杨梅苷防治骨质疏松的应用
阅读：214发布：2020-05-25
专利汇可以提供杨梅苷防治骨质疏松的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了杨梅苷防治骨质疏松的应用，杨梅苷对人骨髓间充质干细胞无毒性作用，不影响 细胞增殖 ；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞的凋亡具有保护作用；并且在其分化过程中改善H2O2诱导的 氧 化 应激状态 ；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞成骨分化抑制具有保护作用；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞成脂分化增强具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表达，从而通过改善人骨髓间充质干细胞凋亡和分化抑制及间接抑制破骨细胞活化来对骨质疏松起保护作用。在去势小鼠骨松模型中，杨梅苷可以改善血清中的氧化应激状态，改善股骨远端和第四腰椎的松质骨骨微结构，表明杨梅苷能够通过抑制氧化应激而改善骨微结构，发挥防治骨质疏松的作用。，下面是杨梅苷防治骨质疏松的应用专利的具体信息内容。
1.杨梅苷在制备用于防治骨质疏松的药物中的应用。
2.含杨梅苷的植物提取物在制备用于防治骨质疏松的药物中的应用。
3.杨梅苷在制备用于改善人骨髓间充质干细胞氧化应激状态的药物中的应用。
4.杨梅苷在制备用于抗人骨髓间充质干细胞凋亡的药物中的应用。
5.杨梅苷在制备用于抗人骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，杨梅苷在制备用于提高人骨髓间充质干细胞中ALP活性的药物中的应用。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，杨梅苷在制备用于提高人骨髓间充质干细胞中促成骨分化基因Alp、Colla1及Ocn表达水平的药物中的应用。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，杨梅苷在制备用于提高人骨髓间充质干细胞中抑制RANKL和IL-6水平的药物中的应用。
9.如权利要求1～8中任意一项所述的应用，其特征在于，杨梅苷的给药量至少为
5mg/kg。
杨梅苷防治骨质疏松的应用
技术领域
[0001] 本发明属于骨质疏松的防治技术领域，涉及杨梅苷防治骨质疏松的应用。
背景技术
[0002] 骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由多种病因导致的骨组织骨量丢失、骨微结构恶化和生物力学性能减退的全身性、退行性、代谢性骨骼疾病，导致骨脆性增加，容易发生骨折，严重威胁着中老年人的身心健康。
[0003] 氧化应激(oxidative stress)是机体内高活性物质如ROS(Reactive oxygen species)产生过多，超出了机体的清除能力，导致氧化和抗氧化失衡的一种状态。生理范围内的ROS在调节人体正常的功能如细胞凋亡、基因表达、信号转导等方面起着重要的作用。然而，高浓度的ROS可以导致核酸、蛋白质、脂质产生氧化反应，损害细胞的结构和功能，引起疾病的发生。
[0004] 近年来，研究发现氧化应激在骨质疏松发生发展中起重要作用。过量氧自由基(ROS)的产生可以抑制骨髓基质干细胞(MSCs)成骨分化，造成MSCs和成骨细胞(OB)凋亡，促进破骨细胞(OC)活化和功能增强，导致骨吸收和骨形成失衡，引起骨微结构改变和骨量降低。
[0005] 杨梅苷(myricitrin)是一种植物黄酮苷，在杨梅的枝干、皮中含量丰富，在其他多种水果和植物中也含有此成分。鉴于其来源丰富，杨梅苷比较容易被提取和纯化。由于杨梅苷的良好活性，它被作为功能性食品、化妆品和药品的重要补充。大量文献表明，杨梅苷具有抗炎、神经保护和抗氧化等性能。
发明内容
[0006] 本发明目的在于提供杨梅苷防治骨质疏松的应用。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008] 杨梅苷在制备用于防治骨质疏松的药物中的应用。
[0010] 杨梅苷在制备用于改善人骨髓间充质干细胞氧化应激状态的药物中的应用。
[0011] 杨梅苷在制备用于抗人骨髓间充质干细胞凋亡的药物中的应用。
[0012] 杨梅苷在制备用于抗人骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的药物中的应用。
[0013] 杨梅苷在制备用于提高人骨髓间充质干细胞中ALP活性的药物中的应用。
[0014] 杨梅苷在制备用于提高人骨髓间充质干细胞中促成骨分化基因Alp、Colla1及Ocn表达水平的药物中的应用。
[0015] 杨梅苷在制备用于提高人骨髓间充质干细胞中抑制RANKL和IL-6水平的药物中的应用。
[0016] 杨梅苷的给药量至少为5mg/kg。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0018] 杨梅苷对人骨髓间充质干细胞(hBMSC)无毒性作用、对hBMSC的凋亡具有保护作用；并且可以改善氧化应激状态；对hBMSC成骨分化抑制具有保护作用；对hBMSC成脂分化增强具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表达。在去势小鼠模型中，杨梅苷可以改善血清中的氧化应激状态，改善股骨远端和腰椎的松质骨骨微结构。
[0019] 人骨髓间充质干细胞是研究早期成骨前体细胞生长、分化的较常用的细胞模型，杨梅苷对hBMSC具有保护作用，促进骨形成，并通过抑制骨吸收因子来抑制破骨细胞的活化，降低骨吸收，最终起到防治骨质疏松的作用。卵巢切除小鼠模型为常用的绝经后骨松模型，通过连续腹腔注射给与不同剂量杨梅苷，明显改善了血清氧化应激状态，对松质骨骨微结构有保护作用，表明其能够发挥预防及治疗绝经后骨质疏松的作用。
[0020] 杨梅苷为纯天然物质，用药较安全，毒副作用小。
[0022] 图1-1为不同浓度杨梅苷对细胞增殖作用的影响。
[0023] 图1-2为杨梅苷对H2O2造成细胞凋亡的保护作用。
[0024] 图2为杨梅苷可以改善细胞氧化应激ROS水平的检测结果。
[0026] 图3-2为杨梅苷在H2O2作用后，对细胞基质钙盐沉积的作用。
[0027] 图3-3A、图3-3B、图3-3C为杨梅苷在H2O2作用后，对3种(Alp、Colla1及Ocn)成骨分化基因表达水平的影响。
[0028] 图4-1为在H2O2作用后，杨梅苷对细胞脂质生成的作用。
[0029] 图4-2为在H2O2作用后，杨梅苷对成脂分化基因PPARγ2表达水平的影响。
[0030] 图5A、图5B为杨梅苷在H2O2作用后，对2种骨吸收因子IL-6和RANKL表达的影响。
[0031] 图6-1A和图6-1B为杨梅苷可以改善小鼠血清中氧化应激指标MDA和GSH水平的检测结果。
[0032] 图6-2为杨梅苷可以改善OVX小鼠股骨远端松质骨骨微结构的Micro-CT结果。
[0033] 图6-3为杨梅苷可以改善OVX小鼠股骨远端松质骨骨微结构的VG染色结果。
具体实施方式
[0034] 下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0035] hBMSC为人骨髓间充质干细胞，具有多向分化潜能，比如分化为成骨细胞、成脂细胞、成纤维细胞等，是研究骨髓间充质干细胞生长、分化的较常用的细胞模型，过氧化氢(H2O2)处理也是较常用的体外氧化应激模型，出于观察杨梅苷对人骨髓间充质干细胞凋亡和分化的影响，及其抗氧化损伤的作用，所以选择hBMSC作为细胞模型，H2O2处理为体外氧化应激模型。卵巢切除(去势)小鼠模型作为动物模型，是常用的模拟妇女绝经后骨松的模型。
[0036] 1、杨梅苷对氧化应激导致hBMSC凋亡的保护作用
[0037] 1.1单纯杨梅苷对细胞的毒性作用
[0038] 将hBMSC细胞以2×103个/mL接种到96孔板上，待细胞长满后，弃掉培养基(成分：α-MEM培养液+20％胎牛血清(FBS)+1％双抗(青链霉素))，加含不同浓度0、0.1、1、10μM杨梅苷的无血清培养基至孔板中，培养24h和72h，观察杨梅苷对细胞增殖作用的影响。在观察点，利用MTT法对细胞活性进行检测。
[0039] 结果如图1-1所示，横坐标为不同浓度的杨梅苷作用时间，该图的纵坐标为细胞活力值，以各组的吸光度OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。由图可见，不同浓度的杨梅苷在观察时间内，对细胞的增殖并无明显影响。
[0040] 1.2杨梅苷对氧化应激导致hBMSC凋亡的保护作用
[0041] 分组情况：空白对照组；单纯H2O2处理组；0.1μM Myricitrin+H2O2；1μM Myricitrin+H2O2；10μM Myricitrin+H2O2。
[0042] 将hBMSC细胞以2×103个/mL接种到96孔板上，待细胞长满后，弃掉培养基，加含不同浓度0、0.1、1、10μM杨梅苷的无血清培养基至孔板中，培养24h，加入H2O2(300μM)，再培养24h，利用MTT法进行细胞活性检测。
[0043] 结果如图1-2所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为细胞活力值，以各组的吸光度OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。由图可见，单纯H2O2作用后，细胞活性降低，经不同浓度杨梅苷作用后细胞活性增加，同单纯H2O2作用组相比，具有统计学# ##差异。图中的#号表示：同对照组相比，P<0.05，P<0.01；图中的*号表示：同单纯H2O2作用组相比，*P＜0.05,**P＜0.01。这表明用杨梅苷处理后能够保护H2O2诱导的hBMSC的凋亡。
[0044] 综上所述，经杨梅苷对hBMSC细胞作用，不同浓度杨梅苷对细胞进行预处理，然后施加H2O2干预，通过MTT检测细胞活性，结果表明单纯H2O2作用可以导致细胞活性降低，造成细胞凋亡，而0.1、1、10μM杨梅苷预处理，对这种损伤具有保护作用。因此，杨梅苷对H2O2诱导的氧化应激导致的细胞凋亡具有保护作用。
[0045] 2、杨梅苷抗氧化作用检测
[0046] hBMSC细胞铺满后，在杨梅苷和/或H2O2作用下，处理方法同上(1.2中)，进行氧化应激相关检测。
[0047] 根据ROS检测试剂盒，利用荧光探针DCFH-DA对细胞内的活性氧进行检测。细胞爬片，0.1、1、10μM杨梅苷预处理24h，300μM H2O2作用24h，然后进行原位装载探针，加入10μM DCFH-DA，孵育20min，用PBS洗3次，去除未结合的探针，利用荧光酶标仪进行检测。
[0048] 结果如图2所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为ROS生成，以各组的吸光度OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。由图可见，单纯H2O2处理后，细胞内的ROS水平升高很明显，而0.1、1、10μM杨梅苷预处理后，细胞内的ROS水平降低。因此，杨梅苷可以改善hBMSC氧化应激ROS水平。
[0049] 3、杨梅苷对氧化应激造成hBMSC成骨分化抑制的保护作用
[0050] 杨梅苷对氧化应激造成hBMSC成骨分化抑制的保护作用：实验分组同上(1.2中)，将细胞铺于6孔板上，铺满后，加入地塞米松0.1uM，10mM甘油磷酸钠以及50ug/mL抗坏血酸进行成骨诱导培养。14天后，给予0.1、1、10μM杨梅苷预处理24h，然后加入300μM H2O2处理24h。
[0051] 3.1根据碱性磷酸酶定量试剂盒(上海杰美)进行ALP定量，收集细胞，裂解后，提取蛋白。测定蛋白浓度，然后根据试剂盒的说明，进行ALP定量检测。
[0052] 结果如图3-1所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为ALP活力，以各组的吸光度OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。单纯H2O2作用后，细胞ALP活性表达同空白对照组相比显著下降，杨梅苷作用后，ALP活性表达升高，同单纯H2O2作用组相比具有统计学差异。ALP为成骨及其前体细胞分化中期的关键表达蛋白，为检测成骨及其前体细胞分化的特异性指标，氧化应激导致ALP活性降低，对成骨及其前体细胞分化为抑制作用，但经杨梅苷作用后，ALP表达增加，改善了氧化应激对hBMSC成骨分化的抑制作用。
[0054] 分组情况：①空白对照组；②单纯H2O2处理组；③0.1μM Myricitrin+H2O2；④1μM Myricitrin+H2O2；⑤10μM Myricitrin+H2O2。
[0055] 结果如图3-2所示，单纯H2O2作用后钙化结节形成较少，但是杨梅苷预处理后，结节面积有增加。钙结节形成为成骨及其前体细胞分化的矿化阶段，氧化应激可以抑制成骨及其前体细胞分化，而杨梅苷可以通过改善氧化应激来改善hBMSC成骨分化。
[0056] 3.3成骨基因的RT-PCR检测：实验分组同上(1.2中)，将细胞铺于6孔板上，铺满后，加入0.1uM地塞米松，10mM甘油磷酸钠以及50ug/mL抗坏血酸进行成骨诱导培养。14天后，给予0.1、1、10μM杨梅苷预处理24h，然后加入300μM H2O2处理24h。用Trizol裂解细胞，提取细胞内的mRNA，根据实时定量RT-PCR的程序，对目的基因Alp、Colla1及Ocn进行定量检测。
[0057] 结果如图3-3A、图3-3B、图3-3C所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为mRNA的相对表达水平，以各组相对于空白对照组的百分率来表述。由图可见，H2O2作用后，细胞成骨分化基因Alp、Colla1及Ocn表达水平下降，杨梅苷作用后，可以显著促进成骨基因表达。Alp、Colla1及Ocn基因分别为成骨及其前体细胞分化中期和后期的关键基因，决定着细胞的分化水平。H2O2抑制成骨及其前体细胞成骨分化基因的表达，而杨梅苷作用后，成骨分化基因表达有上调，说明杨梅苷可以改善H2O2导致的hBMSC成骨分化抑制。
[0058] 4、杨梅苷对氧化应激造成的hBMSC成脂增强的抑制作用
[0059] 4.1油红O检测脂质的生成：成脂诱导14天后，细胞经杨梅苷和/或H2O2处理2天，用PBS冲洗细胞，3.7％甲醛固定20分钟，再用油红O液体染色1小时。
[0060] 分组情况：①空白对照组；②单纯H2O2处理组；③0.1μM Myricitrin+H2O2；④1μM Myricitrin+H2O2；⑤10μM Myricitrin+H2O2。
[0061] 结果如图4-1所示，单纯H2O2作用后脂滴形成较多，但是杨梅苷预处理后，脂滴生成明显减少。脂质生成为骨髓间充质干细胞向成脂分化的标志，氧化应激可以促进成脂分化，而杨梅苷可以通过改善氧化应激来抑制hBMSC成脂分化。
[0062] 4.2成脂基因的RT-PCR检测：实验分组同上(1.2中)，将细胞铺于6孔板上，铺满后，再成脂诱导14天，之后给予0.1、1、10μM杨梅苷预处理24h，然后加入300μM H2O2处理24h。用Trizol裂解细胞，提取细胞内的mRNA，根据实时定量RT-PCR的程序，对目的基因PPARγ2进行定量检测。
[0063] 结果如图4-2所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为mRNA的相对表达水平，以各组相对于空白对照组的百分率来表述。由图可见，H2O2作用后，细胞成脂分化基因PPARγ2表达水平升高，杨梅苷作用后，可以显著抑制成脂基因的表达。PPARγ2为成脂及其前体细胞分化的关键基因，一定程度上决定着细胞的分化水平。H2O2促进成脂分化基因的表达，而杨梅苷作用后，成脂分化基因表达下调，说明杨梅苷可以抑制H2O2导致的hBMSC成脂分化。5、杨梅苷对骨吸收因子的表达影响
[0064] 杨梅苷对氧化应激刺激骨吸收因子增加的抑制作用：分组同上(1.2中)，将细胞铺于6孔板上，铺满后，进行成骨诱导培养，14天后，给予杨梅苷处理，然后加入H2O2，裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度，根据酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测IL-6和RANKL的表达情况。
[0065] 结果如图5A、图5B所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为骨吸收因子的相对表达量，以各组相对于空白对照组的百分率来表述。H2O2作用后，细胞表达的IL-6和RANKL水平增加，杨梅苷预处理可以抑制骨吸收因子的表达。IL-6和RANKL为成骨及其前体细胞分泌的细胞因子，可以活化破骨细胞，进而引起骨吸收增强，导致骨量降低。因此，杨梅苷可以通过抑制IL-6和RANKL的表达，来抑制破骨细胞的活化，进而减少骨量的丢失。
[0066] 综合以上表明：杨梅苷对人骨髓间充质干细胞无毒性作用，不影响细胞增殖；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞的凋亡具有保护作用；并且在其分化过程中改善H2O2诱导的氧化应激状态；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞成骨分化抑制具有保护作用；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞成脂分化增强具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表达，从而通过改善人骨髓间充质干细胞凋亡和分化抑制间接抑制破骨细胞活化来对骨质疏松起保护作用。
[0067] 6.动物骨松模型的建立
[0068] 40只8周大BALB/c雌性小鼠，体重为20-22g。本实验中4组小鼠的初始体重无统计学差异。在切除卵巢前，先将它们置于实验室条件下1周(即通气良好的20℃恒温环境中，每12小时光照与黑暗交替，水粮足量，自由取用)。适应1周后，用戊巴比妥钠(50mg/kg体重)进行麻醉，小鼠被切除卵巢(去势，n＝30)或者假手术(n＝10)。卵巢切除是通过背侧入路切除双侧卵巢。假手术意味着手术找到双侧卵巢，但不切除，直接缝合关闭切口。小鼠被随机分为4组：不处理组(假手术对照组，Sham)；不处理组(单纯卵巢切除组,OVX)；低剂量杨梅苷给药组(卵巢切除后每日通过腹腔注射给予5mg/kg体重的杨梅苷溶液,OVX+Myricitrin(5))；高剂量杨梅苷给药组(卵巢切除后每日通过腹腔注射给予25mg/kg体重的杨梅苷溶液,OVX+Myricitrin(25))。杨梅苷溶解于去离子水中，通过腹腔注射对不处理组小鼠注射同体积去离子水。手术后1周开始给药，连续给药12周时间。给药完成后，麻醉下通过心脏采血获得血液标本，并进行离心。提取每只小鼠的左侧股骨和第四腰椎，清除粘连的肌肉组织，妥善固定。
[0069] 6.1使用脂质过氧化物MDA检测试剂盒检测各组血液样本。在脂质过氧化过程中硫代巴比妥酸与MDA结合生成显色复合物，其最大吸收峰在532nm，利用酶标仪在此处读数。同样，使用GSH检测试剂盒检测各组血液样本。GSH的检测是根据GSH与二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反应形成一个产物，此产物通过酶标仪在412nm处进行读数检测。
[0070] 结果如图6-1A和图6-1B所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为MDA活力和GSH活力，以各组的OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。由图可见，单纯H2O2处理后，血清中的MDA水平明显升高，GSH水平明显降低；而高、低剂量的杨梅苷给药组血清中的MDA水平降低，GSH水平升高。因此，杨梅苷可以改善血清中氧化应激状态。
[0071] 6.2显微CT检测骨微结构：第四腰椎和股骨远端的骨微结构通过探索轨迹SP预临床标本显微CT进行检测。分辨率为8mm，管电压为50kV，管电流为0.1mA。通过一个桌面显微CT处理软件进行重建和3D定量分析。所有标本的扫描环境和分析方法相同。股骨扫描区域限定为远端干垢端，并且向近端的初级松质近末端区域延伸2.0mm。在排除了颅骨及尾终板区后，椎体的松质骨区域被包含在每一个显微CT选区中。在这些待扫描的区域中，松质骨与皮质骨的分界为内皮质骨面。选定的感兴趣区的3D参数用于数据分析，包括：骨矿物质密度、连接密度、结构模型指数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度和相对骨体积分数。进行扫描分析的操作者对标本的处理过程单盲。
[0072] 结果如图6-2所示，相对于假手术组，卵巢切除导致了小鼠松质骨骨微结构的损害，表现为骨矿密度、连接密度、骨小梁数量、骨小梁厚度及骨体积分数的下降。同时，卵巢切除后结构模型指数和骨小梁分离度明显提高。结果具有统计学差异。然而，高、低剂量杨梅苷给药组明显逆转了卵巢切除引起的骨微结构参数的变化趋势，起到保持第四腰椎及股骨远端小梁骨骨量的作用，结果具有统计学差异。因此，杨梅苷能够对绝经后骨质疏松发挥预防及治疗作用。
[0073] 6.3通过VG染色进行组织学检测：小鼠的左侧股骨取材完成后，用4％多聚甲醛固定48小时。所有标本用80％酒精脱水，并用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)进行包埋。用旋转切片机切取240mm片厚的冠状位薄片，然后将所有切片打磨成20mm片厚，用于进行VG染色。
[0074] 结果如图6-3所示，相对于假手术组，卵巢切除组骨小梁数量明显下降，小梁间的距离明显变宽。给予高、低剂量杨梅苷药物处理后，上述骨小梁损害效果明显得到改善，表现为骨小梁数量的增加及骨小梁间距的减小。
[0075] 因此，杨梅苷可应用于骨质疏松的防治，尤其是应用在制备防治骨质疏松药物的中。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 人参皂苷Rb2对成骨细胞前体细胞保护的应用 | 2020-05-26 | 468 |
| 多感知通道交互的应激辅助决策实验装置及其实验方法 | 2020-05-19 | 546 |
| 用于预防和治疗温血动物的应激状态的含有溶血磷脂酰丝氨酸的制剂 | 2020-05-15 | 138 |
| 诊断应激的药物和方法 | 2020-05-18 | 342 |
| 应用类胰高血糖素肽－1(GLP－1)或类似物消除外科手术后的分解代谢改变 | 2020-05-17 | 622 |
| 一种蛋鸭应激状态的鉴别方法 | 2020-05-11 | 214 |
| 一种实验性高原肠道屏障损伤大鼠模型的建立方法 | 2020-05-21 | 291 |
| 创伤、感染、手术及其他应激状态全营养配方食品 | 2020-05-14 | 175 |
| 1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖在制备防治骨质疏松症药品中的应用 | 2020-05-27 | 790 |
| 一种蛋鸭应激状态的鉴别方法 | 2020-05-11 | 104 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈