灯盏乙素苷元晶型及其制备方法
阅读：4发布：2021-11-29
专利汇可以提供灯盏乙素苷元晶型及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于医药化工领域，具体涉及多种灯盏乙素 苷元 晶型及其制备方法。本发明还涉及灯盏乙素苷元晶型在制备 预防 和/或 治疗 心脑 血管 疾病 、 风 湿性关节炎和中风后遗症等的药物中的用途。本发明的灯盏乙素苷元晶型具有较好的 稳定性 ，并可克服灯盏乙素口服吸收差， 生物 利用度低的问题。，下面是灯盏乙素苷元晶型及其制备方法专利的具体信息内容。
1.灯盏乙素苷元晶型A，其特征在于所述晶型A在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下位置处的主要特征吸收峰：14.5±0.2°、16.9±
0.2°、22.0±0.2°、26.7±0.2°和27.4±0.2°。
2.权利要求1的晶型A，其特征在于在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收峰中的一个或多个：11.2±0.2°、13.8±
0.2°、20.4±0.2°、24.8±0.2°、28.7±0.2°和30.4±0.2°等。
3.权利要求1或2的晶型A，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为366.1±3.0℃。
4.权利要求1-3任一项的晶型A，其纯度≥90％，优选≥95％。
5.权利要求1-4任一项的晶型A的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取灯盏花乙素加入回流温度为120℃至220℃(例如180℃)的与水混溶的有机溶剂(例如丙二醇或乙二醇)，加热回流，使灯盏花乙素全部溶解；
(2)向溶液中缓慢滴加酸溶液；继续回流6-16小时；
(3)溶液冷却，析出沉淀，过滤，滤饼分别以步骤(1)所述的回流溶剂(例如丙二醇或乙二醇)、水洗涤，以及任选的干燥、粉碎的步骤，即得灯盏乙素苷元晶型A；
(4)任选地，通过悬浮搅拌、缓慢降温、反溶剂添加、反向反溶剂添加、液-固气相渗透、离子液体诱导结晶、湿度诱导和湿法研磨中的一种或几种也可从灯盏乙素固体(包括晶型A、无定型或其它晶型)获得晶型A。
6.权利要求1-4任一项的晶型A，其为无水物。
7.药物组合物，其含有权利要求1-4任一项的晶型A，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
8.权利要求1-4任一项的晶型A在制备预防和/或治疗心脑血管疾病(例如闭塞性脑血管所致后遗瘫痪、冠心病、心绞痛)、风湿性关节炎、中风后遗症、肾病综合征、糖尿病性肾病、慢性肾小球肾炎等肾脏疾病，抗结核药物性肝损伤、急性黄疸性肝炎、慢性肝炎、顽固性肝硬化腹水等肝脏疾病、慢性阻塞性肺疾病急性加重期合并低氧血症，糖尿病周围神经病变、糖尿病足等糖尿病慢性并发症，视网膜震荡伤、缺血性视神经病变、眼中心性浆液性视网膜病变等眼科疾病、突发性耳聋或胎儿生长受限等疾病的药物中的用途。
灯盏乙素苷元晶型及其制备方法
技术领域
背景技术
[0003] 灯盏乙素(也称野黄芩苷，英文名为Scutellarin)具有改善脑血循环,增 加脑血流量,降低血粘度和抗血小板凝聚等作用。灯盏乙素临床应用广泛,主 要用于心脑血管疾病,如闭塞性脑血管所致后遗瘫痪、冠心病、心绞痛等。灯 盏乙素在治疗心脑血管疾病、风湿性关节炎和中风后遗症等方面有显著的疗 效(唐于平,李念光,段金廒.灯盏乙素苷元衍生物及其制备方法和其应用[P]. 江苏：CN101891728A,2010-11-24.)。此外，灯盏花素在临床上还可用于治 疗肾病综合征、糖尿病性肾病、慢性肾小球肾炎等肾脏疾病，抗结核药物性 肝损伤、急性黄疸性肝炎、慢性肝炎、顽固性肝硬化腹水等肝脏疾病以及慢 性阻塞性肺疾病急性加重期合并低氧血症，糖尿病周围神经病变、糖尿病足 等糖尿病慢性并发症，视网膜震荡伤、缺血性视神经病变、眼中心性浆液性 视网膜病变等眼科疾病，以及突发性耳聋和胎儿生长受限等(孙华,宋怡.灯 盏花素的临床拓展应用[J].亚太传统医药,2013,05:63-64.)。
[0004] 由于早前纯化工艺不完善，多采用灯盏花素作为原料药进行临床疾病的 治疗。灯盏花素给药存在的问题是，灯盏花素本身为灯盏乙素、灯盏乙素同 分异构体-异野黄芩苷及其其他的混合物，成分复杂，在质量控制中存在一些 问题。而灯盏乙素是灯盏花素中的主成分，是技术推进的结果，但灯盏乙素 口服吸收差，口服利用率不高。
[0005] 灯盏乙素苷元是灯盏乙素的水解产物(刘建明,熊玉卿.灯盏乙素及其苷 元药代动力学特征的研究进展[J].中国中药杂志,2009,24:3165-3168.)，又名 野黄芩素，英文名为Scutellarein，CAS NO.529-53-3，分子式为C15H10O6， 分子量为286.2。
[0006] 随着纯化分离技术和检测技术的发展，结合目前对灯盏乙素及苷元的研 究发现，灯盏乙素苷元较乙素在胃肠道具有更高的渗透性，口服吸收约为灯 盏乙素的3倍。车庆明等研究大鼠灌胃给予等量灯盏乙素苷元及灯盏乙素,表 明灯盏乙素苷元口服易于吸收,与灯盏乙素相比,体内代谢稳定，其相对生 物利用度为301.8％(车庆明,陈颖,潘丽怡,何红.灯盏花乙素苷元不同给药剂 量的大鼠药动学比较[J].中国新药杂志,2006,18:1557-1561.)。车庆明等还发 现，灯盏乙素苷元口服给药后在体内主要转化为灯盏花注射剂的有效成分灯 盏乙素，其血药分布与灯盏花注射剂的情况较为接近(车庆明,潘丽怡,陈颖, 何红.灯盏花乙素苷元的药动学研究[J].中国药学杂志,2007,18:1418-1421.)。 换言之，灯盏乙素苷元有几乎等同于灯盏乙素的药理活性。吕等利用脑组织 进行灯盏乙素脂质体的动力学研究，结合现有研究结果表明灯盏乙素能通过 血脑屏障在脑组织分布(Int J Pharm.2005 Dec 8；306(1-2):99-106.Distribution of liposomal breviscapine in brain following intravenous injection in rats.Lv W1,Guo J,Li J,Huang L,Ping Q.)。苷元口 服给药，当剂量为200mg/kg时，大鼠血浆中可以测到灯盏乙素苷元和灯盏 乙素，而剂量为20mg/kg时，只能测到灯盏乙素，检测不到原形药(车庆明, 陈颖,潘丽怡,何红.灯盏花乙素苷元的胆汁排泄研究[J].中国中药杂 志,2006,20:1710-1712.)。居文政等测定了灯盏乙素血药浓度以及临床药代动 力学，受试者口服给药360mg灯盏乙素，在1、3、
5、8小时取血测定灯盏 乙素浓度，仅在5小时时测定20ng/ml，而在血浆和尿液中测得大量的苷元， 提示灯盏乙素可能在结肠被水解为苷元而吸收(居文政,储继红,谭仁祥,熊宁 宁.UPLC-MS/MS联用法分析灯盏花乙素在胃肠道的代谢物[J].中国临床药 理学与治疗学,
2006,03:292-295.)。
5、8小时取血测定灯盏 乙素浓度，仅在5小时时测定20ng/ml，而在血浆和尿液中测得大量的苷元， 提示灯盏乙素可能在结肠被水解为苷元而吸收(居文政,储继红,谭仁祥,熊宁 宁.UPLC-MS/MS联用法分析灯盏花乙素在胃肠道的代谢物[J].中国临床药 理学与治疗学,
2006,03:292-295.)。
[0007] 由于灯盏乙素口服吸收差，口服利用率不高，而灯盏乙素苷元能够在体 内转化为灯盏乙素，且其口服吸收优于灯盏乙素，如果能够得到灯盏乙素苷 元具有一定稳定性的晶型，将更有利于药物开发及工业化生产。
发明内容
[0008] 本发明通过缓慢挥发结晶、悬浮搅拌、缓慢降温、反溶剂添加、反向反 溶剂添加、液-固气相渗透、液-液气相渗透、离子液体诱导结晶、聚合物诱 导结晶、湿度诱导、湿法研磨、加热诱导等方法制备得到灯盏乙素苷元的多 晶型及苷元的铵盐水合物晶型，由此完成了本发明。
[0009] 本发明第一方面涉及灯盏乙素苷元晶型A，其特征在于所述晶型A在使 用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下 位置处的主要特征吸收峰：14.5±0.2°、16.9±0.2°、22.0±0.2°、26.7±0.2°和 27.4±0.2°。
[0010] 在本发明的一个实施方案中，所述晶型A在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度 表示的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收峰 中的一个或多个：11.2±0.2°、13.8±0.2°、20.4±0.2°、24.8±0.2°、28.7±0.2°和 30.4±0.2°等。
[0011] 在本发明的一个具体实施方案中，所述晶型A在使用Cu-Kα辐射，以2θ 角度表示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰： 7.2±0.2°、11.2±0.2°、13.8±0.2°、14.5±0.2°、16.9±0.2°、20.4±0.2°、21.3±0.2°、 22.0±0.2°、23.0±0.2°、24.4±0.2°、24.8±0.2°、26.7±0.2°、27.4±0.2°、28.7±0.2°、 30.4±0.2°、31.1±
0.2°、32.3±0.2°、33.1±0.2°、33.8±0.2°、34.8±0.2°和37.3±0.2°。
0.2°、32.3±0.2°、33.1±0.2°、33.8±0.2°、34.8±0.2°和37.3±0.2°。
[0012] 在本发明的具体实施方案中，其典型的X射线粉末衍射图谱如图1所示。
[0014] 在本发明的具体实施方案中，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 366.1℃。
[0015] 在本发明的具体实施方案中，其典型的DSC图如图2所示。
[0016] 根据本发明任一项的晶型A，其纯度≥90％，优选≥95％。
[0017] 本发明还涉及本发明任一项的晶型A的制备方法，其包括以下步骤：
[0018] (1)取灯盏乙素加入回流温度为120℃至220℃(例如180℃)的与水 混溶的有机溶剂(例如丙二醇或乙二醇)，加热回流，使灯盏花乙素全部溶 解；
[0021] (4)任选地，通过悬浮搅拌、缓慢降温、反溶剂添加、反向反溶剂添加、 液-固气相渗透、离子液体诱导结晶、湿度诱导和湿法研磨中的一种或几种也 可从灯盏乙素固体(包括晶型A、无定型或其它晶型)获得晶型A。
[0022] 在本发明的实施方案中，上述步骤(4)中的方法选自以下八种方法中的 一种或几种：
[0023] (1)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入水或者乙醇或者或乙 酸或乙腈或者丙酮或者甲基异丁基酮或者四氢呋喃或者醋酸异丙酯或者甲基 叔丁基醚或者1,4-二氧六环或者正己烷或者甲苯或者乙二醇/水混合溶剂或者 丙二醇/水混合溶剂或者PEG400/庚烷混合溶剂或者N-甲基吡咯烷酮/水混合 溶剂或者二甲亚砜/水混合溶剂或者二甲基甲酰胺/水混合溶剂得到悬浮液， 在室温(RT)或者40-60℃(例如50℃)条件下搅拌4-8天(例如6天)，离 心分离固体得到晶型A；
[0024] (2)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入二甲亚砜/乙醇混合溶 剂或者二甲亚砜/四氢呋喃混合溶剂或者N-甲基吡咯烷酮/甲基叔丁基醚混合 溶剂或者N-甲基吡咯烷酮/乙酸乙酯混合溶剂或者二甲基甲酰胺/丙酮混合溶 剂或者或者二甲基甲酰胺/乙腈混合溶剂，在40-60℃(例如50℃)平衡一段 时间(例如30min)后降温2-5天(例如3天)降至3-10℃(例如5℃)， 在该温度下悬浮搅拌1-4天(例如2天)后离心分离固体得到晶型A；
[0025] (3)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入正溶剂，使固体完全 溶解，然后将该澄清溶液缓慢加入反溶剂，析出的沉淀或者在室温条件下挥 发后得到的固体即为灯盏乙素苷元晶型A；正溶剂和反溶剂的组合可以是 N-甲基吡咯烷酮/水或者二甲亚砜/甲醇或者二甲亚砜/丙酮或者二甲基甲酰 胺/水；
[0026] (4)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入正溶剂，使固体完全 溶解，然后将该澄清溶液缓慢加入到反溶剂中，析出的沉淀或者在室温条件 下挥发后得到的固体即为灯盏乙素苷元晶型A；正溶剂和反溶剂的组合可以 是N-甲基吡咯烷酮/水或者二甲亚砜/甲醇或者二甲亚砜/丙酮或者二甲基甲 酰胺/水；
[0027] (5)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)至瓶中，将小瓶敞口置于装 有二氯甲烷或者乙醇或者甲醇或者甲苯或者乙腈或者四氢呋喃或者二甲基 甲酰胺或者丙酮的密闭玻璃瓶中，室温条件下避光放置一段时间(例如13 天)后取出固体，得到晶型A；
[0028] (6)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)至瓶中，加入二甲亚砜/四氢 呋喃混合溶剂或者二甲基甲酰胺/乙腈混合溶剂或者二甲亚砜/乙醇混合溶剂， 得到澄清溶液，加入离子液体至澄清溶液中。所得溶液在室温条件下缓慢挥 发，获得晶型A；所述离子液体例如是指1-丁基-3-甲基咪唑阳离子盐溶液；
[0029] (7)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)至瓶中，放置于恒定湿度(例 如30％-99％，例如32.8％或者57.6％或者75.3％或者97.3％)的容器内，室温 储存一段时间(例如11天)，得到晶型A；
[0030] (8)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)至研钵中，添加异丙醇或者 乙酸或者乙腈或者丙酮或者醋酸异丙酯，研磨(例如15min)，得到晶型A。
[0031] 本发明还涉及灯盏乙素苷元晶型D，其特征在于所述晶型D在使用 Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下位 置处的特征吸收峰：14.1±0.2°、15.8±0.2°、24.1±0.2°、26.1±0.2°、28.0±0.2°。
[0032] 在本发明的一个实施方案中，所述晶型D在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度 表示的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收峰 中的一个或多个：10.0±0.2°、11.2±0.2°、18.0±0.2°、24.6±0.2°、25.6±0.2°、 29.5±0.2°和29.8±0.2°等。
[0033] 在本发明的一个具体实施方案中，所述晶型D在使用Cu-Kα辐射，以2θ 角度表示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰： 7.0±0.2°、9.9±0.2°、11.1±0.2°、14.1±0.2°、15.7±0.2°、18.0±0.2°、19.9±0.2°、 21.2±0.2°、22.4±0.2°、24.1±0.2°、24.6±0.2°、25.2±0.2°、25.5±0.2°、26.0±0.2°、 27.9±0.2°、29.4±
0.2°、29.8±0.2°、30.9±0.2°、31.8±0.2°、35.0±0.2°、36.8°±0.2° 和38.6±0.2°。
0.2°、29.8±0.2°、30.9±0.2°、31.8±0.2°、35.0±0.2°、36.8°±0.2° 和38.6±0.2°。
[0034] 在本发明的具体实施方案中，其典型的X射线粉末衍射图谱如图7所示。
[0035] 根据本发明任一项的晶型D，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 363.2±3.0℃。
[0036] 在本发明的具体实施方案中，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 363.2℃。
[0037] 在本发明的具体实施方案中，其典型的DSC图如图8所示。
[0038] 根据本发明任一项的晶型D，其纯度≥90％，优选≥95％。
[0039] 本发明还涉及本发明任一项的晶型D的制备方法，其选自以下七种方法 中的一种：
[0040] (1)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入吡啶-丙酮(体积比例 如为3：1)或吡啶-庚烷(体积比例如为3：1)混合溶剂，使样品完全溶解 得到澄清溶液，在室温条件下缓慢挥发，挥干溶剂后得到的固体即为灯盏 乙素苷元晶型D。
[0041] (2)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入吡啶，使固体完全溶 解，然后缓慢加入乙醇，析出的沉淀或者在室温条件下挥发后得到的固体 即为灯盏乙素苷元晶型D；或者以二甲基甲酰胺作为溶剂，四氢呋喃作为 反溶剂也可以得到类似结果。
[0042] (3)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入N-甲基吡咯烷酮，使 固体完全溶解，然后将该澄清溶液缓慢加入乙腈中，析出的沉淀或者在室温 条件下挥发后得到的固体即为灯盏乙素苷元晶型D；以吡啶作为溶剂、乙醇 作为反溶剂或者以二甲基甲酰胺作为溶剂，四氢呋喃作为反溶剂也可以得 到类似结果。
[0043] (4)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入DMF/MEK(体积比 例如为1：1)混合溶剂，得到澄清溶液，加入混合聚合物至澄清溶液中， 所得溶液在室温条件下缓慢挥发，即得到灯盏乙素苷元晶型D。
[0044] (5)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，溶于吡啶/乙酸乙酯(体积 比例如为3：1)中，在室温敞口挥发，即得到灯盏乙素苷元晶型D。
[0045] (6)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入丙酮或者乙腈得到悬 浮液，在室温(RT)和40-60℃(例如50℃)条件下搅拌4-8天(例如6天)， 离心分离固体得到晶型A和晶型D的混合物。
[0046] (7)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入二甲基甲酰胺，使固体 完全溶解，然后缓慢加入水，析出的沉淀或者在室温下挥发后得到的固体即 为晶型A和晶型D的混合物。
[0047] 在本发明的实施方案中，所述混合聚合物是指聚乙烯吡咯烷酮(PVP)， 聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯乙酸酯(PVAc)，聚氯乙烯(PVC)，羟丙基 甲基纤维素(HPMC)和甲基纤维素(MC)按质量比1:1:1:1:1:1混合配制 得到的聚合物。
[0048] 本发明还涉及灯盏乙素苷元晶型E，其特征在于所述晶型E在使用 Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下位 置处的主要特征吸收峰：9.6±0.2°、14.0±0.2°、15.3±0.2°、17.8±0.2°和26.6±0.2°。
[0049] 在本发明的一个实施方案中，所述晶型E在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度 表示的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收峰 中的一个或多个：10.2±0.2°、10.9±0.2°、16.1±0.2°、19.3±0.2°、21.2±0.2°、 28.5±0.2°、29.8±0.2°和31.1±0.2°等。
[0050] 在本发明的一个具体实施方案中，所述晶型E在使用Cu-Kα辐射，以2θ 角度表示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰： 9.6±0.2°、10.2±0.2°、10.9±0.2°、14.0±0.2°、15.3±0.2°、16.1±0.2°、17.8±0.2°、19.3±0.2°、21.2±0.2°、25.8±0.2°、26.6±0.2°、28.5±0.2°、29.8±0.2°和31.1±0.2°。
[0051] 在本发明的具体实施方案中，其典型的X射线粉末衍射图谱如图9所示。
[0052] 根据本发明任一项的晶型E，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 364.0±3.0℃。
[0053] 在本发明的具体实施方案中，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 364.0℃。
[0054] 在本发明的具体实施方案中，其典型的DSC图如图10所示。
[0055] 根据本发明任一项的晶型E，其纯度≥90％，优选≥95％。
[0056] 本发明还涉及本发明任一项的晶型E的制备方法，其包括以下步骤：
[0057] 取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)加热至250-350℃(例如300℃)， 然后自然降至室温后，即获得灯盏乙素苷元晶型E。
[0058] 本发明还涉及灯盏乙素苷元铵盐晶型，其特征在于所述铵盐晶型在使 用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下 位置处的主要特征吸收峰：9.0±0.2°、10.5±0.2°、14.9±0.2°、23.6±0.2°和 26.6°±0.2°。
[0059] 在本发明的一个实施方案中，所述铵盐晶型在使用Cu-Kα辐射，以2θ角 度表示的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收 峰中的一个或多个：6.4±0.2°、12.8±0.2°、13.8±0.2°、15.3±0.2°、22.7±0.2°、 25.7±0.2°、27.7±0.2°、29.1±0.2°和32.0±0.2°等。
[0060] 在本发明的一个具体实施方案中，所述铵盐晶型在使用Cu-Kα辐射，以 2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰： 6.4±0.2°、9.0±0.2°、10.5±0.2°、12.8±0.2°、13.8±0.2°、14.9±0.2°、15.3±0.2°、 17.1±0.2°、18.2±
0.2°、22.7±0.2°、23.6±0.2°、25.7±0.2°、26.6°±0.2°、27.7±0.2°、 29.1±0.2°、30.1±0.2°、32.0±0.2°、34.8±0.2°和37.8±0.2°。
0.2°、22.7±0.2°、23.6±0.2°、25.7±0.2°、26.6°±0.2°、27.7±0.2°、 29.1±0.2°、30.1±0.2°、32.0±0.2°、34.8±0.2°和37.8±0.2°。
[0061] 在本发明的具体实施方案中，其X射线粉末衍射图谱如图19所示。
[0062] 根据本发明任一项的铵盐晶型，其为水合物。
[0063] 本发明还涉及本发明任一项的铵盐晶型的制备方法，其为方法(1)或(2)：
[0065] (2)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入氨水，并加入丙酮得 到悬浮液，在室温条件下搅拌4-8天(例如6天)，离心分离固体得到灯盏 乙素苷元铵盐晶型和灯盏乙素苷元晶型A的混合物。
[0066] 本发明还涉及灯盏乙素苷元晶型B，其特征在于所述晶型B在使用 Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下位 置处的主要特征吸收峰：7.2±0.2°、9.9±0.2°、14.6±0.2°、15.7±0.2°和26.2±0.2°。
[0067] 在本发明的一个实施方案中，所述晶型B在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度 表示的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收峰 中的一个或多个：11.2±0.2°、14.1±0.2°、18.9±0.2°、20.8±0.2°、25.0±0.2°和 28.0±0.2°等。
[0068] 在本发明的一个具体实施方案中，所述晶型B在使用Cu-Kα辐射，以2θ 角度表示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰： 7.2±0.2°、9.9±0.2°、11.2±0.2°、14.1±0.2°、14.6±0.2°、15.7±0.2°、18.9±0.2°、 20.8±0.2°、22.0±0.2°、25.0±0.2°、26.2±0.2°、28.0±0.2°和35.5±0.2°。
[0069] 在本发明的具体实施方案中，其典型的X射线粉末衍射图谱如图3所示。
[0070] 根据本发明任一项的晶型B，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 361.6±3.0℃。
[0071] 在本发明的具体实施方案中，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 361.6℃。
[0072] 在本发明的具体实施方案中，其DSC图如图4所示。
[0073] 根据本发明任一项的晶型B，其纯度≥90％，优选≥95％。
[0074] 本发明还涉及本发明任一项的晶型B的制备方法，其为方法(1)或(2) 或(3)：
[0075] (1)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入吡啶-水(体积比例如 为3：1)混合溶剂中，使样品完全溶解得到澄清溶液，所得溶液在室温条 件下缓慢挥发，挥干溶剂后即得灯盏乙素苷元晶型B；
[0076] (2)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入吡啶-乙腈(体积比例 如为3：1)混合溶剂中，使样品完全溶解得到澄清溶液，所得溶液在室温 条件下缓慢挥发，挥干溶剂后即得灯盏乙素苷元晶型B。
[0077] (3)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入吡啶-乙酸乙酯(体积 比例如为3：1)混合溶剂中，使样品完全溶解得到澄清溶液，所得溶液在 室温条件下缓慢挥发，挥干溶剂后即得灯盏乙素苷元晶型B。
[0078] 本发明还涉及灯盏乙素苷元晶型C，其特征在于所述晶型C在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下位 置处的特征吸收峰：7.2±0.2°、14.6±0.2°、19.5±0.2°、20.6±0.2°和25.0±0.2°。
[0079] 在本发明的一个实施方案中，所述晶型C在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度 表示的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收峰 中的一个或多个：9.2±0.2°、16.4±0.2°、16.9±0.2°、17.7±0.2°、18.2±0.2°、18.9±0.2°、 21.5±0.2°、22.0±0.2°、22.8±0.2°、25.7±0.2°、27.0±0.2°、27.7±0.2°、28.7±0.2°、 29.3±0.2°和
32.4±0.2°等。
32.4±0.2°等。
[0080] 在本发明的一个具体实施方案中，所述晶型C在使用Cu-Kα辐射，以2θ 角度表示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰： 7.2±0.2°、9.2±0.2°、10.0±0.2°、10.6±0.2°、10.9±0.2°、14.6±0.2°、15.0±0.2°、 15.9±0.2°、16.1±0.2°、16.4±0.2°、17.6±0.2°、18.2±0.2°、18.9±0.2°、19.5±0.2°、 20.3±0.2°、20.7±
0.2°、21.5±0.2°、22.0±0.2°、22.9±0.2°、23.7±0.2°、24.6±0.2°、 24.9±0.2°、25.8±0.2°、27.0±0.2°、27.7±0.2°、28.7±0.2°、32.4±0.2°、35.5±0.2° 和38.0±0.2°。
0.2°、21.5±0.2°、22.0±0.2°、22.9±0.2°、23.7±0.2°、24.6±0.2°、 24.9±0.2°、25.8±0.2°、27.0±0.2°、27.7±0.2°、28.7±0.2°、32.4±0.2°、35.5±0.2° 和38.0±0.2°。
[0081] 在本发明的具体实施方案中，其典型的X射线粉末衍射图谱如图5所示。
[0082] 根据本发明任一项的晶型C，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 363.2±3.0℃。
[0083] 在本发明的具体实施方案中，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 363.2℃。
[0084] 在本发明的具体实施方案中，其典型的DSC图如图6所示。
[0085] 根据本发明任一项的晶型C，其纯度≥90％，优选≥95％。
[0086] 本发明还涉及本发明任一项的晶型C的制备方法，其为方法(1)或(2)：
[0087] (1)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入吡啶，使固体完全溶解， 然后缓慢加入庚烷，析出的沉淀或者在室温下挥发后得到的固体即为灯盏乙 素苷元晶型C；
[0088] (2)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入吡啶，使固体完全溶解， 然后缓慢加入到庚烷中，析出的沉淀或者在室温下挥发后得到的固体即为灯 盏乙素苷元晶型C。
[0089] 本发明还涉及灯盏乙素苷元晶型F，其特征在于所述晶型F在使用 Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下位 置处的特征吸收峰：18.1±0.2°、31.7±0.2°和37.3±0.2°。
[0090] 在本发明的一个具体实施方案中，所述晶型F在使用Cu-Kα辐射，以2θ 角度表示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰： 18.1±0.2°、18.3±0.2°、31.7±0.2°和37.3±0.2°。
[0091] 在本发明的具体实施方案中，其典型的X射线粉末衍射图谱如图11所示。
[0092] 根据本发明任一项的晶型F，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 328.4±3.0℃。
[0093] 在本发明的具体实施方案中，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 328.4℃。
[0094] 在本发明的具体实施方案中，其典型的DSC图如图12所示。
[0095] 本发明还涉及本发明任一项的晶型F的制备方法，其包括以下步骤：
[0096] 取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入正己烷或者甲苯得到悬浮液， 在室温(RT)和40-60℃(例如50℃)条件下搅拌4-8天(例如6天)，离心 分离固体得到晶型A和晶型F的混合物。
[0097] 本发明还涉及灯盏乙素苷元晶型G，其特征在于所述晶型G在使用 Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下位 置处的主要特征吸收峰：8.3±0.2°、14.3±0.2°、18.2±0.2°、20.7±0.2°和23.6±0.2°。
[0098] 在本发明的一个实施方案中，晶型G在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示 的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收峰中的 一个或多个：7.2±0.2°、10.9±0.2°、15.8±0.2°、16.7±0.2°、22.4±0.2°、24.8±0.2°、 25.7±0.2°和27.7±
0.2°等。
0.2°等。
[0099] 在本发明的一个具体实施方案中，晶型G在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度 表示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰：6.8±0.2°、 7.2±0.2°、8.3±0.2°、9.9±0.2°、10.9±0.2°、14.2±0.2°、15.8±0.2°、16.7±0.2°、 18.2±0.2°、20.4±
0.2°、20.7±0.2°、21.9±0.2°、22.3±0.2°、23.6±0.2°、24.8±0.2°、 25.7±0.2°、27.7±0.2°、28.9±0.2°、30.9±0.2°、32.2±0.2°和37.7±0.2°。
0.2°、20.7±0.2°、21.9±0.2°、22.3±0.2°、23.6±0.2°、24.8±0.2°、 25.7±0.2°、27.7±0.2°、28.9±0.2°、30.9±0.2°、32.2±0.2°和37.7±0.2°。
[0100] 在本发明的具体实施方案中，其典型的X射线粉末衍射图谱如图13所示。
[0101] 根据本发明任一项的晶型G，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 358.8±3.0℃。
[0102] 在本发明的具体实施方案中，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 358.8℃。
[0103] 在本发明的具体实施方案中，其典型的DSC图如图14所示。
[0104] 根据本发明任一项的晶型G，其纯度≥90％，优选≥95％。
[0105] 本发明还涉及本发明任一项的晶型G的制备方法，方法1或者方法2：
[0106] (1)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入吡啶/庚烷(体积比例 如为1：1)混合溶剂，得到澄清溶液，加入混合聚合物至澄清溶液中，所得 溶液在室温条件下缓慢挥发，获得灯盏乙素苷元晶型G。
[0107] (2)取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，加入吡啶/甲醇(体积比例 如为3：1)或者吡啶/1,4-二氧六环(体积比例如为3：1)或者吡啶/甲基叔丁 基醚(体积比例如为3：1)或者吡啶/2-甲基四氢呋喃(体积比例如为3：1) 或者吡啶/甲苯(体积比例如为3：1)或者吡啶，得到澄清溶液，加入混合聚 合物至澄清溶液中，所得溶液在室温条件下缓慢挥发，获得灯盏乙素苷元晶 型G。
[0108] 在本发明的实施方案中，所述混合聚合物是指聚乙烯吡咯烷酮(PVP)， 聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯乙酸酯(PVAc)，聚氯乙烯(PVC)，羟丙基 甲基纤维素(HPMC)和甲基纤维素(MC)按质量比1:1:1:1:1:1混合配制 得到的聚合物。
[0109] 本发明还涉及灯盏乙素苷元晶型H，其特征在于所述晶型H在使用 Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下位 置处的特征吸收峰：7.4±0.2°、14.8±0.2°、19.1±0.2°、21.0±0.2°和25.0±0.2°。
[0110] 在本发明的一个实施方案中，所述晶型H在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度 表示的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收峰 中的一个或多个：10.1±0.2°、10.9±0.2°、11.5±0.2°、16.2±0.2°、19.8±0.2°、 22.2±0.2°、23.2±0.2°、27.7±0.2°和29.0±0.2°等。
[0111] 在本发明的一个具体实施方案中，所述晶型H在使用Cu-Kα辐射，以2θ 角度表示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰： 7.4±0.2°、10.1±0.2°、10.9±0.2°、11.5±0.2°、13.7±0.2°、14.8±0.2°、15.7±0.2°、 16.2±0.2°、17.2±0.2°、18.6±0.2°、19.1±0.2°、19.8±0.2°、20.2±0.2°、21.0±0.2°、 21.7±0.2°、22.2±
0.2°、23.2±0.2°、23.9±0.2°、25.0±0.2°、25.5±0.2°和26.0±0.2°。
0.2°、23.2±0.2°、23.9±0.2°、25.0±0.2°、25.5±0.2°和26.0±0.2°。
[0112] 在本发明的具体实施方案中，其典型的X射线粉末衍射图谱如图15所示。
[0113] 根据本发明任一项的晶型H，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 364.4±3.0℃。
[0114] 在本发明的具体实施方案中，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 364.4℃。
[0115] 在本发明的具体实施方案中，其典型的DSC图如图16所示。
[0116] 本发明还涉及本发明任一项的晶型H的制备方法，其包括以下步骤：
[0117] 取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，溶于吡啶/乙酸乙酯(体积比例 如为3：1)混合溶剂中，在室温敞口挥发，得到晶型D；将得到的晶型D 溶于吡啶/乙酸乙酯(体积比例如为3：1)中，室温挥发，得到晶型H。
[0118] 本发明还涉及灯盏乙素苷元晶型I，其特征在于所述晶型I在使用Cu-Kα 辐射，以2θ角度表示的X射线粉末衍射图谱中，至少具有约为以下位置处的 主要特征吸收峰：6.9±0.2°、15.6±0.2°、19.9±0.2°、22.3±0.2°和26.8±0.2°。
[0119] 在本发明的一个实施方案中，所述晶型I在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表 示的X射线粉末衍射图谱中，还具有选自约为以下位置处的特征吸收峰中 的一个或多个：21.0±0.2°、25.8±0.2°和26.3±0.2°等。
[0120] 在本发明的一个实施方案中，所述晶型I在使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表 示的X射线粉末衍射图谱中，具有约为以下位置处的特征吸收峰：6.6±0.2°、 6.9±0.2°、7.0±0.2°、12.8±0.2°、14.0±0.2°、15.6±0.2°、15.7±0.2°、17.0±0.2°、 19.0±0.2°、19.9±0.2°、21.0±0.2°、21.7±0.2°、22.0±0.2°、22.3±0.2°、23.2±0.2°、 25.8±0.2°、
26.3±0.2°、26.8±0.2°、27.7±0.2°、28.2±0.2°和29.0±0.2°。
26.3±0.2°、26.8±0.2°、27.7±0.2°、28.2±0.2°和29.0±0.2°。
[0121] 在本发明的具体实施方案中，其典型的X射线粉末衍射图谱如图17所示。
[0122] 根据本发明任一项的晶型I，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 362.1±3.0℃。
[0123] 在本发明的具体实施方案中，其利用差示扫描量热法测定的熔点约为 362.1℃。
[0124] 在本发明的具体实施方案中，其典型的DSC图如图18所示。
[0125] 本发明还涉及本发明任一项的晶型I的制备方法，其包括以下步骤：
[0126] 取灯盏乙素苷元固体(例如晶型A)，溶于吡啶/乙酸乙酯(体积比例 如为3：1)混合溶剂中，室温挥发，得到晶型I。
[0127] 本发明还涉及本发明任一项的晶型A、晶型D、晶型E、晶型F，其为无 水物。
[0128] 本发明还涉及本发明任一项的晶型B、晶型C、晶型G、晶型H、晶型I， 其为溶剂合物，例如为吡咯合物。
[0129] 本发明还涉及药物组合物，其含有选自本发明任一项的晶型A、晶型B、 晶型C、晶型D、晶型E、晶型F、晶型G、晶型H、晶型I、铵盐晶型中的至 少一种，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
[0130] 本发明还涉及本发明任一项的晶型A、晶型B、晶型C、晶型D、晶型E、 晶型F、晶型G、晶型H、晶型I、铵盐晶型在制备预防和/或治疗心脑血管疾病 (例如闭塞性脑血管所致后遗瘫痪、冠心病、心绞痛)、风湿性关节炎、中 风后遗症、肾病综合征、糖尿病性肾病、慢性肾小球肾炎等肾脏疾病，抗结 核药物性肝损伤、急性黄疸性肝炎、慢性肝炎、顽固性肝硬化腹水等肝脏疾 病、慢性阻塞性肺疾病急性加重期合并低氧血症，糖尿病周围神经病变、糖 尿病足等糖尿病慢性并发症，视网膜震荡伤、缺血性视神经病变、眼中心性 浆液性视网膜病变等眼科疾病、突发性耳聋或胎儿生长受限等疾病的药物中 的用途。
[0131] 本发明还涉及预防和/或治疗心脑血管疾病(例如闭塞性脑血管所致后遗 瘫痪、冠心病、心绞痛)、风湿性关节炎、中风后遗症、肾病综合征、糖尿 病性肾病、慢性肾小球肾炎等肾脏疾病，抗结核药物性肝损伤、急性黄疸性 肝炎、慢性肝炎、顽固性肝硬化腹水等肝脏疾病、慢性阻塞性肺疾病急性加 重期合并低氧血症，糖尿病周围神经病变、糖尿病足等糖尿病慢性并发症， 视网膜震荡伤、缺血性视神经病变、眼中心性浆液性视网膜病变等眼科疾病、 突发性耳聋或胎儿生长受限等疾病的方法，所述方法包括给有需要的受试者 预防和/或治疗有效量的本发明任一项的晶型A、晶型B、晶型C、晶型D、晶 型E、晶型F、晶型G、晶型H、晶型I、铵盐晶型的步骤。
[0133] 本发明的灯盏乙素苷元的各种多晶型可以单独使用，或与可药用的载体 或赋形剂一起以药物组合物的形式使用，当以药物组合物的形式使用时，通 常将有效剂量的本发明的灯盏乙素苷元晶型以及一种或多种可药用载体或 稀释剂结合制成适当的施用形式或剂量形式，这一程序包括通过合适的方式 将组分混合、粒化、压缩或溶解。
[0134] 本发明药用组合物可以以下方面的任意方式施与:口服、喷雾吸入、直肠 给药、鼻腔给药、阴道给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌内、 腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器 用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。
[0135] 本发明的药物组合物中含有的药用载体包括但不局限于:离子交换剂，氧 化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘 油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电 解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化 硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钩， 聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛醋等.载体在药物组合物中的含量可以是1重量％～98 重量％，通常大约占到80重量％，为方便起见，局部麻醉剂，防腐剂，缓冲 剂等可直接溶于载体中。
[0136] 口服制剂如口服片剂和胶囊可以含有赋形剂如粘合剂，如糖浆，阿拉伯 胶，山梨醇，黄芪胶，或聚乙烯吡咯烷酮，填充剂，如乳糖，蔗糖，玉米淀 粉，磷酸钙，山梨醇，氨基乙酸，润滑剂，如硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇， 硅土，崩解剂，如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐.片剂 可以用制药学上公知的方法包衣。
[0137] 口服液形式的本发明药物组合物可以制成水和油的悬浮液，溶液，乳浊 液，糖浆或酏剂，也可以制成干品，用前补充水或其它合适的媒质。这种液 体制剂可以包含常规的添加剂，如悬浮剂，山梨醇，纤维素甲醚，葡萄糖糖 浆，凝胶，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，硬脂酸铝凝胶，氢化的食用油脂， 乳化剂，如卵磷脂，山梨聚醣单油酸盐，阿拉伯树胶；或非水载体(可能包含 可食用油)，如杏仁油，油脂如甘油，乙二醇，或乙醇；防腐剂，如对羟基苯 甲酸甲酯或丙酯，山梨酸.如需要可添加调味剂或着色剂。栓剂可包含常规， 的栓剂基质，如可可黄油或其它甘油酯。非肠道给药，液态剂型通常由化合 物和至少一种消毒或无茵的载体制成。载体首选水。依照所选载体和药物浓 度的不同，化合物既可溶于载体中也可制成悬浮溶液，在制成注射用溶液时 先将化合物溶于水中，过滤消毒后装入封口瓶或安瓿中。
[0138] 当皮肤局部施用时，本发明化合物可以制成适当的软膏，洗剂，或霜剂 的形式，其中活性成分悬浮或溶解于一种或多种的载体中。其中软膏制剂可 以使用的载体包括但不局限于:矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚 氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蜡和水；洗剂和霜剂可使用的载体包括但不限于: 矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温60，十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇， 2-辛基十二烷醇，苄醇和水。依据给药方式的不同，组合物中可以含有重量 比0.1％，或更合适的重量比10-60％的活性组分.但组合物为单位剂型时，每 个单位最好包含50～500毫克活性成分.依据给药途径和给药频率的不同，用 于成人的适宜治疗剂量，举例讲可为每天100-3000毫克，如每天1500毫克。
[0139] 必须认识到，灯盏乙素苷元多晶型的最佳给药剂量和间隔是由疾病或症 状的严重程度、化合物性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特 定哺乳动物等条件决定的，而这一最佳给药剂量可由临床医生来确定。
[0140] 本发明提供的灯盏乙素苷元结构式如下：
[0141]
[0142] 该化合物的化学名为5,6,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-4H-苯并吡喃-4-酮。
[0143] 在本发明中，所述熔点是指DSC测试中起始熔化(onset)的温度。
[0144] 在本发明中，所获得的灯盏乙素苷元晶型的纯度≥90％(重量百分比)， 例如≥95％(重量百分比)。
[0145] 在本发明中，所述晶型的纯度是指除去例如其它多晶型或无定形形式的 灯盏乙素苷元等及其它杂质后该晶型的含量，其测量方法例如是通过HPLC测 量的。
[0146] 在本发明中，各晶型X射线粉末衍射图谱中吸收峰的位置可以在上述公 开的具体数值±0.2°的范围内，例如在±0.1°的范围内，差示扫描量热法测定 的熔点可以在上述公开的具体数值±3.0℃的范围内。
[0147] 在本发明中，所述“约为”多少数值是指该围绕该数值的90％-110％范围 内，例如95％-105％范围内。
[0148] 应当理解用不同类型设备或用不同的测试条件可能给出稍微不同的熔 点读数。不同晶型熔点的正确值将受化合物纯度、样品重量、加热速度、 粒径和测试设备的校验和维修的影响。所提供的数值不能作为绝对值。
[0149] 应当理解用不同类型设备或用不同的测试条件可能给出稍微不同的 XRPD的图谱和峰值。不同晶型的图谱、峰值和各衍射峰的相对强度将受 化合物纯度、样品的前处理、扫描速度、粒径和测试设备的校验和维修的 影响。所提供的数值不能作为绝对值。
[0150] 发明的有益效果
[0151] 现代药效学与药动学研究结果表明，口服灯盏乙素后在体内真正的吸收 形式是灯盏乙素苷元(傅晓钟,张伟,王永林,兰燕宇,王爱民,周雯,黄勇,李靖,邢 凤晶,刘影.灯盏乙素苷元4'-L-氨基酸衍生物的设计、合成与抗氧化活性[J]. 药学学报,2011,05:548-555.)，因此，以灯盏乙素苷元作为原料药进行制剂的 开发具有口服吸收好、生物利用度更高的优点。
[0153] 图1灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图
[0154] 图2灯盏乙素苷元晶型A的TGA和DSC图
[0155] 图3灯盏乙素苷元晶型B的XRPD图
[0156] 图4灯盏乙素苷元晶型B的TGA和DSC图
[0157] 图5灯盏乙素苷元晶型C的XRPD图
[0158] 图6灯盏乙素苷元晶型C的TGA和DSC图
[0159] 图7灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图
[0160] 图8灯盏乙素苷元晶型D的TGA和DSC图
[0161] 图9灯盏乙素苷元晶型E的XRPD图
[0162] 图10灯盏乙素苷元晶型E的TGA和DSC图
[0163] 图11灯盏乙素苷元晶型F的XRPD图
[0164] 图12灯盏乙素苷元晶型F的DSC图
[0165] 图13灯盏乙素苷元晶型G的XRPD图
[0166] 图14灯盏乙素苷元晶型G的TGA和DSC图
[0167] 图15灯盏乙素苷元晶型H的XRPD图
[0168] 图16灯盏乙素苷元晶型H的TGA和DSC图
[0169] 图17灯盏乙素苷元晶型I的XRPD图
[0170] 图18灯盏乙素苷元晶型I的TGA和DSC图
[0171] 图19灯盏乙素苷元铵盐水合物晶型的XRPD图
[0172] 图20灯盏乙素苷元铵盐水合物晶型的TGA和DSC图
[0173] 图21晶型A和晶型C的1H-NMR对比谱图
[0174] 图22晶型A和晶型H的1H-NMR对比谱图
具体实施方式
[0175] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技 术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明 的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规 产品。
[0176] 缩略语：
[0177] XRPD-x ray powder diffraction x射线粉末衍射(也叫XRD)
[0178] TGA-Thermogravimetric Analysis热重分析
[0179] DSC-differential scanning calorimetry差示扫描量热法
[0180] RT-room temperature室温
[0181] GC－gas chromatography气相色谱分析法
[0182] HNMR－Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectra核磁共振氢谱
[0183] X射线粉末衍射测试条件：
[0184] XRPD图谱在PANalytical Empyrean X射线粉末衍射分析仪上采集，典 型的XRPD参数表1所示。
[0185] 表1 X射线粉末衍射测试条件
[0186]
[0187] 热重分析和差示扫描量热法测试条件：
[0188] 热重分析和差示扫描量热法分别在TA Q500热重分析仪和TA Q200 差示扫描量热仪上采集，表2列出了典型的参数。
[0189] 表2 热重分析和差示扫描量热法测试条件
[0190]
[0191] 以下实施例中的典型样品是指利用一定方法制备得到的该晶型样品中 进一步挑选出的结晶度好、纯度高、溶残小，熔点明确的晶型样品。
[0192] 实施例1 灯盏乙素苷元晶型A的制备
[0193] 称取100克灯盏乙素(购自云南植物药业有限公司)，投入5000ml圆 底烧瓶中，加入4000ml丙二醇或乙二醇，搅拌并加热至回流，保温回流使 灯盏乙素全溶解；向溶液中缓慢滴加5％盐酸溶液20ml；继续回流6-16小时， 水解反应完成。溶液冷却，析出大量沉淀，过滤，滤饼分别以丙二醇或乙二 醇、水洗涤，干燥、粉碎，即得灯盏乙素苷元晶型A，含量(HPLC测定) 不低于96％。
[0194] 按照该方法制备得到的晶型A典型的XRPD图见图1，其图谱峰值信息 见表3，典型的TGA及DSC图见图2，其熔点为366.1℃(从DSC判读其 熔程为366.1℃-368.6℃)。
[0195] 表3 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0196]
[0197]
[0198] 通过悬浮搅拌，缓慢降温，反溶剂添加，反向反溶剂添加，液-固气相渗 透，离子液体诱导结晶，湿度诱导，湿法研磨等方法均可以得到晶型A。
[0199] 方法1：室温下称量约15mg晶型A样品至1.5mL玻璃瓶中，分别加 入0.5mL水或者乙醇或者醋酸或者乙腈或者甲基异丁酮或者四氢呋喃或者 乙酸异丙酯或者甲基叔丁基醚或者1,4二氧六环或者乙二醇/水(体积为例如 1:1)混合溶剂或者丙二醇/水(体积为例如1:1)混合溶剂或者聚乙二醇400/ 庚烷(体积为例如1:1)混合溶剂或者甲基吡咯烷酮/水(体积为例如1:1)混 合溶剂或者甲基吡咯烷酮/水(体积为例如1:1)混合溶剂或者二甲亚砜/水(体 积为例如1:1)混合溶剂或者二甲基甲酰胺/水(体积为例如1:1)混合溶剂得 到悬浮液，在室温(RT)磁力搅拌6天，离心分离固体。或者在50℃下， 称量约15mg晶型A样品至
1.5mL玻璃瓶中，分别加入0.5mL水或者 乙醇或者醋酸或者丙酮或者甲基异丁酮或者四氢呋喃或者乙酸异丙酯或者甲 基叔丁基醚或者1,4二氧六环或者乙二醇/水(体积为例如1:
1)混合溶剂或 者丙二醇/水(体积为例如1:1)混合溶剂或者聚乙二醇400/庚烷(体积为例 如1:1)混合溶剂或者甲基吡咯烷酮/水(体积为例如1:1)混合溶剂或者甲基 吡咯烷酮/水(体积为例如1:1)混合溶剂或者二甲亚砜/水(体积为例如1:1) 混合溶剂或者二甲基甲酰胺/水(体积为例如1:1)混合溶剂得到悬浮液，磁 力搅拌6天，离心分离固体得到晶型A。
1.5mL玻璃瓶中，分别加入0.5mL水或者 乙醇或者醋酸或者丙酮或者甲基异丁酮或者四氢呋喃或者乙酸异丙酯或者甲 基叔丁基醚或者1,4二氧六环或者乙二醇/水(体积为例如1:
1)混合溶剂或 者丙二醇/水(体积为例如1:1)混合溶剂或者聚乙二醇400/庚烷(体积为例 如1:1)混合溶剂或者甲基吡咯烷酮/水(体积为例如1:1)混合溶剂或者甲基 吡咯烷酮/水(体积为例如1:1)混合溶剂或者二甲亚砜/水(体积为例如1:1) 混合溶剂或者二甲基甲酰胺/水(体积为例如1:1)混合溶剂得到悬浮液，磁 力搅拌6天，离心分离固体得到晶型A。
[0200] 方法2：称量约15mg晶型A样品至1.5mL玻璃瓶中，分别加入0.5 mL丙酮得到悬浮液，在室温下磁力搅拌6天，离心分离固体。或者称量约 15mg晶型A样品至1.5mL玻璃瓶中，分别加入0.5mL乙腈得到悬浮液， 在50℃磁力搅拌6天，离心分离固体。该两种方法可以制备得到晶型A和 晶型D的混晶。
[0201] 加入丙酮得到晶型A和晶型D，其图谱峰值信息见表4。
[0202] 表4 灯盏乙素苷元晶型A和晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0203]
[0204]
[0205] 加入乙腈得到晶型A和晶型D，其图谱峰值信息见表5。
[0206] 表5 灯盏乙素苷元晶型A和晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0207]
[0208]
[0209] 方法3：称量约15mg晶型A样品至1.5mL玻璃瓶中，分别加入0.5 mL己烷或甲苯得到悬浮液，在室温下或者50℃磁力搅拌6天，离心分离固 体得到晶型A和晶型F的混晶。
[0210] 以己烷为溶剂，在室温磁力搅拌6天得到晶型A和晶型F，其图谱峰值 信息见表6。
[0211] 表6 灯盏乙素苷元晶型A和晶型F的XRPD图谱峰值信息
[0212]
[0213] 以甲苯为溶剂，室温下搅拌6天，得到晶型A和晶型F，其图谱峰值信 息见表7。
[0214] 表7灯盏乙素苷元晶型A和晶型F的XRPD图谱峰值信息
[0215]
[0216] 以己烷为溶剂，在50℃磁力搅拌6天得到晶型A和晶型F，其图谱峰 值信息见表8。
[0217] 表8 灯盏乙素苷元晶型A和晶型F的XRPD图谱峰值信息
[0218]
[0219] 以甲苯为溶剂，在50℃磁力搅拌6天得到晶型A和晶型F，其图谱峰 值信息见表9。
[0220] 表9 灯盏乙素苷元晶型A和晶型F的XRPD图谱峰值信息
[0221]
[0222] 方法4：称量约20mg晶型A样品至1.5mL玻璃瓶中，分别加入0.5 mL二甲亚砜/乙醇(体积为例如1:5)混合溶剂或者二甲亚砜/四氢呋喃(体 积为例如1:5)混合溶剂或者甲基吡咯烷酮/甲基叔丁基醚(体积为例如1:5) 混合溶剂或者甲基吡咯烷酮/乙酸乙酯(体积为例如1:5)混合溶剂或者二甲 基甲酰胺/丙酮(体积为例如1:5)混合溶剂或者二甲基甲酰胺/乙腈(体积为 例如1:5)混合溶剂，在50℃平衡30min后降温3天降至5℃，在5℃悬 浮搅拌2天后离心分离固体得到晶型A。
[0223] 以二甲亚砜/乙醇(体积为例如1:5)为溶剂得到晶型A，其图谱峰值信 息见表10。
[0224] 表10 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0225]
[0226] 以二甲亚砜/四氢呋喃(体积为例如1:5)为溶剂得到晶型A，其图谱峰 值信息见表11。
[0227] 表11灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0228]
[0229] 以甲基吡咯烷酮/甲基叔丁基醚(体积为例如1:5)为溶剂得到晶型A， 其图谱峰值信息见表12。
[0230] 表12 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0231]
[0232]
[0233] 以甲基吡咯烷酮/乙酸乙酯(体积为例如1:5)为溶剂得到晶型A，其图 谱峰值信息见表13。
[0234] 表13 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0235]
[0236] 以二甲基甲酰胺/丙酮(体积为例如1:5)为溶剂得到晶型A，其图谱峰 值信息见表14。
[0237] 表14 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0238]
[0239]
[0240] 以二甲基甲酰胺/乙腈(体积为例如1:5)为溶剂得到晶型A，其图谱峰 值信息见表15。
[0241] 表15 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0242]
[0243] 方法5：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，加入0.2 mL甲基吡咯烷酮，使固体完全溶解，然后缓慢滴加0.2～2mL水，如果有 沉淀析出，将沉淀分离。如果未有沉淀析出，则在室温条件下快速挥发。或 者是0.2ml二甲亚砜中，以甲醇或者丙酮作为反溶剂可以获得晶型A。或者 0.2ml二甲基甲酰胺中，以水作为反溶剂可以得到晶型A和晶型D的混合物。
[0244] 以二甲基甲酰胺为溶剂，水为反溶剂得到晶型A和晶型D，其图谱峰值 信息见表16。
[0245] 表16 灯盏乙素苷元晶型A和晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0246]
[0247]
[0248] 方法6：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，放置于 恒定湿度(相对湿度32.8％或者57.6％或者75.3％或者97.3％)的容器内， 室温储存11天，得到晶型A。
[0249] 放置于相对湿度32.8％得到晶型A，其图谱峰值信息见表17。
[0250] 表17 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0251]
[0252] 放置于相对湿度57.6％得到晶型A，其图谱峰值信息见表18。
[0253] 表18 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0254]
[0255] 放置于相对湿度75.3％得到晶型A，其图谱峰值信息见表19。
[0256] 表19 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0257]
[0258] 放置于相对湿度97.3％得到晶型A，其图谱峰值信息见表20。
[0259] 表20 灯盏乙素苷元晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0260]
[0261]
[0262] 方法7：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，加入0.2 mL甲基吡咯烷酮，使固体完全溶解，然后缓慢滴加到水中，如果有沉淀析 出，将沉淀分离。如果未有沉淀析出，则在室温条件下快速挥发。或者是0.2ml 二甲亚砜中，以甲醇或者丙酮作为反溶剂可以得到晶型A。或者0.2ml二甲 基甲酰胺中，以水作为反溶剂可以得到晶型A。
[0263] 方法8：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL的玻璃瓶中，将3 mL小瓶敞口置于装有3mL二氯甲烷或者乙醇或者甲醇或者甲苯或者乙腈 或者四氢呋喃或者二甲基甲酰胺或者丙酮的20mL密闭玻璃瓶中，室温条件 下避光放置13天后取出固体得到晶型A。
[0264] 方法9：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，分别 加入0.4～0.5mL二甲亚砜/四氢呋喃(体积比为2:1)混合溶剂或者二甲亚 砜/乙醇(体积比为2:1)混合溶剂或者二甲基甲酰胺/乙腈(体积为例如2:1) 混合溶剂，得到澄清溶液，加入约3.0mg的离子液体([Bmim]PF6或者 [Bmim]BF4或者[Bmim]Br，其中Bmim：1-丁基-3-甲基咪唑阳离子。)至澄 清溶液中。所得溶液在室温条件下缓慢挥发，得到晶型A。
[0265] 方法10：称量约15mg的灯盏乙素苷元晶型A至玛瑙研钵中，添加约 10μL异丙醇或者醋酸或者乙腈或者丙酮或者乙酸异丙酯，研磨15min， 得到晶型A。
[0266] 实施例2灯盏乙素苷元晶型B的制备
[0267] 称量约10mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，分别加入0.5～1.25mL吡啶/水(体积比3:1)或吡啶/乙腈(体积比3:1)或吡啶/乙酸乙酯(体 积比3:1)，确保样品完全溶解得到澄清溶液。所得的溶液在室温条件下缓慢 挥发，挥干溶剂后得到晶型B。
[0268] 方法1：以吡啶/水(体积比3:1)为溶剂得到晶型B，其图谱峰值信息见表 21。
[0269] 表21 灯盏乙素苷元晶型B的XRPD图谱峰值信息
[0270]
[0271] 方法2：以吡啶/乙腈(体积比3:1)为溶剂得到晶型B，其图谱峰值信息见 表22。
[0272] 表22 灯盏乙素苷元晶型B的XRPD图谱峰值信息
[0273]
[0274] 方法3：以吡啶/乙酸乙酯(体积比3:1)为溶剂得到晶型B，其图谱峰值信 息见表23。
[0275] 表23 灯盏乙素苷元晶型B的XRPD图谱峰值信息
[0276]
[0277] 利用方法3制备得到的晶型B典型的XRPD图见图3，其图谱峰值信息 见表24，典型的TGA和DSC图见图4，晶型B的熔程为(361.6℃-368.3℃)， 其熔点为361.6℃。
[0278] 表24 灯盏乙素苷元晶型B的XRPD图谱峰值信息
[0279]
[0280]
[0281] 实施例3 灯盏乙素苷元晶型C的制备
[0282] 方法1：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，加入0.2 mL吡啶，使固体完全溶解，然后缓慢滴加0.2～2mL庚烷到吡啶溶液，如 果有沉淀析出，将沉淀分离得到固体样品。如果未有沉淀析出，则在室温条 件下快速挥发，得到晶型C，其图谱峰值信息见表25。
[0283] 表25 灯盏乙素苷元晶型C的XRPD图谱峰值信息
[0284]
[0285]
[0286] 方法2：称量约15mg的灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，加入 0.2mL吡啶，使固体完全溶解。将以上澄清溶液缓慢滴加至5℃庚烷，如果 有沉淀析出，将沉淀分离得到固体样品。如果未有沉淀析出，进行室温条件 下快速挥发试验，得到晶型C，其图谱峰值信息见表26。
[0287] 表26 灯盏乙素苷元晶型C的XRPD图谱峰值信息
[0288]
[0289] 利用方法1制备得到的晶型C典型的XRPD图见图5，其图谱峰值信息 见表27，典型的TGA和DSC图见图6，晶型C的熔程为(363.2℃-369.9℃)， 其熔点为363.2℃。
[0290] 表27 灯盏乙素苷元晶型C的XRPD图谱峰值信息
[0291]
[0292] 实施例4 灯盏乙素苷元晶型D的制备
[0293] 方法1：称量约10mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，加入 0.5～1.25mL吡啶/丙酮(体积比3:1)或吡啶/庚烷(体积比3:1)混合溶剂， 确保样品完全溶解得到澄清溶液。所得的溶液在室温条件下缓慢挥发，挥干 溶剂后得到的固体为晶型D。
[0294] 以吡啶/丙酮(体积比3:1)为溶剂得到晶型D，其图谱峰值信息见表28。
[0295] 表28 灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0296]
[0297] 以吡啶/庚烷(体积比3:1)为溶剂得到晶型D，其图谱峰值信息见表29。
[0298] 表29 灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0299]
[0300] 方法2：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，加入0.2 mL吡啶，使固体完全溶解，然后缓慢滴加0.2～2mL乙醇，如果有沉淀析 出，将沉淀分离得到固体样品。如果未有沉淀析出，则在室温条件下快速挥 发。或者是0.2ml二甲基甲酰胺中，以四氢呋喃作为反溶剂可以得到晶型D。
[0301] 以吡啶为正溶剂，乙醇为反溶剂得到晶型D，其图谱峰值信息见表30。
[0302] 表30 灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0303]
[0304] 以二甲基甲酰胺为正溶剂，四氢呋喃为反溶剂得到晶型D，其图谱峰值 信息见表31。
[0305] 表31 灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0306]
[0307]
[0308] 方法3：称取约500mg灯盏乙素苷元晶型A置于20mL小瓶中，加2.5mL 吡啶溶解澄清(磁力搅拌)，滴加14.5mL乙醇至吡啶溶液中，样品析出后 离心得到晶型D.
[0309] 方法4：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，加入到 0.2mLN-甲基吡咯烷酮，使固体完全溶解。将以上澄清溶液缓慢滴加至5℃ 乙腈中，如果有沉淀析出，将沉淀分离得到固体样品。如果未有沉淀析出， 进行室温条件下快速挥发试验进行制备。以上溶剂和反溶剂组合还可以采用 吡啶/乙醇或者是二甲基甲酰胺/四氢呋喃，均可以获得晶型D。
[0310] 采用N-甲基吡咯烷酮/乙腈得到晶型D，其图谱峰值信息见表32。
[0311] 表32 灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0312]
[0313]
[0314] 采用吡啶/乙醇得到晶型D，其图谱峰值信息见表33。
[0315] 表33 灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0316]
[0317] 采用二甲基甲酰胺/四氢呋喃得到晶型D，其图谱峰值信息见表34。
[0318] 表34 灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0319]
[0320] 方法5：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，分别加 入0.5～1.0mL二甲基甲酰胺/丁酮(体积比1：1)，得到澄清溶液，加入约1.5 mg的混合聚合物(混合高聚物：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)， 聚乙烯乙酸酯(PVAc)，聚氯乙烯(PVC)，羟丙基甲基纤维素(HPMC) 和甲基纤维素(MC)按质量比1:1:1:1:1:1混合配制)至澄清溶液中。所得 溶液在室温条件下缓慢挥发，获得晶型D，其图谱峰值信息见表35。
[0321] 表35 灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0322]
[0323]
[0324] 方法6：称量约15mg晶型A样品至1.5mL玻璃瓶中，分别加入0.5 mL丙酮得到悬浮液，在室温下磁力搅拌6天，离心分离固体。或者称量约 15mg晶型A样品至1.5mL玻璃瓶中，分别加入0.5mL乙腈得到悬浮液， 在50℃磁力搅拌6天，离心分离固体得到晶型D和晶型A的混晶。
[0325] 加入丙酮得到悬浮液，在室温下磁力搅拌6天得到晶型D和晶型A，其 其图谱峰值信息见表36。
[0326] 表36 灯盏乙素苷元晶型D和晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0327]
[0328]
[0329] 加入乙腈得到悬浮液，在50℃磁力搅拌6天得到晶型D和晶型A，其 其图谱峰值信息见表37。
[0330] 表37 灯盏乙素苷元晶型D和晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0331]
[0332]
[0333] 方法7：称量约15mg晶型A样品至3mL玻璃瓶中，加入0.2mL二 甲基甲酰胺使固体完全溶解，然后缓慢滴加0.2-2ml的水，离心分离固体得 到晶型D和晶型A的混晶，其其图谱峰值信息见表38。
[0334] 表38 灯盏乙素苷元晶型D和晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0335]
[0336] 利用方法4以N-甲基甲酰胺作为溶剂，乙腈作为反溶剂制备得到的晶型 D典型的XRPD图见图7，其图谱峰值信息见表39。典型的TGA和DSC图 见图8，晶型D的熔程为(363.2℃-369.7℃)，其熔点为363.2℃。
[0337] 表39 灯盏乙素苷元晶型D的XRPD图谱峰值信息
[0338]
[0339]
[0340] 实施例5 灯盏乙素苷元晶型E的制备
[0341] 方法1：晶型A样品在TGA中加热至300℃，维持5-10min，并自然降 至室温后可以获得晶型E的固体，其其图谱峰值信息见表40。
[0342] 表40 灯盏乙素苷元晶型E的XRPD图谱峰值信息
[0343]
[0344]
[0345] 方法2：晶型D样品置于TGA仪器中，以10℃/min从室温加热至330℃ 后平衡3min，在N2保护下自然降至室温后取出，得到晶型E。
[0346] 利用方法1制备得到的晶型E典型的XRPD图见图9，其图谱峰值信息 见表41。晶型E典型的TGA和DSC图见图10，晶型E的熔程为(364.0℃ -369.2℃)，其熔点为364.0℃。
[0347] 表41 灯盏乙素苷元晶型E的XRPD图谱峰值信息
[0348]
[0349] 实施例6 灯盏乙素苷元晶型F的制备
[0350] 方法1：称量约15mg晶型A样品至1.5mL玻璃瓶中，加入0.5mL正 己烷或者甲苯得到悬浮液，在室温下磁力搅拌6天，离心分离固体得到晶型 A和晶型F的混合物。或者上述悬浮液在50℃下磁力搅拌6天可以获得类 似结果。
[0351] 加入正己烷得到悬浮液，在室温下磁力搅拌6天，得到晶型F和晶型A， 其其图谱峰值信息见表42。
[0352] 表42 灯盏乙素苷元晶型F和晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0353]
[0354] 加入甲苯得到悬浮液，在室温下磁力搅拌6天，得到晶型F和晶型A， 其其图谱峰值信息见表43。
[0355] 表43 灯盏乙素苷元晶型F和晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0356]
[0357]
[0358] 加入正己烷得到悬浮液，在50℃下磁力搅拌6天，得到晶型F和晶型 A，其其图谱峰值信息见表44。
[0359] 表44 灯盏乙素苷元晶型F和晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0360]
[0361] 加入甲苯得到悬浮液，在50℃下磁力搅拌6天，得到晶型F和晶型A， 其其图谱峰值信息见表45。
[0362] 表45 灯盏乙素苷元晶型F和晶型A的XRPD图谱峰值信息
[0363]
[0364] 方法2：由悬浮搅拌得到的晶型A和晶型F的混合物加热至370℃后 降至室温后得到。
[0365] 利用方法2制备得到的晶型F典型的XRPD图见图11，其图谱峰值信 息见表46。晶型F典型的DSC图见图12，晶型F的熔程为(328.4℃-331.5℃)， 其熔点为328.4℃。
[0366] 表46 灯盏乙素苷元晶型F的XRPD图谱峰值信息
[0367]
[0368] 实施例7 灯盏乙素苷元晶型G的制备
[0369] 方法1：称量约15mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，加入0.5 ～1.0mL吡啶/庚烷(体积比1:1)，得到澄清溶液，加入约1.5mg的混合聚合 物(混合高聚物：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯乙 酸酯(PVAc)，聚氯乙烯(PVC)，羟丙基甲基纤维素(HPMC)和甲基 纤维素(MC)按质量比1:1:1:1:1:1混合配制)至澄清溶液中。所得溶液在 室温条件下缓慢挥发，获得晶型G，其图谱峰值信息见表47。
[0370] 表47 灯盏乙素苷元晶型G的XRPD图谱峰值信息
[0371]
[0372]
[0373] 方法2：称量约10mg灯盏乙素苷元晶型A至3mL玻璃瓶中，加入 0.5～1.25mL吡啶或者吡啶/甲醇(体积比3:1)或者吡啶/1,4-二氧六环(体积比 3:1)或者吡啶/甲基叔丁基醚(体积比3:1)或者吡啶/2-甲基四氢呋喃(体积比3:1) 或者吡啶/甲苯(体积比3:1)混合溶剂，确保样品完全溶解得到澄清溶液。所 得的溶液在室温条件下缓慢挥发，挥干溶剂后得到的固体得到晶型G。
[0374] 加入吡啶得到晶型G，其图谱峰值信息见表48。
[0375] 表48 灯盏乙素苷元晶型G的XRPD图谱峰值信息
[0376]
[0377] 加入吡啶/甲醇(体积比3:1)得到晶型G，其图谱峰值信息见表49。
[0378] 表49 灯盏乙素苷元晶型G的XRPD图谱峰值信息
[0379]
[0380]
[0381] 加入吡啶/1,4-二氧六环(体积比3:1)得到晶型G，其图谱峰值信息见表50。
[0382] 表50 灯盏乙素苷元晶型G的XRPD图谱峰值信息
[0383]
[0384]
[0385] 加入吡啶/甲基叔丁基醚(体积比3:1)得到晶型G，其图谱峰值信息见表 51。
[0386] 表51 灯盏乙素苷元晶型G的XRPD图谱峰值信息
[0387]
[0388] 加入吡啶/2-甲基四氢呋喃(体积比3:1)得到晶型G，其图谱峰值信息 见表52。
[0389] 表52 灯盏乙素苷元晶型G的XRPD图谱峰值信息
[0390]
[0391]
[0392] 加入吡啶/甲苯(体积比3:1)得到晶型G，其图谱峰值信息见表53。
[0393] 表53 灯盏乙素苷元晶型G的XRPD图谱峰值信息
[0394]
[0395] 利用方法1制备得到的晶型G典型的XRPD图见图13，其图谱峰值信 息见表54。典型的TGA和DSC图见图14，晶型G的熔程为(358.8℃-375.8℃) 和(367.2℃-383.1℃)，其熔点为358.8℃和367.2℃。
[0396] 表54 灯盏乙素苷元晶型G的XRPD图谱峰值信息
[0397]
[0398]
[0399] 实施例8灯盏乙素苷元晶型H的制备
[0400] 称量约100mg灯盏乙素苷元晶型A，溶于8mL吡啶/乙酸乙酯(3：1， v/v)中，在室温敞口挥发，得到晶型D。将得到的晶型D溶于2mL吡啶/ 乙酸乙酯(3：1，v/v)中，室温挥发3天，得到晶型H。其他方法获得的 晶型D也可以通过溶于2ml吡啶/乙酸乙酯(3:1，v/v)中，室温挥发3天得 到晶型H。
[0401] 晶型H典型的XRPD图见图15，其图谱峰值信息见表55。典型的TGA 和DSC图见图16，晶型H的熔程为(364.4℃-369.3℃)，其熔点为364.4℃。
[0402] 表55 灯盏乙素苷元晶型H的XRPD图谱峰值信息
[0403]
[0404]
[0405] 实施例9 灯盏乙素苷元晶型I的制备
[0406] 称量约50mg灯盏乙素苷元晶型A，溶于2mL吡啶/乙酸乙酯(3：1， v/v)中，置于室温挥发6天，得到晶型I。
[0407] 晶型I典型的XRPD图见图17，其图谱峰值信息见表56。典型的TGA 和DSC图见图18，晶型I的熔程为(362.1℃-368.9℃)，其熔点为362.1℃。
[0408] 表56 灯盏乙素苷元晶型I的XRPD图谱峰值信息
[0409]
[0410]
[0411] 实施例10 灯盏乙素苷元铵盐晶型的制备
[0412] 方法1：称量约20mg晶型A样品至1.5mL玻璃瓶中，按1:1摩尔比加入 氨水，并加入0.5mL丙酮得到悬浮液，在室温(RT)条件下磁力搅拌6天 (2天后检测固体中主要为游离酸晶型A)，离心分离固体为苷元晶型A和苷 元的铵盐晶型。
[0413] 方法2：或者是取500mg晶型A样品和17.5mL 0.1mol/L氨水至20mL小 瓶中。在室温悬浮搅拌约48h后离心分离固体测定XRPD，固体中仍然含有游 离酸晶型A。补加0.1mol/L氨水至初始体积继续搅拌。观察到氨水体积减少 就补加0.1mol/L氨水至初始体积继续搅拌，15天后完全转化为铵盐。添加 0.1mol/L氨水的总体积约为10mL。(0.1mol/L的氨水为浓氨水与丙酮配置得 到)。
[0414] 利用方法1制备得到的灯盏乙素苷元铵盐晶型典型的XRPD图见图19， 其图谱峰值信息见表57。铵盐晶型典型的TGA和DSC图见图20，未观察 到明显的熔点。
[0415] 表57 灯盏乙素苷元铵盐晶型的XRPD图谱峰值信息
[0416]
[0417] 实施例11 各晶型分析及高效液相检测结果
[0418] XRPD主要检测化合物的晶型情况，提供了化合物各种晶型的特征性衍 射峰信息。TGA分析检测了晶体在加热过程中失重情况，主要给出了样品是 否在溶剂合物的信息。
[0419] 通过TGA分析发现晶型A、D、E、F为无水晶型，其余晶型为溶剂合 物晶型，进一步GC和HNMR分析发现，其余晶型为吡咯合物晶型。
[0420] 晶型B：TGA结果显示晶型B加热至250℃有17.0％的失重，晶型B 样品GC结果显示有18.0％的吡啶，且加热脱去溶剂后转化为晶型D，说明 晶型B为吡啶溶剂合物。
[0421] 晶型C：TGA结果显示晶型C加热至250℃时有33.0％的失重，晶型 C样品GC结果显示约有36.4％的吡啶，且加热脱去溶剂后转化为晶型D， 说明晶型C为吡啶的溶剂合物。晶型C和晶型A的1H-NMR对比谱图见 图21，结果显示晶型C样品比晶型A样品多3个峰(7.39、7.79、8.58ppm)， 这3个峰为吡啶在氘代DMSO中的氢归属，同样说明晶型C样品为吡啶 溶剂合物，且晶型C样品中没有降解产物。
[0422] 晶型G：DSC和TGA结果表明晶型G在加热过程中可能由脱溶剂产 生吸热峰，其余吸热峰可能由转晶或熔化所致。TGA显示样品有24.5％的 失重。晶型G的GC结果表明其中含有吡啶，且加热脱去溶剂后转化为晶 型D，说明晶型G为吡啶溶剂合物。
[0423] 晶型H：晶型H的DSC和TGA图显示该样品在加热过程中有由脱溶 剂、转晶和熔化产生吸热峰，TGA显示～30.4％的失重。晶型H样品和晶型 A的1H-NMR对比谱图见图22，结果显示晶型H样品比晶型A样品多3个 峰(7.39、7.79、8.58ppm)，这3个峰为吡啶在氘代DMSO中的氢归属， 同时说明且晶型H样品中没有降解产物。晶型H加热脱去溶剂后转化为晶 型D，说明晶型H为吡啶溶剂合物。
[0424] 晶型I：晶型I的DSC和TGA图显示该样品在加热过程中由于脱溶剂、 转晶和熔化产生多个吸热峰，TGA显示样品有约34.2％的失重。晶型I的 GC结果表明其中含有吡啶，且加热脱去溶剂后转化为晶型D，说明晶型I为 吡啶溶剂合物。
[0425] DSC对样品的受热熔化温度进行监控，获得样品的熔点数据。
[0426] 高效液相检测发现，除晶型F、H、I外，其余晶型纯度高于95％。
[0427] 高效液相检测方法如表58所示：
[0428] 表58 高效液相检测方法
[0429]
[0430]
[0431] 高效液相检测结果如表59所示：
[0432] 表59 高效液相检测结果
[0433]晶型 保留时间(min) 纯度/％
晶型A 21.82 97.27
晶型B 21.97 94.32
晶型C 21.95 99.17
晶型D 21.83 96.94
晶型E 21.94 99.03
晶型F和晶型A 21.97 97.76
晶型G 21.93 95.48
晶型A 21.82 97.27
晶型B 21.97 94.32
晶型C 21.95 99.17
晶型D 21.83 96.94
晶型E 21.94 99.03
晶型F和晶型A 21.97 97.76
晶型G 21.93 95.48
[0434] 注：由于晶型F、H、I获得样品较少，未进行高效液相色谱分析。
[0435] 通过XRPD、TGA、DSC等多种检测手段可以对上述共10种晶型进行 定性的描述。
[0436] 在330℃左右，晶型A和晶型D可以转化为晶型E，而在室温到50℃下， 晶型A、D、E为稳定性最好的晶型。通过异丙醇中溶解度测定发现，溶解 性依次为晶型A＞晶型D＞晶型E。
[0437] 灯盏乙素苷元铵盐晶型为水溶剂合物，未检测到熔点。优点是，成盐后 苷元本身稳定性好，未观察到明显降解。
[0438] 实施例12 灯盏乙素苷元晶型A的活性测定
[0439] 1.实验材料
[0440] 受试药品：灯盏乙素苷元(以下简称苷元)：褐绿粉末，批号20120206， 其为晶型A，按照实施例1的方法制备得到。试验时使用剂量为45.8mg/kg (为临床拟用量的6倍)；
[0441] 试剂和试药：红四氮唑(TTC)，Sigma公司产品，批号120K5305；0.5％ 注射液，批号：12020604，昆明市宇斯药业有限责任公司生产。水合氯醛(批 号：T20061114，国药集团化学试剂有限公司)；MDA试剂盒(批号： 20120401)，SOD试剂盒(批号：20120401)，一氧化氮(NO)试剂盒(批号：20120401)，蛋白定量试剂盒(批号：20120401)，均由南京建成生物工程 研究所提供。
[0442] 实验仪器：
[0443] UV-2501紫外分光光度计(日本岛津公司生产)；Centrifuge 5810R型冷 冻离心机(德国eppendoff公司)；BS110型电子分析天平，(赛多利斯公司)； COOLPIXS550数码相机，尼康公司产品。MIAS医学图象分析系统(北京 航空航天大学图像中心)。
[0444] 实验动物及饲养条件
[0445] SD雄性大鼠，体重250±20g，广东省医学试验动物中心，动物合格证号： SCXK(粤)2008-0002。饲料许可证：SCXK(滇)20050009：饲养于本所天然 药物筛选研究中心动物实验室。动物实验室，温度：20～26℃(日温差≤4℃)； 湿度：40％～70％；换气次数：10～20次/h；气流速度：0.1～0.2m/s；噪音： ≤60dB；工作照度：150～300lx，动物照度：15～20lx；照明：12:12h明暗 交替。
[0446] 2.实验方法
[0447] 2.1模型制备
[0448] SD雄性大鼠，禁食一夜，自由饮水。试验当天腹腔注射35％水合氯醛 (350mg/kg)麻醉，仰卧位固定，沿颈正中线切开皮肤，暴露右侧颈总动脉， 分离颈内、外动脉，从颈外动脉游离端插入3#尼龙线(直径0.285mm)， 从颈外动脉远心端将尼龙线导入到颈内动脉，插至Willis环大脑中动脉处， 以有效阻断大脑中动脉，插入的尼龙线长度距颈总动脉分叉处18～20mm。 然后将颈外动脉游离端连同腔内尼龙线一并结扎，以防出血。逐层缝合皮下 筋膜和皮肤，局部滴加抗菌素防止感染。阻断大脑中动脉(MCAO)2h后， 小心抽出颈内动脉血管腔内的尼龙线，使颈内动脉再灌注，右侧上肢未见明 显偏瘫的大鼠从试验中剔除。动物按神经功能评分值分组。
[0449] 2.2给药方案.
[0450] 试验设3个组，每组15只动物。分别为假手术组、模型对照组、灯盏乙 素苷元(45.8mg/kg)组。假手术组和模型对照组给0.3％等容量的羧甲基纤 维素钠(CMC-Na)。假手术组、模型对照组、灯盏乙素苷元组均连续灌胃 给药4次，分别于再灌注后1h、12h、24h、36h各给药一次，大鼠灌胃给药 体积为1ml/100g。
[0451] 2.3观察指标
[0452] 2.3.1神经功能损害程度评定：分别于再灌注1h(给药前)、12h、24h、36h、48h根据下述附表评分标准，采用双盲法对动物进行行为障碍评分， 用于评价神经功能损害程度，总分为16分，分数越高，表明动物神经功能损 害程度越严重。(李茜，王秋娟，郭青龙.新型神经保护剂TQ0701-2对大鼠 脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学，2010，15(1)： 36-40.)
[0453] 2.3.2对48h梗死范围的影响。
[0454] 再灌注48h后，断头取脑，迅速冰冻，沿冠状面切成2mm厚的切片， 脑片放入1％TTC染液中，避光37℃温孵30min进行染色，10％甲醛溶 液固定一周后，采用数码相机成像系统将数字影象存储于计算机中，并用北 京航空航天大学图象中心的MIAS医学图像分析系统测量梗死区和全脑面积， 计算脑梗死范围(梗死区面积占全脑面积百分比)。
[0455] 统计方法
[0457] 3.实验结果
[0458] 3.1对神经功能损害的影响
[0459] 表60 灯盏乙素苷元对缺血/再灌注大鼠神经功能的影响( n＝15)
[0460]
[0461] 注：与假手术组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型对照组比较：﹡P＜0.05，﹡﹡P＜0.01.
[0462] 试验结果显示(表60)：大鼠栓线法造模后，与假手术比较，各组动物 均出现严重的神经功能障碍(P<0.01)，证明模型成功。灯盏乙素苷元 45.8mg/kg剂量给药后48h，动物的神经功能障碍明显改善,与模型对照组比 较具有显著意义(P<0.05)，改善率为34.97％。
[0463] 3.2对48h脑梗死范围的影响
[0464] 表61 灯盏乙素苷元对缺血/再灌注大鼠脑梗死范围的影响( n＝15)
[0465]
[0466]
[0467] 注：与假手术组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较：﹡P＜0.05，﹡﹡P＜0.01。
[0468] 试验结果显示(表61)：与模型对照组相比，灯盏乙素苷元45.8mg/kg 剂量可显著缩小MCAO缺血再灌注大鼠的脑梗死面积，缩小率为42.46％ (P<0.05)。
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