技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物发酵及其应用领域，具体涉及一株黄绿木霉新菌株HLMM-04，同时，本发明还涉及利用该菌株制备玄参烟用香料的方法。
背景技术
[0002] 加香加料是
卷烟工艺中的关键环节，是有效提升卷烟抽吸品质，形成卷烟特有
风格的有效手段之一。目前我国
烟草中添加的烟用香料大多是采用传统方法萃取再加以调配所得，虽然生产操作简单，但也存在香气单调、改善卷烟抽吸效果不明显等缺点。利用微生物对香原料进行发酵可以增加传统提取香料中多种香气物质的含量，提升香气丰富性，进而生产出香气丰富、高品质的卷烟，满足消费者对卷烟品质的要求。
[0003] 玄参(Scrophularia ningpoensis Hemsl.)为玄参科草本
植物，生于海拔1700米以下的竹林、溪旁、丛林及高草丛中。味甘、苦、咸，性微寒，可清热凉血、滋阴降火、解毒散结。主温热病热和营血、身热、烦渴、舌绛、发斑、骨蒸劳嗽、虚烦不寤、津伤便秘、目涩昏花、咽喉喉肿痛、瘰疬痰核、痈疽疮毒。
[0004] 木霉菌(Trichoderma spp.)广泛分布于自然界，在腐木、种籽、植物残体、
有机肥、
土壤和空气中尤多。木霉菌生长营养要求简单，生长速度快，对于工业化生产十分有利。黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)为木霉属的一种，作为一种重要的生防因子，对植物病原的拮抗作用具有广谱性、多制性，还能产生多种酶类分解土壤中的动植物残体，增加土壤肥
力。已有对黄绿木霉的报道多集中在
土壤改良、
生物防治及生物
肥料等方面。
现有技术中尚未见将黄绿木霉用于玄参发酵制备烟用香料的报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株黄绿木霉新菌株，该菌株具有产
纤维素酶，进而促进
纤维素分解成寡糖或单糖的能力。
[0006] 本发明的目的还在于提供一种利用该菌株发酵玄参制备烟用香料的方法。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
[0008] 除非另有说明，本发明所采用的百分数均为
质量百分数。
[0009] 一种黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)HLMM-04菌株，CGMCC No.10839，其具有产纤维素酶，进而促进纤维素分解成寡糖或单糖的能力。
[0010] 利用所述菌株制备烟用香料的方法，包括以下步骤：
[0011] (1)将黄绿木霉HLMM-04CGMCC No.10839菌株活化两次后，接种于装有200mL PDA液体培养基的三
角瓶中，在20～35℃，180rpm下发酵培养1～7d；所述的PDA液体培养基：
马铃薯200g，
葡萄糖20g，补蒸馏
水至1L，pH5.5～8.5，115℃高压灭菌15min；
[0012] (2)发酵液过滤去除菌体，取上清液缓慢加入
硫酸氨至80％
饱和度，4℃下静置过夜，离心收集沉淀物并溶于2mL缓冲液中，再用缓冲液进行
透析，得到粗酶液；所述的缓冲液为：0.02mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.3；
[0013] (3)将玄参
去污洗净，
破碎后加入两倍重量的水，混合均匀，调pH至6.0；加入黄绿木霉HLMM-04粗酶液，发酵，粗酶液添加量为玄参质量的5％～20％，发酵
温度为30℃，发酵时间2～5h；回流提取3h，过滤除渣，将上清液减压浓缩，即得所需烟用香料。
[0014] 进一步的，为防止香料变质，按烟用香料重量的5％添加丙二醇。
[0015] 步骤(1)中最适宜的产酶条件为初始pH 6.5，培养温度28℃，培养时间5d。
[0016] 相对于现有技术，本发明具有以下优点：
[0017] (1)本发明首次将黄绿木霉应用于烟用香料制备领域。采用黄绿木霉HLMM-04菌株发酵液处理玄参，与未处理对照相比，在原有玄参特征香气保持的同时，香气丰富性增加，增加卷烟药草香，喉部刺激性减少。
[0018] (2)本发明成本低廉，操作简单，便于实现大规模工业化生产，应用前景良好。
[0020] 本发明的菌株，已于2015年5月22日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCG)；该中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株分类命名为黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)HLMM-04，保藏号为CGMCC No.10839。
具体实施方式
[0021] 下面通过
实施例对本发明做进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定。
[0022] 实施例1
[0023] 1、黄绿木霉HLMM-04菌株的适宜产酶条件
[0024] 1.1培养基初始pH对HLMM-04菌株产酶的影响
[0025] 将液体培养基的pH分别调到5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在28℃、120rpm下振荡培养3天后，测定纤维素酶活，表明最适宜的初始pH为6.5。
[0026] 1.2培养温度对HLMM-04菌株产酶的影响
[0027] 将接种后的液体发酵培养基分别置于20℃、25℃、28℃、32℃、35℃下，120r/min振荡培养3d后，测定纤维素酶活，表明最适宜的培养温度为28℃。
[0028] 1.3培养时间对HLMM-04菌株产酶的影响
[0029] 将接种好的液体培养基(pH 6.5)置于恒温恒湿箱中，28℃，120r/min振荡培养，每24h测定一次纤维素酶活，培养到第5天时纤维素酶活达到最大值。
[0030] 2、黄绿木霉HLMM-04粗酶液制备方法
[0031] 根据以上优化结果，将黄绿木霉HLMM-04菌株活化两次后，接种于装有200mL PDA液体培养基(pH 6.5)的三角瓶中，在28℃，180rpm下发酵培养5d。过滤去除菌体。取上清液缓慢加入硫酸氨至80％饱和度，4℃下静置过夜，离心收集沉淀物并溶于2mL缓冲液(0.02mol/L Na2HPO4-NaH2PO4的缓冲液，pH 7.3)中，用同样的缓冲液进行透析，得到粗酶液。
[0032] 3、黄绿木霉HLMM-04菌株发酵制备烟用香料的方法
[0033] 将玄参去污洗净，破碎后加入两倍重量的水，混合均匀，调pH至6.0；加入黄绿木霉HLMM-04粗酶液，发酵；粗酶液添加量为玄参质量的15％，发酵温度为30℃，发酵时间3h；回流提取3h，过滤除渣，将上清液减压浓缩，即得玄参烟用香料。
[0034] 为防止变质，按发酵香料重量的5％添加丙二醇。
[0035] 4、产品特征及理化性质
[0036] 所得发酵烟用香料为红棕色液体，不澄清。产品理化性质见表1。
[0037] 表1 黄绿木霉HLMM-04发酵玄参香料的理化指标
[0038]
[0039] 5、卷烟加香实验
[0040] 取玄参发酵烟用香料0.1g，取无菌水稀释50倍后，均匀喷洒在50g未加香叶组中，装入干净的密封袋内，于室温下放置2h后，将烟丝于120℃烘箱中烘干，使水分含量达到11％-13％。将处理后的烟丝及对照放入恒温恒湿箱中，在温度22℃、湿度60％条件下平衡
24h，手工卷制成卷烟，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。以未发酵玄参提取香料及枯草芽孢杆菌发酵玄参香料为对照。加香结果表明，玄参黄绿木霉HLMM-04发酵香料与对照区别明显，具有丰富香气、增加卷烟药草香，改善喉部刺激性的作用。评价结果见表2。
[0041] 表2 玄参发酵香料评吸结果
[0042]
[0043] 实施例2
[0044] 重复实施1，有以下不同点：粗酶液添加量为玄参质量的5％，发酵时间2h。
[0045] 1、产品特征及理化性质
[0046] 所得发酵烟用香料为红棕色液体，不澄清。产品理化性质见表3。
[0047] 表3 黄绿木霉HLMM-04发酵玄参香料的理化指标
[0048]
[0049] 2、卷烟加香实验
[0050] 加香结果表明，玄参黄绿木霉HLMM-04发酵香料与对照区别明显，具有丰富香气，改善喉部刺激性的作用。评价结果见表4。
[0051] 表4 玄参发酵香料评吸结果
[0052]
[0053] 实施例3
[0054] 重复实施1，有以下不同点：粗酶液添加量为玄参质量的20％，发酵时间5h。
[0055] 1、产品特征及理化性质
[0056] 所得发酵烟用香料为红棕色液体，不澄清。产品理化性质见表5。
[0057] 表5 黄绿木霉HLMM-04发酵玄参香料的理化指标
[0058]
[0059] 2、卷烟加香实验
[0060] 加香结果表明，玄参黄绿木霉HLMM-04发酵香料与对照区别明显，药香突出，但苦味较重，与烟气不协调。评价结果见表6。
[0061] 表6 玄参发酵香料评吸结果
[0062]
