一种人肺腺癌自发转移细胞株及其建立方法
阅读：855发布：2020-07-12
专利汇可以提供一种人肺腺癌自发转移细胞株及其建立方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属 微 生物 动物细胞系领域。本发明采用人 肺 腺癌SPC－A－1细胞株为源细胞，建立具有自发转移高潜能的人肺腺癌自发转移细胞株SPC－A－1－BM，保藏编号：CGMCC No.1577。所述细胞具有以下生物学特性：肺、淋巴结和骨组织自发高转移率及其高滞瘤率，其中滞瘤率达100％，肺转移80％，淋巴结转移85％，骨转移25％； 染色 体核型属亚三倍体，染色体变异大，细胞DNA不稳定；对EGFR 信号 通路的依赖性降低，伴随抗凋亡蛋白生存素和Bcl－2以及血管生成因子基因表达的上调。所述细胞株是理想的人肺腺癌的自发转移研究模型，在揭示人肺腺癌的转移机制和抗转移药物筛选中有着广阔的前景。，下面是一种人肺腺癌自发转移细胞株及其建立方法专利的具体信息内容。
1、一种人肺腺癌自发转移细胞株，其特征是所述细胞分类命名：人肺腺癌 自发转移细胞株SPC-A-1-BM，保藏编号：CGMCC No.1577。
2、按权利要求1所述的人肺腺癌自发转移细胞株，其特征是所述细胞具有 以下生物学特性：
1)具有肺、淋巴结和骨组织自发高转移率及其高滞瘤率，其中滞瘤率达 100％，肺转移80％，淋巴结转移85％，骨转移25％；
2)染色体核型属亚三倍体，染色体变异大，细胞DNA不稳定；
3)细胞株的生长对EGFR信号通路的依赖性降低，伴随着抗凋亡蛋白生 存素和Bcl-2以及血管生成因子VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D基因表达的上调。
3、按权利要求1所述的人肺腺癌自发转移细胞株，其特征是所述细胞株的源 细胞是SPC-A-1细胞。
4、按权利要求1所述的人肺腺癌自发转移细胞株的建立方法，其特征是通过 下述步骤：
1)免疫缺陷小鼠血道注射源细胞后形成脏器转移；
2)小鼠尾静脉注射放射性同位素骨显像剂后通过单光子发射型计算机 断层仪或配置针孔准直器的伽马相机行骨显像检出小鼠骨转移灶；
3)病变骨组织进行体外培养获得以骨转移为主的转移性肺腺癌细胞亚 群；
4)步骤3)的癌细胞重复上述循环获得具有骨转移为主高潜能的人肺腺 癌细胞亚群；
5)步骤4)的骨转移人肺腺癌细胞种植在小鼠肺部60天后取纵隔淋巴 结体外培养，得淋巴结转移细胞；
6)将步骤5)的淋巴结转移细胞再作小鼠肺部种植，完成第十个循环， 得人肺腺癌自发转移细胞株；
7)将步骤6)的人肺腺癌自发转移细胞株小鼠皮下种植。
5、按权利要求4所述的人肺腺癌自发转移细胞株的建立方法，其中步骤7) 的小鼠皮下种植人肺腺癌自发转移细胞200万/鼠，60天。
技术领域
本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有自发转移高潜 能的人肺腺癌细胞株及其建立方法和用途。
背景技术
肺癌是最常见、恶性程度最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率和死亡率 的前3位。在我国尤其是大、中城市，肺癌自二十世纪八十年代起始终是首位恶性肿 瘤杀手。目前，肺癌的临床治疗原则是以外科手术为主的多学科综合治疗。经过几 十年的不懈努力，目前已有相当一部分病人可采取早诊断、早治疗和积极的综合治 疗(包括手术、放疗、化疗和生物治疗等)而获得长期生存，但大部分病人就诊时 已属晚期，肿瘤广泛转移，其中骨转移的发生率高达52.3％和49.6％[Moriwaki，Gan To Kagaku Ryoho，1987 14；1680-87]，尤其肺腺癌竟高达62.1％[杨瑞品，中华核医 学杂志，1992 12；24-26]。这类患者的治疗效果很差，一年生存率不超过20％。目 前对于肺癌转移缺乏有效的诊疗方法和药物。因此，深入研究人肺腺癌转移的分子 机理和积极寻找有效的诊疗手段，具有非常重要的意义。由于IIIa期以上的晚期 肺癌属于手术禁忌，难以获得实验材料对转移癌细胞进行系统研究，因而建立人体 肺腺癌的转移模型是目前开展此类研究的唯一选择。
目前，已有的小鼠转移模型是由左心室、尾静脉血道种植肿瘤细胞而形成多脏 器转移的实验转移模型[Wakabayashi，Oncology，2000 Jun；59(1)：75-80；Sasaki， Anticancer Res，1998 May-Jun；18(3A)：1579-84；Iguchi，Cancer Res，1996 Sep 1；56(17)：4040-3；Miki，Oncol Res，2000 12(5)：209-217.]，也有支气管灌注或肺穿刺 植入肿瘤细胞后形成脏器转移的肺癌原位转移模型[March，Vet Pathol，2001 38：483-490；Hastings，Anticancer Res，2000 20：3625-30；McLemore，Cancer Res， 1987 47：5132-40]。
近年来，自发转移模型越来越受到肿瘤研究机构和学者的重视，有肝癌自发转 移模型[Gao，World J Gastroenterol，2004 10：3107-11]、乳腺癌自发转移模型 [Wong，Am J Pathol，2002 161：749-753]、肉瘤自发转移模型[Yamamoto，Clin Exp Metastasis，2003 20：181-185]、肺癌自发转移模型，Inufusa[Nippon Geka Gakkai Zasshi.1988 Jul；89(7)：1075-82]仅在裸鼠皮下种植人肺腺癌转移亚型细胞产生肺转 移而在血液和肌肉中种植不转移；Teraoka[Jpn J Cancer Res.1995 May；86(5)：419-23] 将人肺组织种植在SCID鼠的胸部皮下，然后皮下种植人肺鳞癌和腺癌细胞比较种植 在SCID身上的人肺组织和鼠肺组织的转移情况；Kozaki[Cancer Res，2000 60：2535-40]将人肺大细胞癌H460细胞和它的淋巴结转移亚型细胞H460-LNM35分别 种植在SCID鼠皮下比较两组SCID鼠前哨淋巴结和肺转移情况，结果前哨淋巴结组 差异明显而肺转移组未见明显差异；Miyahara[Thorac Cardiovasc Surg.2005 Apr；53(2)：118-21]建Lweis鼠肺癌细胞自发转移模型研究某药物疗效。
国内外文献均未见具有自发转移同时侵袭肺、淋巴结(纵隔和腋下淋巴结)和 骨组织的高转移性人肺腺癌细胞株的报道。
各种来源的肿瘤细胞在体内自发转移在多数情况下是有固定的靶器官，即这些 具有转移性的肿瘤亚细胞群(subpopulation)在控制得很好的实验条件下，会按照固 定的方法在固定区域内形成肿瘤转移灶，而这些固定的肿瘤转移模型正是肿瘤工作 者作为抗肿瘤转移药物筛选的工具及肿瘤病理学家作为了解肿瘤转移病理过程的手 段和模型。[卢大用，河南医学研究20009(3)：2822-51]。
目前，已有的小鼠转移模型是由左心室、尾静脉血道种植肿瘤细胞而形成多脏 器转移的实验转移模型[Wakabayashi，Oncology，2000 Jun；59(1)：75-80；Sasaki， Anticancer Res，1998 May-Jun；18(3A)：1579-84；Iguchi，Cancer Res，1996 Sep 1；56(17)：4040-3；Miki，Oncol Res，2000 12(5)：209-217.]，也有支气管灌注或肺穿刺 植入肿瘤细胞后形成脏器转移的肺癌原位转移模型[March，Vet Pathol，2001 38：483-490；Hastings，Anticancer Res，2000 20：3625-30；McLemore，Cancer Res， 1987 47：5132-40]。
近年来，自发转移模型越来越受到肿瘤研究机构和学者的重视，有肝癌自发转 移模型[Gao，World J Gastroenterol，2004 10：3107-11]、乳腺癌自发转移模型 [Wong，Am J Pathol，2002 161：749-753]、肉瘤自发转移模型[Yamamoto，Clin Exp Metastasis，2003 20：181-185]、肺癌自发转移模型，Inufusa[Nippon Geka Gakkai Zasshi.1988 Jul；89(7)：1075-82]仅在裸鼠皮下种植人肺腺癌转移亚型细胞产生肺转 移而在血液和肌肉中种植不转移；Teraoka[Jpn J Cancer Res.1995 May；86(5)：419-23] 将人肺组织种植在SCID鼠的胸部皮下，然后皮下种植人肺鳞癌和腺癌细胞比较种植 在SCID身上的人肺组织和鼠肺组织的转移情况；Kozaki[Cancer Res，2000 60：2535-40]将人肺大细胞癌H460细胞和它的淋巴结转移亚型细胞H460-LNM35分别 种植在SCID鼠皮下比较两组SCID鼠前哨淋巴结和肺转移情况，结果前哨淋巴结组 差异明显而肺转移组未见明显差异；Miyahara[Thorac Cardiovasc Surg.2005 Apr；53(2)：118-21]建Lweis鼠肺癌细胞自发转移模型研究某药物疗效。
国内外文献均未见具有自发转移同时侵袭肺、淋巴结(纵隔和腋下淋巴结)和 骨组织的高转移性人肺腺癌细胞株的报道。
各种来源的肿瘤细胞在体内自发转移在多数情况下是有固定的靶器官，即这些 具有转移性的肿瘤亚细胞群(subpopulation)在控制得很好的实验条件下，会按照固 定的方法在固定区域内形成肿瘤转移灶，而这些固定的肿瘤转移模型正是肿瘤工作 者作为抗肿瘤转移药物筛选的工具及肿瘤病理学家作为了解肿瘤转移病理过程的手 段和模型。[卢大用，河南医学研究20009(3)：2822-51]。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有自发转移高潜能的人肺腺癌自发转移细胞株。本 发明的进一步目的是提供该人肺腺癌细胞株的医用用途。
本发明采用人肺腺癌SPC-A-1细胞株作为源细胞，通过免疫缺陷小鼠体内、外 连续筛选及核素骨显像检测的方法，建立了具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株 (Human Lung Adenocarcinoma cell Subpopulation with Highly Bone Metastasis， SPC-A-1BM，CGMCC No.1226，)。本发明在人肺腺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM 的基础上，将人肺腺癌骨转移细胞再经实验小鼠肺部种植后形成对侧肺、纵隔和腋 下淋巴结转移，在小鼠肺部种植60天后处死，取纵隔淋巴结体外培养。待细胞长出 后再种植在小鼠的肺部。经过3个循环后获得具有肺、淋巴结和骨自发转移高潜能 的人肺腺癌细胞亚群(Human Lung Adenocarcinoma Subline with Spontaneous Metastases Characters，SPC-A-1SM)，已于2005年12月26日保藏，保藏单位： CGMCC，北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号：CGMCC No.1577，分类命 名：人肺腺癌自发转移细胞株SPC-A-1-SM。
本发明细胞株具有以下生物学特性：
1、具有肺、淋巴结和骨组织自发转移高转移率及其高滞瘤率，
本发明对亲代细胞和自发转移细胞进行了比较，结果显示，本发明细胞株在肺、 淋巴结和骨组织转移率及其滞瘤率明显高，滞瘤率达100％；肺转移80％；淋巴结 转移85％；骨转移25％。表1是亲代和自发转移细胞肺、淋巴结和骨组织转移率(转 移鼠/种植鼠)及其滞瘤率比较(％)。
表1.
肺转移 淋巴结转移 骨转移 滞瘤率 细胞种植部位 左心室 皮下 左心室 皮下 左心室 皮下 皮下 SPC-A-1 0/10(0) 0/10(0) 3/10(30) 3/10(30) 2/19(10.5) 0/10(0) 8/10(80) SPC-A-1SM 8/8(100) 16/20(80) 8/8(100) 17/20(85) 8/8(100) 5/20(25) 20/20(100)
2，染色体核型分析显示：SPC-A-1SM细胞属亚三倍体，且每个细胞的染色体 存在较大变异，说明该细胞DNA的不稳定性。
本发明计100个细胞的染色体条带分析和G分带-核型分析，结果显示： SPC-A-1SM细胞属亚三倍体且每个细胞的染色体存在较大变异，说明该细胞DNA 的不稳定性，其中第2、7、13、15、17、22增加一条，23号增加2条；第9、16号减 少一条；第7号短臂倒位一条；15号易位染色体一条；性染色体分别是XX和Y。表2是 细胞计数表(计100个细胞)。
表2.
染色体条数/细胞 ≤0 41-50 51-60 61-70 ＞70 细胞数 5 5 40 40 10
3，本发明细胞株的生长对EGFR信号通路的依赖性降低，这种降低伴随着抗 凋亡蛋白生存素(Survivin)和Bcl-2以及血管生成因子VEGF-B、VEGF-C及 VEGF-D基因表达的上调。
本发明采用定量PCR技术分别对亲代细胞SPC-A-1和自发转移细胞 SPC-A-1SM中上皮生长因子受体(EGFR/HER)家族、血管内皮生长因子(VEGF) 家族和3个抗凋亡蛋白的基因表达进行了测试分析，结果显示，与亲代细胞比较， 本自发转移细胞中除erbB4/HER4受体表达增高外其他受体表达显著下降，提示此 类细胞的生长对EGFR信号通路的依赖性降低，这种降低伴随着抗凋亡蛋白生存素 (Survivin)和Bcl-2以及血管生成因子VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D基因表达 的上调。表3是亲代细胞和自发转移细胞的基因表达分析。
表3.
目标基因 基因表达值 比值(％) SPC-A-1 SPC-A-1SM EGFR/HER1 7247.1 2198.3 30％ ErbB2/HER2 11294 8362.1 74％ ErbB3/HER3 9129 1755.7 19％ ErbB4/HER4 27 45.4 168％ VEGF-A 52941.1 15316.1 29％ VEGF-B 21458.8 39080.5 182％ VEGF-C 2988.2 24368 816％ VEGF-D 10.3 175.0 1699％ Survivin 39764.7 43103.4 108％ Bcl-2 1305.9 4281.6 328％ Bcl-xL 202.4 36.5 18％
本发明通过下述方法建立具有自发转移高潜能的人肺腺癌自发转移细胞株。
采用实验动物免疫缺陷小鼠(NIH-BNX mice)，在已建立的人肺腺癌骨转移细 胞株及其动物模型的基础上(国家发明专利申请号：200410093062.8)，将人肺腺癌 骨转移细胞再经实验小鼠肺部种植后形成对侧肺、纵隔和腋下淋巴结转移，在小鼠 肺部种植60天后处死，取纵隔淋巴结体外培养。待细胞长出后再种植在小鼠的肺部。 经过3个循环后获得具有肺、淋巴结和骨转移高潜能的自发转移性人肺腺癌细胞亚 群。所述的建株过程包括下述步骤：
1.免疫缺陷小鼠血道注射亲代肺腺癌细胞SPC-A-1后形成个别脏器转移；
2.小鼠尾静脉注射放射性同位素骨显像剂后通过单光子发射型计算机断层 仪(SPECT)或配置自行设计的特殊孔径的针孔准直器的伽马相机行骨显像检出小 鼠骨转移病灶；
3.切除病变骨组织进行体外培养获得以骨转移为主的转移性肺腺癌细胞亚 群；
4.用这些癌细胞重复以上循环以获得具有骨转移为主高潜能的人肺腺癌细 胞亚群；
5.将经过7次循环，骨转移率达80％以上的转移细胞种植在小鼠肺部60天 后取纵隔淋巴结体外培养；
6.将纵隔淋巴结培养出的转移细胞再作小鼠肺部种植，然后完成第十个循 环，培养出的转移细胞经小鼠皮下注射滞瘤率达100％；肺转移80％；淋巴结转移85％； 骨转移25％。
本发明建立了以人肺腺癌的自发转移细胞株及其动物模型。自发转移细胞株及 其动物模型，较其它实验性转移细胞株及动物模型更接近人类发病机制。该模型的 建立不仅为深入研究肺癌转移的机理提供了一个理想的材料，而且随着研究的深入， 可进一步抗转移药物筛选及开发出新颖有效的治疗手段，使广大肺癌病人受益，具 有显著的科学意义和应用价值。
附图说明：
图1是亲代细胞SPC-A-1。图2是本发明细胞株第10代转移细胞。图3是本 发明细胞株第12代转移细胞。图4是本发明细胞株染色体G分带。图5是本发明细 胞株染色体核型分析。图6是本发明细胞株皮下种植60天脊柱转移。图7是本发明细 胞株腋下淋巴结转移。图8是本发明细胞株纵隔淋巴结转移。图9本发明细胞株是脊 柱转移病理，HE×100。图10是本发明细胞株腋下、肋间LN转移。图11是本发明细 胞株肺广泛转移。图12是本发明细胞株玻片夹击法示肺转移。
本发明采用人肺腺癌SPC-A-1细胞株作为源细胞，通过免疫缺陷小鼠体内、外 连续筛选及核素骨显像检测的方法，建立了具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株 (Human Lung Adenocarcinoma cell Subpopulation with Highly Bone Metastasis， SPC-A-1BM，CGMCC No.1226，)。本发明在人肺腺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM 的基础上，将人肺腺癌骨转移细胞再经实验小鼠肺部种植后形成对侧肺、纵隔和腋 下淋巴结转移，在小鼠肺部种植60天后处死，取纵隔淋巴结体外培养。待细胞长出 后再种植在小鼠的肺部。经过3个循环后获得具有肺、淋巴结和骨自发转移高潜能 的人肺腺癌细胞亚群(Human Lung Adenocarcinoma Subline with Spontaneous Metastases Characters，SPC-A-1SM)，已于2005年12月26日保藏，保藏单位： CGMCC，北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号：CGMCC No.1577，分类命 名：人肺腺癌自发转移细胞株SPC-A-1-SM。
本发明细胞株具有以下生物学特性：
1、具有肺、淋巴结和骨组织自发转移高转移率及其高滞瘤率，
本发明对亲代细胞和自发转移细胞进行了比较，结果显示，本发明细胞株在肺、 淋巴结和骨组织转移率及其滞瘤率明显高，滞瘤率达100％；肺转移80％；淋巴结 转移85％；骨转移25％。表1是亲代和自发转移细胞肺、淋巴结和骨组织转移率(转 移鼠/种植鼠)及其滞瘤率比较(％)。
表1.
肺转移 淋巴结转移 骨转移 滞瘤率 细胞种植部位 左心室 皮下 左心室 皮下 左心室 皮下 皮下 SPC-A-1 0/10(0) 0/10(0) 3/10(30) 3/10(30) 2/19(10.5) 0/10(0) 8/10(80) SPC-A-1SM 8/8(100) 16/20(80) 8/8(100) 17/20(85) 8/8(100) 5/20(25) 20/20(100)
2，染色体核型分析显示：SPC-A-1SM细胞属亚三倍体，且每个细胞的染色体 存在较大变异，说明该细胞DNA的不稳定性。
本发明计100个细胞的染色体条带分析和G分带-核型分析，结果显示： SPC-A-1SM细胞属亚三倍体且每个细胞的染色体存在较大变异，说明该细胞DNA 的不稳定性，其中第2、7、13、15、17、22增加一条，23号增加2条；第9、16号减 少一条；第7号短臂倒位一条；15号易位染色体一条；性染色体分别是XX和Y。表2是 细胞计数表(计100个细胞)。
表2.
染色体条数/细胞 ≤0 41-50 51-60 61-70 ＞70 细胞数 5 5 40 40 10
3，本发明细胞株的生长对EGFR信号通路的依赖性降低，这种降低伴随着抗 凋亡蛋白生存素(Survivin)和Bcl-2以及血管生成因子VEGF-B、VEGF-C及 VEGF-D基因表达的上调。
本发明采用定量PCR技术分别对亲代细胞SPC-A-1和自发转移细胞 SPC-A-1SM中上皮生长因子受体(EGFR/HER)家族、血管内皮生长因子(VEGF) 家族和3个抗凋亡蛋白的基因表达进行了测试分析，结果显示，与亲代细胞比较， 本自发转移细胞中除erbB4/HER4受体表达增高外其他受体表达显著下降，提示此 类细胞的生长对EGFR信号通路的依赖性降低，这种降低伴随着抗凋亡蛋白生存素 (Survivin)和Bcl-2以及血管生成因子VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D基因表达 的上调。表3是亲代细胞和自发转移细胞的基因表达分析。
表3.
目标基因 基因表达值 比值(％) SPC-A-1 SPC-A-1SM EGFR/HER1 7247.1 2198.3 30％ ErbB2/HER2 11294 8362.1 74％ ErbB3/HER3 9129 1755.7 19％ ErbB4/HER4 27 45.4 168％ VEGF-A 52941.1 15316.1 29％ VEGF-B 21458.8 39080.5 182％ VEGF-C 2988.2 24368 816％ VEGF-D 10.3 175.0 1699％ Survivin 39764.7 43103.4 108％ Bcl-2 1305.9 4281.6 328％ Bcl-xL 202.4 36.5 18％
本发明通过下述方法建立具有自发转移高潜能的人肺腺癌自发转移细胞株。
采用实验动物免疫缺陷小鼠(NIH-BNX mice)，在已建立的人肺腺癌骨转移细 胞株及其动物模型的基础上(国家发明专利申请号：200410093062.8)，将人肺腺癌 骨转移细胞再经实验小鼠肺部种植后形成对侧肺、纵隔和腋下淋巴结转移，在小鼠 肺部种植60天后处死，取纵隔淋巴结体外培养。待细胞长出后再种植在小鼠的肺部。 经过3个循环后获得具有肺、淋巴结和骨转移高潜能的自发转移性人肺腺癌细胞亚 群。所述的建株过程包括下述步骤：
1.免疫缺陷小鼠血道注射亲代肺腺癌细胞SPC-A-1后形成个别脏器转移；
2.小鼠尾静脉注射放射性同位素骨显像剂后通过单光子发射型计算机断层 仪(SPECT)或配置自行设计的特殊孔径的针孔准直器的伽马相机行骨显像检出小 鼠骨转移病灶；
3.切除病变骨组织进行体外培养获得以骨转移为主的转移性肺腺癌细胞亚 群；
4.用这些癌细胞重复以上循环以获得具有骨转移为主高潜能的人肺腺癌细 胞亚群；
5.将经过7次循环，骨转移率达80％以上的转移细胞种植在小鼠肺部60天 后取纵隔淋巴结体外培养；
6.将纵隔淋巴结培养出的转移细胞再作小鼠肺部种植，然后完成第十个循 环，培养出的转移细胞经小鼠皮下注射滞瘤率达100％；肺转移80％；淋巴结转移85％； 骨转移25％。
本发明建立了以人肺腺癌的自发转移细胞株及其动物模型。自发转移细胞株及 其动物模型，较其它实验性转移细胞株及动物模型更接近人类发病机制。该模型的 建立不仅为深入研究肺癌转移的机理提供了一个理想的材料，而且随着研究的深入， 可进一步抗转移药物筛选及开发出新颖有效的治疗手段，使广大肺癌病人受益，具 有显著的科学意义和应用价值。
附图说明：
图1是亲代细胞SPC-A-1。图2是本发明细胞株第10代转移细胞。图3是本 发明细胞株第12代转移细胞。图4是本发明细胞株染色体G分带。图5是本发明细 胞株染色体核型分析。图6是本发明细胞株皮下种植60天脊柱转移。图7是本发明细 胞株腋下淋巴结转移。图8是本发明细胞株纵隔淋巴结转移。图9本发明细胞株是脊 柱转移病理，HE×100。图10是本发明细胞株腋下、肋间LN转移。图11是本发明细 胞株肺广泛转移。图12是本发明细胞株玻片夹击法示肺转移。
具体实施方式
实施例1
1，预实验人肺腺癌细胞1×106，注入免疫缺陷小鼠皮下，待瘤子长到 0.5-1公分时取出瘤子，取周边瘤体组织剪碎、捣浆、细胞培养，细胞长出后扩增 到所需细胞量备用。
2，免疫缺陷小鼠体重大于20克，雌雄不论。购进后SPF级笼养数日。
3，麻醉实验动物在小鼠的腹腔和腿部肌肉分别注入稀释硫喷妥钠 (0.75mg/只)及氯胺酮(1.5mg/只)。待用(静脉系统注射癌细胞不需麻醉)。
4，癌细胞注射首次在麻醉小鼠的左心室注入0.8×106 SPC-A-1人肺腺癌细 胞。
5，称重注射两周后隔天称重。体重低于16克要严密观察防止死亡。
6，显像每两周分别作同位素骨扫描，发现骨转移灶后取出作体外培养。免 疫缺陷小鼠经左心室注射人肺腺癌细胞后形成转移，通过小鼠尾静脉注射放射性同 位素后，在配置自行设计、委托加工的孔径直径为1mm的针孔准直器的伽马相机和 双探头西门子ECT平面骨显像确定骨转移病灶(放射性同位素骨扫描检测骨转移病 灶比X线早3-6个月)。
7，骨转移细胞体外传代培养 将取出的小鼠疑似骨转移灶，剪成小块放细胞 培养瓶培养，待长出癌细胞后进一步扩增，然后将骨转移细胞再注射于小鼠血道。 获得骨转移性肺癌细胞亚群。
8，将经过7次循环，骨转移率达80％以上的骨转移细胞种植在小鼠肺部60 天后取纵隔淋巴结体外培养。
9，将纵隔淋巴结培养出的转移细胞再作小鼠肺部种植。经过肺内种植体外培 养3个循环后，获得自发转移细胞，命名为：SPC-A-1SM。该自发转移细胞经小鼠 皮下注射2×106/只，滞瘤率达100％；荷瘤60天后，肺转移80％；淋巴结转移85％； 骨转移25％。
本发明细胞株与为源细胞SPC-A-1进行比较，结果显示：SPC-A-1SM其浸润、 迁徙、侵袭能力是源细胞无法比拟的。a，皮下种植自发转移细胞后，小鼠成瘤率 100％；皮下种植源细胞SPC-A-1后，小鼠成瘤率80％。b，皮下种植自发转移细胞 60天后，肺转移结节数为7-49个，平均数为11个，肺转移率达80％；淋巴结转移 灶数目为6-12个，平均为8个，淋巴结转移率达85％；骨转移灶数目为1-3个，平 均0.3个，骨转移率达25％。而皮下种植源细胞SPC-A-1后，肺转移率为零、淋巴 结转移率30％、骨转移率为零。c，皮下种植自发转移细胞和源细胞后，其它脏器 均未发现明显转移。d，皮下种植自发转移细胞200万后，小鼠生存天数为66-92 天。而皮下种植源细胞200万后，在同等条件下，小鼠生存天数为130-180天。
实施例2
1，自发转移细胞 200万细胞/只BNX鼠，备用。
2，免疫缺陷小鼠 体重18克，6-7周龄，雌雄兼用。购进后SPF级笼养数 日。
3，自发转移模型制作 将自发转移细胞各100万/0.1毫升注射在小鼠左右 两侧皮下。
4，测量瘤子 三周后每周测量瘤子大小。45天后要严密观察防止死亡。
5，显像 皮下癌细胞种植60天作同位素骨扫描，扫描前小鼠深度麻醉，在 扫描过程中部分较大肺结节、淋巴结和骨转移灶呈现放射性浓聚现象，须重点探查。
6，解剖 解剖前测量瘤子大小，全身数码照相。解剖从腹部开始，观察瘤子 血供、前哨、腋下和纵隔等部位淋巴结分布；肺部转移状况，可以用玻片夹击肺组 织观看肺转移，必要时计算肺结节数、淋巴结数(前哨、腋下和纵隔)。取放射性浓 聚的骨组织浸泡福尔马林送检病理。各要点均数码照相。
7，填好database和表格。
本发明所述实验用BNX鼠显像前因显像时间较长必须注射麻醉药，而且尽可能 排净小便；所采用的细胞培养基为本领域公知的10％胎牛血清RPMI 1640培养基， pH＝7，CO2孵养箱培育为37℃、CO2浓度为5％。
1，预实验人肺腺癌细胞1×106，注入免疫缺陷小鼠皮下，待瘤子长到 0.5-1公分时取出瘤子，取周边瘤体组织剪碎、捣浆、细胞培养，细胞长出后扩增 到所需细胞量备用。
2，免疫缺陷小鼠体重大于20克，雌雄不论。购进后SPF级笼养数日。
3，麻醉实验动物在小鼠的腹腔和腿部肌肉分别注入稀释硫喷妥钠 (0.75mg/只)及氯胺酮(1.5mg/只)。待用(静脉系统注射癌细胞不需麻醉)。
4，癌细胞注射首次在麻醉小鼠的左心室注入0.8×106 SPC-A-1人肺腺癌细 胞。
5，称重注射两周后隔天称重。体重低于16克要严密观察防止死亡。
6，显像每两周分别作同位素骨扫描，发现骨转移灶后取出作体外培养。免 疫缺陷小鼠经左心室注射人肺腺癌细胞后形成转移，通过小鼠尾静脉注射放射性同 位素后，在配置自行设计、委托加工的孔径直径为1mm的针孔准直器的伽马相机和 双探头西门子ECT平面骨显像确定骨转移病灶(放射性同位素骨扫描检测骨转移病 灶比X线早3-6个月)。
7，骨转移细胞体外传代培养 将取出的小鼠疑似骨转移灶，剪成小块放细胞 培养瓶培养，待长出癌细胞后进一步扩增，然后将骨转移细胞再注射于小鼠血道。 获得骨转移性肺癌细胞亚群。
8，将经过7次循环，骨转移率达80％以上的骨转移细胞种植在小鼠肺部60 天后取纵隔淋巴结体外培养。
9，将纵隔淋巴结培养出的转移细胞再作小鼠肺部种植。经过肺内种植体外培 养3个循环后，获得自发转移细胞，命名为：SPC-A-1SM。该自发转移细胞经小鼠 皮下注射2×106/只，滞瘤率达100％；荷瘤60天后，肺转移80％；淋巴结转移85％； 骨转移25％。
本发明细胞株与为源细胞SPC-A-1进行比较，结果显示：SPC-A-1SM其浸润、 迁徙、侵袭能力是源细胞无法比拟的。a，皮下种植自发转移细胞后，小鼠成瘤率 100％；皮下种植源细胞SPC-A-1后，小鼠成瘤率80％。b，皮下种植自发转移细胞 60天后，肺转移结节数为7-49个，平均数为11个，肺转移率达80％；淋巴结转移 灶数目为6-12个，平均为8个，淋巴结转移率达85％；骨转移灶数目为1-3个，平 均0.3个，骨转移率达25％。而皮下种植源细胞SPC-A-1后，肺转移率为零、淋巴 结转移率30％、骨转移率为零。c，皮下种植自发转移细胞和源细胞后，其它脏器 均未发现明显转移。d，皮下种植自发转移细胞200万后，小鼠生存天数为66-92 天。而皮下种植源细胞200万后，在同等条件下，小鼠生存天数为130-180天。
实施例2
1，自发转移细胞 200万细胞/只BNX鼠，备用。
2，免疫缺陷小鼠 体重18克，6-7周龄，雌雄兼用。购进后SPF级笼养数 日。
3，自发转移模型制作 将自发转移细胞各100万/0.1毫升注射在小鼠左右 两侧皮下。
4，测量瘤子 三周后每周测量瘤子大小。45天后要严密观察防止死亡。
5，显像 皮下癌细胞种植60天作同位素骨扫描，扫描前小鼠深度麻醉，在 扫描过程中部分较大肺结节、淋巴结和骨转移灶呈现放射性浓聚现象，须重点探查。
6，解剖 解剖前测量瘤子大小，全身数码照相。解剖从腹部开始，观察瘤子 血供、前哨、腋下和纵隔等部位淋巴结分布；肺部转移状况，可以用玻片夹击肺组 织观看肺转移，必要时计算肺结节数、淋巴结数(前哨、腋下和纵隔)。取放射性浓 聚的骨组织浸泡福尔马林送检病理。各要点均数码照相。
7，填好database和表格。
本发明所述实验用BNX鼠显像前因显像时间较长必须注射麻醉药，而且尽可能 排净小便；所采用的细胞培养基为本领域公知的10％胎牛血清RPMI 1640培养基， pH＝7，CO2孵养箱培育为37℃、CO2浓度为5％。
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