防水的（例如，对于湿气或蒸发的变化是不 可透过的）和/或不透光的。
[0228] 本发明用以下实施例进行进一步说明，其不应被理解为作为进一步限制。 实施例
[0229] 实施例1.多学科评估化合物（I)相比于诺龙和α-甲基泼尼松龙(PDN)在运动的mdx (肌营养不良症)小鼠模型上的体内治疗的效果
[0230] 介绍
[0231] 本研究的目的是，通过体内和离体方法的多学科手段，测试化合物（I)，一种具有 肌肉的特定作用的选择性雄激素受体调节剂(SARM)对慢性运动的mcM、鼠模型的影响。获 得迪谢纳肌营养不良患者临床使用糖皮质激素的同意后，对化合物（I)(30mk/kg，皮下注射 6天/周）的效果与那些用α-甲基泼尼松龙(PDN)(lmg/kg腹腔内注射6天/周）的平行治疗以 及与那些蛋白同化药物诺龙(5mg/kg，皮下注射6天/周）的平行治疗相对比。
[0232] 实验描述了通过离体测定主要功能和形态学端点的结果，根据方法学途径和体内 数据修正该结果。
[0233] 方法
[0234] 将化合物（I)和诺龙溶解于10%乙醇/90%玉米油（Sigma-Aldrich)以获得0.1ml 体积/IOg体重所需的最终剂量。将PDN(来自商业制剂URBASON)用无菌水稀释用以注射 (0.1ml/10g体重）。将40只5-6周大的mdx小鼠 （Charles River Italy for Jackson Lab)首 先随机分成体重、前肢力量和归一化力量(前肢力量/体重)均一的组(在运动/治疗期的开 始(时间〇))，如下：
[0235] · 7只久坐不动的MDX+载剂（乙醇和玉米油）
[0236] · 7只未治疗的运动的MDX+载剂（乙醇和玉米油）
[0237] · 9只运动的MDX+化合物（I)30mg/kg
[0238] · 8只运动的MDX+诺龙5mg/kg
[0239] · 3只运动的MDX+载剂(无菌水）
[0240] · 6只运动的MDX+PDN lmg/kg
[0241] 治疗为期4-6周。在4周结束时，34只小鼠保持在实验记录中，如下：
[0242] · 7只久坐不动的MDX+载剂（乙醇和玉米油）
[0243] · 7只未治疗的运动的MDX+载剂（乙醇和玉米油）
[0244] · 6只运动的MDX+化合物（I)30mg/kg
[0245] · 5只运动的MDX+诺龙5mg/kg
[0246] · 3只运动的MDX+载剂(无菌水）
[0247] · 6只运动的MDX+PDN lmg/kg
[0248] 慢性运动由在水平跑步机上以12m/min跑步30min组成，每周两次。药物治疗比运 动方案早一天开始。在进行体外实验前，至少进行四周的运动。每周从头至尾监测体内参 数。在离体实验时小鼠的年龄为9-12周。然后在体外，针对一些方面评价试验化合物的效 力：
[0249] •通过等长收缩评价EDL肌肉和横膈膜肌肉的机械性能
[0252] •分光光度测定肌酸激酶(CK)的血浆水平(其作为细胞膜损伤的指标）、乳酸脱氢 酶(LDH)的血衆水平(其作为代谢耐受(metabolic sufferance)的指标）、活性氧物质的血 浆水平(其作为氧化应激的标记物）
[0253] •腦扬肌(GC)和横隔膜的形态分析
[0254] 值表示为平均值土S.E.M。统计分析通过多重比较的方差的ANOVA检验，然后进行 事后Bonferroni ' s检验来进行。Student' s t检验也被用于两个组之间的比较。
[0255] 储存血浆样品，随后分析化合物（I)的血浆水平。切除全腿骨，清洗周围组织，并 在-80°C冷冻。将侧胫骨进行收集、清洁、并在4°C在40%乙醇中保存。骨样品用于骨质密度 和形态分析。SARM作用的可能靶标(心脏、前列腺、肛提肌、比目鱼肌)或有毒的药物作用的 可能标记物（肝、肾、脾）的器官也被收集并称重。收集额外的肌肉样品（GC、TA、横膈膜肌 肉），在液氮中快速冷冻或在冷异戊烷中冷冻并储存于-80°C用于进一步最终生物化学分析 (通过ELISA分析促纤维化和/或促炎性细胞因子和/或生长和转录因子)或免疫组织化学 (DHE染色、NF_kB染色、utrophin)。
[0256] 结果
[0257] 通过等长收缩测试EDL和横膈肌的机械性能
[0258] 对EDL和横膈膜肌肉的标准等长收缩测量通过经由两个轴向铂丝的电场刺激获 得。对于每一制剂，在初步稳定程序(为了处理后获得适当的温度平衡和舒张）后测定最佳 静息长度，即，由40V去极化步骤持续0.2ms引起的所能允许的最大张力。然后在开始记录过 程之前将制剂静置约30分钟。
[0259]横膈膜
[0260] 抽搐张力：5次由40V和0.2ms的脉冲（每30秒）引起的单独的抽搐-测定最大抽搐 张力和收缩动力学(到达峰值的时间和半松弛时间）；
[0261] 力-频率曲线：450ms的从10至140Hz的0.2ms 40V的脉冲序列，-测定半最大激活 (Hz50)最大强直张力和频率；
[0262] 疲劳:5次100Hz (450ms)的强直性刺激(tetani )，间隔为5秒，^测定张力下降的百 分比。
[0263] 对横膈膜的收缩特性的药物治疗的效果示于图1至7。对每个图，图B显示了来自两 组载剂治疗的运动的mdx小鼠集中在一起的数值。也提供了抽搐张力和强直张力和收缩动 力学的绝对值和标准化值的单独数值和平均值。
[0264]抽搐张力和强直张力均在运动的mdx小鼠的横膈膜肌肉中相对于野生型显著降低 (图1和2)。化合物(I)和诺龙治疗的横膈膜肌肉的抽搐张力值大于那些未治疗的，且没有更 多显著差异(就野生型而论）。在此参数中，两种蛋白同化的化合物比TON发挥更大的保护作 用。强直张力增加的明显趋势也在药物治疗组中观察到，并且特别是在用两种蛋白同化的 化合物治疗的小鼠中。当载剂治疗的运动的mdx小鼠的组被汇集在一起时，化合物（I)、诺龙 和TON治疗的横膈膜的强直张力的值均显著大于未治疗的，虽然仍然比野生型低（图2B)。实 验组之间的钙相关的参数(抽搐/强直比和Hz50)和收缩动力学(到达峰值的时间，松弛时间 等），均未观察到显著的差异（图3-6) ^dx小鼠的横膈膜肌肉比野生型更易疲劳，且在运动 组中观察到疲劳的进一步增加（图7)。有趣的是，在药物治疗的组中观察到保护，特别是用 化合物（I)和I 3DN治疗的组中。在5次反复的强直性刺激(tetani)之后，在这两个组中的力量 的下降与野生型无显著差异。
[0265] EDL 肌肉
[0266] 抽搐张力：5次由40V和0.2ms的脉冲(每30秒）引起的单独的抽搐，-测定最大抽搐 张力和收缩动力学(到达峰值的时间和半松弛时间）；
[0267] 力-频率曲线：350ms的从10至140Hz的0.2ms 40V的脉冲序列，-测定半最大激活 (Hz50)最大强直张力和频率；
[0268] 疲劳:5次100Hz (450ms)的强直性刺激(tetani )，间隔为5秒，^测定张力下降的百 分比。
[0269] 结果示于图8至14。对每个图，图B显示了来自两组载剂治疗的运动的mdx小鼠集中 在一起的数值。抽搐张力和强直张力和收缩动力学的绝对值和标准化值的单独数值和平均 值也被提供。
[0270] 久坐不动的或者运动的MdxEDL肌肉显示显著低于野生型EDL肌肉的标准化的抽搐 张力和强直张力。相对于久坐不动的动物，在运动的动物中观察到的肌肉力量略有下降。没 有观察到药物治疗的动物组中抽搐张力或强直张力（作为绝对值和标准化值）的显著改善 (图8-9)。在诺龙治疗组中观察到抽搐张力增加的倾向（图8)。实验组之间的收缩和舒张时 间观察到无显著差异（图10-11)。测定表征钙稳态的参数，尤其是抽搐/强直比和力-频率曲 线。抽搐/强直比在未治疗的运动的mdx中显著上升(与野生型EDL肌肉相比）；这与细胞溶质 钙水平所描述的增加一致。然而，在化合物（I)或诺龙治疗的动物中均没有观察到效果，在 PDN治疗组中观察到轻微但不显著的下降（图12)。类似地，没有观察到对半最大激活的频率 的显著效果（图13)。
[0271] 然后测试保护肌肉防止疲劳的治疗可行性。以5秒的间隔施加250ms的强直刺激， 关注在头5次强直刺激过程中的下降，因为这代表了疲劳的动态阶段。运动的mdxEDL肌肉疲 劳更甚于野生型和Mdx久坐不动，后者显示了意外的对疲劳的抗性，这也许与在这个年龄的 肢肌肉中发生的主动再生(De Luca等2003)相关。有趣的是，在诺龙以及TON组中观察到参 数的部分恢复。事实上，用PDN治疗的肌肉显示出类似于久坐不动的mdx的值（图14B)。未发 现在偏心性收缩上治疗有任何显著的保护作用，因为在所有组中，在10次拉伸试验后观察 到类似的60-70%的力量下降(在最大强直性收缩期间，20%的拉伸超过静息张力）（数据未 显示）。
[0272] EDL肌肉的电生理记录
[0273] 机械阈限(MT)是刺激收缩-耦合和钙稳态的电生理指标(De Luca等，JPET 2003; Fraysse等，Neurobiol .Dis. ,2004)。增加持续时间的去极化电压步骤的应用将纤维收缩的 收缩向着更负电位的方向移动，直到达到恒定基强度(rheobase)电压。基强度电压表示在 该电压处，从肌浆网释放的钙和再摄取的钙处于稳态。基强度电压朝着更负电位的移动(如 营养不良MdxEDL肌纤维中发生的）表明更多的钙可用于收缩，其是源于更大的释放，或更慢 的再摄取，或更高的基础胞质水平。
[0274] 对MT的药物治疗的效果示于图15-17。可以看出，用化合物（I)的治疗导致了在去 极化脉冲的持续时间内纤维收缩的电位（向着野生型）的显著移动。诺龙和TON都没有化合 物(I)有效（图15)。实际上，从数据点拟合计算的基强度电压表明化合物(I)治疗的EDL肌肉 的基强度电压几乎与野生型重叠，而诺龙和PDN显示在未治疗的mdx和野生型中间的值（图 16)。在达到平衡的动力学过程观察到改善。实际上，对化合物(I)治疗的EDL肌纤维来说，达 到基本电流强度的时间常数显著地短于那些未经治疗的运动的组，且与野生型无显著差异 (图17)。在此参数上，化合物（I)的效果优于诺龙和PDN JDN在强度-持续曲线、基强度电压 和时间常数的效果与在之前的试验(De Luca等，JPET，2003)中观察到的一致。
[0275] 电缆（cable)参数
[0276] 被动式电缆性质适合于:响应于矩形过度极化电流脉冲的膜电位的空间和时间的 变化。这些变化取决于纤维直径、膜电容和膜电阻，其可以通过使用标准电缆分析从实验值 来计算。电缆参数中，相对低的膜电阻(RM)值是骨骼肌纤维的典型特征，这由于高的总膜离 子电导率(gm)。高gm是由于静息肌纤维膜对氯离子和钾离子的高渗透性，其是通过静息膜 电位处打开的特殊通道。尤其是，EDL肌纤维的总gm的80%是由于ClC-I氯离子通道的氯离 子通道电导率(gCl)，剩下的20%是由于不同的钾通道亚组的电导率。Rm的增加和gm的显著 降低（主要是由于gCl减少)是Mdx横隔膜和运动的EDL肌肉的典型的细胞标志。gm的降低与 同时涉及在肌肉退化过程中的CLC-I通道的生化调节和表达的复杂机制有关。gm的降低被 认为是组织耐受(tissue sufferance)的细胞标志。
[0277] 在目前的研究中，不存在静息膜电位的任何变化，观察到在运动的mdx小鼠与久坐 不动的mdx和野生型小鼠的EDL肌纤维中的较高Rm值（图18)。观察到两个载剂治疗组的mdx 小鼠的Rm和gm值的轻微的差别。所有药物治疗导致Rm的显著下降并伴有gm的增加。相比于 PDN产生的效果，用化合物（I)产生的效果尤其明显。PDN产生的效果，与以前的研究（De Luca等 JPET 2003)中观察到的相一致(De Luca等人，JPET2003)。
[0278] 生化标志物:治疗对肌酸激酶、乳酸脱氢酶和活性氧物质的影响
[0279] 血浆肌酸激酶显著上升是肌营养不良的典型诊断标志物。并行地，乳酸脱氢酶的 增加也被视为代谢耐受的标志，而活性氧物质的增加可以作为持续的氧化应激的结果发 生。通常，这些生化指数由于运动方案进一步恶化。然而，在本研究中，所有的三个参数CK、 LDH和ROS被特别地在久坐不动的mdx小鼠中改变，因此没有观察到运动的显著效果。用各药 物治疗所观察到的效果示于图19-21。可见，关于使用任何药物用于这些生化标志物，未观 察到显著改善。在化合物(I)治疗的mdx小鼠中观察到LDH的轻微但不显著的减少。这证实了 TON对CK和LDH缺乏效果，这在以前的研究中已经发现。
[0280] 组织学和形态学
[0281] 在不同的实验条件下，横膈膜和GC肌肉的组织学剖面的代表性图片示于图22。两 种肌肉均表现为典型的营养不良特征，如肌肉构造的改变，其中存在坏死区域、渗入物和大 的非肌肉区，这可能是由于纤维化组织和脂肪组织的沉积。还明显观察到存在较大的纤维 尺寸和中枢核纤维（centronuclearated fiber,CNF)的变化的。改变也存在于经治疗的肌 肉组中，尽管一些定性的缓解迹象可以观察到。对有限数量的组织切片的初步形态测定分 析表明药物治疗动物的中枢核纤维的百分比没有变化，以及横膈膜和GC肌肉的坏死区域和 非肌肉区域的轻微减少。诺龙和PDN治疗的肌肉均观察到普通纤维和中枢核纤维的纤维面 积的增加，但在化合物(I)治疗的肌肉中未观察到（图23)。
[0282] 实施例2.用化合物(I)、诺龙和α-甲基泼尼松龙治疗mdx小鼠的比较
[0283] 将化合物（I)、诺龙和α-甲基泼尼松龙给药每周6天至野生型(Wt)和mdx小鼠。图24 描述了在起始(TO)和4周(T4)之后的野生型(Wt)和经治疗的mdx小鼠的体内参数，经治疗的 小鼠用玉米油(Mdx+Vl)治疗或用包含化合物（I) (Mdx+化合物（I))、或包含5mg/kg诺龙(Mdx +NAND)、或包含水(Mdx+V2)或包含lmg/kga-甲基泼尼松龙(Mdx+PDN)的30mg/kg的组合物治 疗。在每一幅图中，竖条代表5至7只动物的平均值土S.E.M.。通过使用ANOVA检验进行多重 比较和事后Bonferroni t检验校正评价各组之间的显著差异。
[0284] 在(A)中，竖条显示体重值(体重），以g为单位。使用ANOVA检验，未观察到mdx小鼠 (经过治疗的或未治疗的）的值的显著差异。在(B)中，竖条显示最大前肢强度(前肢力），以 kg为单位。ANOVA检验没有表明在时间0(T 0)的任何显著差异。在时间4(T4)发现显著差异 (F>5.79; ρ〈0.005)。事后Bonferroni t检验的结果表不如下:*相对于野生型小鼠具有显著 差异p〈0.003;相对于各载剂治疗的mdx运动的小鼠具有显著差异0.007〈p〈0.01。在(C)中， 竖条显示通过标准化每只小鼠的前肢力量相对于其各自体重计算出的标准化的前肢力量 的值(标准化前肢力）jNOVA检验没有显示出对于时间O(TO)的显著差异。在时间4(T4)发现 显著差异(F>5.8 ;ρ〈0·006)。事后Bonferroni t检验的结果表不如下：*相对于野生型小鼠 具有显著差异0.0006〈p〈0.03;相对于mdx运动的小鼠具有显著差异0.003〈p〈0.02。在(D) 中，竖条显示在跑步机耗竭试验中跑的总距离（以m为单位）。相对于野生型动物在TO和T4的 所有数值均存在显著差异。事后Bonferroni t检验的结果表示如下:*相对于野生型小鼠具 有显著差异5.5 X 10-7〈p〈0.01。
[0285] 实施例3.用不同量的化合物（I)治疗mdx小鼠
[0286] 将化合物（I)向野生型(Wt)和mdx小鼠每周给药6天。图25描述了在不同时间点，从 起始（TO)直到治疗的12周（T12)的野生型(Wt)和经治疗的mdx小鼠的体内参数，经治疗的 mdx小鼠用玉米油(Mdx+Vl)治疗或用化合物⑴（Mdx+化合物（I))以0.3mg/kg、3mg/kg和 30mg/kg的量治疗。在每一幅图中，数值代表5至8只动物的平均值土 S.E.M.。通过使用ANOVA 检验进行多重比较和事后Bonferroni t检验校正评价各组之间的显著差异。
[0287] 在(A)中，竖条显示体重值(体重），以g为单位。ANOVA检验未观察到BW在时间0、时 间4和时间6的显著差异。BW的明显差异发现在时间8(F>3.9;p〈0.02)和时间12(F>3.8;p〈 0.03)。事后13〇1^61'1'〇]1；[1:检验的结果表不如下:*相对于野生型小鼠具有显著差异0.006〈口 〈0.01和相对于mdx运动的小鼠具有显著差异p〈0.05。在(B)中，在试验的开始(F駄TO)、第4 周(Fg£T4)、第8周(Fg£T8)、第12周(F影:T12)，竖条显示最大前肢强度(前肢力），以kg为单 位。ANOVA 检验在T0(F>9;p〈0.0006)、T4(F>ll;p〈0.0002)、T8(F>3.76;p〈0.02W^12(F> 5.4 ;p〈0.006)具有显著差异。事后Bonferroni t检验的结果表不如下:*相对于野生型小鼠 具有显著差异9.3 X 10-8〈p〈0.02和相对于mdx运动的小鼠具有显著差异3.6 X 10-6〈p〈0.01。 在(C)中，通过相对于其各自体重标准化每只小鼠的前肢力量而计算出标准化的前肢力量 的值(标准化前肢力）C 3ANOVA检验显示从T4开始的所有时间点的显著差异(F>4;p〈0.02)。事 后1301^61'1'0]1；[1:检验的结果表不如下：*相对于野生型小鼠具有显著差异。〈0.0005;和°相 对于mdx运动的小鼠具有显著差异0.002〈p〈0.02。在(D)中，显示在跑步机耗竭试验中的跑 的总距离，以m为单位。使用ANOVA检验和Student ' s t检验评估各组之间的显著差异。相对 于野生型动物在相应时间点的所有数值均存在显著差异。在T4(F>5.4;p〈0.007)、T8(FM;p 〈0.02)和Tl2(F>5;p〈0.009)发现显著差异。事后Bonferroni t检验的结果表不如下:*相对 于野生型小鼠具有显著差异0.0009〈p〈0.02和°相对于mdx运动的小鼠具有显著差异0.009〈 p<0.030
[0288] 实施例4.化合物（I)、诺龙和α-甲基泼尼松龙的治疗对雄激素敏感组织和其他潜 在的靶组织的影响
[0289] 用化合物（I)、诺龙和α-甲基泼尼松龙治疗mdx小鼠每周6天。图26描述了用化合物 (I)和比较参照物治疗4周对于雄激素敏感组织和其他潜在的靶组织的重量的影响。每一个 竖条代表5至10只动物的平均值土S.E.M.，且显示经治疗的mdx小鼠相对于其个体体重的标 准化的组织重量，所述小鼠用载剂(玉米油和水;Md X+VTQT)治疗或用30mg/kg化合物（I) (Mdx +化合物（I))、用5mg/kg诺龙(Mdx+NAND)治疗或用lmg/kga-甲基泼尼松龙(Mdx+roN)治疗。 [0290]在(A)中，该图显示雄激素敏感组织的重量，即心脏、前列腺、肛提肌、EDL和比目鱼 肌。由于作图原因，肛提肌的标准化值放大10倍。ANOVA分析和Bonf erroni t检验表明仅肛 提肌的重量具有显著差异(F>4;p〈0.015)。与载剂治疗的mdx相比具有显著差异(p〈0.05)。 在(B)中，该图显示脾、肝和肾的重量。由于作图原因，肝的标准化值放大10倍。ANOVA分析和 Bonferroni t检验表明仅肝的重量具有显著差异(F>3;p〈0.04);与载剂治疗的mdx相比具 有显著差异(P〈〇.〇2)。
[0291] 实施例5 .治疗对雄激素敏感组织和其他潜在的靶组织在剂量依赖性和时间依赖 性的影响
[0292] 化合物(I)对雄激素敏感组织和其他潜在的靶组织的剂量依赖性和时间依赖性影 响示于图27。每个竖条代表5至8只动物的平均值土 S. E. M .，且显示经治疗的mdx小鼠相对于 其个体体重的标准化的组织重量，所述小鼠用玉米油(Mdx+Vl)治疗或用化合物（I) (Mdx+化 合物（I))以0.3、3或30mg/kg的量治疗。每周给药6天。在(A)中，该图显示雄激素敏感组织的 重量，即心脏、前列腺、肛提肌、EDL和比目鱼肌。由于作图原因，肛提肌的标准化值放大10 倍。ANOVA分析和Bonferroni t检验表明仅前列腺的重量具有显著差异(F>12;p〈5.4 X 10 _5);与载剂治疗的111如相比具有显著差异(？〈1.4乂1〇-5)。在(8)中，图显示脾、肝和肾的重 量。由于作图原因，肝的标准化值放大I〇倍。ANOVA分析和Bonf erroni t检验表明仅肾的重 量具有显著差异(F>19 ;p〈l. 9 X HT6);与载剂治疗的mdx相比具有显著差异(p〈0.03)。
[0293] 实施例6.各种药物治疗对横隔膜的最大等长抽搐张力和强直张力的影响
[0294] 图28中，（A)和(B)列举了第一研究中野生型和mdx小鼠（经治疗的或未治疗的）的 横膈膜肌肉的最大等长抽搐张力（sP tw，测量为kN/m2)和强直张力(sPo，测量为kN/m2)的标准 化值。图中列出以下组:野生型小鼠(Wt)和经治疗的mdx小鼠，经治疗的小鼠用载剂(水或玉 米油;Mdx+ντοτ)治疗或用30mg/kg化合物（I) (Mdx+化合物（I))、用5mg/kg诺龙(Mdx+NAND)治 疗或用lmg/kga-甲基泼尼松龙(Mdx+PDN)治疗。每周给药6天。每个竖条代表4至7只动物的 平均值土S.E.M.。通过使用ANOVA检验进行多重比较(F值)如下评价各组之间的显著差异:F =3;p〈0.05。事后Bonferroni t检验校正用于评估个体平均值之间的显著差异，并表示如 下:*相对于野生型具有显著差异(0.001〈p〈0.05);相对于McIx+Vtqt具有显著差异(p〈0.01)。 在(C)和(D)中，显示了第二研究中野生型和mdx小鼠（经治疗的或未治疗的）的横膈膜肌肉 的最大等长抽搐张力（sP tw，测量为kN/m2)和强直张力（sPo,测量为kN/m2)的标准化值。图显 示野生型小鼠(Wt)和经治疗的mdx小鼠，经治疗的小鼠用载剂(仅玉米油;Mdx+Vl)治疗或用 化合物（I) (Mdx+化合物（I))以0.3、3或30mg/kg的量治疗。每周给药6天。每个竖条代表每组 4至7只动物的平均值土 S. E. M.。通过使用ANOVA检验进行多重比较(F值)如下评价各组之间 的显著差异:F = 3;p〈0.05。使用事后Bonferroni t检验校正，且结果表示如下：*相对于野 生型具有显著差异(〇.〇〇1〈?〈〇.〇5);相对于]\^^+¥1具有显著差异(？〈0.01)。
[0295] 实施例7.治疗对分离的EDL肌肉的收缩参数的影响
[0296] 野生型和经治疗的mdx小鼠中分离的EDL肌肉的收缩参数显示于图29,经治疗的小 鼠用玉米油(Mdx+Vl)治疗或用化合物（I) (Mdx+化合物（I))以0.3、3或30mg/kg的量治疗，每 周6天。
[0297] 在(A)中，显示最大等长抽搐张力（sPtw，测量为kN/m2)的标准化值。ANOVA分析表明 显著差异，F = 4且p〈0.05。事后Bonferroni t检验的结果表示如下：*相对于野生型小鼠具 有显著差异(P〈〇.〇5)和。相对于Mdx+Vl具有显著差异(0.005〈p〈0.05)。在(B)中。显示最大 等长强直张力（sPo，测量为kN/m 2)的标准化值。ANOVA分析表明显著差异，F = 4且p〈0.03。事 后13〇1^61'1'〇]1；[1:检验的结果表不如下:*相对于野生型小鼠具有显著差异(0.01〈。〈0.05)。 在(C)中，显示了肌肉疲劳，其定义为在第10次脉冲时相对于第一次收缩的力的下降百分 比。ANOVA分析未发现显著差异。事后Bonferroni t检验的结果表明具有显著差异，其结果 显示如下相对于野生型小鼠具有显著差异(p〈0.005)。在(D)中，显示了在离心性收缩过 程中的张力的下降百分比（计算为相对于第一次离心刺激的张力的第10次脉冲的下降）。 ANOVA分析表明显著差异，F = 4且p〈0.02。事后Bonferroni t检验的结果表示如下:*相对于 野生型小鼠具有显著差异(P〈0.05)。每个竖条代表每组4至7只动物的平均值土S.E.M.。
[0298] 实施例8.用多种药物治疗的mdx的机械阈限的比较
[0299] 在图30(A)，数据(其表示为2至5种制剂的14至30个值的平均值土S.E.M.)显示野 生型小鼠 (WT，黑色圈）和经治疗的mdx小鼠在增加的脉冲持续时间下的EDL肌纤维的收缩的 电压(机械阈限），所述经治疗的mdx小鼠用载剂(玉米油和水;McIx+Vtqt，白色圈）治疗、30mg/ kg化合物（I)(白色三角）治疗、5mg/kg诺龙(颠倒的黑色三角）治疗或Img/kg PDN(白色菱 形）治疗。每周6天给药。在每一次脉冲持续时间，用30mg/kg化合物（I)、5mg/kg诺龙或Img/ kg PDN治疗的mdx小鼠的肌纤维的电压阈值明显比用载剂治疗的mcM、鼠更偏正向。对于一 些数据点，标准误差棒是不可见的，因为它比符号尺寸更小。在(B)和(C)中，通过在A中的电 压-持续时间曲线的数据点的拟合计算出具有相对标准误差的基强度电压(单位为mV)和时 间常数(单位为ms)。在(D)中，示出A中所描述的相同实验组的EDL肌纤维的总剩余的膜离子 电导率( gm)(单位为yS/cm2)。竖条代表3至5种制剂的25至37个纤维的值的平均值土SEM1^t 于每一个参数，通过使用ANOVA检验进行多重比较(F值)和事后Bonferroni t检验校正评价 各组之间的显著差异。对于基强度电压(F>4;p〈0.003)和gm(F>7;p〈0.0002)发现显著差异。 事后Bonferroni t检验结果表不如下:*相对于野生型具有显著差异(p〈0.05);°相对于mdx 运动的小鼠具有显著差异(P〈〇.02)。
[0300] 实施例9.治疗的和未治疗的mdx小鼠的机械阈限的比较
[0301] 在图31(A)，数据(其表示为3种制剂的27至41个值的平均值土S.E.M.)显示野生型 小鼠(WT，黑色圈）和经治疗的mdx小鼠在增强的脉冲持续时间下的EDL肌纤维的收缩的电压 (机械阈限），所述经治疗的mdx小鼠用载剂(玉米油和水;Mdx+Vi，白色圈）治疗、0.3mg/kg化 合物（I)(白色方形）、3mg/kg化合物（I)(黑色方形）或30mg/kg化合物（I)(白色三角）治疗。 每周6天给药。用任何剂量的化合物（I)治疗的mdx小鼠的肌纤维的电压阈值明显比用载剂 治疗的mdx小鼠（p〈0.01或更小，通过Student ' s t检验)更偏正向。对于一些数据点，标准误 差棒是不可见的，因为它比符号尺寸更小。在(B)和(C)中，通过在A中的电压-持续时间曲线 的数据点的拟合计算出分别具有相对标准误差基强度电压(单位为mV)和时间常数(单位为 ms)。在⑶中，示出A中所描述的相同实验组的EDL肌纤维的总剩余的膜离子电导率(gm)(单 位为yS/cm2)。竖条代表2至3种制剂的21至41个纤维的值的平均值土SEM。对于每一个参数， 通过使用ANOVA检验进行多重比较(F值)和事后Bonferroni t检验校正评价各组之间的显 著差异。显著差异发现于基强度电压（F>4;p〈0.003)和8111(?>22 ;。〈1.3\10^6)。事后 Bonferroni t检验结果表示如下相对于野生型小鼠具有显著差异（I. I X 10_13〈p〈0.02) 和°相对于mdx运动的小鼠具有显著差异(p〈l X HT6)。
[0302] 实施例10.用化合物（I)治疗后的横膈膜和腓肠肌的组织学
[0303]显示mdx小鼠的横隔膜(DIA)和腓肠肌(GC)的形态学剖面的苏木精-曙红染色示于 图32,所述mdx小鼠是未治疗的（载剂)或用GPL0492在不同剂量(0.3、3和3〇11^/1^)治疗。每 周6天给药。对于定性比较，野生型的GC肌肉的典型剖面示于图的顶部。该切片说明了肌营 养不良肌肉的较差的同质结构，且纤维的尺寸具有很大差异，大片区域坏死伴有单核浸润 和/或小的再生纤维。非肌肉组织的区域也是可见的。图像为20X放大倍数。
[0304] 实施例11.化合物(I )、诺龙或α-甲基泼尼松龙对纤维化标记物的影响
[0305] Mdx小鼠用玉米油(Mdx+Vl)治疗或用30mg/kg化合物（I) (Mdx+化合物（I))、或5mg/ kg诺龙(Mdx+NAND)、或水(Mdx+V2)或lmg/kga-甲基泼尼松龙(Mdx+PDN)每周治疗6天。图33 (A)示出横膈肌肌肉损伤区域的百分比（左侧）和横膈肌非肌肉区域的百分比（右侧），测量 通过苏木精-曙红染色。每个竖条是至少3块肌肉/每块肌肉大约10个区域(field)的平均 值。通过使用ANOVA检验和事后Bonferroni t检验校正评价各组之间的显著差异。结果表示 如下相对于用玉米油治疗的mdx小鼠具有显著差异(p〈0.03)。在(B)中，竖条显示经治疗 的mdx小鼠中的横膈肌的总水平（左侧）和活性TGF-βΙ水平（右侧），所述小鼠用载剂（玉米 油，Mdx+Vl)治疗或用30mg/kg化合物（I) (Mdx+化合物（I))、或5mg/kg诺龙(Mdx+NAND)治疗， 用ELISA测量。各值是4至5个制剂的平均值土 S.E.M.。通过使用ANOVA检验进行多重比较评 价各组之间的显著差异，其显示TGF-βΙ水平无任何显著差异。事后Bonferroni t检验结果 表示如下:°相对于用载剂治疗的mdx小鼠具有显著差异(p〈0.03)。在(C)中，竖条显示经治 疗的mdx小鼠中的横膈肌的总水平（左侧）和活性TGF-βΙ水平（右侧），所述小鼠用玉米油 (Mdx+Vl)治疗或用化合物（I)以0 · 3、3或30mg/kg(Mdx+化合物（I))治疗，用ELI SA测量。每周 6天给药。各值是4至5个制剂的平均值土 S. E.M.。通过使用Student ' s t检验评价各组之间 的显著差异。相对于mdx运动的小鼠具有显著差异(0.05〈p〈0.025)。
[0306] 实施例12.皮下递送化合物(I)后的血浆水平
[0307]图34显示皮下递送0.3mg/kg(A)、3mg/kg(B)或30mg/kg(C)的化合物于向野生型小 鼠（以单次急性剂量接收）（黑色圈，伴有斜线）或递送于mdx小鼠（其接收慢性剂量）（黑色 圈）后历时8小时评估的化合物(I)的血浆水平。
[0308] 实施例13.野生型、运动的和未运动的mdx小鼠的睾酮水平的比较
[0309] 在图35(A)中，竖条显示8周龄运动4周的（WT EXER;MDXEXER)或未运动的（WT SED; MDXSED)野生型和mdx小鼠的血清睾酮水平。各竖条是5至6只动物的平均值土 S. E. M.。通过 使用Student's t检验评价各组之间的显著差异.*相对于野生型小鼠具有显著差异（p〈 0.05)。在(B)中，竖条显示化合物（I)对mdx小鼠的血清睾酮水平的效果。各竖条是5至7只动 物的平均值土S.E.M.。
[0310] 实施例14.化合物(I)治疗对ICF-I和卵泡抑素基因水平的影响
[0311]对以下进行实时PCR分析:胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和卵泡抑素，其基因参与 肌肉质量的控制;肌细胞生成素，其为肌肉再生的标志物;和过氧化物酶体增殖物受体γ-辅激活因子(PGC)-la，其为肌肉代谢和动力传导信号的调节剂。
[0312]图 36示出了使用载剂(Mdx+Vl)、0 · 3mg/kg化合物（I) (Mdx+0 · 3mg/kg化合物（I))和 3mg/kg化合物（I) (Mdx+3mg/kg化合物（I))所对应的在横膈膜(左侧;DIA)和腓肠肌(右侧； GC)的靶基因相比于持家基因 GADPH的标准化值。每周6天给药。各值是4至5个制剂的平均值 土S.E.M.
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