1.研究TNFR1/MAP4K4/ARP3复合物在胶质瘤侵袭性生长机制的实验方法，其特征为，包括以下步骤：
步骤1，分析TNFR1与MAP4K4的相互作用及其机制，明确胶质瘤炎症微环境中，TNFR1招募并激活MAP4K4，从而促进胶质瘤侵袭性生长；
步骤2，分析MAP4K4与ARP3的相互作用及其机制，明确在胶质瘤进展中，MAP4K4通过磷酸化ARP3，激活ARP2/3复合物，促进肌动蛋白聚合及伪足形成，增强胶质瘤细胞的侵袭性；
步骤3，分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体的相互作用及其机制，明确胶质瘤炎症微环境中，TNFR1通过招募并激活MAP4K4，从而磷酸化ARP3，激活ARP2/3复合物，促进肌动蛋白聚合及伪足形成，增强胶质瘤细胞的侵袭性；
步骤4，利用胶质瘤临床病理标本及构建裸鼠胶质瘤脑内模型，在整体水平全面探讨分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体对胶质瘤在体内侵袭性生长的影响。
2.如权利要求1所述研究TNFR1/MAP4K4/ARP3复合物在胶质瘤侵袭性生长机制的实验方法，其特征为，所述步骤1包括：
(1)验证胶质瘤及正常脑组织中TNFR1与MAP4K4的表达，分析两者表达的相关性，及与临床病理因素包括患者病理级别、复发及预后的相关性；
(2)分别在胶质瘤组织、工具细胞及胶质瘤细胞中验证并分析TNFR1与MAP4K4的相互作用，并根据各自结构域特点分别构建截短突变质粒，明确其相互作用结构域；
(3)在TNF-α刺激下，干预TNFR1表达或TNFR1与MAP4K4相互作用，分别在胶质瘤细胞株及工具细胞中明确TNFR1与MAP4K4相互作用对MAP4K4磷酸化修饰的调节作用；
(4)在TNF-α刺激下，干预TNFR1表达或TNFR1与MAP4K4相互作用，分析TNFR1与MAP4K4相互作用对胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响；
(5)分别构建TNFR1过表达、小干扰及不与MAP4K4相互作用的突变细胞株，利用裸鼠构建胶质瘤脑内模型，明确TNFR1与MAP4K4的相互作用对动物模型中胶质瘤发生发展的影响；
所述步骤2包括：
(1)验证胶质瘤及正常脑组织中MAP4K4与ARP3的表达，分析两者表达的相关性，及与临床病理因素包括患者病理级别、复发及预后的相关性；
(2)分别在胶质瘤组织、工具细胞及胶质瘤细胞中验证并分析MAP4K4与ARP3相互作用，并根据各自结构域特点分别构建截短突变质粒，明确其相互作用结构域；(3)干预MAP4K4表达或MAP4K4与ARP3相互作用，分别在胶质瘤细胞株及工具细胞中明确MAP4K4与ARP3相互作用对ARP3磷酸化修饰的调节作用；
(4)干预MAP4K4表达或MAP4K4与ARP3相互作用，分析MAP4K4与ARP3相互作用对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迁移、侵袭能力的调节作用；
(5)分别构建MAP4K4过表达、小干扰及不与ARP3相互作用的突变细胞株，利用裸鼠构建胶质瘤脑内模型，明确MAP4K4与ARP3的相互作用对动物模型中胶质瘤发生发展的影响；
所述步骤3包括：
(1)工具细胞及胶质瘤细胞中验证TNFR1、MAP4K4及ARP3三者两两相互作用，并明确TNFR1与ARP3相互作用的结构域；
(2)分别在胶质瘤细胞及工具细胞中干预TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3复合物形成，明确TNFR1影响MAP4K4对APR3的磷酸化作用；
(3)分别在胶质瘤细胞及工具细胞中干预TNFR1/MAP4K4、TNFR1/ARP3及MAP4K4/ARP3复合物形成，明确TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、细胞伪足形成及细胞迁移、侵袭能力的影响；
所述步骤4包括：
(1)综合分析胶质瘤及正常脑组织中TNFR1、MAP4K4与ARP3表达的相关性及与临床相关因素包括患者病理级别、复发及预后的相关性；
(2)分别构建TNFR1、MAP4K4与ARP3过表达、小干扰的稳定细胞株，以1×108密度在脑立体定位仪下注射至裸鼠皮质内，构建裸鼠胶质瘤脑内模型；
(3)4周后收集脑组织，检测肿瘤形成的大小、重量等情况，并比较其与裸鼠生存率的关系，HE染色检测肿瘤侵袭情况；
(4)获取裸鼠肿瘤组织Western Blot及免疫组化检测TNFR1、MAP4K4与ARP3的表达情况；
(5)组织消化，原代细胞培养，重复步骤3，分析并验证TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体对裸鼠原代胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、细胞伪足形成及细胞迁移、侵袭能力的影响。
3.如权利要求2所述研究TNFR1/MAP4K4/ARP3复合物在胶质瘤侵袭性生长机制的实验方法，其特征为，所述步骤1还包括：
1)收集130例胶质瘤病例的病理组织石蜡标本，病例选择标准为：①有影像学明确诊断包括CT及核磁共振；②有术后病理明确诊断；③术前无放疗、化疗及激素治疗；④组织分型和病理分级参照《2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准》；收集40组胶质瘤术后新鲜癌组织及癌旁组织，结合临床作出明确的组织分型和病理分级诊断；另取10例因急性脑外伤行内减压术所得正常脑组织标本为对照；
2)通过Western Blot和免疫组化等方法，研究不同病理分级的胶质瘤组织、胶质瘤瘤体中心组织及周边组织中TNFR1与MAP4K4的蛋白表达情况，将蛋白表达情况与胶质瘤的临床因素进行相关性统计，分析TNFR1与MAP4K4表达的相关性及其表达与胶质瘤患者病理级别、复发及预后的相关性；
3)在体外，GST-pull down验证TNFR1与MAP4K4存在相互作用；
①构建His标记的TNFR1及GST标记的MAP4K4的原核表达载体，诱导体外表达，分离纯化His-TNFR1及GST-MAP4K4；
②将耦合有GST-MAP4K4的Glutathione Sepharose 4B与纯化的His-TNFR1共孵育，洗涤后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot检测His-TNFR1的表达，明确TNFR1在体外可以与MAP4K4相结合形成复合物；
4)HEK293T细胞中验证TNFR1与MAP4K4存在相互作用；
①构建Myc标记的MAP4K4及HA标记的TNFR1的真核表达载体，共转入HEK293T细胞，收集细胞蛋白，分别用HA及Myc抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测Myc-MAP4K4及HA-TNFR1的表达，明确TNFR1与MAP4K4的外源性相互作用；
②根据TNFR1与MAP4K4的分子结构的特征，构建TNFR1及MAP4K4的截短载体，将上述截短载体共转HEK293T细胞，免疫共沉淀联合Western Blot分析TNFR1与MAP4K4截短载体的相互作用，明确TNFR1与MAP4K4相互作用的结构域；
5)胶质瘤细胞中验证TNFR1与MAP4K4存在相互作用；
①收集H4、U87-MG及U251胶质瘤细胞，通过Western Blot在蛋白水平检测TNFR1与MAP4K4的表达；收集H4、U87-MG及U251胶质瘤细胞，通过RT-PCR在mRNA水平检测TNFR1与MAP4K4的表达；选择低表达的细胞株用于过表达实验，选择高表达的细胞株用于小干扰实验；
②选取TNFR1与MAP4K4表达差异显著的胶质瘤细胞株，收集细胞蛋白，分别用TNFR1及MAP4K4的抗体进行免疫共沉淀，并以同型IgG作为对照，Western Blot检测MAP4K4及TNFR1的表达，明确在胶质瘤细胞株中TNFR1与MAP4K4的内源性相互作用；
③固定胶质瘤细胞株，分别用TNFR1与MAP4K4的特异性抗体进行免疫标记，激光共聚焦显微镜下观察胶质瘤细胞中TNFR1与MAP4K4的定位情况，分析胶质瘤细胞株中TNFR1与MAP4K4的相互作用；
6)胶质瘤细胞中检测TNFR1与MAP4K4的相互作用对MAP4K4磷酸化修饰的调节及其机制；选取高表达TNFR1的胶质瘤细胞系，予以干扰TNFR1表达；低表达TNFR1的胶质瘤细胞系，予以过表达TNFR1，同时予以TNF-α50ng/mL刺激48h，对照组不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，用TNFR1抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测TNFR1与MAP4K4相互作用的改变，及MAP4K4及p-MAP4K4的表达；
7)HEK293T细胞中检测TNFR1与MAP4K4的相互作用对MAP4K4磷酸化修饰的调节及其机制；
①将Myc标记的MAP4K4及浓度不同的HA标记的TNFR1表达载体共转染HEK293T细胞，同时予以TNF-α50ng/mL刺激48h，对照组不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，用HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测TNFR1与MAP4K4相互作用的改变，及MAP4K4及p-MAP4K4的表达；
②将Myc标记的MAP4K4分别与HA标记的TNFR1及其截短突变表达载体共转染HEK293T细胞，予以TNF-α50ng/mL刺激48h，对照组不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，用HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测MAP4K4及p-MAP4K4的表达；
8)在TNF-α刺激下，检测TNFR1及MAP4K4各自对胶质瘤细胞迁移和侵袭性的调节作用；
利用先前构建的TNFR及MAP4K4的过表达或小干扰质粒，转染胶质瘤细胞株，将细胞接种至Lamin包被的培养板上，予或不予TNF-α刺激，利用细胞划痕实验构建胶质瘤细胞迁移模型；
接种至包被有Matrigel的8um孔径的Transwel l小室上构建侵袭模型，检测不同细胞的迁移及侵袭的能力；
9)在TNF-α刺激下，检测干预TNFR1与MAP4K4的相互作用对MAP4K4及TNFR1各自调节胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响；在胶质瘤细胞中共转TNFR1的过表达载体或小干扰质粒及MAP4K4的过表达载体或小干扰质粒，通过细胞划痕及Transwell侵袭实验，检测不同细胞的迁移及侵袭的能力；
8
10)分别构建TNFR1过表达、小干扰及不与MAP4K4相互作用的稳定细胞株，以1×10 密度在脑立体定位仪下注射至裸鼠皮质内，构建裸鼠胶质瘤脑内模型；4周后收集脑组织，检测肿瘤形成的大小、重量等情况，并比较其与裸鼠生存率的关系，HE染色检测肿瘤侵袭情况；
获取裸鼠肿瘤组织Western Blot及免疫组化检测TNFR1及MAP4K4的表达情况；组织消化，原代细胞培养，重复实验步骤1中(3)及(4)，验证并分析TNFR1与MAP4K4的相互作用对裸鼠原代胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的影响；
所述步骤2还包括：1)收集130例胶质瘤病例的病理组织石蜡标本，病例选择标准为：①有影像学明确诊断包括CT及核磁共振；②有术后病理明确诊断；③术前无放疗、化疗及激素治疗；④组织分型和病理分级参照《2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准》；收集40组胶质瘤术后新鲜癌组织及癌旁组织，结合临床作出明确的组织分型和病理分级诊断；另取10例因急性脑外伤行内减压术所得正常脑组织标本为对照；
2)通过Western Blot和免疫组化等方法，研究不同病理分级的胶质瘤组织、胶质瘤瘤体中心组织及周边组织中MAP4K4与ARP3的蛋白表达情况，将蛋白表达情况与胶质瘤的临床因素进行相关性统计，分析MAP4K4与ARP3表达的相关性及其表达与胶质瘤患者病理级别、复发及预后的相关性；
3)在体外，GST-pul l down验证MAP4K4与ARP3存在相互作用；
①构建His标记的ARP3及GST标记的MAP4K4的原核表达载体，诱导体外表达，分离纯化His-ARP3及GST-MAP4K4；
②将耦合有GST-MAP4K4的Glutathione Sepharose 4B与纯化的His-ARP3共孵育，洗涤后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot检测His-ARP3的表达，明确ARP3在体外可以与MAP4K4相结合形成复合物；
4)HEK293T细胞中验证MAP4K4与ARP3存在相互作用；
①构建Myc标记的MAP4K4及Flag标记的ARP3的真核表达载体，共转入HEK293T细胞，收集细胞蛋白，用Flag及Myc抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测Myc-MAP4K4及Flag-ARP3的表达，明确MAP4K4与ARP3的外源性相互作用；
②根据MAP4K4与ARP3的分子结构的特征，构建MAP4K4及ARP3的截短载体，将上述截短载体共转HEK293T细胞，免疫共沉淀联合Western Blot分析MAP4K4与ARP3截短载体的相互作用，明确MAP4K4与ARP3相互作用的结构域；
5)胶质瘤细胞中验证MAP4K4与ARP3存在相互作用；
①收集H4、U87-MG及U251胶质瘤细胞，通过Western Blot在蛋白水平检测MAP4K4与ARP3的表达；收集H4、U87-MG及U251胶质瘤细胞，通过RT-PCR在mRNA水平检测MAP4K4与ARP3的表达；选择低表达的细胞株用于过表达实验，选择高表达的细胞株用于小干扰实验；
②选取MAP4K4与ARP3表达差异显著的胶质瘤细胞株，收集细胞蛋白，分别用MAP4K4与ARP3的抗体进行免疫共沉淀，并以同型IgG作为对照，Western Blot检测MAP4K4与ARP3的表达，明确在胶质瘤细胞株中MAP4K4与ARP3的内源性相互作用；
③固定胶质瘤细胞株，分别用MAP4K4与ARP3的特异性抗体进行免疫标记，激光共聚焦显微镜下观察胶质瘤细胞中MAP4K4与ARP3的定位情况，分析胶质瘤细胞株中MAP4K4与ARP3的相互作用；
6)胶质瘤细胞中检测MAP4K4与ARP3的相互作用对ARP3磷酸化修饰的调节及其机制；
选取高表达MAP4K4的胶质瘤细胞系，予以干扰TNFR1表达；低表达MAP4K4的胶质瘤细胞系，予以过表达MAP4K4，收集细胞蛋白，用MAP4K4抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测MAP4K4与ARP3相互作用的改变，及ARP3和p-ARP3的表达；
7)HEK293T细胞中检测MAP4K4与ARP3的相互作用对ARP3磷酸化修饰的调节及其机制；
①将Flag标记的ARP3及浓度不同的Myc标记的MAP4K4表达载体共转染HEK293T细胞，收集细胞蛋白，用Myc抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测MAP4K4与ARP3相互作用的改变，及ARP3和p-ARP3的表达；
②将Flag标记的ARP3分别与Myc标记的MAP4K4及其截短突变表达载体共转染HEK293T细胞，收集细胞蛋白，用Myc抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达；
8)检测MAP4K4及ARP3各自对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迁移、侵袭能力的调节作用；
利用先前构建的MAP4K4及ARP3的过表达或小干扰质粒，转染胶质瘤细胞株，用免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变；免疫荧光及光镜技术检测细胞伪足生长的改变；
细胞划痕Transwel l侵袭实验，检测不同细胞的迁移及侵袭的能力；
9)检测干预MAP4K4及ARP3的表达对ARP3及MAP4K4各自调节胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迁移、侵袭能力的影响；
在胶质瘤细胞中共转MAP4K4的过表达载体或小干扰质粒及ARP3的过表达载体及小干扰质粒，用免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变；免疫荧光及光镜技术检测细胞伪足生长的改变；细胞划痕Transwell侵袭实验，检测不同细胞的迁移及侵袭的能力；
10)分别构建MAP4K4过表达、小干扰及不与ARP3相互作用的稳定细胞株，以1×108密度在脑立体定位仪下注射至裸鼠皮质内，构建裸鼠胶质瘤脑内模型；4周后收集脑组织，检测肿瘤形成的大小、重量等情况，并比较其与裸鼠生存率的关系，HE染色检测肿瘤侵袭情况；
获取裸鼠肿瘤组织Western Blot及免疫组化检测MAP4K4及ARP3的表达情况；组织消化，原代细胞培养，重复实验步骤2中(3)及(4)，验证并分析MAP4K4与ARP3的相互作用对裸鼠原代胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的影响；
所述步骤3还包括：1)在体外，GST-pull down验证TNFR1与ARP3存在相互作用；
①构建His标记的ARP3及GST标记的TNFR1的原核表达载体，诱导体外表达，分离纯化His-ARP3及GST-TNFR1；
②将耦合有GST-TNFR1的Glutathione Sepharose 4B与纯化的His-ARP3共孵育，洗涤后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot检测His-ARP3的表达，明确ARP3在体外可以与TNFR1相结合形成复合物；
2)HEK293T细胞中验证TNFR1与ARP3存在相互作用；
①构建HA标记的TNFR1及Flag标记的ARP3的真核表达载体，共转入HEK293T细胞，收集细胞蛋白，用Flag及HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测HA-TNFR1及Flag-ARP3的表达，明确TNFR1与ARP3的外源性相互作用；
②根据TNFR1与ARP3的分子结构的特征，构建TNFR1及ARP3的截短载体，将上述截短载体共转HEK293T细胞，免疫共沉淀联合Western Blot分析TNFR1与ARP3截短载体的相互作用，明确TNFR1与ARP3相互作用的结构域；
3)胶质瘤细胞中验证TNFR1与ARP3存在相互作用；
①选取TNFR1与ARP3表达差异显著的胶质瘤细胞株，收集细胞蛋白，分别用TNFR1与ARP3的抗体进行免疫共沉淀，并以同型IgG作为对照，Western Blot检测TNFR1与ARP3的表达，明确在胶质瘤细胞株中TNFR1与ARP3的内源性相互作用；
③固定胶质瘤细胞株，分别用TNFR1与ARP3的特异性抗体进行免疫标记，激光共聚焦显微镜下观察胶质瘤细胞中TNFR1与ARP3的定位情况，分析胶质瘤细胞株中TNFR1与ARP3的相互作用；
4)胶质瘤细胞中检测TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用对MAP4K4及ARP3磷酸化修饰的调节及其机制；
①选取高表达TNFR1的胶质瘤细胞系，干扰TNFR1表达；低表达TNFR1的胶质瘤细胞系，过表达TNFR1，予或不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，用TNFR1抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达；
②选取高表达TNFR1的胶质瘤细胞系，干扰TNFR1表达；低表达TNFR1的胶质瘤细胞系，过表达TNFR1，予或不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，检测MAP4K4及p-MAP4K4表达的变化；
③若上一个步骤②中MAP4K4的表达有变化，在②的基础上，干预MAP4K4的表达，用TNFR1抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达是否改变；
5)HEK293T细胞中检测TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用对MAP4K4及ARP3磷酸化修饰的调节及其机制；
①将Flag标记的ARP3及浓度不同的HA标记的TNFR1表达载体共转染HEK293T细胞，予或不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，用HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达；
②将Flag标记的ARP3分别与HA标记的TNFR1及其截短突变表达载体共转染HEK293T细胞，予或不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，用HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达；
③将Flag标记的ARP3及浓度不同的HA标记的TNFR1表达载体共转染HEK293T细胞，予或不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，检测MAP4K4及p-MAP4K4表达的变化；
④若上一个步骤③中MAP4K4的表达有变化，在③的基础上，干预MAP4K4的表达，用HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达是否改变；
6)在步骤1及步骤2中，已检测TNFR1、MAP4K4及ARP3各自对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迁移、侵袭能力的调节作用；
7)在TNF-α刺激下，检测干预TNFR1/ARP3复合物的形成对TNFR1促进ARP3磷酸化，调节胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迁移、侵袭能力的影响，明确TNFR1通过促进ARP3磷酸化，来促进胶质瘤侵袭性生长；
在胶质瘤细胞中共转TNFR1的过表达载体或小干扰质粒及ARP3的过表达载体及小干扰质粒，予或不予TNF-α刺激，用Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达；免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变；光镜技术检测细胞伪足生长的改变；细胞划痕及Transwell侵袭实验，检测不同细胞的迁移及侵袭的能力；
8)在TNF-α刺激下，检测干预MAP4K4/ARP3复合物的形成对MAP4K4调节ARP3磷酸化及胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迁移、侵袭能力的影响，明确MAP4K4通过磷酸化ARP3，从而促进胶质瘤侵袭性生长；
在胶质瘤细胞中共转ARP3的过表达载体或小干扰质粒及MAP4K4的过表达载体及小干扰质粒，予或不予TNF-α刺激，用Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达；免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变；光镜技术检测细胞伪足生长的改变；细胞划痕及Transwell侵袭实验，检测不同细胞的迁移及侵袭的能力；
9)在TNF-α刺激下，检测干预TNFR1/MAP4K4复合物的形成对MAP4K4磷酸化ARP3，从而调节胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迁移、侵袭能力的影响，明确TNFR1通过招募MAP4K4，从而磷酸化ARP3，促进胶质瘤侵袭性生长；
在胶质瘤细胞中共转TNFR1的过表达载体或小干扰质粒及MAP4K4的过表达载体或小干扰载体，予或不予TNF-α刺激，用Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达；免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变；光镜技术检测细胞伪足生长的改变；细胞划痕及Transwell侵袭实验，检测不同细胞的迁移及侵袭的能力；
所述步骤4还包括：1)收集130例胶质瘤病例的病理组织石蜡标本，病例选择标准为：①有影像学明确诊断包括CT及核磁共振；②有术后病理明确诊断；③术前无放疗、化疗及激素治疗；④组织分型和病理分级参照《2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准》；收集40组胶质瘤手术新鲜组织及瘤旁组织，结合临床作出明确的组织分型和病理分级诊断；另取10例因急性脑外伤行内减压术所得正常脑组织标本为对照；
2)通过Western Blot和免疫组化等方法，研究不同病理分级的胶质瘤组织、胶质瘤瘤体中心组织及周边组织中TNFR1、MAP4K4与ARP3的蛋白表达情况，将蛋白表达情况与胶质瘤的临床因素进行相关性统计，分析TNFR1、MAP4K4与ARP3表达的相关性及其表达与胶质瘤患者病理级别、复发及预后的相关性。