水通道蛋白4作为抑郁症药物靶点的用途
阅读：138发布：2020-05-21
专利汇可以提供水通道蛋白4作为抑郁症药物靶点的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 水 通道蛋白4作为 预防 和 治疗 抑郁症 的药物靶点的应用。本发明的研究结果显示，AQP4与抑郁症的发病和治疗有直接的相关性，抑郁症会阻滞血清中AQP4的表达，使之含量减少，经药物如二笨乙烯苷、大黄素等治疗后，AQP4的含量升高；患抑郁症后，海 马 中AQP4表达量相对减少，经药物如二笨乙烯苷、大黄素等治疗后，AQP4的表达量增加。AQP4是抑郁症新的治疗靶点。，下面是水通道蛋白4作为抑郁症药物靶点的用途专利的具体信息内容。
水通道蛋白4作为抑郁症药物靶点的用途
技术领域
背景技术
[0002] 抑郁症是一种精神科常见的疾病，据世界卫生组织统计，抑郁症已成为世界第4大疾患，中国第2大疾病负担，预测到2020年，可能成为仅次于冠心病的第二大疾病，占全球疾病负担的15％，终身抑郁症的发病率在6％～8％之间，随着人口的逐步老龄化，抑郁症在60岁以上人群中的发病率将高达20％～50％。抑郁症病人是自杀的高危人群，在病人发病至康复期，始终存在自杀的危险。抑郁症的识别诊断率很低，有效治愈率也很低。目前抑郁症的发病机制并未明确解析，抑郁症的发生有多个生物学假说，包括单胺能神经递质假说、脑奖赏通路受损假说、下丘脑-垂体-肾上腺素轴(HPA轴)功能异常假说及神经营养因子假说等，从而导致抑郁症治疗可选的药物靶点及有效的治疗药物非常有限。
[0003] 水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是分子量为26～34kDa的疏水性内在膜蛋白，有助于水的快速和被动转运，含有250～290个氨基酸。最初在1988年，由Agre等人从人血红细胞中分离发现了第一个AQP，并命名为AQP从被发现至目前为止，水通道蛋白家族成员的数量持续增加，目前在人类和啮齿类动物中发现了13种AQP，即AQP0-AQP12，其中AQP4是哺乳动物大脑中最主要的水通道蛋白。
[0004] AQP4是由Hase-gawa等在1994年通过同源性克隆从大鼠中分离出来。AQP4基因定位于人的染色体18q11.2与q12.1之间的连接处。由4个外显子和3个内含子组成，4个外显子编码的氨基酸序列分别为127、55、27、92位，三个内含子，其长度分别为0.8、0.3和5.2Kb。AQP4基本结构由6个跨膜区域和5个环构成，5个环包括A、C、E3个胞外环和B、D2个胞内环。
AQP4在脑内的分布很广泛，是中枢神经系统中最早发现的水通道蛋白。
AQP4在脑内的分布很广泛，是中枢神经系统中最早发现的水通道蛋白。
[0005] AQP4在兴奋性细胞中不表达，但在中枢神经系统的星形胶质细胞和室管膜细胞等上皮支持细胞中表达。AQP4在整个大脑中的分布各不相同，包括大脑皮层，胼胝体，视网膜，小脑，下丘脑的大细胞核和脑干。AQP4在与脑微血管直接接触的星形胶质细胞及其终足上呈现极性分布。AQP4在中枢神经系分布广泛分布，并在许多中枢神经统疾病中发挥重要作用，如脑水肿，肿瘤，癫痫和神经性脊髓炎。
[0006] 水通道蛋白的发现与鉴定是人类细胞学上的一个里程碑，AQP-4作为水通道蛋白家族的一种，主要分布在脑内的星形胶质细胞。最新研究表明，AQP4可调节星形胶质细胞的功能，并在突触可塑性以及学习记忆过程中发挥重要的作用。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供AQP4作为抑郁症药物靶点的用途。本发明的研究结果显示，AQP4与抑郁症密切相关，其为后期治疗抑郁症药物研发提供了一个全新的药物靶点以及新的治疗手段和思路。
[0008] 为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 第一方面，建立了多种稳定、可靠、能淮确模拟人类疾病状态的动物模型，为后续研究奠定坚实的基础。最后选定慢性不可预见性应激刺激Willner改良模型(CUMS)，此模型相比经典模型进行了两方面的改动，一是使应激因子的强度明显降低，二是以快感缺乏的测量作为模型是否成功的关键，使之更现实地模拟了人们日常生活中遭遇的“困难”。在经过长期温和应激刺激之后蔗糖水饮用量的减少反映了内源性抑郁症的中心症状即快感缺乏，同时模拟了其他重症抑郁障碍的症状表现，如运动能力及社会交往能力下降、探索行为能力下降、侵犯攻击能力缺陷、性行为能力下降等。
[0012] 这些研究结果提示AQP4或其基因可以作为药物靶点在筛选治疗抑郁症药物中的应用。抑郁症包括内源性抑郁症、反应性抑郁症、隐匿性抑郁症、药物引起的继发性抑郁症、更年期或产后抑郁症、脑外伤或脑卒中诱发的抑郁症以及抑郁性神经症在内的各种抑郁症状的药物的应用和用于糖尿病合并抑郁症。
[0013] 本发明的有益效果是：
[0014] 本发明首次发现抑郁症会阻滞血清中AQP4的表达，使之含量减少。而经药物(二笨乙烯苷、大黄素等)治疗后，AQP4的含量升高；同样的，患抑郁症后，海马中AQP4表达量相对减少，经药物(二笨乙烯苷、大黄素等)治疗后，AQP4的表达量增加。基于此，本发明首次提出并验证AQP4与抑郁症的发病和治疗有直接的相关性，是抑郁症新的治疗靶点，为抑郁症的治疗开辟了新的思路。附图说明
[0015] 图1为1小鼠AQP4与吸光度值关系；
[0016] 图2为各给药组血清中AQP4的含量；
[0017] 图3为免疫印迹实验电泳图；
[0018] 图4为AQP4的蛋白相对表达水平；
[0019] 图5为Mus AQP4扩增曲线；
[0020] 图6为Mus AQP4熔解曲线；
[0021] 图7为β-actin扩增曲线；
[0022] 图8为β-actin熔解曲线；
[0023] 图9为各组AQP4 mRNA的相对表达量。
具体实施方式
[0024] 下面通过动物实验对本发明的技术方案详细说明，但并不意味着对本发明的任何限制。
[0025] 实验材料
[0026] 1.实验动物：雄性昆明系SPF级小鼠，体重30±2g购于四川省实验医学动物中心，SCXK[渝]2018-0003。每天接受12h光照/12h黑暗，光照周期为8:00-20:00，实验室温度20±2℃，湿度60％，动物可以自行摄取标准饲料和清洁用水，动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。
[0027] 2.试药：
[0028] 二苯乙烯苷：自制；
[0029] 大黄素：自制；
[0030] 大黄素葡萄糖苷：自制；
[0031] 土大黄苷：自制；
[0032] 制首乌粉末：自制
[0033] 0.9％生理盐水：四川科伦药业股份有限公司。
[0034] 实施例一：建立抑郁模型
[0035] SPF级KM小鼠120只，适应性饲养1周，随机分为正常组和模型组。造模2周后，模型组按体重随机分为抑郁模型组、二苯乙烯苷组、土大黄苷组、大黄素葡萄糖苷组、大黄素组、注射制首乌粉末给药组。
[0036] 慢性轻度不可预知性刺激因素包括10种：夹尾5分钟/次、水平震荡20分钟/次、禁水(12小时)、冰水(4℃)游泳、禁食12小时、鼠笼(倾斜角45度)倾斜、潮湿垫料(不能过湿)、禁食禁水、异物放置(纸屑、橘子皮等)、异味刺激。
[0037] 模拟人类日常生活中接受的慢性低强度应激，保证每日安排1种不同刺激，顺序随机，连续不重复使动物不能预料刺激的发生。共执行6周。
[0038] 造模后对空白组和模型组的小鼠共16只小鼠，进行糖水消耗实验，糖水浓度为3％，进行2次，时间为下午四点到五点。然后在每周周一下午的固定时间进行检测，一共4次。此操作在小鼠禁食禁水24小时后进行，以同一笼中进行，评价指标为平均每只小鼠的糖水消耗量。空白组和实验组小鼠糖水消耗量如表1所示。
[0039] 表1小鼠糖水消耗量(mL)
[0040]
[0041] 从表中可以看出，建模后模型组与空白组比较，小鼠糖水消耗量显著减少；在第5周的时候，模型组的小鼠糖水消耗量显著低于空白组。慢性不可知抑郁模型的建立引起动物的缺乏快感，且该抑郁模型具有效性和持续性，表明造模效果良好，可用于进行后续实验。
[0042] 实施例二：注射给药及样本采集
[0043] 1.注射给药
[0044] 小鼠模型建立后，开始注射药物，其中注射药物粉末组以5g/kg粉末配制剂，二苯乙烯苷组、土大黄苷组、大黄素葡萄糖苷组、大黄素组以100mg/kg药物配制制剂。连续注射15天。
[0045] 2.眼球取血、海马组织摘取
[0046] 所有小鼠进行眼球取血实验，取血1mL，离心20min，转速3000转/s。取上清液，冰箱保存。取出脑组织，切去小脑，沿中线将大脑分开，将大脑皮层朝下、内层结构朝上放在冰袋上，小心用弯镊将白质剥掉，海马在靠近小脑侧的里面，月牙形。取出后放置冰箱保存。
[0047] 实施例三：水通道蛋白4表达水平检测
[0048] 一、血清中AQP4的表达水平
[0049] 1.酶联免疫吸附法
[0050] (1)实验方法，包括以下步骤：
[0051] S1：首让抗原结合到固相载体的表面，并且保证抗原的免疫活性；
[0052] S2：让抗原或抗体与可以标记抗原抗体保持免疫活性，也可以保持酶的活性的一种酶连接成酶标抗原或抗体；
[0053] S3：开始实验检测时，将已经标记的标本和酶标抗原和第一步中的固相载体上的抗原进行反应。
[0054] S4：洗涤，将反应形成的复合物和其他杂质分开。然后在标本中的与酶反应的量和结合在固相上的酶量有一定的比例关系。因为在加入酶反应的物质后，经酶催化会发生化学反应，并且是有色产物，随意可以通过有色产物颜色的深浅来分析。并且因为在酶的作用下其效果会被放大，可以很清晰的看出结果。
[0055] (2)仪器和试剂
[0056] 所用仪器和试剂如表2所示。
[0057] 表2酶联免疫吸附实验所用仪器和试剂
[0058]
[0059] 2.实验内容
[0060] 双抗体夹心法，包括以下步骤：
[0061] S1：将特异性抗体与固相载体连接，纯化水通道蛋白4的抗体包被微孔板，形成固相水通道蛋白4抗体，洗涤去除实验过程中未结合的抗体以及其他杂质。
[0062] S2：加受检标本，使之与固相水通道蛋白4抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的水通道蛋白4抗体结合，最后得到固相抗原复合物。洗涤去除实验过程中未结合的抗体以及其他杂质。
[0064] S4：加底物四甲基联苯胺(TMB)，夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。加底物四甲基联苯胺在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下变成的黄色。(四甲基联苯胺TMB是ELISA实验中应用最广泛的底物。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，很稳定，并且无致癌性。颜色的深浅和样品中的水通道蛋白4呈正相关。)
[0065] 3.实验结果
[0066] 用酶标仪测定吸光度(OD值)，波长为450nm，得到浓度和吸光度值标准曲线。结果如图1所示，拟合度R2＝0.9575，表明数据可用。
[0067] 图2中给出了空白组与实验组小鼠血清中AQP4的含量情况，从中可以看出：与空白组比较，抑郁模型组的AQP4蛋白含量明显减少；与抑郁模型组比较，各给药组中AQP4的含量明显增加。结果表明，抑郁症会阻滞血清中AQP4的表达，使之含量减少，制何首乌中的有效化学成分大黄素葡萄糖苷和大黄素有明显的抗抑郁效果(P＜0.05，P＜0.05)，AQP4含量增加。
[0068] 二、海马组织中AQP4的表达水平
[0069] 1.免疫印迹试验
[0070] (1)试验内容，包括以下步骤：
[0071] S1：蛋白样品的制备
[0072] ①在冰上收细胞，用PBS清洗两次，洗去培养基。1500r，5min离心，弃去上清液。
[0073] ②裂解细胞(裂解液:RIPA裂解液100-120微升/皿)，根据所需蛋白浓度加细胞裂解液。混匀。于冰上裂解20min。
[0074] ③14000r，10min离心。上清液即为所需蛋白样品液。
[0075] ④用Bradford蛋白分析法测蛋白浓度。
[0076] ⑤按100ul裂解液加30ul的6X的loading buffer的比例，向蛋白样品液中添加loading buffer。
[0077] ⑥于95℃，5min条件下对蛋白样品进行高温变性。
[0078] S2：聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
[0079] 灌胶：
[0080] ①保证玻璃板干燥洁净，玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶。
[0081] ②配好分离胶，加入TEMED，混匀后即可灌胶。灌胶过程中胶要沿着玻璃板流下，防止有气泡产生。将胶灌至接近绿带中线即可。
[0084] ⑤配制浓缩胶，加入TEMED,混匀后将剩余空间灌满浓缩胶。然后插入梳子。待浓缩胶凝固后小心拔出梳子。
[0086] 电泳：
[0087] 向电解槽中加入适量的Running Buffer，将蛋白样品以50μg的标准换算出的体积进行上样。以电压120V或160V进行电泳，电泳至前沿跑至最底端即可进行转膜。电泳结果如图3所示，
[0088] S3：转膜
[0089] 用硝酸纤维素膜(NC膜)，进行转膜。组装转膜“三明治”的过程在Transfer buffer中进行:黑的一面在下，依次放上滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，然后合上“三明治”。整个过程必须保证无气泡。接着把转膜“三明治”放入转膜槽中，注意正负极放置正确。倒入适量的Transfer buffer。在冰浴中进行转膜。转膜条件：120V，1.5h。
[0090] S4：封闭
[0091] 转膜结束后，取出NC膜，按照所需蛋白的位置，裁剪NC膜。使其浸润于封闭液中，缓慢摇荡1h。
[0092] S5：一抗杂交
[0093] 封闭过后，把NC膜放入塑料袋中，按膜的大小加入适量的一抗溶液(一抗:封闭液＝1:1000)，密封，在摇床上缓慢摇荡孵育4h。
[0094] S6：二抗杂交
[0095] 一抗孵育完成后，取出NC膜，交替加入TBST和TBS进行洗膜，一共洗三次，每次7～10min。然后，再将NC膜放入塑料袋中，加入酶标二抗(一抗的抗体，含辣根过氧化物酶HRP)(二抗:封闭液＝1:1000)，密封，在摇床上缓慢摇荡孵育45min。最后再次洗膜(同上)。
[0096] S7：曝光。
[0097] (2)实验结果
[0098] 图4中给出了空白组与实验组小鼠海马组织中AQP4的含量情况，图中#表示抑郁模型组和空白组比较差异，*表示给药组和抑郁模型组比较差异，一个符号*是P＜0.05有统计学差异，两个符号**P＜0.01有显著统计学差异；从图中可以看出：抑郁模型组和空白组相比较，AQP4表达量相对减少，具有统计学差异(P＜0.05)；给药组和抑郁模型组相比较，大黄素葡萄糖苷组和注射药物组中AQP4的表达量增加，具有显著统计学差异(P＜0.01)。结果表明，抑郁症小鼠的海马组织中AQP4表达减少，给药后，水通道蛋白4表达量明显增加(P＜0.01)。
[0099] 2.PCR实验
[0100] (1)仪器和试剂
[0101] PCR实验所用仪器如表3所示。
[0102] 表3 PCR实验所用仪器
[0103]
[0104]
[0105] PCR实验所用试剂如表4所示。
[0106] 表4 PCR实验所用试剂
[0107]
[0108] (2)实验内容
[0109] ①实时荧光定量PCR检测mRNA。采用Trizol法提取RNA，包括以下步骤：
[0110] S1：样本的前处理
[0111] 首先取出在-80℃冰箱中保存的新鲜冰冻组织，其重量约为100mg，加入1mL Trizol试剂，然后用用匀浆器研磨成浆，移至1.5mL EP管中，必须保证无RNase。最后裂解10分钟。
[0112] S2：加入200μL氯仿，剧烈颠倒混匀数次，室温放置5分钟。
[0113] S3：4℃，12000rpm，离心15分钟，可见分成上(RNA)中(蛋白)下(DNA)三相。
[0114] S4：转移上层水相(约400μL)于另一新1.5mL EP管中，加入400μL异丙醇，混匀后室温静置10分钟。
[0115] S5：4℃，12000rpm，离心10分钟，管底可见白色的RNA沉淀。
[0116] S6：弃上清，加入无RNase的75％乙醇1mL，涡旋混匀后，4℃，10000rpm，离心5分钟。
[0117] S7：重复步骤6一次。
[0118] S8：弃上清，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，将沉淀溶于20μLDEPC水中。
[0119] S9：取溶解后的RNA2微升用微量分光光度计测定OD260、OD280以及OD260/OD280值，最后计算RNA的浓度和纯度。
[0120] 根据OD260/OD280比值，估测RNA质量，比值在1.8～2.0之间满足实验要求。根据吸-3光光度值按下列公式计算样品RNA的浓度：总RNA浓度(μg/μL)＝OD260×40×10 。
[0121] 将总RNA放于-80℃冰箱内保存以备用。
[0122] ②逆转录成cDNA
[0123] 逆转录反应体系溶液表5所示。
[0124] 表5逆转录反应体系
[0125]
[0126] 逆转录反应条件为：25℃ 5分钟，50℃ 15分钟，85℃ 5分钟，4℃ 10分钟。
[0127] ③实时荧光定量PCR检测
[0128] 将cDNA做10倍稀释，然后进行PCR检测。PCR检测反应体系如表6所示。
[0129] 表6实时荧光定量PCR反应体系
[0130]
[0131] PCR检测反应条件为：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟；95℃ 30sec，60℃ 30sec，40cycles。
[0132] PCR检测所用引物如表6所示。
[0134]
[0135] (3)实验结果
[0136] 图5为Mus AQP4扩增曲线，从中可以看出Mus AQP4约第20个循环进入扩增指数期。荧光阈值为0.104264，此时Ct值(扩增循环数)约为23。图6为Mus AQP4熔解曲线，其曲线为单一峰，表明引物设计特异性强。Tm值，即DNA双链解链50％的温度约为84℃。图7为β-actin扩增曲线，表明β-actin约第15个循环进入扩增指数期，荧光阈值为0.164925，此时Ct值(扩增循环数)约为20。图8为β-actin熔解曲线，其曲线为单一峰，表明引物设计特异性强。Tm值，即DNA双链解链50％的温度约为84℃。
[0137] 图9为各个组中AQP4 mRNA的相对表达量，图中#表示抑郁模型组和空白组比较差异，*表示给药组和抑郁模型组比较差异，*是表明有统计学差异(P＜0.05)，**表明有显著统计学差异(P＜0.01)，***表明有极显著统计学差异(P＜0.001)。其中抑郁模型组与空白组比较，AQP4 mRNA表达量减少，有极显著统计学差异(p<0.001)；给药组与抑郁模型组相比较，AQP4 mRNA表达量增加，其中二苯乙烯苷组相比抑郁模型组，AQP4 mRNA表达量增加，有统计学差异(P＜0.05)；大黄素葡萄糖苷组相比抑郁模型组，AQP4 mRNA表达量增加，有极显著统计学差异(P＜0.001)；注射药物组相比于抑郁模型组，AQP4 mRNA表达量增加，有统计学差异(P＜0.05)。
[0138] 经过以上分析可知，AQP4与抑郁症的发病和治疗有直接的相关性。抑郁症会阻滞血清中AQP4的表达，使之含量减少，经药物(二笨乙烯苷、大黄素等)治疗后，AQP4的含量升高；患抑郁症后，海马中AQP4表达量相对减少，经药物(二笨乙烯苷、大黄素等)治疗后，AQP4的表达量增加。AQP4是抑郁症新的治疗靶点。
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