显微镜照明系统及方法
阅读：163发布：2020-05-12
专利汇可以提供显微镜照明系统及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种 显微镜 照明系统，用于在第一、共焦和第二、非共焦显微镜照明模式之间进行转换，该系统具有用以提供第一显微镜照明模式的显微镜照明单元(100)，包括：照明源装置(10)，用于产生平行于光轴(9)传播的照明光束(16)；扫描镜装置(2)，用于在垂直于光轴的平面中偏转照明光束(16)；扫描目镜(3)和下游扫描镜筒透镜(7)的后焦面(6)上，并扩展照明光束(16)，显微镜物镜(7)将照明光束聚焦在待检查的样本(8)上。为了提供特别用于 定位 显微镜的第二显微镜照明模式，该单元(100)具有聚焦透镜(4)，该聚焦透镜可被插入照明光束(16)的路径中从而使得照明光束被聚焦在显微镜物镜(7)的后焦面(6)上。(5)，用于将扫描镜装置(2)成像在显微镜物镜，下面是显微镜照明系统及方法专利的具体信息内容。
1.一种显微镜照明系统，用于在激光扫描显微镜照明模式和定位显微镜照明模式之间进行转换，该显微镜照明系统具有用以提供激光扫描显微镜照明模式的显微镜照明单元(100)，包括：
照明源装置(10)，用于产生平行于光轴(9)传播的照明光束(16)；
扫描镜装置(2)，用于在垂直于光轴的平面中偏转照明光束(16)；
扫描目镜(3)和下游的扫描镜筒透镜(5)，用于将扫描镜装置(2)成像在显微镜物镜(7)的后焦面(6)上，并用于扩展照明光束(16)，显微镜物镜(7)将照明光束聚焦在待检查的样本(8)上；
其中，为了提供定位显微镜照明模式，该显微镜照明单元(100)具有聚焦透镜(4)，该聚焦透镜能够在扫描目镜(3)和扫描镜筒透镜(5)之间或在扫描镜筒透镜(5)和显微镜物镜(7)的后焦面(6)之间被插入照明光束(16)的路径中从而使得照明光束(16)被聚焦在显微镜物镜(7)的后焦面(6)上，
其中所述照明源装置(10)包括用于扩展照明光束(16)的望远镜光器件(1)，其中为了提供定位显微镜照明模式，所述望远镜光器件(1)能够从所述照明光束(16)的路径中移开。
2.如权利要求1所述的显微镜照明系统，其中聚焦透镜(4)能够沿光轴(9)移动。
3.如前述任一权利要求所述的显微镜照明系统，其中激光扫描显微镜照明模式提供用于共焦显微镜的照明，照明源装置(10)包括激光辐射源(32)。
4.如权利要求1或2所述的显微镜照明系统，其中定位显微镜照明模式提供用于GSDIM方法的照明，照明源装置(10)包括激光辐射源(32)。
5.一种使用根据权利要求3或4的显微镜照明系统的方法，用于在用于共焦显微镜的激光扫描显微镜照明和用于GSDIM方法的定位显微镜照明之间进行转换。
6.一种显微镜，具有显微镜物镜(7)和根据权利要求1-4中之一的显微镜照明系统。
7.如权利要求6所述的显微镜，其中在扫描镜筒透镜(5)和显微镜物镜(7)之间的照明光束(16)的路径中设置分束镜(19)，以使得来自样本(8)的观察光束(15)被耦合输出。
8.一种用于在激光扫描和定位显微镜照明模式之间进行转换的方法，使用用以提供激光扫描显微镜照明模式的显微镜照明单元(100)，其中，
照明源装置(10)产生平行于光轴(9)传播的照明光束(16)；
扫描镜装置(2)在垂直于光轴的平面中偏转照明光束(16)；以及
扫描目镜(3)和下游的扫描镜筒透镜(5)将扫描镜装置(2)成像在显微镜物镜(7)的后焦面(6)上并扩展照明光束(16)，显微镜物镜(7)将照明光束(16)聚焦在待检查的样本(8)上，其中，该显微镜照明单元(100)提供定位显微镜照明模式，其中，聚焦透镜(4)在扫描目镜(3)和扫描镜筒透镜(5)之间或在扫描镜筒透镜(5)和显微镜物镜(7)的后焦面(6)之间被插入照明光束(16)的路径中从而使得照明光束(16)被聚焦在显微镜物镜(7)的后焦面(6)上，
其中所述照明源装置(10)包括用于扩展照明光束(16)的望远镜光器件(1)，其中为了提供定位显微镜照明模式，所述望远镜光器件(1)被从所述照明光束(16)的路径中移开。
显微镜照明系统及方法
技术领域
背景技术
[0002] 本发明涉及超分辨率定位显微镜方法的技术实施。这种方法的特征在于在获取图像时，仅有几个物点在给定的时间同时发射光线。如果这些点之间的间距显著地大于光学分辨率，则可通过数学质心确定方法来确定出这些点的位置，其精度高于所使用的物镜的光学分辨率。对许多不同物点的单个图像求和，最终能够得到整个物体的超分辨率图像。这种方法的已知变型体的区别在于它们确保了仅有几个物点同时发射光线。这种方法的名称例如是PALM，STORM和GSDIM。下文中将简要地描述最后一种方法。
[0003] GSDIM表示“跟随单个分子返回的基态损耗”。这种方法使用了具有三重态(也是“暗态”)的荧光体。最初，通过照射适当的激光能量，染料分子从基态迁移至激发态。然后从激发态迁移至三重态，三重态的寿命(约100ms)远长于激发单重态的寿命(仅约3ns)，因此给定充足的光强，分子在三重态积聚。分子从三重态返回至基态，产生自发发射。记录这些自发发射的单个图像，通过前述精度高于光学分辨率的数学方法确定出这些自发发射的位置。分辨率可达到20-25nm，通常小于60nm。然而，可实现的分辨率同样也基于激光能量和所使用的摄像机的分辨率。
[0004] 实施GSDIM的主要技术条件是采用高能量光使得样本产生荧光激发。这可以通过合适的激光照明来实现，其可以是由全内反射荧光显微镜(TIRF)照明装置提供的，该照明装置将激光光束聚焦至物镜的光瞳(物镜的后焦面)。这种方法的优点在于能够均匀地照明样本，且同时照明的景深比较大。为了最佳地使用激光的能量，激光光束的横截面被减少至照明的样本场仅是TIRF照明中的四分之一(例如，当采用100倍放大率的物镜时，照明的样本场的直径为约60μm，然而在TIRF照明中，该直径可达到约250μm)。
[0006] 以下是TIRF显微镜的一些最初观察。典型地，使用具有高数值孔径的油浸物镜的反转光显微镜来实现全反射需要的入射平角。在盖片和样本之间的界面上产生全反射。在盖片下的区域内形成所谓的瞬逝场。该场的光强以指数方式衰减进入样本。对于可见光，透入深度典型地为100-200nm。如果该区域中存在有能够吸收照射波长的光的荧光分子，则这些分子能够被激发以发射荧光。由于样本中可观察的层的厚度仅有100-200nm，因而沿光轴的分辨率显著地高于普通荧光显微镜(层区厚度典型地为500nm)的分辨率。在TIRF显微镜中，在物镜的边缘处耦合入激发光，从而其能够以需要的平角入射至盖片上。
[0007] 附图1a示意性地示出具有照明光束16的典型的TIRF照明：光源18(典型地为激光器)发出的光线(由虚线表示)被准直光器件17准直。准直光被扫描目镜13聚焦。传送光器件14将焦点成像在物镜7的后焦面6上，此前光线被分束镜19反射。分束镜可提供诸如物理分离(physical separation)，几何分离(geometrical separation)，色彩分离(color separat ion)或偏振分离(polarization separation)。由于扫描目镜13难以被安装的尽可能靠近物镜7以直接聚焦在物镜的后焦面6上，则鉴于显微镜座的机械特性需要设置传送光器件14。为了使用具有不同后焦面位置的物镜，扫描目镜13是可聚焦的(由箭头指示)。物镜将聚焦在物镜7的后焦面6上的激光光束作为平行光束投射至样本8的空间(物空间)。该平行光束照亮样本8中直径为Da(典型地约为250μm)的圆。
[0008] 对于TIRF显微镜，关键的是扫描镜12(示意性地示出)是可倾斜的。通过倾斜扫描镜12(由两个箭头指示)，焦点移动至垂直于物镜光轴的后焦面6。从而，激光光束穿过样本8的角度基于扫描镜12的倾斜。当这个角度大于盖片和样本媒质之间的全反射角，就是上述的TIRF显微镜。
[0009] 以这种方式照亮的样本随后发射荧光(由实线表示)。该光线穿过分束器19并通过镜筒透镜21形成图像22。
[0010] 附图1b示出用于GSDIM方法的典型照明。其中关键的是每一照明样本区域上的激光能量都比较高。因此，需要的是激光能量作用在大大减少的样本直径Db(典型地约为60μm)上。这可以通过转换TIRF和GSDIM照明的方式修正参考附图1a描述的TIRF照明来实现。在上述TIRF照明装置中，通过在光路中插入望远镜11(由虚线表示)来减少光束直径。以这种方式，样本中被照亮的圆被减少至直径Db(约为60μm)，结果能量密度增大了约18倍。典型地，激光光束垂直入射在样本8上。在很少情况下，在扫描镜12处于倾斜位置时执行观察。其他的细节参见参考附图1a给出的解释。
[0011] 从TIRF照明转换至GSDIM照明的上述已知方法具有相对简易的优点，因其通过插入望远镜来实现，但也具有以下缺点：在TIRF条件下，即扫描镜12处于倾斜位置时，鲜少执行GSDIM显微镜。更重要的是，TIRF自身都是鲜少使用的应用，因而将其和GSDIM显微镜结合的意义不大。因此，对定位显微镜感兴趣的大多数用户不得不购买包含有鲜少被使用的复杂的TIRF照明装置的显微装置。
[0012] 另一应用为共焦显微镜。具体而言，可参见大量的现有技术。共焦显微镜，不同于传统光显微镜(也是“宽视场显微镜”)，并不照明整个样本，在任何时点上都仅照明样本的一部分或一个点。采用适当聚焦的激光器或点光源通过显微镜物镜逐点地照明并扫描样本。因此能够相继地测量样本的所有扫描部分所反射的光强。从而，根据测量的光强构建样本的图像。由于其具有高的轴向分辨率，共焦显微镜能够获得大量不同焦面上的这种图像并生成清晰的三维图像。为此，激光器或点光源的激发光被聚焦在样本中的不同焦面上。被样本反射的光通常通过将光线聚焦至样本上的同一物镜而被成像在一小孔上，并穿过该小孔抵达探测器。激发光焦点和探测光焦点彼此共焦，即重合。因此而被命名“共焦显微镜”。来自焦面之外的平面的光线无法穿过小孔抵达探测器。通过在x-y方向上扫描样本，即在垂直于物镜光轴(z-方向)的平面上进行扫描，能够获得选定焦面(z＝z0)上样本的图像。
[0013] 美国专利7187494B2描述了能够在TIRF显微镜和共焦显微镜之间转换的显微镜系统。该文献的图6示出了用于共焦显微镜的激光扫描显微镜的典型配置。该文献的图7绘出了TIRF显微镜的典型配置。如该文献的图8所示，基于共焦显微镜和TIRF显微镜的结合，该美国专利涉及用于这种组合的可选方案，包括使用可插入共焦显微镜的光路中以将激光聚焦在物镜的后焦面上的光器件，且在后焦面位置主光线平行于光轴。后者对于TIRF照明是必需的。作为上述组合的可选实施例，该专利文献描述了使用完全折叠的光路来实现TIRF和共焦显微镜之间的转换。
[0014] 美国专利7551351B2描述了采用TIRF照明用于光学地操作样本的显微镜。该文献提出了一种显微镜系统，其照明方式可在TIRF照明和操作激光照明之间转换。该操作激光可用于漂白，用于标记目的和/或用于微解剖。使用可插入TIRF激光的光路中的平面镜，或使用可被激活的透镜来实现TIRF照明和操作激光照明之间的转换。
[0015] 德国专利文献DE19901219A1披露了一种光学布置，其设置在共焦激光显微镜的照明光路中，并适于提供最佳照明且降低了激发光损失。为此，在激光器的下游布置透镜和下游变焦光器件。这种布置用于扩展平行激光光束较窄的横截面。被扩展的光束被引导至扫描镜上并被反射至物镜。穿过物镜入瞳的光束被物镜聚焦在物体上。使用上述变焦透镜，可以较高或较低的精度来调节到达物镜出瞳的照明光束的直径，从而减少了光的损失。
发明内容
[0016] 本发明的目的之一在于提供特别适于定位显微镜的(第二)非共焦照明，特别地用于GSDIM方法，且可独立于TIRF照明进行使用。特别地，这种照明旨在可被转换至适于共焦显微镜的(第一)照明。
[0018] 依据本发明，提供了用于定位显微镜的显微镜照明系统，下文中通常更多地称为“第二显微镜照明模式”，借由该系统能够在第一显微镜照明模式、特别地用于共焦显微镜的照明和第二显微镜照明模式之间进行转换。本发明的显微镜照明系统具有以提供第一显微镜照明的显微镜照明单元，其包括以下组件：照明光源装置，用于产生平行于光轴传播的照明光束；扫描镜装置，用于在垂直于光轴的平面中偏转照明光束；以及扫描目镜和下游扫描镜筒透镜，用于将扫描镜装置成像在显微镜物镜的后焦面上，并用于扩展照明光束，显微镜物镜将照明光束聚焦在待检查的样本上。为了提供第二显微镜照明模式，即特别地为了提供适于定位显微镜的照明，该显微镜照明单元具有聚焦透镜，该聚焦透镜可被插入照明光束的路径中从而使得照明光束被聚焦在显微镜物镜的后焦面上。
[0019] 由于使用了前述扫描镜装置，第一显微镜照明模式特别地适于激光扫描显微镜照明，即特别地适于共焦显微镜，第二显微镜照明模式特别地适于定位显微镜，且更特别地，适于开始描述的GSDIM方法。
[0020] 迄今为止，已知的先前技术仅提供了具有能够通过合适的方法分别被转换至用于共焦显微镜或定位显微镜的照明装置的TIRF照明装置的显微镜照明系统，本发明则提出了特别地适于共焦显微镜和定位显微镜的显微镜照明模式的组合。这种组合的优点在于共焦显微镜构成了公认的用于高分辨率荧光显微镜的现有技术水平的一部分，且共焦显微镜被用于以最高的光学分辨率进行定量研究。上述定位显微镜具有相同的目标，因此能够结合共焦显微镜和定位显微镜向用户提供了极大的优势。特别地，其能够使用同样的激光器以用于各个显微镜照明模式。
[0021] 本发明考虑到两个所述显微镜照明模式中不同的光学成像条件，并采取了相应的适配以允许在两个显微镜照明模式之间进行转换。
[0022] 为进一步说明的目的，且不失一般性，假定第一显微镜照明模式是共焦显微镜照明。相似地，第二显微镜照明模式被假定为用于GSDIM的显微镜照明。下文中将描述从共焦显微镜照明向GSDIM照明的转换。当然，所描述的同样也可应用于相反的情形，即从GSDIM照明转换至共焦显微镜照明。两种转换方式是平等的。
[0023] 首先，使用照明源装置以产生平行于光轴传播的照明光束。对于共焦显微镜，典型地使用准直的激光束。为了提供第一显微镜照明模式，即共焦显微镜照明模式，望远镜光器件被设置在照明光束的路径中以扩展照明光束的直径。
[0024] 照明光束(扩展的激光束)平行于光轴传播，并入射在能够以已知的方式在垂直于光轴的平面中偏转照明光束的扫描镜装置。若光轴为z-方向，则所述平面是x-y平面。以上述的方式使用扫描镜装置以扫描焦面上带检查的样本。
[0025] 显微镜照明单元包括扫描目镜和下游扫描镜筒透镜作为其它组件。这两个组件可为单透镜或复合透镜系统。扫描目镜和扫描镜筒透镜一起执行两个功能。第一，扩展光束直径，特别地扩展至能够全部照亮显微镜物镜的后焦面。第二，将特别地包括一个或多个依次布置的扫描镜的扫描镜装置成像在显微镜物镜的后焦面。最终，物镜将激光束聚焦在样本上。在该配置中，由扫描镜装置引起的激光束的倾斜导致了激光束在后焦面位置处的倾斜，从而导致了焦点垂直于光轴的移动。
[0026] 为了从第一、共焦显微镜照明模式转换至第二、非共焦照明模式，例如用于实施GSDIM方法的目的，依据本发明需要在照明光束的路径中插入聚焦透镜。由于插入了聚焦透镜，激光束不再被聚焦在样本上，而是被聚焦在显微镜物镜的后焦面上。聚焦透镜可为单透镜或复合透镜系统。
[0027] 如前所述，照明源装置包括望远镜光器件以扩展照明光束以用于第一、共焦照明模式。这种扩展通常是需要的，这是因为激光束在穿过望远镜光器件之前经过的声光分束器(简称AOBS)所允许的最大光束直径通常小于扫描目镜需要的光束直径。因此，使用望远镜光器件以在AOBS和扫描目镜之间扩展激光束。
[0028] 为了提供第二、非共焦显微镜照明模式，从照明光束的路径中移开望远镜光器件。以这种方式，照亮的样本场的直径减少，样本上光强被增大了约25倍。因此，这种布置使得能够采用高的照明强度来执行定位显微镜。
[0029] 有利的是在扫描目镜和扫描镜筒透镜之间的照明光束路径中插入聚焦透镜。对于申请人目前销售的共焦显微镜，这特别地有利。在另一配置中，原则上聚焦透镜也可插入在扫描镜筒透镜和显微镜物镜的后焦面之间，只要插入该聚焦透镜能够将照明光束聚焦在显微镜物镜的后焦面上即可。
[0030] 同样有利的是，聚焦透镜可沿光轴移动，或在多元件设计的情况下聚焦透镜的一部分可沿光轴移动。这样能够针对后焦面位置不同的物镜调节焦点。
[0031] 为了在两个上述显微镜照明模式之间进行转换，有利的是，在插入聚焦透镜的同时或紧随其后就移开望远镜光器件，反之亦然。
[0032] 正如前文中反复强调的，本发明的显微镜照明系统特别地适于在特别用于共焦显微镜的激光扫描显微镜照明和特别用于GSDIM方法的定位显微镜照明之间进行转换。
[0033] 根据本发明，如上文详细描述的，本发明还涉及一种具有显微镜物镜和显微镜照明系统的显微镜。显微镜的配置，特别地共焦或定位显微镜的配置是先前技术中周知的，因而本文中不再详细地讨论。从样本发出的光线(共焦显微镜的情况下发射荧光辐射)通过显微镜物镜和其它下游的光器件聚焦在共焦小孔上，并穿过小孔抵达探测器。
[0034] 在定位显微镜中，来自样本的观察光束在扫描镜筒透镜和物镜之间被耦合出。为此，在这两者之间设置分束镜。
[0035] 本发明还涉及一种提供用于定位显微镜的照明的方法，该发明特别地通过将共焦显微镜照明转换至其来提供这种照明模式。关于本发明的方法，可参考上述关于根据本发明和所描述的实施例及优点的显微镜照明系统的解释。上述披露的内容同样明确地应用于本发明的方法。
[0037] 可以理解，上述特征和下文中描述的特征不仅可在特定的组合中使用，同样可在其它组合中使用，在不背离本发明范围的情况下还可单独使用。
[0038] 利用典型实施例，附图中示意性地示出本发明，且下文中参考附图进行了详细的描述。
附图说明
[0039] 附图1是具有用于TIRF照明的照明装置(附图1a)和用于GSDIM方法的照明装置(附图1b)的显微镜的示意图，借由此可在两个照明模式之间进行转换。
[0040] 附图2是用于共焦显微镜的显微镜照明单元(附图2a)和具有用于GSDIM方法的照明单元的显微镜(附图2b)的示意图，借由此可在两个照明模式之间进行转换。
具体实施方式
[0041] 附图1a和1b中示出的照明单元运行的设计和原理在说明书的介绍部分中已有详细的描述。
[0042] 在附图2中，仅是示意性地示出了根据本发明的显微镜照明系统的实施例。特别地，附图2a示出了用于共焦显微镜的显微镜照明单元100，附图2b示出了该显微镜照明单元100用于GSDIM方法的修正。在这两个图中，照明光束16都源自光源32(典型地为激光器或其它点状光源)且最初自下而上传播。光线被准直光器件31准直。下文中假定激光束的波长适于在染色的样本8中引起荧光发射。
[0043] 附图2a中，除了光源32和准直光器件31，由10标识的照明源装置还包括望远镜光器件1以用于扩展激光束，图中示出为激光束16。扩展的激光束入射在扫描镜装置2上，图中示出为一扫描镜。扫描镜可在两个空间方向上倾斜，从而使得产生的激光束在垂直于光轴9的平面中发生倾斜。扫描目镜由3标识出。在准直光器件31和望远镜光器件1之间，激光束典型地穿过声光分束器(AOBS)(图中未示出)，分束器分离照明光束和观察光束，其允许通过的光束的最大直径小于扫描目镜3所需要的直径。因此附图2a中在扫描目镜3之前提供望远镜光器件1以扩展光束。
[0044] 在附图2a中，扫描镜筒透镜5和平面镜29布置在扫描目镜3的下游。扫描目镜3和扫描镜筒透镜5一起作为具有两个功能的另一望远镜光器件。第一，进一步地扩展光束直径以全部并最佳地照亮物镜7的后焦面6。第二，将扫描镜成像在后焦面6的位置处。因此，扫描镜装置2的位置与焦平面6共轭。最终物镜7将激光束聚焦在样本8上。样本适于被荧光体染色，从而入射的激光辐射激发出荧光。通过倾斜扫描镜，即通过恰当地控制扫描镜装置2，激光束的焦点在样本8的焦平面中移动，因此实现了在垂直于光轴9的平面中进行扫描。
[0045] 附图2b示意性地示出了附图2a的显微镜照明单元100，但在附图2b中，其适应于在显微镜200中提供第二显微镜照明模式，此处用于GSDIM方法。相同的附图标记表示相同的元件，因此不再赘述。在附图2b示出的实施例中，为了转换至第二显微镜照明模式，最初在光束16的路径中插入聚焦透镜4。聚焦透镜4和扫描镜筒透镜5一起保证了激光束被聚焦在显微镜物镜7的后焦面6上。在示出的实施例中，聚焦透镜4被插入在扫描目镜3和扫描镜筒透镜5之间的照明光束16的路径中。聚焦透镜4下方的双箭头表示其可沿光轴9移动。从而可针对使用不同的物镜7时焦平面6的不同位置来调节聚焦透镜4的位置。
[0046] 在插入聚焦透镜4的同时或紧随其后，将望远镜光器件1从光束16的路径中移开。以这种方式，可确保照明光束不被扩展，从而入射在样本8每单元面积上的光强都很高。在此处示出的用于GSDIM方法的显微镜照明模式中，无需在扫描镜装置2中倾斜扫描镜。通过从照明光束16的路径中移开望远镜光器件1，样本8上的光强增大了25倍。这种能量密度是需要的，以在照射的样本表面上给予充分的激发能量。
[0047] 附图标记列表
[0048] 1 望远镜光器件
[0049] 2 扫描镜装置
[0050] 3 扫描目镜
[0051] 4 聚焦透镜
[0052] 5 扫描镜筒透镜
[0053] 6 物镜的后焦面
[0054] 7 物镜
[0055] 8 样本
[0056] 9 光轴
[0057] 10 照明源装置
[0058] 11 望远镜
[0059] 12 扫描镜
[0060] 13 扫描目镜
[0061] 14 传送光器件
[0062] 15 观察光束
[0063] 16 照明光束
[0064] 17 准直光器件
[0065] 18 光源
[0066] 19 分束镜
[0067] 21 镜筒透镜
[0068] 22 图像
[0069] 29 平面镜
[0070] 31 准直光器件
[0071] 32 光源，激光辐射源
[0072] 100 显微镜照明单元
[0073] 200 显微镜
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