一种抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制备方法和用途
专利汇可以提供一种抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种黑平菇蛋白PoAP及其制备方法，首先将黑平菇菌丝干粉在 磷酸 缓冲液中浸提1～3小时，离心，收集上清液；然后分别向所得上清液中加入 硫酸 铵至 饱和度 为40％和70％，2～6℃放置6～12小时，离心，收集沉淀；用磷酸缓冲液溶解沉淀，接着用重蒸馏 水 进行 透析 ；再经阴离子交换柱分离，用0.5M NaCl洗脱，收集洗脱峰；然后经30KD 超滤 管超滤，5000rpm离心超虑40min，所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。本发明黑平菇蛋白PoAP为单一蛋白，可进行遗传工程应用；其次，对 烟草 花叶病毒抑制效果好；且为天然提取物，对人类和环境均无害；另外，黑平菇蛋白制备方法简单，原料易得，成本较低。，下面是一种抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1、一种抗植物病毒的黑平菇蛋白，其特征在于所述的黑平菇蛋白来自黑平 菇(Pleurotus ostreatus)，其N端氨基酸序列为：DAATGYRSVAYFVNWAIYGR。
2、按照权利要求1所述的黑平菇蛋白，按照如下方法制备：
(1)将黑平菇菌丝干粉与pH值为7.0～9.0的磷酸缓冲液混合，在2～6℃ 浸提1～3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；
(2)向黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，于2～6℃放置6～ 12小时，离心，收集上清液；
(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，于2～6℃放 置6～12小时，离心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；
(4)用0.01～0.03mol/L、pH6.0～9.0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1～3倍重量的重蒸馏水中透析8～16小时；
(5)透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0.5M NaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6)收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
3、按照权利要求2所述的黑平菇蛋白，其特征在于其步骤(1)中所述的 黑平菇菌丝干粉的重量与磷酸缓冲液的混合比例为1g∶10～20ml。
4、按照权利要求2或3所述的黑平菇蛋白，其特征在于其步骤(1)、(2) 或步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。
5、按照权利要求4所述的黑平菇蛋白，其特征在于其步骤(1)、(2)或 步骤(3)中所述的离心的时间为25min。
6、权利要求1～5任一所述的黑平菇蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将黑平菇菌丝干粉与pH值为7.0～9.0的磷酸缓冲液的混合，在2～ 6℃浸提1～3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；
(2)向黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，于2～6℃放置6～ 12小时，离心，收集上清液；
(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，于2～6℃放 置6～12小时，离心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；
(4)用0.01～0.03mol/L、pH6.0～9.0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1～3倍重量的重蒸馏水中透析8～16小时；
(5)透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0.5M NaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6)收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
7、按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述的黑 平菇菌丝干粉的重量与磷酸缓冲液的混合比例为1g∶10～20ml。
8、按照权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)、(2)或 步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。
9、按照权利要求8所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)、(2)或步骤 (3)中所述的离心的时间为25min。
10、权利要求1～5任一所述的黑平菇蛋白在防治烟草花叶病毒病上的应 用。
技术领域
本发明属于生物农药领域，具体涉及一种抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制 备方法和用途。
背景技术
目前已有多类化学农药在防治植物病毒病害方面应用，但其效果并不理想， 且随着人们对生态环境的重视，化学农药的发展和应用受到了限制。而生物农 药由于其有效成分多为天然物质，施用后在自然界有其顺畅的降解途径，对环 境污染小、对人、畜毒性低等特点日益受到人们的青睐。
不同种类的外源抗病毒活性蛋白分别从植物、动物和微生物中得到分离。 1925年Duggar从美洲商陆(Phytolacca Americana)中发现了具有抗植物病毒 的活性物质(Duggar，1925)，食用真菌来源的抗植物病毒蛋白的发现要相对晚 一些，迄今从食用菌中分离纯化出抗植物病毒蛋白还很少。1987年，由 Kobayashi等人首次报道了香菇(Lentinus edodes)子实体中植物病毒侵染抑 制剂，即FBP(fruiting body protein，FBP)蛋白。孙慧等(2001年，2003年) 公开了一种抑制TMV侵染的杨树菇(Agrocybe aegeri ta)蛋白AAVP(Agrocybe aegerita antiviral protein，AAVP)。付鸣佳等(2003年)公开了一种抗TMV 侵染的金针菇(Flammulina velutipes)蛋白，命名其为Zb蛋白。
黑平菇是平菇(Pleurotus ostreatus)的一个菌种，生活力强，进行生料 或熟料栽培，栽培方法简便、管理粗放，生长周期短、产量高。专利申请《一 种黑平菇提取物及其制备方法与应用》(申请号为：200810223438.0)公开了一 种具有抗植物病毒作用的黑平菇蛋白提取物，但是没有明确蛋白提取物中哪种 活性物质具有抗植物病毒的作用，有待进一步的研究和探索。
发明内容
本发明另一目的在于提供上述黑平菇蛋白的制备方法。
本发明还一目的是提供上述黑平菇蛋白在抗烟草花叶病毒病上的应用。
实现本发明的技术方案如下：
本发明一种抗植物病毒的黑平菇蛋白，所述黑平菇蛋白来自黑平菇 (Pleurotus ostreatus)，其N端氨基酸序列为：DAATGYRSVAYFVNWAIYGR(SEQ ID No：1)。
上述抗植物病毒的黑平菇蛋白，按照如下方法制备：
(1)将黑平菇菌丝干粉与pH7.0～9.0的磷酸缓冲液混合，在2～6℃浸提 1～3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；
(2)向所得黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，于2～6℃放 置6～12小时，离心，收集上清液；
(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，于2～6℃放 置6～12小时，离心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；
(4)用0.01～0.03mol/L、pH6.0～9.0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1～3倍重量的重蒸馏水中透析8～16小时；
(5)透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0.5M NaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6)收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
按照通用的命名方法，将上述所得黑平菇蛋白命名为PoAP(Pleurotus ostreatus Antivirus Protein)。
上述黑平菇蛋白步骤(1)中所述的黑平菇菌丝干粉与磷酸缓冲液之间的混 合比例为1g∶10～20ml。
上述黑平菇蛋白步骤(1)中所述的磷酸缓冲液的pH值为8.0。
上述黑平菇蛋白步骤(1)、(2)或步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。
上述黑平菇蛋白步骤(1)、(2)或步骤(3)中所述的离心的时间为25min。
所述的黑平菇菌丝干粉可于市场上购买得到。
上述黑平菇蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将黑平菇菌丝干粉与pH值为7.0～9.0的磷酸缓冲液的混合，在2～ 6℃浸提1～3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；
(2)向黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，于2～6℃放置6～ 12小时，离心，收集上清液；
(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，于2～6℃放 置6～12小时，离心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；
(4)用0.01～0.03mol/L、pH6.0～9.0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1～3倍重量的重蒸馏水中透析8～16小时；
(5)透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0.5M NaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6)收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
上述制备方法步骤(1)中所述的黑平菇菌丝干粉的重量与磷酸缓冲液的混 合比例为1g∶10～20ml。
上述制备方法步骤(1)中所述的磷酸缓冲液的pH值为8.0。
上述制备方法步骤(1)、(2)或步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。
上述制备方法步骤(1)、(2)或步骤(3)中所述的离心的时间为25min。
上述制备方法中如无特别说明，均为常规方法。
本发明黑平菇蛋白可用于防治植物病毒，如烟草花叶病毒等。具体方法为 将本发明黑平菇蛋白用水稀释至蛋白总浓度为100～200ug/mL，喷施于3～4叶 期烟草上。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明将抗植物病毒的黑平菇蛋白具 体为一种单一的蛋白，从为获得该蛋白的氨基酸序列及其编码基因提供了基础， 进而为遗传工程应用该蛋白提供了可能；(2)本发明黑平菇蛋白对植物病毒的 抑制效果好，如在黑平菇蛋白浓度为200ug/mL，喷施烟草72小时后，对烟草 花叶病毒的抑制率达到77.49％；(3)本发明黑平菇蛋白为天然提取物，对人类 和环境均无害，使用安全；(4)本发明黑平菇蛋白制备方法简单，原料易得， 成本较低，适于大规模的生产和应用。
附图说明
图1本发明黑平菇蛋白PoAP电泳鉴定图谱；其中1为标准分子量，2为本 发明黑平菇蛋白。
图2a为用分子筛(Gel filtration)鉴定蛋白分子量的标准曲线图，
其中A为牛血清白蛋白、B为鸡卵清蛋白、C为胰蛋白酶。
图2b为用分子筛(Gel filtration)鉴定黑平菇蛋白分子量的层析图。
具体实施方式
实施例1本发明黑平菇蛋白的制备
按照如下方法进行：
(1)将黑平菇菌丝干粉(购于宜昌森源食用菌有限责任公司)2g与pH值 为8.0的磷酸缓冲液20mL的混合，在4℃浸提2小时，10000rpm离心25min； 弃沉淀，上清即为黑平菇菌丝粗提液。
(2)向所得黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，于4℃放置 8小时，然后在10000rpm下离心25min，收集上清液。
(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，于4℃放置8 小时，10000rpm离心25min，收集沉淀得到黑平菇蛋白粗提物；
(4)用0.03mol/L、pH9.0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗提物溶解， 然后在1～3倍重量的重蒸馏水中透析12小时；
(5)透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0.5M NaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6)收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
实施例2本发明黑平菇蛋白的制备
按照如下方法进行：
(1)将黑平菇菌丝干粉2g与pH值为7.0的磷酸缓冲液20ml的混合，在4℃ 浸提2小时，10000rpm离心25min，上清即为黑平菇菌丝粗提掖；
(2)向所得黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，于4℃放置 8小时，10000rpm离心25min，收集上清液；
(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，于4℃放置8 小时，10000rpm离心25min，收集沉淀得到黑平菇蛋白粗提物；
(4)用0.01mol/L、pH8.0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗提物溶解， 然后在2倍重量的重蒸馏水中透析16小时；
(5)透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0.5M NaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6)收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
实施例3本发明黑平菇蛋白的制备
用下述方法提取：
(1)按黑平菇菌丝干粉的质量与pH值为9.0的磷酸缓冲液的混合比例为 1g∶20mL，在4℃浸提2小时，10000rpm离心25min，取上清液，得黑平菇的 菌丝粗提液；
(2)在所得黑平菇的菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，于4℃放 置6小时，然后在10000rpm下离心25min，取上清液；
(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，于4℃放置6 小时，然后在10000rpm下离心25min，收集沉淀，得到黑平菇蛋白粗提物；
(4)用0.02mol/L、pH7.0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗提物溶解， 然后在2倍重量的重蒸馏水中透析10小时；
(5)透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0.5M NaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6)收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
实施例4本发明黑平菇蛋白PoAP的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
按照如下方法进行：
(1)配制分离胶和浓缩胶按照通常的方法配制，分离胶浓度12％(每5mL 凝胶中含1.6mL去离子水，2.0mL 30％Acrylamide，1.3mL 1.5M pH8.8Tris-HCl， 50μL 10％SDS，50μL 10％过硫酸铵，2μL TEMED)，浓缩胶浓度5％(每3mL 凝胶中含2.1mL去离子水，0.5mL 30％Acrylamide，0.38mL 1.5M pH8.8Tris-HCl， 30μL 10％SDS，30μL 10％过硫酸铵，3μL TEMED)。
(2)用微量进样器取实施例1所制备的黑平菇蛋白，每孔进样15μL。浓 缩胶30V/cm，分离胶20V/cm，待指示剂距离凝胶底端1cm时停止电泳。
(3)染色及脱色：固定(30min)-致敏(30min)-水洗(3次，每次10min) -银染(20min)-水洗(2次，每次1min)-显色(视情况而定)-终止(10min) -保存(1％冰醋酸中，4℃保存)。
结果(如图1)电泳显示只有一条蛋白条带，无其他杂带，说明实施例1 中所得黑平菇蛋白为一种单一的蛋白质，通过迁移率计算本发明黑平菇蛋白 PoAP的分子量为32.0kDa。
实施例5本发明黑平菇蛋白PoAP的凝胶层析测定
按照如下方法进行：
(1)凝胶层析过程于4℃进行，所用试剂均经过滤和脱气处理。凝胶层析 采用SephacrylTM S-200(1.6cm×60cm)预装层析柱，去离子水充分平衡至280nm 紫外吸光值不再变化。
(2)用实施例1所制备的黑平菇蛋白上样，去离子水0.5mL/min洗脱，280nm 检测其紫外吸光值。标准蛋白分别采用牛血清白蛋白(66.0kDa)、鸡卵清蛋白 (44.28kDa)和胰蛋白酶(25.0kDa)(购于Merck公司)，以相同条件洗脱。 分别记录PoAP及标准蛋白的洗脱体积，绘制标准曲线，计算PoAP的分子量。
(3)结果根据标准蛋白分子量和洗脱体积(牛血清白蛋白(66.0kDa)、 鸡卵清蛋白(44.28kDa)、胰蛋白酶(25.0kDa)和实施例1所制备的黑平菇蛋 白的洗脱体积分别为32.46mL、37.07mL、109.91mL和36.95mL)绘制标准曲线 (见图2a和图2b)，得到回归方程，通过黑平菇蛋白的洗脱体积计算出本发明 黑平菇蛋白PoAP的分子量为34.7kDa，结合其SDS-PAGE分子量，推测黑平菇 蛋白PoAP为一个单亚基蛋白。
实施例6本发明黑平菇蛋白PoAP的N-端氨基酸序列测定
按照如下方法进行：
(1)取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。
(2)取出实施例4所得的电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5～10分钟。
(3)在50V恒压条件下(100-170mA)于室温下进行电印迹转移2小时。
(4)取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行 染色。
(5)考马斯亮蓝染色，可将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％ 乙酸，染色30-50秒，用50％甲醇脱色，并用去离子水充分洗涤，然后将剪下 待测序的条带经北京大学生命科学中心进行N端氨基酸序列分析。
(6)结果所测得本发明黑平菇蛋白PoAP的N端氨基酸序列为： DAATGYRSVAYFVNWAIYGR(SEQ ID No：1)。
实施例7黑平菇蛋白PoAP抑制烟草花叶病毒试验
1、实验步骤
1)喷雾防治处理：将实施例1得到的PoAP分别用水稀释到不同的蛋白浓 度(见表1)，分别对三至四叶期的枯斑三生烟进行整株喷雾，每个处理三个重 复，每个重复三株，每株三片叶子。同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生 烟作为对照(CK)，设置三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。
2)病毒接种液的制备：病毒来源为本研究室保存的TMV普通株系(以普通 烟为寄主，活体保存)，其获取方法是：将感染烟草花叶病毒TMV普通株系的普 通烟的叶片去除主脉，与pH8.0的0.01mol/L的PBS按1g/20ml混合，每20mlPBS 加0.015g金刚砂，将叶片充分研磨，得到接种液。
3)接种：将按步骤1)的方法喷雾72小时后得到的枯斑三生烟植株，用 步骤2)得到的接种液进行摩擦接种(植病研究方法(第三版)，方中达，中国 农业出版社)接种后立即用清水冲洗，于温室中培养，培养条件为28℃光照12 小时，18℃无光照12小时，交替进行。
表1实施例1的PoAP蛋白抗TMV试验结果
4)抑制率计算：接种72小时后观察枯斑三生烟叶片产生枯斑数量，按下 式计算出枯斑抑制率。
X＝(CK-Y)/CK×100(式I)
式I中，X为枯斑抑制率，单位：％；CK为清水对照叶片的平均枯斑个数， 单位：个；Y为经实施例1制备的PoAP诱导处理后叶片的平均枯斑个数，单 位：个。
结果从表1可以看出，本发明黑平菇蛋白PoAP有较高的抗TMV活性，效果 可达60％以上，其中PoAP在浓度≥100μg/mL时，其抗TMV活性较高，在此浓度 以上其抗TMV活性随PoAP浓度变化不明显。
序列表
<110>北京市农林科学院
<120>一种抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制备方法和用途
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>Pleurotus ostreatus
<400>1
Asp Ala Ala Thr Gly Tyr Arg Ser Val Ala Tyr Phe Val Asn Trp Ala
1 5 10 15
Ile Tyr Gly Arg
20
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种血液透析泵 | 2020-05-12 | 226 |
| 血液透析系统 | 2020-05-12 | 248 |
| 透析患者用输液 | 2020-05-12 | 536 |
| 一种血液透析用透析器 | 2020-05-11 | 639 |
| 血液透析元件 | 2020-05-13 | 288 |
| 腹膜透析液 | 2020-05-11 | 592 |
| 腹膜透析液 | 2020-05-11 | 420 |
| 血液透析容器 | 2020-05-12 | 601 |
| 血液透析器、血液透析装置及血液透析方法 | 2020-05-12 | 449 |
| 血液透析装置 | 2020-05-13 | 784 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
