技术领域
[0001] 本
发明涉及一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针及其制备和成像方法，属于
生物检测技术领域。
背景技术
[0002] 胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是
哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占
蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。胶原蛋白因具有良好的
生物相容性、可
生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、
化妆品等领域获得广泛的应用。胶原蛋白是人体关键的结构和功能蛋白，是
皮肤、骨骼、肌
腱等结缔组织的主要成分，在细胞迁移、增殖、分化等基本的生命活动中发挥重要作用。胶原蛋白的过度降解，被发现与
肿瘤、关节炎等严重
疾病息息相关。肿瘤作为一种全球性疾病，发展周期长、致死率极高，因此，肿瘤的早期检测对于肿瘤的
治疗而言极为重要。胶原蛋白在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥直接作用，是肿瘤早期检测的重要生物标志物。因此，建立胶原蛋白的高效检测方法，对于肿瘤等疾病的
基础机理研究和诊断技术开发都非常关键。
[0003] 拉曼
光谱是一种散射光谱，它通过对与入射光
频率不同的散射光谱进行分析获得分子的振动、转动信息，用于分子结构的深度解析。与常用的
荧光方法相比，
拉曼散射显示出以下优点：首先，拉曼散射对
光漂白有抵抗
力，这使得拉曼
信号非常稳定并且可以用于长时间的样品分析；第二，拉曼信号的峰宽狭窄，允许它轻松地进行
多重检测；第三，拉曼信号可提供丰富的分子信息，可以揭示生物分子的指纹行为。因此，拉曼成像，作为一种新兴的检测方法，在化学、生物学和医学分析中的应用引起越来越多的关注。开发一种靶向识别胶原蛋白的拉曼成像方法，将为解析胶原相关疾病提供新的工具，为这些疾病的诊断和治疗提供新的机会。
发明内容
[0004] 由鉴于此，本发明提供了一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针及其制备和成像方法。本方法利用可以特异性结合胶原蛋白的多肽序列，结合增强拉曼信号的
纳米粒子和拉曼
信号分子开发的新型多肽探针，制备简单，检测方便，无生物毒性。该探针为体外组织和体内活体拉曼成像提供了新的工具，为肿瘤、等胶原蛋白相关疾病的深入研究提供了一种有竞争力的检测方法。
[0005] 本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
[0006] 本发明的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针，其包含一个可以靶向结合胶原蛋白的多肽序列；探针的N端为半胱
氨酸，帮助探针结合到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列之间通过一个小
片段连接，以避免纳米粒子干扰多肽序列靶向结合胶原蛋白；具有拉曼增强能力的纳米粒子上同时修饰拉曼信号分子，提供拉曼检测信号。
[0007] 一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其为以下步骤：1)固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽；2)将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；3)将多肽结合到已被信号分子修饰的纳米粒子上。
[0008] 一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的成像方法，体外组织成像方法为，使用多肽拉曼探针溶液对
组织切片进行
染色，在2-6℃孵育1-4hrs，吸去染色液后，1xPBS洗掉未结合的拉曼探针，使用拉曼
显微镜进行成像；体内活体成像方法为，将多肽拉曼探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。
[0009] 多肽拉曼探针的结构为Cys-Linker-X-Y-Z，其中，Cys为半胱氨酸，X为包含4-46个氨基酸的胶原蛋白靶向多肽，Linker为连接半胱氨酸和胶原蛋白靶向多肽的小片段；Y为具有拉曼增强能力的纳米粒子，Z为拉曼信号分子，X和Z均修饰在Y表面；连接半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列的小片段为6-氨基己酸、聚乙二醇、1-10个甘氨酸、聚乙烯中的至少一种；具有拉曼增强能力的纳米粒子为过渡金属纳米粒子和
半导体纳米基底及纳米粒子负载到三维结构物质上形成的SERS复合基底中的至少一种；信号分子为4-MBA、4-MBN、4-EBT、4-三甲基
硅基乙炔-苯硫酚、4-苯基乙炔基-苯硫酚、硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯中的至少一种。
[0010] 固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽的方法为：
[0011] a)将80-120mg的
树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
[0012] b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
[0013] c)将N端由Fmoc保护的氨基酸与HOBt和HBTU由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs，氨基酸、HOBt、HBTU与DIEA的摩尔比为4:4：4:6；
[0014] d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mLDMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
[0015] e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mLDMF和DCM洗2-4次；
[0016] f)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:
水的
质量比为90:5:5，反应1-6hrs；
[0017] g)向反应液加入
冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。
[0018] 将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的纳米粒子上的具体方法为，该信号分子通过巯基或氨基修饰到纳米粒子表面，首先将信号分子溶于DMSO配成100mM的溶液，取1mL纳米粒子与100uL信号分子溶液混合搅拌1-4hrs，使巯基配位到纳米粒子表面，然后12000rmp离心洗去多余信号分子，得到信号分子修饰的纳米粒子。
[0019] 将多肽结合到已被信号分子修饰的纳米粒子上的具体方法为：多肽通过N-端的半胱氨酸配位作用修饰到纳米粒子上，将多肽溶于水中配成2mM的溶液，取200uL修饰了信号分子的纳米粒子与400uL多肽溶液混合搅拌1-4hrs，确保半胱氨酸上的巯基配位到纳米离子表面，保证了多肽的成功修饰，然后12000rmp离心洗去多余多肽，得到多肽修饰的拉曼探针。
[0020] 组织切片为冰冻切片或
石蜡切片；在组织切片使用80-120μL多肽拉曼探针溶液染色，在2-6℃孵育1-4hrs，使用1xPBS洗掉未结合探针，使用拉曼显微镜观察拍照。
[0021] 组织切片为模型动物组织切片和病理组织切片，病理组织切片为良性肿瘤组织、
恶性肿瘤组织、骨科组织疾病、
纤维化组织、
炎症组织、增生组织、动脉粥样硬化组织、肝硬化组织、眼睛激光矫正手术术后组织、皮肤光损伤组织、皮肤热损伤组织、皮肤酸
碱腐蚀组织或
辐射损伤组织。
[0022] 胶原多肽拉曼探针在注射前先溶于已灭菌的含半胱氨酸的1XPBS中，实验活体为模型动物。
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] 1.因拉曼探针具有抗光漂白能力强、拉曼信号稳定、拉曼缝宽窄、可多重检测等优点，本发明研发的新型胶原蛋白靶向的多肽拉曼探针，为组织中胶原蛋白的检测提供了荧光成像等方法以外的一种高效的成像工具；
[0025] 2.本发明研发的新型胶原蛋白靶向的多肽拉曼探针，包括胶原蛋白靶向多肽，具有拉曼增强能力的纳米粒子和拉曼信号分子三部分，制备方法简单可靠；多肽拉曼探针溶液中分散性好，
稳定性高，使用方便，可长期使用，随时检测；
[0026] 3.该多肽拉曼探针使用具有特异性结合胶原蛋白能力的多肽序列，它与胶原蛋白的
抗体相比，稳定性好，特异性高，胶原蛋白的结合能力强，组织染色不需要封闭组织，染色时间短。
附图说明
[0027] 下面结合附图和
实施例对本发明作进一步描述。
[0028] 图1为本发明探针1的大鼠膀胱组织染色拉曼显微镜图；
[0029] 图2为本发明探针1的大鼠
耳朵组织染色拉曼显微镜图；
[0030] 图3为本发明探针2的大鼠膀胱组织染色拉曼显微镜图；
[0031] 图4为本发明探针2的大鼠尾巴组织染色拉曼显微镜图；
[0032] 图5为本发明的大鼠肌腱组织两种探针同时染色拉曼显微镜图；
[0033] 图6为本发明的大鼠尾巴组织两种探针同时染色拉曼显微镜图；
[0034] 图7为本发明的病人
肺癌组织两种探针同时染色拉曼显微镜图。
具体实施方式
[0035] 以下将结合附图对本发明进行详细说明，为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0036] 实施例1
[0037] (1)多肽拉曼探针的设计
[0038] 设计的多肽拉曼探针的特征包括:①、包含一个可以靶向结合胶原蛋白的多肽序列；②、探针的N端为半胱氨酸，以帮助探针结合到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；③、半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列之间通过一个小片段连接，以避免纳米粒子干扰多肽序列靶向结合胶原蛋白；④具有拉曼增强能力的纳米粒子上同时修饰拉曼信号分子，提供拉曼检测信号；
[0039] (2)多肽拉曼探针的制备
[0040] 包括：①、固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽；②、将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；③、将多肽结合到已被信号分子修饰的纳米粒子上；
[0041] (3)体外组织成像
[0042] 使用多肽拉曼探针溶液对组织切片进行染色，在2-6℃孵育1-4hrs，吸去染色液后，1x PBS洗掉未结合的拉曼探针，使用拉曼显微镜进行成像；
[0043] (4)体内活体成像
[0044] 将多肽拉曼探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。
[0045] 所述步骤(1)中多肽拉曼探针的结构为Cys-Linker-X-Y-Z，其中，Cys为半胱氨酸，X为包含4-46个氨基酸的胶原蛋白靶向多肽，Linker为连接半胱氨酸和胶原蛋白靶向多肽的小片段；Y为具有拉曼增强能力的纳米粒子，Z为拉曼信号分子，X和Z均修饰在Y表面。
[0046] 所述步骤(1)中多肽探针的胶原蛋白靶向序列来自于以下两个表中的多肽序列的一种或几种，该多肽序列包含4-46个氨基酸，可以靶向结合胶原蛋白。
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051] 所述步骤(1)中连接半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列的小片段为6-氨基己酸，聚乙二醇、1-10个甘氨酸、聚乙烯中的一种或几种。
[0052] 所述步骤(1)中具有拉曼增强能力的纳米粒子为金、
银、
铜等过渡金属纳米粒子和Zn0等半导体纳米基底及纳米粒子负载到半导体、
石墨烯等其他三维结构物质上形成的SERS复合基底中的一种或几种。
[0053] 所述步骤(1)中信号分子为4-MBA(4-巯基苯
甲酸)，4-MBN(4-巯基苯甲腈),4-EBT(4-乙炔基-苯硫酚),4-三甲基硅基乙炔-苯硫酚,4-苯基乙炔基-苯硫酚，R1(硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯)等中的一种或几种。
[0054] 所述步骤(2)中固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽的具体方法为：
[0055] a)将80-120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；
[0056] b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；
[0057] c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；
[0058] d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
[0059] e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；
[0060] f)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为90:5:5，反应1-6hrs；
[0061] g)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
[0062] 所述步骤(2)中将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的纳米粒子上的具体方法为，该信号分子通过巯基、羧基或氨基修饰到纳米粒子表面，首先将信号分子溶于DMSO配成100mM的溶液，取1mL纳米粒子与100uL信号分子溶液混合搅拌1-4hrs，确保巯基配位到纳米粒子表面，然后12000rmp离心洗去多余信号分子，得到信号分子修饰的纳米粒子。
[0063] 所述步骤(2)中将多肽结合到已被信号分子修饰的纳米粒子上的具体方法为：多肽通过N-端的半胱氨酸配位作用修饰到纳米粒子上，将多肽溶于水中配成2mM的溶液，取200uL修饰了信号分子的纳米粒子与400uL多肽溶液混合搅拌1-4hrs，确保半胱氨酸上的巯基配位到纳米离子表面，保证了多肽的成功修饰，然后12000rmp离心洗去多余多肽，得到多肽修饰的拉曼探针。
[0064] 所述步骤(3)中组织切片为冰冻切片或石蜡切片；在组织切片使用80-120μL多肽拉曼探针溶液染色，在2-6℃孵育1-4hrs，使用1x PBS洗掉未结合探针，使用拉曼显微镜观察拍照。
[0065] 所述步骤(3)中的组织切片，包括模型动物组织切片和病理组织切片。其中病理组织切片，可为良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、骨科组织疾病、纤维化组织、炎症组织、增生组织、动脉粥样硬化组织、肝硬化组织、眼睛激光矫正手术术后组织、皮肤光损伤组织、皮肤热损伤组织、皮肤酸碱腐蚀组织、辐射损伤组织等。
[0066] 所述步骤(4)中胶原多肽拉曼探针在注射前先溶于已灭菌的含半胱氨酸的1X PBS中，实验活体包括小鼠、大鼠、斑
马鱼、猴等各种模型动物。
[0067] 实施例2
[0068] (1)多肽拉曼探针的设计
[0069] 设计的多肽拉曼探针的特征包括:①、胶原蛋白靶向序列为(Gly-Pro-Hyp)7；②、多肽探针的N端为半胱氨酸，以帮助多肽结合到具有拉曼增强能力的Ag纳米粒子上；③、半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列之间通过6-氨基己酸(Ahx)连接，以避免纳米粒子干扰多肽序列靶向结合胶原蛋白；④、Ag纳米粒子上同时修饰拉曼信号分子4-MBN，提供拉曼检测信号；
[0070] (2)多肽拉曼探针的制备
[0071] 包括：①、固相合成胶原蛋白靶向多肽Cys-Ahx-(Gly-Pro-Hyp)7；②、将信号分子4-MBN修饰到具有Ag纳米粒子上；③、将多肽结合到已被4-MBN修饰的Ag纳米粒子上；
[0072] 其中，固相合成胶原蛋白靶向多肽Cys-Ahx-(Gly-Pro-Hyp)7的具体方法为：
[0073] 1.将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
[0074] 2.由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
[0075] 3.将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs。
[0076] 4.反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
[0077] 5.重复步骤3、4，直到合成目标序列的胶原多肽Cys-Ahx-(Gly-Pro-Hyp)7，显色反应检测反应完全，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次；
[0078] 6.树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝90:5:5)，反应3hrs；
[0079] 7.反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后
风干，得到粗肽。粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
[0080] 将信号分子4-MBN修饰到具有Ag纳米粒子上的具体方法为：首先将4-MBN溶于DMSO配成100mM的溶液，取1mL Ag纳米粒子与100uL 4-MBN溶液混合搅拌2hrs，确保巯基配位到纳米粒子表面，然后12000rmp离心洗去多余4-MBN，得到4-MBN修饰的纳米粒子。
[0081] 将多肽结合到已被4-MBN修饰的Ag纳米粒子上的具体方法为：将多肽溶于水中配成2mM的溶液，取200uL修饰了4-MBN的纳米粒子与400uL多肽溶液混合搅拌4hrs，确保半胱氨酸上的巯基配位到纳米离子表面，保证了多肽的成功修饰，然后12000rmp离心洗去多余多肽，得到多肽修饰的拉曼探针。
[0082] (3)体外组织成像
[0083] 鼠膀胱及鼠肌腱组织冰冻切片上加100μL 400pM多肽拉曼探针溶液分别及同时染色，4℃孵育2hrs。吸去染色液后，使用1x PBS洗涤5次，洗掉未结合探针。使用拉曼显微镜观察拍照，如图1和图2所示。
[0084] 实施例3
[0085] (1)多肽拉曼探针的设计
[0086] 设计的多肽拉曼探针的特征包括:①、胶原蛋白靶向序列为LRELHLNNNG；②、多肽的N端氨基酸为半胱氨酸，以帮助多肽结合到具有拉曼增强能力的Ag纳米粒子上；③、半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列之间通过6-氨基己酸(Ahx)连接，以避免纳米粒子干扰多肽序列靶向结合胶原蛋白；④、Ag纳米粒子上同时修饰拉曼信号分子R1，提供拉曼检测信号；
[0087] (2)多肽拉曼探针的制备
[0088] 包括：①、固相合成胶原蛋白靶向多肽Cys-Ahx-LRELHLNNNG；②、将信号分子R1修饰到具有Ag纳米粒子上；③、将多肽结合到已被R1修饰的Ag纳米粒子上；
[0089] 其中，固相合成胶原蛋白靶向多肽Cys-Ahx-LRELHLNNNG的具体方法为：
[0090] 1.将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
[0091] 2.由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
[0092] 3.将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs。
[0093] 4.反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
[0094] 5.重复步骤3、4，直到合成目标序列的胶原多肽Cys-Ahx-LRELHLNNNG，显色反应检测反应完全，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次；
[0095] 6.树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝90:5:5)，反应3hrs；
[0096] 7.反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到粗肽。粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；
[0097] 将信号分子R1修饰到具有Ag纳米粒子上的具体方法为：首先将R1溶于DMSO配成100mM的溶液，取1mL Ag纳米粒子与100uL R1溶液混合搅拌2hrs，确保巯基配位到纳米粒子表面，然后12000rmp离心洗去多余R1，得到R1修饰的纳米粒子。
[0098] 将多肽结合到已被R1修饰的Ag纳米粒子上的具体方法为：将多肽溶于水中配成2mM的溶液，取200uL修饰了R1的纳米粒子与400uL多肽溶液混合搅拌4hrs，确保半胱氨酸上的巯基配位到纳米离子表面，保证了多肽的成功修饰，然后12000rmp离心洗去多余多肽，得到多肽修饰的拉曼探针。
[0099] (3)体外组织成像
[0100] 鼠膀胱及鼠肌腱组织冰冻切片上加100μL 400pM多肽拉曼探针溶液分别染色，4℃孵育4hrs。吸去染色液后，使用1x PBS洗涤5次，洗掉未结合探针。使用拉曼显微镜观察拍照，如图3和图4所示。
[0101] 实施例4
[0102] (1)两种多肽拉曼探针的体外组织成像
[0103] 大鼠肌腱、大鼠尾巴组织以及病人肺癌组织冰冻切片上加100μL，各400pM的两种多肽拉曼探针溶液分别染色，4℃孵育4hrs。吸去染色液后，使用1x PBS洗涤5次，洗掉未结合探针。使用拉曼显微镜观察拍照，如图5、图6和图7所示。
[0104] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的
权利要求范围当中。
