用于治疗眼部病症的优化的抗体组合物
阅读：303发布：2021-11-25
专利汇可以提供用于治疗眼部病症的优化的抗体组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了 抗体 缀合物，其包括与 聚合物 (例如，透明质酸(HA)聚合物)共价连接的抗体(例如，抗VEGF抗体)，半胱 氨 酸工程改造的抗体，其药物组合物及其用途，例如用于 治疗 与病理性血管发生相关的病症(例如，眼部病症)。，下面是用于治疗眼部病症的优化的抗体组合物专利的具体信息内容。
1.抗体缀合物，其包含(i)抗体和(ii)共价附接到所述抗体的透明质酸(HA)聚合物，其中所述HA聚合物具有1.1或更低的多分散指数(PDI)。
2.权利要求1的抗体缀合物，其中所述HA聚合物具有1.0至1.1之间的PDI。
3.权利要求2的抗体缀合物，其中所述HA聚合物具有1.0至约1.05之间的PDI。
4.权利要求1-3中任一项的抗体缀合物，其中所述HA聚合物具有约1.0001至约1.05之间的PDI。
5.权利要求4的抗体缀合物，其中所述HA聚合物具有约1.001的PDI。
6.权利要求1-5中任一项的抗体缀合物，其中所述HA聚合物具有约1兆道尔顿(MDa)或更低的分子量。
7.权利要求6的抗体缀合物，其中所述HA聚合物具有约25kDa至约500kDa的分子量。
8.权利要求7的抗体缀合物，其中所述HA聚合物具有约100kDa至约250kDa的分子量。
9.权利要求8的抗体缀合物，其中所述HA聚合物具有约150kDa至约200kDa的分子量。
10.权利要求1-9中任一项的抗体缀合物，其中所述HA聚合物是线性HA聚合物。
11.权利要求1-10中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物具有约10nm至约60nm的流体动力学半径。
12.权利要求11的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物具有约25nm至约35nm的流体动力学半径。
13.权利要求12的抗体缀合物，其中所述流体动力学半径为约20nm至约30nm。
14.权利要求1-13中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物具有相对于未共价附接到HA聚合物的参考抗体增加的眼部半衰期。
15.权利要求14的抗体缀合物，其中相对于参考抗体，所述眼部半衰期增加至少约2倍。
16.权利要求15的抗体缀合物，其中相对于参考抗体，所述眼部半衰期增加至少约4倍。
17.权利要求14-16中任一项的抗体缀合物，其中所述眼部半衰期为玻璃体半衰期。
18.权利要求14-17任一项的抗体缀合物，其中所述参考抗体与所述抗体缀合物的抗体相同。
19.权利要求1-18中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体特异性结合选自由以下各项组成的组的生物分子：血管内皮生长因子(VEGF)；IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；
血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质。
20.权利要求19的抗体缀合物，其中所述VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。
21.权利要求19的抗体缀合物，其中所述与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；
HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。
22.权利要求19的抗体缀合物，其中所述抗体特异性结合VEGF。
23.权利要求22的抗体缀合物，其中所述抗体包含以下六个高变区(HVR)：
(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，其中X1是Ile或His，X2是Ala或Arg，X3是Tyr或Lys，X4是Thr或Glu，X5是Arg、Tyr、Gln或Glu，X6是Ala或Glu，X7是Lys或Glu，和X8是Gly或Glu；
(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含RASQX1VSTAVA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其中X1为Asp或Arg；
(e)HVR-L2，其包含X1ASFLYS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列，其中X1为Ser或Met；和
(f)HVR-L3，其包含X1QGYGX2PFT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，其中X1是Gln、Asn或Thr，和X2是Ala、Asn、Gln或Arg。
24.权利要求23的抗体缀合物，其中所述抗体包含以下六个HVR：
(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)、GITPAGGYEYYADSVKG(SEQ ID NO:21)或GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)或QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。
25.权利要求23或24的抗体缀合物，其中所述抗体包含以下六个HVR：
(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
26.权利要求23-25中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体进一步包含以下重链可变
(VH)结构域构架区(FR)：
(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；
(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；
(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序
列；和
(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。
27.权利要求23-26中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体进一步包含以下轻链可变
(VL)结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；
(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；
(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序
列；和
(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
28.权利要求23或24的抗体缀合物，其中所述抗体包含以下六个HVR：
(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。
29.权利要求28的抗体缀合物，其中所述抗体进一步包含以下VL结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；
(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；
(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序
列；和
(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
30.权利要求23或24的抗体缀合物，其中所述抗体包含以下六个HVR：
(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
31.权利要求30的抗体，其中所述抗体进一步包含以下VL结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、
DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；
(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:
27)的氨基酸序列；
(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和
(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
32.权利要求28-31中任一项的抗体，其中所述抗体进一步包含以下VH结构域FR：
(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或
EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；
(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；
(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序
列；和
(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。
33.权利要求22的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:
11、40或42的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO：12、41或46的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
34.权利要求33的抗体缀合物，其中所述VH结构域进一步包含以下FR：
(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；
(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；
(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序
列；和
(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。
35.权利要求34的抗体缀合物，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
36.权利要求33-35中任一项的抗体缀合物，其中所述VL结构域进一步包含以下FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列；
(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；
(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC(SEQ ID NO:44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列；和
(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)或FGQGTKVEVK(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列。
37.权利要求36的抗体缀合物，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
38.权利要求33的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
39.权利要求33的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
40.权利要求33的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
41.权利要求33的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
42.权利要求22的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:
33或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO：12、34、35、36、37或38的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
43.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体进一步包含以下FR：
(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或
EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；
(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；
(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序
列；和
(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。
44.权利要求43的抗体缀合物，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
45.权利要求43的抗体缀合物，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
46.权利要求42-45中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体进一步包含以下FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、
DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；
(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:
27)的氨基酸序列；
(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和
(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
47.权利要求46的抗体缀合物，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
48.权利要求46的抗体缀合物，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
49.权利要求46的抗体缀合物，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
50.权利要求46的抗体缀合物，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
51.权利要求46的抗体缀合物，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
52.权利要求46的抗体缀合物，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
53.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
54.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
55.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
56.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
57.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
58.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
59.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
60.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
61.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
62.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
63.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)重链，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
64.权利要求42的抗体缀合物，其中所述抗体包含(a)重链，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
65.权利要求22-64中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体能够抑制VEGF与VEGF受体的结合。
66.权利要求65的抗体缀合物，其中所述VEGF受体是VEGF受体1(Flt-1)。
67.权利要求65的抗体缀合物，其中所述VEGF受体是VEGF受体2(KDR)。
68.权利要求22-67中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体以约2nM或更低的Kd结合人VEGF(hVEGF)。
69.权利要求68的抗体缀合物，其中所述抗体以约75pM至约2nM的Kd结合hVEGF。
70.权利要求69的抗体缀合物，其中所述抗体以约75pM至约600pM的Kd结合hVEGF。
71.权利要求70的抗体缀合物，其中所述抗体以约75pM至约500pM的Kd结合hVEGF。
72.权利要求71的抗体缀合物，其中所述抗体以约60pM的Kd结合hVEGF。
73.权利要求23-27、33-41和63-72中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体具有大于约
83.5℃的解链温度(Tm)。
74.权利要求73的抗体缀合物，其中所述抗体具有约85℃至约91℃的Tm。
75.权利要求74的抗体缀合物，其中所述抗体具有约89℃的Tm。
76.权利要求23、24、28-32、42-62中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体具有低于8的等电点(pI)。
77.权利要求76的抗体缀合物，其中所述抗体具有约5至约7的pI。
78.权利要求77的抗体缀合物，其中所述抗体具有约5至约6的pI。
79.权利要求1-78中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
80.权利要求1-79中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体是抗原结合抗体片段。
81.权利要求80的抗体缀合物，其中所述抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。
82.权利要求81的抗体缀合物，其中所述抗体片段是Fab。
83.权利要求1-82中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体是单特异性抗体。
84.权利要求1-82中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体是多特异性抗体。
85.权利要求84的抗体缀合物，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
86.权利要求85的抗体缀合物，其中所述双特异性抗体结合VEGF和选自由以下各项组成的组的第二生物分子：IL-1β；白细胞介素-6(IL-6)；白细胞介素-6受体(IL-6R)；白细胞介素-13(IL-13)；IL-13受体(IL-13R)；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；
VEGF受体；ST-2受体；和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质。
87.权利要求86的抗体缀合物，其中所述VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合的VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR)。
88.权利要求86的抗体缀合物，其中所述与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；
HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。
89.权利要求1-88中任一项的抗体缀合物，其中所述抗体是半胱氨酸工程改造的抗体。
90.权利要求89的抗体缀合物，其中所述半胱氨酸工程改造的抗体包含重链中的半胱氨酸突变，其选自由HC-A118C、HC-A140C和HC-L174C(EU编号)组成的组，或包含轻链中的半胱氨酸突变，其选自由LC-K149C和LC-V205C(Kabat编号)组成的组。
91.权利要求90的抗体缀合物，其中所述重链中的半胱氨酸突变是HC-A118C(EU编号)。
92.权利要求90的抗体缀合物，其中所述重链中的半胱氨酸突变是HC-A140C(EU编号)。
93.权利要求90的抗体缀合物，其中所述重链中的半胱氨酸突变是HC-L174C(EU编号)。
94.权利要求90的抗体缀合物，其中所述轻链中的半胱氨酸突变是LC-K149C(Kabat编号)。
95.权利要求90的抗体缀合物，其中所述轻链中的半胱氨酸突变是LC-V205C(Kabat编号)。
96.权利要求90-95中任一项的抗体缀合物，其中所述HA聚合物在半胱氨酸突变处共价附接到抗体上。
97.权利要求1-96中任一项的抗体缀合物，其用作药物。
98.权利要求1-96中任一项的抗体缀合物，其用于制备用于治疗受试者眼部病症的药物。
99.权利要求1-96中任一项的抗体缀合物，其用于减少或抑制患有眼部病症的受试者中的血管发生。
100.权利要求1-96中任一项的抗体缀合物，其用于治疗受试者的眼部病症。
101.权利要求98-100中任一项用途的抗体缀合物，其中所述眼部病症选自由以下各项组成的组：年龄相关性黄斑变性(AMD)、黄斑变性、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)(包括病灶性、非中心DME和弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其它缺血相关的视网膜病、早产儿视网膜病(ROP)、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(包括近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病、眼的组织胞浆菌病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病、诺里病、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(包括传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、眼睑炎、干眼、外伤性眼损伤和舍格伦病。
102.权利要求101的用途的抗体缀合物，其中所述眼部病症是AMD、DME、DR或RVO。
103.权利要求101或102的用途的抗体缀合物，其中所述眼部病症是AMD。
104.权利要求101-103中任一项用途的抗体缀合物，其中所述AMD是湿性AMD。
105.权利要求101或102的用途的抗体缀合物，其中所述眼部病症是DME。
106.药物组合物，其包含权利要求1-96中任一项的抗体缀合物和药学上可接受的载
体、赋形剂或稀释剂。
107.权利要求106的药物组合物，所述药物组合物进一步包含第二活性剂，其中所述第二活性剂选自由以下各项组成的组：抗体、抗血管发生剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、止痛剂和与第二生物分子结合的化合物。
108.权利要求107的药物组合物，其中所述抗血管发生剂是VEGF拮抗剂。
109.权利要求108的药物组合物，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体融合蛋白、适体、抗VEGF 或VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
110.权利要求109的药物组合物，其中所述抗VEGF抗体是雷珠单抗
RTH-258或双特异性抗VEGF抗体。
111.权利要求110的药物组合物，其中所述双特异性抗VEGF抗体是抗VEGF/抗Ang2抗
体。
112.权利要求111的药物组合物，其中所述抗VEGF/抗Ang2抗体是RG-7716。
113.权利要求109的药物组合物，其中所述可溶性VEGF受体融合蛋白是阿柏西普
114.权利要求109的药物组合物，其中所述适体是培加尼布
115.权利要求109的药物组合物，其中所述抗VEGF 是abicipar pegol。
116.权利要求109的药物组合物，其中所述VEGFR酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、伐他拉尼(PTK787)、semaxaminib(SU5416)和 (舒尼替尼)。
117.权利要求107的药物组合物，其中所述第二生物分子选自由以下各项组成的组：
IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质。
118.权利要求117的药物组合物，其中所述VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、
mbVEGFR或sVEGFR。
119.权利要求117的药物组合物，其中所述与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；
TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。
120.权利要求107和117-119任一项的药物组合物，其中结合第二生物分子的化合物是抗体或其抗原结合片段。
121.权利要求120的药物组合物，其中所述抗原结合抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。
122.权利要求106-121中任一项的药物组合物，其用作药物。
123.权利要求106-121中任一项的药物组合物，其用于制备用于治疗受试者眼部病症的药物。
124.权利要求106-121中任一项的药物组合物，其用于减少或抑制患有眼部病症的受试者中的血管发生。
125.权利要求106-121中任一项的药物组合物，其用于治疗受试者的眼部病症。
126.权利要求123-125中任一项用途的药物组合物，其中所述眼部病症选自由以下各项组成的组：年龄相关性黄斑变性(AMD)、黄斑变性、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)(包括病灶性、非中心DME和弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其它缺血相关的视网膜病、早产儿视网膜病(ROP)、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(包括近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病、眼的组织胞浆菌病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病、诺里病、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(包括传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、眼睑炎、干眼、外伤性眼损伤和舍格伦病。
127.权利要求126的用途的药物组合物，其中所述眼部病症是AMD、DME、DR或RVO。
128.权利要求126或127的用途的药物组合物，其中所述眼部病症是AMD。
129.权利要求126-128中任一项用途的药物组合物，其中所述AMD是湿性AMD。
130.权利要求126或127的用途的药物组合物，其中所述眼部病症是DME。
131.减少或抑制患有眼部病症的受试者中的血管发生的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-96中任一项的抗体缀合物或权利要求106-121中任一项的药物组合物，从而减少或抑制所述受试者中的血管发生。
132.治疗眼部病症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的权利要求1-96中任一项的抗体缀合物或权利要求106-121中任一项的药物组合物。
133.权利要求131或132的方法，其中所述眼部病症选自由以下各项组成的组：年龄相关性黄斑变性(AMD)、黄斑变性、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)(包括病灶性、非中心DME和弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其它缺血相关的视网膜病、早产儿视网膜病(ROP)、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(包括近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病、眼的组织胞浆菌病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病、诺里病、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(包括传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、眼睑炎、干眼、外伤性眼损伤和舍格伦病。
134.权利要求133的方法，其中所述眼部病症是AMD、DME、DR或RVO。
135.权利要求133或134的方法，其中所述眼部病症是AMD。
136.权利要求133-135中任一项的方法，其中所述AMD是湿性AMD。
137.权利要求133或134的方法，其中所述眼部病症是DME。
138.权利要求131-137中任一项的方法，其进一步包括向所述受试者施用有效量的第二活性剂，其中所述第二活性剂选自由以下各项组成的组：抗体、抗血管发生剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、止痛剂和与第二生物分子结合的化合物。
139.权利要求138的方法，其中所述抗血管发生剂是VEGF拮抗剂。
140.权利要求139的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体融合蛋白、适体、抗VEGF 或VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
141.权利要求140的方法，其中所述抗VEGF抗体是雷珠单抗 RTH-258
或双特异性抗VEGF抗体。
142.权利要求141的方法，其中所述双特异性抗VEGF抗体是抗VEGF/抗Ang2抗体。
143.权利要求142的方法，其中所述抗VEGF/抗Ang2抗体是RG-7716。
144.权利要求140的方法，其中所述可溶性VEGF受体融合蛋白是阿柏西普
145.权利要求140的方法，其中所述适体是培加尼布
146.权利要求140的方法，其中所述抗VEGF 是abicipar pegol。
147.权利要求140的方法，其中所述VEGFR酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、伐他拉尼(PTK787)、semaxaminib(SU5416)和 (舒尼替尼)。
148.权利要求138的方法，其中所述第二生物分子选自由以下各项组成的组：IL-1β；
IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ
5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；
ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质。
149.权利要求148的方法，其中所述VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。
150.权利要求149的方法，其中所述与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；
IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。
151.权利要求138和148-150中任一项的方法，其中结合第二生物分子的化合物是抗体或其抗原结合片段。
152.权利要求151的方法，其中所述抗原结合抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。
153.权利要求131-152中任一项的方法，其中所述抗体缀合物或药物组合物以玻璃体内、眼部、眼内、近巩膜、眼球筋膜囊下、脉络膜上、局部、静脉内、肌肉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜内、腹膜、心室内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眶内、口服、经皮、通过吸入、通过注射、通过滴眼液、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以霜剂或以脂质组合物施用。
154.权利要求153的方法，其中所述抗体缀合物或药物组合物以玻璃体内、眼部、眼内、近巩膜、眼球筋膜囊下、脉络膜上或局部施用。
155.权利要求153或154的方法，其中所述抗体缀合物或药物组合物通过注射玻璃体内施用。
156.权利要求153或154的方法，其中所述抗体缀合物或药物组合物通过滴眼液或软膏局部施用。
157.权利要求153或154的方法，其中所述抗体缀合物或药物组合物通过通道递送装置施用。
158.权利要求131-157中任一项的方法，其中所述受试者是人。
用于治疗眼部病症的优化的抗体组合物
[0002] 本申请包含序列表，其以ASCII格式电子提交，并通过引用整体并入本文。所述ASCII拷贝，在2018年3月22日生成，命名为50474-160WO3_Sequence_List_3.22.18_ST25，并且大小为57,671字节。发明领域
[0003] 本发明通常涉及抗体缀合物、半胱氨酸工程改造的抗体、其组合物(例如药物组合物)及其使用方法。
背景技术
[0004] 血管发生是一种紧密调节的过程，通过该过程由预先存在的血管形成新血管。尽管血管发生在发育过程中对于确保充足的血液循环是重要的，但是多种病症与病理性血管发生相关，诸如眼部病症(例如，年龄相关性黄斑变性，AMD)和细胞增生病症(例如，癌症)。血管内皮生长因子(VEGF)是临床验证的血管发生的驱动因子，并且，VEGF的中和(例如，使用抗VEGF封闭性抗体)可以用于治疗与病理性血管发生相关的病症。
[0005] 目前用于治疗与病理性血管发生相关的眼部病症(例如AMD(例如湿性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性视网膜病(DR)和视网膜静脉阻塞(RVO))的方法通常涉及玻璃体内注射VEGF拮抗剂(例如，抗VEGF Fab雷珠单抗)。由于抗VEGF Fab的作用位点在视网膜的眼睛后部，并且还因为Fab在眼睛中具有相对短的停留时间，所以通常通过玻璃体内注射相对频繁的给药(例如每4周1次，Q4W)来获得来自抗VEGF Fab的最大患者益处。可能期望用于眼部病症的抗VEGF抗体或抗体片段(例如Fabs)的长久作用递送，以至少部分地降低给药频率，这可以改善患者的便利性和依应性。
[0006] 仍然需要用于治疗眼部病症(例如AMD(例如湿性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性视网膜病(DR)和视网膜静脉阻塞(RVO))的长久作用递送的抗体组合物。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供了抗体缀合物，其包括与抗体(例如抗VEGF抗体)共价连接的单分散聚合物(例如单分散透明质酸(HA)聚合物)，可用于例如制备抗体缀合物的半胱氨酸工程改造的抗体，包括抗体缀合物的组合物(例如药物组合物)，以及制备和使用它们的方法，例如用于治疗用途。
[0009] 在一个方面，本发明的特征在于抗体缀合物，其包含(i)抗体和(ii)共价附接到所述抗体的透明质酸(HA)聚合物，其中所述HA聚合物具有1.1或更低的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，所述HA聚合物具有1.0至1.1之间的PDI。在一些实施方案中，所述HA聚合物具有1.0至约1.05的PDI。在一些实施方案中，所述HA聚合物具有约1.0001至约1.05之间的PDI。在一些实施方案中，所述HA聚合物具有约1.001的PDI。在一些实施方案中，所述HA聚合物具有约1兆道尔顿(MDa)或更低的分子量。在一些实施方案中，所述HA聚合物具有约25kDa和约500kDa之间的分子量。在一些实施方案中，所述HA聚合物具有约100kDa和约
250kDa之间的分子量。在一些实施方案中，所述HA聚合物具有约150kDa和约200kDa之间的分子量。在一些实施方案中，所述HA聚合物是线性HA聚合物。在一些实施方案中，所述抗体缀合物具有约10nm至约60nm的流体动力学半径。在一些实施方案中，所述抗体缀合物具有约25nm至约35nm的流体动力学半径。在一些实施方案中，所述流体动力学半径为约20nm至约30nm。
250kDa之间的分子量。在一些实施方案中，所述HA聚合物具有约150kDa和约200kDa之间的分子量。在一些实施方案中，所述HA聚合物是线性HA聚合物。在一些实施方案中，所述抗体缀合物具有约10nm至约60nm的流体动力学半径。在一些实施方案中，所述抗体缀合物具有约25nm至约35nm的流体动力学半径。在一些实施方案中，所述流体动力学半径为约20nm至约30nm。
[0010] 在前述方面的一些实施方案中，抗体缀合物具有相对于未共价附接到HA聚合物的参考抗体增加的眼部半衰期。在一些实施方案中，相对于参考抗体，所述眼部半衰期增加至少约2倍。在一些实施方案中，相对于参考抗体，所述眼部半衰期增加至少约4倍。在一些实施方案中，所述眼部半衰期是玻璃体半衰期。在一些实施方案中，所述参考抗体与所述抗体缀合物的抗体相同。
[0011] 在前述方面的一些实施方案中，所述抗体特异性结合选自由以下各项组成的组的生物分子：血管内皮生长因子(VEGF)；IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素(betacellulin)；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质。在一些实施方案中，VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些实施方案中，与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；
CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。
CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。
[0012] 在前述方面的一些实施方案中，所述抗体特异性结合VEGF。在一些实施方案中，所述抗体包含以下六个高变区(HVR)：(A)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，其中X1是Ile或His，X2是Ala或Arg，X3是Tyr或Lys，X4是Thr或Glu，X5是Arg、Tyr、Gln或Glu，X6是Ala或Glu，X7是Lys或Glu，和X8是Gly或Glu；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQX1VSTAVA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其中X1为Asp或Arg；(e)HVR-L2，其包含X1ASFLYS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列，其中X1为Ser或Met；和(f)HVR-L3，其包含X1QGYGX2PFT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，其中X1是Gln、Asn或Thr，和X2是Ala、Asn、Gln或Arg。在一些实施方案中，所述抗体包含以下六个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)、
GITPAGGYEYYADSVKG(SEQ ID NO:21)或GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含
RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)或QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。
GITPAGGYEYYADSVKG(SEQ ID NO:21)或GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含
RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)或QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。
[0013] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体进一步包含以下重链可变(VH)结构域构架区(FR)：(a)FR-H1，其包含
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含以下轻链可变(VL)结构域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含以下轻链可变(VL)结构域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
[0014] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含以下VL结构域FR：(a)FR-L1，其包含
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
[0015] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含以下VL结构域FR：(a)FR-L1，其包含
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含以下VH结构域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或
EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含以下VH结构域FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或
EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。
[0016] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11、40或42的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO：12、41或46的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，所述VH结构域进一步包含以下FR：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；
(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4,其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域进一步包含以下FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC(SEQ ID NO:44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)或FGQGTKVEVK(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4,其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域进一步包含以下FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC(SEQ ID NO:44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)或FGQGTKVEVK(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0017] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0018] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0019] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0020] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
[0021] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:33或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO：12、34、35、36、37或38的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含以下FR：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或
EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含以下FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、
DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含以下FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、
DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
[0022] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
[0023] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
[0024] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
[0025] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
[0026] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
[0027] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0028] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
[0029] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
[0030] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
[0031] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0032] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)重链，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
[0033] 在上述方面的一些实施方案中，所述抗体包含(a)重链，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
[0034] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗体能够抑制VEGF与VEGF受体的结合。在一些实施方案中，所述VEGF受体是VEGF受体1(Flt-1)。在一些实施方案中，所述VEGF受体是VEGF受体2(KDR)。
[0035] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗体以约2nM或更低的Kd结合人VEGF(hVEGF)。在一些实施方案中，所述抗体以约75pM至约2nM之间的Kd结合hVEGF。在一些实施方案中，抗体以约75pM至约600pM之间的Kd结合hVEGF。在一些实施方案中，抗体以约75pM至约500pM之间的Kd结合hVEGF。在一些实施方案中，所述抗体以约80pM的Kd结合hVEGF。在一些实施方案中，所述抗体以约60pM的Kd结合hVEGF。
[0037] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗体具有低于8的等电点(pI)。在一些实施方案中，所述抗体具有约5至约7的pI。在一些实施方案中，所述抗体具有约5至约6的pI。
[0038] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0039] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗体是结合VEGF的抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。在一些实施方案中，所述抗体片段是Fab。
[0040] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗体是单特异性抗体。在任何前述方面的其它实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体结合VEGF和选自由以下各项组成的组的第二生物分子：白细胞介素1β(IL-1β)；白细胞介素-6(IL-6)；白细胞介素-6受体(IL-6R)；白细胞介素-13(IL-13)；IL-13受体(IL-13R)；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质。在一些实施方案中，VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合的VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR)。在一些实施方案中，与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：
补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。
补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。
[0041] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述抗体是半胱氨酸工程改造的抗体。在一些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体包含重链中的半胱氨酸突变，其选自由HC-A118C、HC-A140C和HC-L174C(EU编号)组成的组，或包含轻链中的半胱氨酸突变，其选自由LC-K149C和LC-V205C(Kabat编号)组成的组。在一些实施方案中，重链中的半胱氨酸突变是HC-A118C(EU编号)。在一些实施方案中，重链中的半胱氨酸突变是HC-A140C(EU编号)。在一些实施方案中，重链中的半胱氨酸突变是HC-L174C(EU编号)。在一些实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变是LC-K149C(Kabat编号)。在一些实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变是LC-V205C(Kabat编号)。在一些实施方案中，HA聚合物在半胱氨酸突变处共价附接到抗体上。
[0042] 在另一方面，任何前述抗体缀合物可用作药物。
[0043] 在另一方面，任何前述抗体缀合物可以用于制备用于治疗受试者眼部病症的药物。
[0044] 在另一方面，任何前述抗体缀合物可用于减少或抑制患有眼部病症的受试者中的血管发生。
[0045] 在另一方面，任何前述抗体缀合物可用于治疗受试者的眼部病症。
[0046] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述眼部病症选自由以下各项组成的组：年龄相关性黄斑变性(AMD)、黄斑变性、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)(包括病灶性、非中心DME和弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其它缺血相关的视网膜病、早产儿视网膜病(ROP)、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(包括近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病(von Hippel-Lindau disease)、眼的组织胞浆菌病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病(Coats’disease)、诺里病(Norrie Disease)、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(包括传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、眼睑炎、干眼、外伤性眼损伤和舍格伦病。在一些实施方案中，所述眼部病症是AMD、DME、DR或RVO。在一些实施方案中，所述眼部病症是AMD。在一些实施方案中，所述AMD是湿性AMD。在一些实施方案中，所述眼部病症是DME。
[0047] 在另一方面中，本发明的特征在于药物组合物，其包含本文所述的任一抗体缀合物以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含第二活性剂，其中所述第二活性剂选自由以下各项组成的组：抗体、抗血管发生剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、止痛剂和与第二生物分子结合的化合物。在一些实施方案中，所述抗血管发生剂是VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体融合蛋白、适体、抗VEGF 或VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体是雷珠单抗 RTH-258或双
特异性抗VEGF抗体。在一些实施方案中，双特异性抗-VEGF抗体是抗-VEGF/抗-Ang2抗体。在一些实施方案中，抗VEGF/抗Ang2抗体是RG-7716。在一些实施方案中，所述可溶性VEGF受体融合蛋白是阿柏西普(afibercept， )。在一些实施方案中，所述适体是培加尼
布(pegaptanib， )。在一些实施方案中，所述抗-VEGF 是
abiciparpegol。在一些实施方案中，所述VEGFR酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、伐他拉尼(vatalanib)(PTK787)、semaxaminib(SU5416)和 (舒尼替尼(sunitinib))。在
一些实施方案中，第二生物分子选自由以下各项组成的组：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-
13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；
apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质。在一些实施方案中，VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些实施方案中，与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；
CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。在一些实施方案中，结合第二生物分子的化合物是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。在一些实施方案中，所述抗原结合抗体片段是Fab。
特异性抗VEGF抗体。在一些实施方案中，双特异性抗-VEGF抗体是抗-VEGF/抗-Ang2抗体。在一些实施方案中，抗VEGF/抗Ang2抗体是RG-7716。在一些实施方案中，所述可溶性VEGF受体融合蛋白是阿柏西普(afibercept， )。在一些实施方案中，所述适体是培加尼
布(pegaptanib， )。在一些实施方案中，所述抗-VEGF 是
abiciparpegol。在一些实施方案中，所述VEGFR酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、伐他拉尼(vatalanib)(PTK787)、semaxaminib(SU5416)和 (舒尼替尼(sunitinib))。在
一些实施方案中，第二生物分子选自由以下各项组成的组：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-
13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；
apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质。在一些实施方案中，VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些实施方案中，与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；
CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。在一些实施方案中，结合第二生物分子的化合物是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。在一些实施方案中，所述抗原结合抗体片段是Fab。
[0048] 在另一方面，任何前述药物组合物可用作药物。
[0049] 在另一方面，任何前述药物组合物可以用于制备用于治疗受试者眼部病症的药物。
[0050] 在另一方面，任何前述药物组合物可用于减少或抑制患有眼部病症的受试者中的血管发生。
[0051] 在另一方面，任何前述药物组合物可用于治疗受试者的眼部病症。
[0052] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述眼部病症选自由以下各项组成的组：年龄相关性黄斑变性(AMD)、黄斑变性、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)(包括病灶性、非中心DME和弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其它缺血相关的视网膜病、早产儿视网膜病(ROP)、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(包括近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病(von Hippel-Lindau disease)、眼的组织胞浆菌病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病(Coats’disease)、诺里病(Norrie Disease)、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(包括传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、眼睑炎、干眼、外伤性眼损伤和舍格伦病。在一些实施方案中，所述眼部病症是AMD、DME、DR或RVO。在一些实施方案中，所述眼部病症是AMD。在一些实施方案中，所述AMD是湿性AMD。在一些实施方案中，所述眼部病症是DME。
[0053] 在另一方面，本发明的特征在于减少或抑制患有眼部病症的受试者中的血管发生的方法，包括向受试者施用有效量的本文所述的任何抗体缀合物或本文所述的任何药物组合物，从而减少或抑制受试者中的血管发生。
[0054] 在另一方面，本发明的特征在于治疗眼部病症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的本文所述的任何抗体缀合物或本文所述的任何药物组合物。
[0055] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述眼部病症选自由以下各项组成的组：年龄相关性黄斑变性(AMD)、黄斑变性、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)(包括病灶性、非中心DME和弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其它缺血相关的视网膜病、早产儿视网膜病(ROP)、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(包括近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病(von Hippel-Lindau disease)、眼的组织胞浆菌病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病(Coats’disease)、诺里病(Norrie Disease)、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(包括传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、眼睑炎、干眼、外伤性眼损伤和舍格伦病。在一些实施方案中，所述眼部病症是AMD、DME、DR或RVO。在一些实施方案中，所述眼部病症是AMD。在一些实施方案中，所述AMD是湿性AMD。在一些实施方案中，所述眼部病症是DME。
[0056] 在任何前述方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用有效量的第二活性剂，其中所述第二活性剂选自由以下各项组成的组：抗体、抗血管发生剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、止痛剂和与第二生物分子结合的化合物。在一些实施方案中，所述抗血管发生剂是VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体融合蛋白、适体、抗VEGF 或VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，所述抗VEGF抗体是雷珠单抗 RTH-258或
双特异性抗VEGF抗体。在一些实施方案中，双特异性抗-VEGF抗体是抗-VEGF/抗-Ang2抗体。
在一些实施方案中，抗VEGF/抗Ang2抗体是RG-7716。在一些实施方案中，所述可溶性VEGF受体融合蛋白是阿柏西普(afibercept， )。在一些实施方案中，所述适体是培加
尼布(pegaptanib， )。在一些实施方案中，所述抗-VEGF 是
abicipar pegol。在一些实施方案中，所述VEGFR酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：
4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-
2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、伐他拉尼(vatalanib)(PTK787)、semaxaminib(SU5416)和 (舒尼替尼(sunitinib))。在
一些实施方案中，第二生物分子选自由以下各项组成的组：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-
13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；
apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质。在一些实施方案中，VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些实施方案中，与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；
CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。在一些实施方案中，结合第二生物分子的化合物是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。
双特异性抗VEGF抗体。在一些实施方案中，双特异性抗-VEGF抗体是抗-VEGF/抗-Ang2抗体。
在一些实施方案中，抗VEGF/抗Ang2抗体是RG-7716。在一些实施方案中，所述可溶性VEGF受体融合蛋白是阿柏西普(afibercept， )。在一些实施方案中，所述适体是培加
尼布(pegaptanib， )。在一些实施方案中，所述抗-VEGF 是
abicipar pegol。在一些实施方案中，所述VEGFR酪氨酸激酶抑制剂选自由以下组成的组：
4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-
2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、伐他拉尼(vatalanib)(PTK787)、semaxaminib(SU5416)和 (舒尼替尼(sunitinib))。在
一些实施方案中，第二生物分子选自由以下各项组成的组：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-
13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；
apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质。在一些实施方案中，VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些实施方案中，与AMD风险遗传相关的蛋白质选自由以下各项组成的组：补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；
CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC，COL10A1；和TNFRSF10A。在一些实施方案中，结合第二生物分子的化合物是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。
[0057] 在任何前述方面的一些实施方案中，抗体缀合物或药物组合物以玻璃体内、眼部、眼内、近巩膜、眼球筋膜囊下(subtenonly)、脉络膜上(superchoroidally)、局部、静脉内、肌肉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜内、腹膜、心室内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眶内、口服、经皮、通过吸入、通过注射、通过滴眼液、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以霜剂或以脂质组合物施用。在一些实施方案中，抗体缀合物或药物组合物以玻璃体内、眼部、眼内、近巩膜、眼球筋膜囊下、脉络膜上或局部施用。在一些实施方案中，抗体缀合物或药物组合物通过注射玻璃体内施用。在一些实施方案中，抗体缀合物或药物组合物通过滴眼液或软膏局部施用。在一些实施方案中，抗体缀合物或药物组合物通过通道递送装置施用。
[0058] 在任何前述方面的一些实施方案中，受试者是人。
[0060] 图1A图示了200kDa HA的代表性样品中分子量的总体分布(以摩尔质量表示)。
[0062] 图1C图示了40kDa、200kDa和600kDa HA聚合物的多分散性。该图下方的表格显示了所示样品的数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、多分散指数(PDI)和分子量(MW)范围(以Mw表示)。
[0063] 图2是一系列图，其显示HA-G6.31.AARR缀合物在生理相关的应激条件下具有物理稳定性的差异，如通过串联折射率(RI)和多角度光散射(MALS)检测器的大小排阻层析(SEC)(SEC-RI-MALS)所评估的。系列标签指HA主链分子量(40kDa(“40K”)；200kDa
(“200K”)；和600kDa(“600K”)和Fab的负载水平。
(“200K”)；和600kDa(“600K”)和Fab的负载水平。
[0064] 图3是一系列图，其显示对于HA40K-G6.31.AARR-4.7％(左图)、HA200K-G6.31.AARR-4.7％(中图)和HA600K-G6.31.AARR-2.1％(右图)，SEC保留曲线随时间的变化，表明SEC保留时间向较晚的时间(较小的流体动力学尺寸)偏移，该偏移的程度取决于HA主链分子量。
[0065] 图4是显示SEC-RI-MALS数据的一系列图，其绘制为HA40K-G6.31.AARR-4.7％(左图)、HA200K-G6.31.AARR-4.7％(中图)和HA600K-G6.31.AARR-2.1％(右图)的累积重量分数。
[0066] 图5图示了商业多分散HA(黑色)和单分散HA(灰色)的SEC-RI-MALS表征结果，证明了两种生产技术之间的质量分布差异。右图中的表格显示了通过该分析测定的Mn、Mw和PDI值。
[0067] 图6图示了多分散HA200K-G6.31.AARR(黑色)和单分散HA150K-G6.31.AARR(灰色)的SEC-RI-MALS表征结果，证明了质量分布差异。右图中的表格显示了通过该分析测定的Mn、Mw和PDI值。
[0068] 图7是示意图，显示了通过将标准Fab铰链肽序列延伸至第一或第二铰链二硫化物半胱氨酸，将标准Fab-C格式的分子被设计成含有用于缀合的游离半胱氨酸残基。为了最小化或防止链间二硫化物和该游离半胱氨酸残基之间的乱序，可以替代地将半胱氨酸在空间上与链间二硫化物进一步分离的位置处突变至Fab表面上(本文称为“ThioFabs”)。
[0069] 图8A-8C是一系列示意图，其显示了铰链序列的柔性和空间邻近性可导致重排为三个可能的二硫化物状态，留下三个不同的半胱氨酸残基可用于缀合。图8A显示了预期的构型，其中铰链序列半胱氨酸被还原并可用于缀合。图8B显示了环化的重链(HC)变体，其中铰链半胱氨酸与通常是链间二硫键的部分的HC半胱氨酸残基形成二硫键，从而留下轻链(LC)链间二硫化物半胱氨酸可用于缀合。图8C显示了LC变体，其中铰链半胱氨酸与通常形成链间二硫键的部分的LC半胱氨酸形成二硫键，从而留下HC链间二硫化物半胱氨酸可用于缀合。
[0070] 图9显示了一系列图，显示了在G6.31.AARR.Fab-C上进行的一系列马来酰亚胺加帽(capping)和限制性Lys-C消化实验的结果，并通过反相超高效液相色谱飞行时间(RP-UPLC-TOF)质谱进行分析。峰上的数字是该峰的总离子计数，并且是峰面积的量度。
[0071] 图10A和10B是一系列图,其显示了HA-G6.31.AARR缀合物的限制性Lys-C(图10A)和透明质酸酶(HAase)(图10B)酶消化的结果，证实了存在与通过通常被链间二硫化物占据的两个半胱氨酸的缀合相关的缀合变体。
[0072] 图11是一系列图,其显示了与G6.31.AARR.Fab-C相比，G6.31.AARR ThioFab与HA200K-马来酰亚胺的缀合正常进行，尽管对于ThioFab样品，Fab向缀合物的转化较低。
[0073] 图12图示了在37℃下，在PBS+2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)中,不同形式的来自G6.31.AARR的模型聚乙二醇(PEG)-马来酰亚胺聚合物的解缀合,如通过RP-UPLC-TOF所评估的。
[0074] 图13A显示了4D5轻链的Kabat编号方案。
[0075] 图13B显示了对于4D5抗体，与Kabat编号方案(中间列)和EU编号方案(右列)相比,从N-末端开始的顺序编号方案(左列)。
[0076] 图14图示了与从多分散HA制备的相似大小的HA-G6.31.AARR缀合物相比，由单分散HA制备的HA-G6.31.AARR缀合物在4周生理应激下显示出改善的物理稳定性。右图中的表格显示了第0、2和4周的Mw(kDa)。具体实施方案
[0077] 1.定义
[0078] 本文所用的术语“约”是指本领域技术人员容易知晓的各个值的通常误差范围。本文提及“约”值或参数包括(和描述)针对该值或参数本身的实施方案。
[0079] 用于本文目的的“接纳体人构架”是包含衍生自如下所定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可包含其相同的氨基酸序列，或者其可包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL接纳体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
[0080] “亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法，包括本文所述的那些方法来测量。下面描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
[0081] “亲和力成熟的”抗体是指与不具有下述改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)和/或构架区(FR)具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致抗体针对抗原的亲和力的提高。
[0082] 术语“血管内皮生长因子”或“VEGF”指血管内皮生长因子蛋白A，如SEQ ID NO：47(也参见Swiss Prot登录号P15692，Gene ID(NCBI)：7422)所示例的。术语“VEGF”包括具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的蛋白质及其同源物和同种型。术语“VEGF”也包括VEGF的已知同种型，例如剪接同种型，例如VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，以及其天然存在的等位基因和加工的形式，包括如Ferrara Mol.Biol.Cell.21:687(2010),Leung等,Science,246:1306(1989)和Houck等,Mol.Endocrin.,5:1806(1991)中所述通过VEGF165的纤溶酶切割产生的110个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子。术语“VEGF”也指来自非人类物种如小鼠、大鼠或灵长类的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF用诸如下述的术语表示，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF等。术语“VEGF”也用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8-109或1-109的多肽的截短形式。在本申请中，对任何此类形式的VEGF的引用可以例如通过“VEGF109”、“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”来鉴定。对于“截短的”天然VEGF的氨基酸位置按照天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的氨基酸位置17(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的针对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。本文所用的术语“VEGF变体”指在天然VEGF序列中包括一个或多个氨基酸突变的VEGF多肽。任选地，所述一个或多个氨基酸突变包括氨基酸置换。为了速记本文所述VEGF变体的命名，应注意的是数字是指沿推定的天然VEGF的氨基酸序列(在之前的Leung等人和之前的Houck等人中提供)的氨基酸残基位置。除非另有说明，本文所用的术语“VEGF”指VEGF-A。
[0083] 术语“抗VEGF抗体”、“结合VEGF的抗体”和“特异性结合VEGF的抗体”指能够以足够的亲和力与VEGF结合的抗体，使得该抗体在靶向VEGF中可用作诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗VEGF抗体与无关的非VEGF蛋白质的结合程度小于所述抗体与VEGF的结合的约10％，例如，通过放射免疫测定法(RIA)所测量的。在某些实施方案中，结合VEGF的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗VEGF抗体结合在来自不同物种的VEGF中保守的VEGF表位。
[0084] 本文的术语“抗体”以最广义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
[0085] “抗体片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原相结合。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab-C、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些情形中，抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0086] 抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，以及残余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整的轻链(L)以及重链(H)的可变区结构域(VH)和一条重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。用胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab’)2片段，该片段大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有额外的几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab-C分子是这样的Fab分子，其被表达使得序列在第一铰链半胱氨酸处截短，从而在表达时直接产生具有游离半胱氨酸的Fab(参见，例如，Shatz等Mol.Pharmaceutics 2016；PubMed identifier(PMID)27244474)。例如，Fab-C分子在重链的位置Cys227可具有游离半胱氨酸。在其它情形中，Fab-C分子可在重链的位置Cys229具有游离半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带有游离的巯基基团的Fab’的名称。F(ab’)2抗体片段最初作为Fab’片段对产生，在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
[0087] 术语“Fc区”在本文中用于定义含有至少部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)进行的，如在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述。
[0088] “Fv”由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中，产生六个高变环(H和L链每个3个环)，这些环有助于氨基酸残基的抗原结合，并对抗体赋予了抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力通常低于完整结合位点的亲和力。
[0089] “单链Fv”还缩写为“sFv”或“scFv”，其是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，该接头使sFv能够形成抗原结合所需的结构。有关sFv的综述，请参见Pluckthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-
Verlag,New York,pp.269-315(1994)中。
Verlag,New York,pp.269-315(1994)中。
[0090] 术语“双抗体”是指通过在VH与VL结构域之间以短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见前段)制备的小抗体片段，使得实现V结构域的链间而非链内配对，产生二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交换”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有更充分的描述。
[0091] “封闭性”抗体或“拮抗”抗体是抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些封闭性抗体或拮抗抗体基本或完全抑制抗原的生物学活性。
[0092] 与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体：在竞争测定中阻断参照抗体与其抗原的结合的50％或更多，并且反之，在竞争测定中，参照抗体阻断所述抗体与其抗原的结合的50％或更多。本文提供了示例性竞争测定。
[0093] 术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种。
[0094] 抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
[0095] “半胱氨酸工程改造的抗体”或“半胱氨酸工程改造的抗体变体”是其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换的抗体。在某些情形中，半胱氨酸工程改造的抗体可以称为THIOMABTM抗体或ThioFab抗体。半胱氨酸工程改造的抗体的巯基基团可以与其他部分例如聚合物(例如HA聚合物，包括单分散HA聚合物)缀合。在特定的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸置换那些残基，从而将反应性巯基基团定位在抗体的可接近位点，并可用于将抗体缀合至其他部分，例如聚合物(例如，HA聚合物)。例如，半胱氨酸工程改造的抗体可以是在轻链中(例如，根据Kabat编号的LC-G64C、LC-I106C、LC-R108C、LC-R142C或LC-K149C)或在重链中(例如，根据Kabat编号的HC-D101C、HC-V184C或HC-T205C，或根据EU编号的HC-T114C、HC-A140C、HC-L174C、HC-L179C、HC-T187C、HC-T209C、HC-V262C、HC-G371C、HC-Y373C、HC-E382C、HC-S424C、HC-N434C和HC-Q438C(即，根据Kabat编号的HC-A136C是根据EU编号的HC-A140C))具有非半胱氨酸天然残基至半胱氨酸的单突变的抗体(参见图13A和13B)。在特定情形中，半胱氨酸工程改造的抗体可包括重链中的半胱氨酸突变，其选自由HC-A118C、HC-A140C和HC-L174C(EU编号)组成的组，或包括轻链中的半胱氨酸突变，其选自由LC-V205C和LC-K149C(Kabat编号)组成的组。在一些情形中，半胱氨酸工程改造的抗体在重链或轻链中具有单个半胱氨酸突变，使得每个全长抗体(即，具有两个重链和两个轻链的抗体)具有两个工程改造的半胱氨酸残基，并且每个Fab片段具有一个工程改造的半胱氨酸残基。在其它情形中，半胱氨酸工程改造的抗体具有多于一个的半胱氨酸突变(例如，2、3、4或5个半胱氨酸突变)。
[0096] “游离半胱氨酸氨基酸”是指已被工程改造到亲本抗体中的半胱氨酸氨基酸残基，其具有巯基官能团(-SH),并且不配对为分子内或分子间二硫桥。
[0097] 术语“巯基反应性值”是游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量表征。巯基反应性值是半胱氨酸工程改造的抗体中与巯基反应试剂反应的游离半胱氨酸氨基酸的百分比，并换算为最大值1。例如，半胱氨酸工程改造抗体上以100％的产率与巯基反应性试剂如生物素-马来酰亚胺试剂反应以形成生物素标记的抗体的游离半胱氨酸氨基酸具有1.0的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的以90％的产率与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有约0.9的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的以80％的产率与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有约0.8的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的以70％的产率与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有约0.7的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的以60％的产率与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有约0.6的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的以50％的产率与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有约0.5的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的以40％的产率与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有约0.4的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的以30％的产率与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有约0.3的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的以20％的产率与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有约0.2的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的以10％的产率与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有约0.1的巯基反应性值。另一个工程改造到相同或不同亲本抗体中的完全不与巯基反应试剂反应的半胱氨酸氨基酸具有0的巯基反应性值。特定半胱氨酸的巯基反应性值的测定可以通过ELISA测定法(例如，如本文所述的PHESELECTOR测定法)、质谱、液相色谱、放射自显影或其它定量分析测试进行。
[0098] “亲本抗体”是包含这样的氨基酸序列的抗体，其中所述氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基被一个或多个半胱氨酸残基取代。亲本抗体可以包含天然或野生型序列。相对于抗体的其他天然、野生型或经修饰形式，亲本抗体可具有预先存在的氨基酸序列修饰(例如添加、缺失和/或置换)。亲本抗体可以针对感兴趣的靶抗原，例如生物学上重要的多肽，诸如VEGF。本文所述的任何抗体(例如，抗VEGF抗体)可以是亲本抗体。
[0099] “效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
[0100] “构架”或“构架区”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。
[0101] 术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文可互换地用于指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
[0102] “人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞生成或来源于利用人抗体库或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0103] “人共有构架”是指这样的构架，其在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是来自可变结构域序列的亚组。一般而言，该序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),
vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如Kabat等人(同前)中的亚组κI。
在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如Kabat等人(同前)中的亚组III。
vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如Kabat等人(同前)中的亚组κI。
在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如Kabat等人(同前)中的亚组III。
[0104] 非人(例如，啮齿动物)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。对于大部分，人源化抗体是具有需要的抗体特异性、亲和力和能力的人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区的残基替换。在一些情形中，人免疫球蛋白的FR残基被相对应的非人残基替换。并且，人源化抗体可包含在接受体抗体或在供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)(典型地是人免疫球蛋白的恒定区)。对于进一步的细节，参见Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
[0105] 术语“可变”是指抗体之间可变结构域的某些片段在序列上极大不同的事实。可变或“V”结构域介导抗原结合，并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是在可变结构域的跨度上平均分布的。相反，V区由下述组成：称为构架区(FRs)的15-30个氨基酸的相对不变的片段，其由称为“高变区”的变化极大的较短区域隔开，所述高变区每个长为9-12个氨基酸。术语“高变区”或“HVR”当在本文中使用时，是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常在VL中包含例如大致约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，并且在VH中包含大致约残基26-35(H1)、49-65(H2)和95-102(H3)的氨基酸残基(在一个实施方案中，H1大致约为残基31-35)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或包含来自“高变环”的那些残基(例如，在VL中残基26-
32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和在VH中26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含由三个高变区连接的四个FR，主要采用β片层构型，所述高变区形成环连接，并且在一些情形中，形成所述β片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密相邻地保持在一起，其中来自另一条链的高变区有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。因此，HVR和FR序列通常以下述顺序出现在VH(或VL)中：
FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中的参与。
32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和在VH中26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含由三个高变区连接的四个FR，主要采用β片层构型，所述高变区形成环连接，并且在一些情形中，形成所述β片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密相邻地保持在一起，其中来自另一条链的高变区有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。因此，HVR和FR序列通常以下述顺序出现在VH(或VL)中：
FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中的参与。
[0106] 术语“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化形式是指Kabat等人(同前)中用于抗体编纂的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含更少的或另外的氨基酸，其与可变结构域的FR或HVR的缩短或插入相对应。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过比对抗体序列与“标准”Kabat编号的序列的同源性区域而针对给定的抗体确定残基的Kabat编号。
[0107] 当提及可变结构域中的残基(大约地,轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(参见，例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)，其通过引用整体并入本文)。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人(同前)中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，提及抗体的可变结构域中的残基编号是指通过Kabat编号系统的残基编号。除非本文另有说明，提及抗体的恒定结构域中的残基编号是指通过EU编号系统的残基编号，也称为EU索引，如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National
Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的。
Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的。
[0108] 除非另有说明，可变结构域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人(见上文)进行编号。
[0109] 术语“分离的抗体”在用于描述本文公开的各种抗体时，意指这样的抗体，已经从表达其的细胞或细胞培养物中鉴定并分离和/或回收所述抗体。其天然环境的污染成分是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定的。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。在优选的实施方案中，将抗体纯化至：(1)通过使用旋杯测序仪足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选使用银染通过SDS-PAGE测定为同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，原因在于多肽天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。
[0110] 术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中出现的变体抗体，这样的变体通常以少量存在)之外，构成该群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其它示例性方法在本文描述。
[0111] 术语”多特异性抗体”以最广义使用，并且具体涵盖包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VH-VL单元具有多表位特异性(即，能够结合一个生物分子上的两个不同表位或不同生物分子上的每个表位)。这种多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具有两个或多个VL和VH结构域的抗体、抗体片段如Fab、Fab’、Fab-C、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三抗体、已经共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合相同或不同靶标上的两个或多个不同表位的能力。“双重特异性”或”双特异性”是指特异性结合相同或不同靶标上的两个不同表位的能力。然而，与双特异性抗体相反，双特异性抗体具有氨基酸序列相同的两个抗原结合臂，并且每个Fab臂能够识别两种抗原。双特异性允许抗体作为单Fab或IgG分子以高亲和力与两个不同的抗原相互作用。根据一个实施方案，IgG1形式的多特异性抗体以5μM-0.001pM、3μM-0.001pM、1μM-0.001pM、0.5μM-0.001pM或0.1μM-0.001pM的亲和力结合每个表位。“单特异性”指仅结合一个表位的能力。
[0112] “天然抗体”指具有变化的结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，所述链通过二硫键结合。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型中的一个。
[0113] 关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“与……特异性结合”或“特异于”特定的多肽或特定多肽靶标上的表位，是指与非特异性相互作用可测量为不同的结合。特异性结合可以，例如，通过与对照分子的结合相比而确定分子的结合而进行测量。例如，特异性结合可通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定，例如，过量的未标记的靶标。在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。本文所用的术语“特异性结合”或“与……特异性结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可以例如由针对靶标具有以下Kd的分子来展示：10-4M或更低、备选地10-5M或更低、备选地10-6M或更低、备选地10-7M或更低、备选地10-8M或更低、备选地10-9M或更低、备选地10-10M或更低、备选地10-11M或更低、备选地10-12M或更低的Kd，或在10-4M至10-6M或10-6M至10-10M或10-7M至10-9M的范围内的Kd。如本领域技术人员所理解的，亲和力和Kd值是反相关的。针对抗原的高亲和力由低Kd值度量。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指这样的结合，其中分子与特定多肽或特定多肽的表位结合，而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位。
[0114] “编码抗VEGF抗体的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或分开的载体中的所述一个或多个核酸分子，和存在于宿主细胞中一个或多个位置的所述一个或多个核酸分子。
[0115] 本文所用的术语”载体”是指能够使与其相连的另一种核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入到已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为”表达载体”。
[0116] 术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用，并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可以包含突变。本文中包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
[0117] 相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将候选序列与参考多肽序列进行比对并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。用于确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以用本领域技术人员熟知的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经与用户文档一起提交至美国版权局(U.S.CopyrightOffice，Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开获得，或者可从源代码编译。
ALIGN-2程序应当被编译以便在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变化。
ALIGN-2程序应当被编译以便在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变化。
[0118] 在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列同一性)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是在序列比对程序ALIGN-2的A和B比对中由该程序评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性的值是使用ALIGN-2计算机程序如上段所述获得的。
[0119] 如本文所用，“施用”是指向受试者给予一定剂量的化合物(例如，本发明的抗体(例如，半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，单分散HA缀合物))或组合物(例如，药物组合物，例如，包含本发明抗体或抗体缀合物的药物组合物)的方法。本文所述方法中使用的组合物可以例如玻璃体内(例如通过玻璃体内注射)、通过滴眼剂、肌肉内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、眶内、口服、局部、透皮、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以霜剂或以脂质组合物施用。本文所述方法中使用的组合物也可全身或局部施用。施用方法可根据各种因素(例如，所施用的化合物或组合物和所治疗的病况、疾病或病症的严重性)而变化。
[0120] “血管发生”是指由预先存在的血管形成新血管的过程。血管发生与血管生成(vasculogenesis)不同，血管生成是从中胚层细胞前体从头形成内皮细胞。与病理性血管发生相关的病症可通过本发明的组合物和方法治疗。与病理性血管发生相关的示例性病症包括但不限于眼部病症(非限制性眼部病症包括，例如，视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病、脉络膜新生血管形成(CNV)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性和其它缺血相关性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿(DME)、病理性近视、冯·希佩尔·林道病、眼的组织胞浆菌病、视网膜静脉阻塞(包括中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、早产儿视网膜病(ROP)、家族性渗出性玻璃体视网膜病(FEVR)、冠茨病、诺里病、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管青光眼和高血压视网膜病)。另外的眼部病症如下所述。
[0121] 本文所用的术语“眼部病症”包括与病理性血管发生相关的任意眼部病症(在本文中还可互换地称为“眼部病况”)。眼部病症的特征可以是改变的或失调的新血管增生和/或新血管向眼组织结构(如视网膜或角膜)中的侵入。非限制性的眼部病症包括，例如，AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中间性AMD、晚期AMD、和地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，局部、非中心DME和弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其它局部缺血相关的视网膜病、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病、眼的组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇(也称为利伯氏先天性黑矇或LCA)、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如多病灶脉络膜炎)、眼部组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、外伤性眼损伤、舍格伦氏病、和其它眼科疾病，其中所述疾病或病症与眼部新血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿有关。其它示例性的眼部病症包括与发红(角的新血管形成)有关的疾病和由纤维血管或纤维组织的异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变。
[0122] 与角膜新血管形成相关的示例性疾病包括但不限于流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏、隐形眼镜过戴、特应性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎(terygium keratitis sicca)、舍格伦综合征、红斑痤疮、phylectenulosis、梅毒、分枝杆菌感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、莫伦溃疡、泰里安边缘变性、边缘性角质层分离、类风湿性关节炎、全身性狼疮、多发性动脉炎、外伤、韦格纳结节病、巩膜炎、史蒂文斯约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、periphigoid放射状角膜切开术和角膜移植排斥(corneal graph rejection)。
[0123] 与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的示例性疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病、黄斑变性、镰刀细胞贫血、结节病、梅毒、弹性假黄瘤、佩吉特氏病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆氏病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病、视网膜色素变性、视网膜水肿(包括黄斑水肿)、伊尔斯病、贝切特病(Behcet’s disease)、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染(例如，多病灶脉络膜炎)、推测的眼组织胞浆菌病、贝斯特氏病(卵黄状黄斑变性)、近视、视窝、施塔加特病、睫状体扁平部炎、视网膜脱离(例如，慢性视网膜脱离)、高粘滞综合症、弓形体病、外伤和激光后并发症。
[0124] “血管发生因子或试剂”是刺激血管发育的生长因子，例如促进血管发生、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管形成等。例如，血管发生因子包括，但不限于，例如VEGF和VEGF家族、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)的成员、TIE配体(血管生成素)、红藻氨酸、Del-1、成纤维细胞生长因子：酸性(aFGF)和碱性(bFGF)、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)、白细胞介素-8(IL-8)、瘦素、肝素结合细胞因子(Midkine)、胎盘生长因子、血小板来源的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板来源的生长因子，特别是PDGF-BB或PDGFR-β、多效蛋白(PTN)、颗粒体蛋白原(Progranulin)、增殖蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)/血管通透性因子(VPF)等。它还包括加速伤口愈合的因子，例如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族成员、和TGF-α和TGF-β。参见，例如，Klagsbrun和D’Amore,Annu.Rev.Physiol.,53:
217-39(1991)；Streit和Detmar,Oncogene,22:3172-3179(2003)；Ferrara&Alitalo,
Nature Medicine 5(12):1359-1364(1999)；Tonini等人,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如，表1列出了已知的血管发生因子)；和Sato,Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)。
217-39(1991)；Streit和Detmar,Oncogene,22:3172-3179(2003)；Ferrara&Alitalo,
Nature Medicine 5(12):1359-1364(1999)；Tonini等人,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如，表1列出了已知的血管发生因子)；和Sato,Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)。
[0125] “抗血管发生剂”或”血管发生抑制剂”是指直接或间接地抑制血管发生、血管形成或不希望的血管渗透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白质、抗体或其缀合物或融合蛋白。应理解的是，抗血管发生剂包括结合和阻断血管生成因子或其受体的血管形成活性的那些试剂。例如，抗血管发生剂是针对如上所定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF拮抗剂(例如针对VEGF-A或VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体)、PDGF拮抗剂(例如抗PDGFR抑制剂如GLEEVECTM(甲磺酸伊马替尼))。抗血管发生剂还包括天然的血管发生抑制剂，例如制管张素、内皮抑制素等。参见，例如，Klagsbrun和D’Amore,Annu.Rev.Physiol.,53:217-39(1991)；Streit and Detmar,Oncogene,22:3172-3179(2003)(例如，表3列出了恶性黑素瘤的抗血管发生疗法)；Ferrara&Alitalo,Nature Medicine 5(12):1359-1364(1999)；Tonini等人,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如，表
2列出了已知的抗血管发生因子)；和Sato Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)(例如，表
1列出了临床试验中使用的抗血管发生剂)。
2列出了已知的抗血管发生因子)；和Sato Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)(例如，表
1列出了临床试验中使用的抗血管发生剂)。
[0126] 本文所用的术语“VEGF拮抗剂”是指能够结合VEGF、降低VEGF表达水平、或中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物活性的分子，所述生物活性包括但不限于VEGF结合一个或多个VEGF受体、VEGF信号传导和VEGF介导的血管发生和内皮细胞存活或增殖。例如，能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物活性的分子能够通过结合一个或多个VEGF受体(VEGFR)(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合的VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR))来发挥其作用。作为可用于本发明方法中的VEGF拮抗剂包括的是与VEGF特异性结合的多肽、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、与VEGF特异性结合从而隔绝其与一个或多个受体结合的受体分子和衍生物、融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron))和VEGF121-白树毒素(Peregrine)。VEGF拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗剂变体，与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的反义核碱基寡聚体；与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的小RNA；靶向VEGF的核酶；VEGF的肽体；和VEGF适体。VEGF拮抗剂还包括结合VEGFR的多肽、抗VEGFR抗体及其抗原结合片段，以及结合VEGFR从而阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性(例如VEGF信号传导)的衍生物，或融合蛋白。VEGF拮抗剂还包括非肽小分子，其结合VEGF或VEGFR并能够阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性。因此，术语“VEGF活性”特别包括VEGF介导的VEGF生物活性。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的VEGF的表达水平或生物活性。在一些实施方案中，被VEGF特异性拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF165。
[0127] 如本文所用，VEGF拮抗剂可包括但不限于抗VEGFR2抗体和相关分子(例如Ramuciruab、Tanibirumab、阿柏西普)、抗VEGFR1抗体和相关分子(例如icrucumab、阿柏西普(VEGF Trap-Eye； )和ziv-阿柏西普(VEGF Trap； ))、双特异性
VEGF抗体(例如MP-0250、vanucizumab(VEGF-ANG2)和在US2001/0236388中公开的双特异性抗体)、双特异性抗体(包括抗VEGF、抗VEGFR1和抗VEGFR2臂中的两个的组合)、抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗、，赛伐珠单抗(sevacizumab)和雷珠单抗)，和非肽小分子VEGF拮抗剂(例如，帕唑帕尼、阿西替尼、凡德他尼(vandetanib)，stivarga，卡博替尼(cabozantinib)，乐伐替尼(lenvatinib)，尼达尼布(nintedanib)，orantinib，拉帕替尼(telatinib)，多韦替尼(dovitinig)，西地尼布(cediranib)，莫特沙芬(motesanib)，索凡替尼(sulfatinib)，阿帕替尼(apatinib)，foretinib，法米替尼(famitinib)，和tivozanib)。另外的VEGF拮抗剂描述如下。
VEGF抗体(例如MP-0250、vanucizumab(VEGF-ANG2)和在US2001/0236388中公开的双特异性抗体)、双特异性抗体(包括抗VEGF、抗VEGFR1和抗VEGFR2臂中的两个的组合)、抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗、，赛伐珠单抗(sevacizumab)和雷珠单抗)，和非肽小分子VEGF拮抗剂(例如，帕唑帕尼、阿西替尼、凡德他尼(vandetanib)，stivarga，卡博替尼(cabozantinib)，乐伐替尼(lenvatinib)，尼达尼布(nintedanib)，orantinib，拉帕替尼(telatinib)，多韦替尼(dovitinig)，西地尼布(cediranib)，莫特沙芬(motesanib)，索凡替尼(sulfatinib)，阿帕替尼(apatinib)，foretinib，法米替尼(famitinib)，和tivozanib)。另外的VEGF拮抗剂描述如下。
[0128] 试剂例如药物制剂的“有效量”是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。
[0129] “个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。“受试者”可以是“患者”。
[0130] “病症”是将受益于使用抗体治疗的任意病况。例如，患有或需要预防异常血管发生(过量的、不适当的或失控的血管发生)的哺乳动物。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论病症的那些病理病况。本文待治疗的病症的非限制性实例包括与病理性血管发生相关的病症(例如，眼部病症)。
[0131] 术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应证、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告。
[0132] “药学上可接受的载体”是指药物制剂中的活性成分以外的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0133] 术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分(例如抗体缀合物)的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
[0134] 如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在尝试改变被治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括，但不限于，防止疾病发生或复发，缓和症状，减轻疾病的任何直接或间接病理学后果，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和缓和或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体缀合物或包含本发明的抗体缀合物的其它组合物(例如，药物制剂)用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
[0135] “分离的”核酸分子是从至少一种污染核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，所述污染核酸分子通常在所述核酸的天然来源中与其相关联。分离的核酸分子不同于其在天然中所发现的形式或环境。因此，分离的核酸分子与天然细胞中存在的该核酸分子是有区别的。然而，分离的核酸分子包括在通常表达抗体的细胞中所含的核酸分子，其中例如所述核酸分子位于不同于天然细胞的染色体位置处。
[0136] 表述“控制序列”是指在特定的宿主生物体内表达可操作连接的编码序列所需要的DNA序列。适用于原核生物的控制序列,例如包括启动子、任选的操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
[0137] 当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，该核酸是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响该序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读相中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
[0138] 如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有的子代的DNA含量可能不精确相同。包括与在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物活性的突变体后代。在意指不同名称时，通过上下文其将是清楚的。
[0139] 起始或参考多肽(例如，参考抗体或其可变结构域/HVR)的“变体”或“突变体”是这样的多肽，其(1)具有不同于起始或参考多肽的氨基酸序列，和(2)通过天然或人工(人造)诱变，来源于起始或参考多肽。此类变体包括例如，目的多肽的氨基酸序列内的残基的缺失，和/或插入和/或置换，本文称为“氨基酸残基变化”。因此，变体HVR是指，相对于起始或参考多肽序列(例如源抗体或抗原结合片段的序列)，包含变体序列的HVR。在此上下文中，氨基酸残基变化是指与起始或参考多肽序列(例如参考抗体或其片段的序列)中相应位置的氨基酸不同的氨基酸。可以进行缺失、插入和置换的任何组合，以得到最终的变体或突变体构建体，条件是最终的构建体具有所需的功能特征。氨基酸变化也可改变多肽的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
[0140] “野生型(WT)”或“参考”序列或“野生型”或“参考”蛋白质/多肽(例如参考抗体的HVR或可变结构域)的序列可以是通过引入突变而衍生变体多肽的参考序列。通常，给定蛋白质的“野生型”序列是自然界中最常见的序列。类似地，“野生型”基因序列是最常在自然界发现的该基因的序列。可以通过天然过程或通过人工诱导方式将突变引入“野生型”基因(并因此引入其编码的蛋白质)。所述过程的产物是原始“野生型”蛋白质或基因的“变体”或“突变体”形式。
[0141] “等电点(pI)”意指这样的pH，在该pH，分子(例如，蛋白，如抗体)不携带净电荷，在本领域中也称为“pH(I)”或“IEP”。
[0142] 如本文所用，”抗体缀合物”是共价附接到一个或多个聚合物上的抗体。任意适当的聚合物可以缀合到抗体上，例如，亲水聚合物(例如，透明质酸(HA)或聚乙二醇(PEG))或疏水聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA))。在具体的实施方案中，聚合物是HA(在本文中也称为“HA缀合物”)。
[0143] 如本文所用，术语“聚合物”是指包括通过化学键以线性、环状、分支、交联或树枝状方式或其组合连接的重复结构单元(即单体)的分子。聚合物可以是合成的或天然存在的，或其组合。应当理解，术语“聚合物”包括共聚物，其是包括两个或更多个不同单体的聚合物。聚合物也可以是均聚物，其是仅包括单一类型单体的聚合物。
[0144] 术语“多分散指数(PDI)”是指聚合物的分子量分布的宽度的量度。PDI在本领域中也称为“分散度指数”、“不均匀性指数”或“分散度 ”。聚合物样品的PDI可以使用方程(I)计算： 其中Mw是重均摩尔质量，Mn是数均摩尔质量。除非另外指出，PDI根据方程(I)计算。
[0145] 聚合物样品可以被认为是“单分散的”(在本领域中也称为均匀)或“多分散的”(在本领域中也称为不均匀)。如本文所用，关于HA聚合物或HA缀合物样品的术语“单分散”是指HA聚合物或HA缀合物样品具有小于或等于约1.1的PDI，例如约1.001、约1.02、约1.03、约1.04、约1.05、约1.06、约1.07、约1.08、约1.09或约1.1。例如，单分散的HA聚合物或HA缀合物样品可以具有在1.0至约1.1之间的PDI(例如，在1至约1.1之间，在1至约1.09之间，在1至约1.08之间，在1至约1.07之间，在1至约1.06之间，1至约1.05、1至约1.04、1至约1.03、1至约1.02、1至约1.01、1至约1.005、约1.001至约1.1、约1.001至约1.09，约1.001至约1.08，约
1.001至约1.07，约1.001至约1.06，约1.001至约1.05，约1.001至约1.04，约1.001至约
1.03，约1.001至约1.02之间、约1.001至约1.01之间、约1.001至约1.005之间、约1.001至约
1.004之间、约1.001至约1.003之间、约1.001至约1.002之间、约1.0001至约1.1之间，约
1.0001至约1.09之间、约1.0001至约1.08之间、约1.0001至约1.07之间、约1.0001至约1.06之间、约1.0001至约1.05之间、约1.0001至约1.04之间、约1.0001至约1.03之间，约1.0001至约1.02之间、约1.0001至约1.01之间、约1.0001至约1.005之间、约1.0001至约1.004之间、约1.0001至约1.003之间、约1.0001至约1.002之间，或约1.0001至约1.005之间)。
1.001至约1.07，约1.001至约1.06，约1.001至约1.05，约1.001至约1.04，约1.001至约
1.03，约1.001至约1.02之间、约1.001至约1.01之间、约1.001至约1.005之间、约1.001至约
1.004之间、约1.001至约1.003之间、约1.001至约1.002之间、约1.0001至约1.1之间，约
1.0001至约1.09之间、约1.0001至约1.08之间、约1.0001至约1.07之间、约1.0001至约1.06之间、约1.0001至约1.05之间、约1.0001至约1.04之间、约1.0001至约1.03之间，约1.0001至约1.02之间、约1.0001至约1.01之间、约1.0001至约1.005之间、约1.0001至约1.004之间、约1.0001至约1.003之间、约1.0001至约1.002之间，或约1.0001至约1.005之间)。
[0146] 相反，术语“多分散”是指HA聚合物或HA缀合物样品具有大于1.1，例如约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8或更高的PDI。例如，在一些实施方案中，多分散HA聚合物或HA缀合物样品具有约1.3至约2、约1.4至约2、约1.5至约2、约1.6至约2、约1.7至约2、约1.8至约2或约1.9至约2的PDI。
[0147] 术语“透明质酸”、“hyaluranon”或“HA”在本文中可互换使用，是指聚合的糖胺聚糖(GAG)，其包含N-乙酰基葡糖胺和葡糖醛酸的重复二糖单位。HA是阴离子、非硫酸化的GAG，其可以例如存在于细胞外基质(例如，眼睛的玻璃体)、结缔组织、表皮和神经组织中。
[0148] 本文所用的术语“聚乙二醇”或“PEG”是指已知为聚氧化乙烯(PEO)或聚氧乙烯(POE)的聚醚化合物(取决于其分子量)。PEG可以具有H-(O-CH2-CH2)n-OH的结构，其中n是任意适当的整数。PEG可以是分支的PEG，星形PEG，或蜂巢型PEG。例如，PEG可以是PEG四聚体、PEG六聚体或PEG八聚体。
[0149] 本文所用的术语“清除”是指每单位时间从区室(例如，眼睛(例如，玻璃体))清除的物质(例如，抗-VEGF抗体，抗体缀合物，融合蛋白(例如，Fab融合蛋白)，或聚合物制剂)的体积。
[0150] 术语“半衰期”是指在体内(例如，在眼睛(例如，玻璃体)内)或在体外物质(例如，抗-VEGF抗体，抗体缀合物，融合蛋白(例如，Fab融合蛋白)，或聚合物制剂)浓度减少一半所需要的时间。
[0151] II.组合物和方法
[0152] 本发明提供了抗体缀合物，其包括与抗体(例如抗VEGF抗体,包含本文所述的任何抗VEGF抗体)连接的聚合物(例如单分散聚合物,包含单分散HA聚合物)，可用于例如制备抗体缀合物的半胱氨酸工程改造的抗体，包括抗体缀合物的组合物(例如药物组合物)，以及制备和使用它们的方法，例如用于治疗用途(例如治疗眼部病症)。
[0153] A.用于本发明缀合物的示例性抗体
[0154] 本发明提供了抗体缀合物，其包括与聚合物(例如单分散聚合物)共价连接的抗体(例如抗VEGF抗体)。可以使用任何合适的抗体(例如抗VEGF抗体)。例如，所述抗体可以特异性结合选自由以下各项组成的组的抗原：VEGF；白细胞介素-1β(IL-1β)；白细胞介素-6(IL-6)；白细胞介素-6受体(IL-6R)；白细胞介素-13(IL-13)；IL-13受体(IL-13R)；PDGF(例如PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2(Ang2)；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR))；ST-2受体；和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质(例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；
TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A)。此类抗体可用于例如减少血管发生和/或治疗或延迟与病理性血管发生相关的病症(例如眼部病症)的进展。可用于本发明抗体缀合物的示例性非限制性抗VEGF抗体在下文中进一步描述。
TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A)。此类抗体可用于例如减少血管发生和/或治疗或延迟与病理性血管发生相关的病症(例如眼部病症)的进展。可用于本发明抗体缀合物的示例性非限制性抗VEGF抗体在下文中进一步描述。
[0155] 在一些情形中，抗VEGF抗体可以包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR，所述HVR选自：(A)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，其中X1是Ile或His，X2是Ala或Arg，X3是Tyr或Lys，X4是Thr或Glu，X5是Arg、Tyr、Gln或Glu，X6是Ala或Glu，X7是Lys或Glu，和X8是Gly或Glu；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQX1VSTAVA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其中X1为Asp或Arg；(e)HVR-L2，其包含X1ASFLYS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列，其中X1为Ser或Met；和(f)HVR-L3，其包含X1QGYGX2PFT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，其中X1是Gln、Asn或Thr，和X2是Ala、Asn、Gln或Arg，或一个或多个上述HVR和其一个或多个变体的组合，所述变体与SEQ ID NO：1-6中的任何一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。
[0156] 例如，抗VEGF抗体可以包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR，所述HVR选自：(A)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)、GITPAGGYEYYADSVKG(SEQ ID NO:21)或
GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)或QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列，或一个或多个上述HVR和其一个或多个变体的组合，所述变体与SEQ ID NO:1、3、7-10或21-23中的任何一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。
GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)或QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列，或一个或多个上述HVR和其一个或多个变体的组合，所述变体与SEQ ID NO:1、3、7-10或21-23中的任何一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。
[0157] 例如，在一些情形中，抗VEGF抗体可以包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR，所述HVR选自：(A)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列，或一个或多个上述HVR和其一个或多个变体的组合，所述变体与SEQ ID NO:1、3或7-10中的任何一个具有至少约80％序列同一性(例如，
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％同一性)。在特定的实例中，在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含
GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％同一性)。在特定的实例中，在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含
GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
[0158] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可以包括以下重链可变结构域构架区(FR)的一个、两个、三个或四个：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。
[0159] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可以包括以下轻链可变结构域FR的一个、两个、三个或四个：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
[0160] 例如，在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗 体包括以下四个 重链可变结构域 FR：(a)FR -H1 ，其包 含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
11的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
11的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0161] 例如，在一些情形中，抗VEGF抗体可以包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR，所述HVR选自：(A)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列，或一个或多个上述HVR和其一个或多个变体的组合，所述变体与SEQ ID NO:1、3、8、9、22或23中的任何一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％同一性)。在特定的实例中，在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。
95％、96％、97％、98％或99％同一性)。在特定的实例中，在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。
[0162] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可以包括以下重链可变结构域构架区(FR)的一个、两个、三个或四个：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。
[0163] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可以包括以下轻链可变结构域FR的一个、两个、三个或四个：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
[0164] 例如，在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗 体包括以下四个 重链可变结构域 FR：(a)FR -H1 ，其包 含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
[0165] 在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗 体包括以下四个 重链可变结构域 FR：(a)FR -H1 ，其包 含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
[0166] 例如，在一些情形中，抗VEGF抗体可以包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR，所述HVR选自：(A)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列，或一个或多个上述HVR和其一个或多个变体的组合，所述变体与SEQ ID NO:1、3、8-10或22中的任何一个具有至少约80％序列同一性(例如，
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％同一性)。在特定的实例中，在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含
GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％同一性)。在特定的实例中，在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含
GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。
[0167] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可以包括以下重链可变结构域构架区(FR)的一个、两个、三个或四个：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。
[0168] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可以包括以下轻链可变结构域FR的一个、两个、三个或四个：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
[0169] 例如，在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗 体包括以下四个 重链可变结构域 FR：(a)FR -H1 ，其包 含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
[0170] 例如，在其他情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗 体包括以下四个 重链可变结构域 FR：(a)FR -H1 ，其包 含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
[0171] 例如，在其他情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗 体包括以下四个 重链可变结构域 FR：(a)FR -H1 ，其包 含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
[0172] 例如，在另外的其他情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下四个重链可变结构域FR：(a)FR-H1，其包含
EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
[0173] 例如，在另外的进一步情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下四个重链可变结构域FR：(a)FR-H1，其包含
EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
[0174] 在其他的情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗 体包括以下四个 重链可变结构域 FR：(a)FR -H1 ，其包 含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ IDNO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ IDNO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
[0175] 例如，在其他情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗 体包括以下四个 重链可变结构域 FR：(a)FR -H1 ，其包 含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
33的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0176] 在其他的情形中，抗VEGF抗体包括以下6个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗 体包括以下四个 重链可变结构域 FR：(a)FR -H1 ，其包 含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。在进一步的情形中，抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：
(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:
51的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0177] 在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)重链可变(VH)结构域，其包含与SEQ ID NO:11、40或42中任何一个具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:11、40或42中任何一个的序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:12、41或46中的任何一个具有至少
90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:12、41或46中任何一个的序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:
11的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL结构域。
96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:11、40或42中任何一个的序列；(b)轻链可变(VL)结构域，其包含与SEQ ID NO:12、41或46中的任何一个具有至少
90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:12、41或46中任何一个的序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:
11的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL结构域。
[0178] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可以包括以下重链可变结构域构架区(FR)的一个、两个、三个或四个：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4,其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。
[0179] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可以包括以下轻链可变结构域FR的一个、两个、三个或四个：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)或DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC(SEQ ID NO:44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)或FGQGTKVEVK(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列。
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC(SEQ ID NO:44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)或FGQGTKVEVK(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列。
[0180] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
[0181] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
[0182] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
[0183] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
[0184] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
[0185] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。
[0186] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。
[0187] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。
[0188] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。
[0189] 在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。例如，在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:11的序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:11的序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些情形中，抗VEGF抗体可包括：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下重链构架区：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；
(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含
WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下轻链构架区：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包括结合结构域，所述结合结构域包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情形中，示例性的抗VEGF是N94A.F83A.N82aR.Y58R(也称为G6.31 AARR或G6.31.AARR)。
(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含
WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包括以下轻链构架区：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，抗VEGF抗体包括结合结构域，所述结合结构域包含(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情形中，示例性的抗VEGF是N94A.F83A.N82aR.Y58R(也称为G6.31 AARR或G6.31.AARR)。
[0190] 在一些情形中，抗VEGF抗体包含(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:33或51具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:33或51的序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:12、34、35、36、37或38中任何一个具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:12、34、35、36、37或
38中任何一个的序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情形中，抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:12、34、35、36、37或
38中任何一个的序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情形中，抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。在一些情形中，抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。
[0191] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可包括以下重链可变结构域构架区(FR)的一个、两个、三个或四个：(a)FR-H1，其包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。
[0192] 在一些情形中，任何前述抗VEGF抗体可以包括以下轻链可变结构域FR的一个、两个、三个或四个：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。
[0193] 在一些情形中，本发明提供了抗体，所述抗体包含(a)重链，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，和/或(b)轻链，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体是以Fab形式表达的G6.31 AARR。
[0194] 在一些情形中，本发明提供了抗体，所述抗体包含(a)重链，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，和/或(b)轻链，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体是缺少与抗人IgG的反应性的G6.31AARR的变体形式。
[0195] 在另一方面，根据上述实施方案中任一项的抗体(例如抗VEGF抗体)可单独或组合地掺入以下1-8节中所述的任何特征：
[0196] 1.抗体亲和力
[0197] 在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤-8 -8 -13 -9 -130.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10 M或更低，例如10 M至10 M，例如10 M至10 M)的解离常数(Kd)。例如，在一些情形中，本文提供的抗体以约10nM或更低的Kd结合抗原(例如人VEGF(hVEGF))。在一些情形中，本文提供的抗体以约5nM或更低的Kd结合抗原(例如
hVEGF)。在一些情形中，本文提供的抗体以约2nM或更低的Kd结合hVEGF。例如，在一些情形中，所述抗体以约25pM至约2nM(例如，约25pM，约50pM，约75pM，约100pM，约125pM，约150pM，约175pM，约200pM，约225pM，约250pM，约275pM，约300pM，约325pM，约350pM，约375pM，约
400pM，约425pM，约450pM，约475pM，约500pM，约525pM，约550pM，约575pM，约600pM，约
625pM，约650pM，约675pM，约700pM，约725pM，约750pM，约775pM，约800pM，约825pM，约
850pM，约875pM，约900pM，约925pM，约950pM，约975pM，约1nM，约1.1nM，约1.2nM，约1.3nM，约1.4nM，约1.5nM，约1.6nM，约1.7nM，约1.8nM，约1.9nM，或约2nM)的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约600pM(例如，约75pM，约100pM，约125pM，约
150pM，约175pM，约200pM，约225pM，约250pM，约275pM，约300pM，约325pM，约350pM，约
375pM，约400pM，约425pM，约450pM，约475pM，约500pM，约525pM，约550pM，约575pM，约
600pM)的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约500pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约400pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约300pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约200pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约150pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约125pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约100pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约
80pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约60pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。
在一些情形中，抗体以约40pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。
hVEGF)。在一些情形中，本文提供的抗体以约2nM或更低的Kd结合hVEGF。例如，在一些情形中，所述抗体以约25pM至约2nM(例如，约25pM，约50pM，约75pM，约100pM，约125pM，约150pM，约175pM，约200pM，约225pM，约250pM，约275pM，约300pM，约325pM，约350pM，约375pM，约
400pM，约425pM，约450pM，约475pM，约500pM，约525pM，约550pM，约575pM，约600pM，约
625pM，约650pM，约675pM，约700pM，约725pM，约750pM，约775pM，约800pM，约825pM，约
850pM，约875pM，约900pM，约925pM，约950pM，约975pM，约1nM，约1.1nM，约1.2nM，约1.3nM，约1.4nM，约1.5nM，约1.6nM，约1.7nM，约1.8nM，约1.9nM，或约2nM)的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约600pM(例如，约75pM，约100pM，约125pM，约
150pM，约175pM，约200pM，约225pM，约250pM，约275pM，约300pM，约325pM，约350pM，约
375pM，约400pM，约425pM，约450pM，约475pM，约500pM，约525pM，约550pM，约575pM，约
600pM)的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约500pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约400pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约300pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约200pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约150pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约125pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约75pM至约100pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约
80pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。在一些情形中，抗体以约60pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。
在一些情形中，抗体以约40pM的Kd结合抗原(例如hVEGF)。
[0198] 在一个实施方案中，Kd通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量。在一个实施方案中，RIA用目的抗体的Fab形式及其抗原进行。例如，Fab对抗原的溶液结合亲合力通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况下，用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，接着用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了确定测定的条件，将 多孔板(Thermo Scientific)用在
50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，并随后用在磷酸缓冲盐水(PBS)中的2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)在室温(约23℃)封闭二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与目的Fab的系列稀释物混合(例如，与在Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997))中的抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。
接着，将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续更长的阶段(例如，约65小时)，以确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中，用于在室温进行温育(例如，持续一小时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20 洗涤八次。当所述板
已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将所述板在
TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数十分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度，用在竞争性结合测定中。
50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，并随后用在磷酸缓冲盐水(PBS)中的2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)在室温(约23℃)封闭二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与目的Fab的系列稀释物混合(例如，与在Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997))中的抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。
接着，将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续更长的阶段(例如，约65小时)，以确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中，用于在室温进行温育(例如，持续一小时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20 洗涤八次。当所述板
已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将所述板在
TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数十分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度，用在竞争性结合测定中。
[0199] 根据另一个实施方案，使用 表面等离振子共振测定法来测量Kd。例如，使用 或 (BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测
定在25℃使用固定的抗原CM5芯片以～10个应答单位(RU)进行。在一个实施方案中，依照供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore，Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入，以获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量，将两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)在25℃以约25μl/分钟的流速注射在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的。使用简单一对一朗格缪尔
(Langmuir)结合模型( Evaluation Software version 3.2)，通过同时拟合
结合和解离传感图，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离振子
6 -1 -1
共振测定法，结合速率(on-rate)超过10M s ，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即如分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯
(stirred cuvette)的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)所测量的，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
定在25℃使用固定的抗原CM5芯片以～10个应答单位(RU)进行。在一个实施方案中，依照供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore，Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入，以获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量，将两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)在25℃以约25μl/分钟的流速注射在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的。使用简单一对一朗格缪尔
(Langmuir)结合模型( Evaluation Software version 3.2)，通过同时拟合
结合和解离传感图，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离振子
6 -1 -1
共振测定法，结合速率(on-rate)超过10M s ，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即如分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色杯
(stirred cuvette)的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)所测量的，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
[0200] 2.抗体稳定性
[0201] 在一些情形中，例如，与抗VEGF抗体，例如G6.31(参见，例如，美国专利号7,758,859和国际申请公开号WO2005/012359，其通过引用整体并入本文)相比，本发明的抗体缀合物或其组合物中使用的抗体具有增强的稳定性。抗体的稳定性可以使用本领域任何已知的方法确定，所述方法例如，差示扫描荧光分析法(DSF)，圆二色性(CD)，内在蛋白荧光，差示扫描量热法，光谱学，光散射(例如，动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS)，自身相互作用色谱(SIC)。与抗VEGF抗体例如G6.31相比，抗VEGF抗体可以具有例如提高的解链温度(Tm)、聚集温度(Tagg)或其他稳定性度量。
[0202] 在某些实施方案中，本文提供的抗体具有大于或等于约80℃(例如，约81℃，约82℃，约83℃，约84℃，约85℃，约86℃，约87℃，约88℃，约89℃，约90℃，约91℃，约92℃，或约93℃)的Tm。例如，在一些情形中，抗VEGF抗体具有大于或等于约83.5℃(例如，约83.5℃，约
84℃，约85℃，约86℃，约87℃，约88℃，约89℃，约90℃，约91℃，约92℃，或约93℃)的Tm。在一些情形中，抗VEGF抗体具有约82℃至约92℃(例如，约82℃，约83℃，约84℃，约85℃，约86℃，约87℃，约88℃，约89℃，约90℃，约91℃，或约92℃)的Tm。在一些大致的情形中，抗VEGF抗体具有约82℃的Tm。在一些情形中，抗VEGF抗体的任一种前述Tm值是使用DSF确定的。在一些实施方案中，抗VEGF抗体的Tm值是如例如国际专利申请号PCT/US2016/053454的实施例1中所述测定的，其通过引用整体并入本文。
84℃，约85℃，约86℃，约87℃，约88℃，约89℃，约90℃，约91℃，约92℃，或约93℃)的Tm。在一些情形中，抗VEGF抗体具有约82℃至约92℃(例如，约82℃，约83℃，约84℃，约85℃，约86℃，约87℃，约88℃，约89℃，约90℃，约91℃，或约92℃)的Tm。在一些大致的情形中，抗VEGF抗体具有约82℃的Tm。在一些情形中，抗VEGF抗体的任一种前述Tm值是使用DSF确定的。在一些实施方案中，抗VEGF抗体的Tm值是如例如国际专利申请号PCT/US2016/053454的实施例1中所述测定的，其通过引用整体并入本文。
[0203] 3.抗体片段
[0204] 在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于，Fab、Fab’、Fab-C、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于某些抗体片段的综述，请参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含拯救受体(salvage receptor)结合表位残基并具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
[0205] 双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中。
[0206] 单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。
[0208] 4.嵌合和人源化抗体
[0209] 在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体在例如美国专利号4,816,567；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人类灵长类动物的可变结构域)及人恒定结构域。在另一实例中，嵌合抗体是种类或亚类已经自亲本抗体的种类或亚类发生变化的“种类转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
[0210] 在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化，以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
[0211] 人源化抗体及其制备方法于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中评述，且进一步于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,
791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“导向选择”方法)中描述。
791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“导向选择”方法)中描述。
[0212] 可用于人源化的人构架区包括，但不限于：使用“最佳拟合”法选择的构架区(参见，例如，Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；源自特定亚型的轻链或重链可变区的人抗体的共同序列的构架区(参见，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)构架区或人生殖系构架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；及源自筛选FR文库的构架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
[0213] 5.人抗体
[0214] 在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的多种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
[0215] 可通过向已经经过修饰因以响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原，来制备人抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代了内源免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合于动物染色体内。在这样的转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181及6,150,584；描述 技术的美国专利号5,770,429；描述K-M 技术的美国专利号7,041,870，及描述
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。通过此类动物产生的
完整抗体的人可变区可进一步修饰，例如通过与不同人类恒定区组合进行修饰。
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。通过此类动物产生的
完整抗体的人可变区可进一步修饰，例如通过与不同人类恒定区组合进行修饰。
[0216] 人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制得。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,
J.Immunol.,147:86(1991).)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中描述。另外的方法包括例如美国专利号
7,189,826(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):
265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中所述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)，及
Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical
Pharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,
J.Immunol.,147:86(1991).)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中描述。另外的方法包括例如美国专利号
7,189,826(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):
265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中所述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)，及
Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical
Pharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
[0217] 也可通过分离选自源自人噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。随后可将这些可变结构域序列与所需人恒定结构域组合。下文描述自抗体文库选择人抗体的技术。
[0218] 6.源自文库的抗体
[0219] 可通过筛选组合文库以获得具有一种或多种所需活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并筛选这些文库以获得具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods
284(1-2):119-132(2004)中描述。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods
284(1-2):119-132(2004)中描述。
[0220] 在某些噬菌体展示方法中，VH及VL基因库(repertoire)是通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组于噬菌体文库中，随后可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12:433-455(1994)中所述对其进行筛选以获得抗原-结合噬菌体。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或Fab片段的抗体片段。来自被免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供免疫原的高亲和力抗体。或者，天然库可被克隆(例如来自人)，以在无任何免疫的情况下提供针对广泛非自身抗原和自身抗原的抗体单一来源，如Griffiths等人，EMBO J，12:725-
734(1993)所述。最后，还可以通过从干细胞克隆未重排的V基因片段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区，并且实现体外重排来合成制备天然文库，如Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.，227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包括，例如：美国专利号5,750,373，和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/
0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
734(1993)所述。最后，还可以通过从干细胞克隆未重排的V基因片段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区，并且实现体外重排来合成制备天然文库，如Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.，227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包括，例如：美国专利号5,750,373，和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/
0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
[0221] 抗体或抗体片段可如国际专利申请号PCT/US2016/053454中所述源自噬菌体文库。
[0222] 从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
[0223] 7.多特异性抗体
[0224] 在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对VEGF而另一种是针对任何其他抗原(例如，第二生物学分子，例如，白细胞介素-1β(IL-1β)；白细胞介素-6(IL-6)；白细胞介素-6受体(IL-6R)；白细胞介素-13(IL-13)；IL-13受体(IL-13R)；PDGF(例如PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2(Ang2)；Tie2；
S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；
TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR))；ST-2受体；和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。因此，双特异性抗体可具有针对下述的结合特异性：VEGF与IL-1β；VEGF与IL-6；VEGF与IL-6R；VEGF与IL-
13；VEGF与IL-13R；VEGF与PDGF(例如，PDGF-BB)；VEGF与血管生成素；VEGF与Ang2；VEGF与Tie2；VEGF与S1P；VEGF与整联蛋白αvβ3；VEGF与整联蛋白αvβ5；VEGF与整联蛋白α5β1；VEGF与β动物纤维素；VEGF与apelin/APJ；VEGF与红细胞生成素；VEGF与补体因子D；VEGF与TNFα；
VEGF与HtrA1；VEGF和VEGF受体(例如，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，mbVEGFR，或sVEGFR)；VEGF与ST-2受体；VEGF与C2；VEGF与因子B；VEGF与因子H；VEGF与CFHR3；VEGF与C3b；VEGF与C5；VEGF与C5a；VEGF与C3a；VEGF与ARMS2；VEGF与TIMP3；VEGF与HLA；VEGF与IL-8；VEGF与CX3CR1；
VEGF与TLR3；VEGF与TLR4；VEGF与CETP；VEGF与LIPC；VEGF与COL10A1；或VEGF与TNFRSF10A。
在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至VEGF的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位到表达VEGF的细胞。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如，Fab，Fab’，或Fab-C片段)。
S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；
TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR))；ST-2受体；和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。因此，双特异性抗体可具有针对下述的结合特异性：VEGF与IL-1β；VEGF与IL-6；VEGF与IL-6R；VEGF与IL-
13；VEGF与IL-13R；VEGF与PDGF(例如，PDGF-BB)；VEGF与血管生成素；VEGF与Ang2；VEGF与Tie2；VEGF与S1P；VEGF与整联蛋白αvβ3；VEGF与整联蛋白αvβ5；VEGF与整联蛋白α5β1；VEGF与β动物纤维素；VEGF与apelin/APJ；VEGF与红细胞生成素；VEGF与补体因子D；VEGF与TNFα；
VEGF与HtrA1；VEGF和VEGF受体(例如，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，mbVEGFR，或sVEGFR)；VEGF与ST-2受体；VEGF与C2；VEGF与因子B；VEGF与因子H；VEGF与CFHR3；VEGF与C3b；VEGF与C5；VEGF与C5a；VEGF与C3a；VEGF与ARMS2；VEGF与TIMP3；VEGF与HLA；VEGF与IL-8；VEGF与CX3CR1；
VEGF与TLR3；VEGF与TLR4；VEGF与CETP；VEGF与LIPC；VEGF与COL10A1；或VEGF与TNFRSF10A。
在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至VEGF的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位到表达VEGF的细胞。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如，Fab，Fab’，或Fab-C片段)。
[0225] 在一些情形中，双特异性抗体是美国专利申请号US 2014/0017244中公开的双特异性抗VEGF/抗血管生成素2(Ang2)抗体，该申请通过引用完全并入本文。例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体可包括结合VEGF的第一结合结构域(诸如本文所述的任何抗VEGF抗体)和结合Ang2的第二结合结构域，其包含：(A)HVR-H1，其包含GYYMH(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SPNPYYYDSSGYYYPGAFDI(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含GGNNIGSKSVH(SEQ ID NO:65)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含DDSDRPS(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QVWDSSSDHWV(SEQ ID NO:67)的氨基酸序列，或一个或多个上述HVR和其一个或多个变体的组合，所述变体与SEQ ID NO:62-67中的任何一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。
[0226] 在一些情形中，所述抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体可包括结合VEGF的第一结合结构域(诸如本文所述的任何抗VEGF抗体)和结合Ang2并且包含下述的第二结合结构域：(a)VH结构域，其包含与SEQ ID NO:68具有至少80％序列同一性(例如，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或
99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:68的序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:69具有至少80％序列同一性(例如，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，
88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:69的序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些情形中，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体可包括结合VEGF的第一结合结构域(诸如本文所述的任何抗VEGF抗体)和特异性结合Ang2的第二结合结构域，其中所述第二结合结构域是国际专利申请公开号WO 2010/069532(其通过引用完全并入本文)中所述的任意抗体结合结构域，或其变体。
99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:68的序列；(b)VL结构域，其包含与SEQ ID NO:69具有至少80％序列同一性(例如，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，
88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:69的序列；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些情形中，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体可包括结合VEGF的第一结合结构域(诸如本文所述的任何抗VEGF抗体)和特异性结合Ang2的第二结合结构域，其中所述第二结合结构域是国际专利申请公开号WO 2010/069532(其通过引用完全并入本文)中所述的任意抗体结合结构域，或其变体。
[0227] 在另一些情形中，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体是国际专利申请公开号WO 2016/073157中所述的任意抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体。
[0228] 在一些情形中，双特异性抗体是双特异性抗VEGF/抗IL-6抗体。在一些情形中，抗VEGF/抗IL-6双特异性抗体可包括结合VEGF的第一结合结构域(诸如本文所述的任何抗VEGF抗体)和结合IL-6的第二结合结构域。第二结合结构域可以是本领域已知的任意抗IL-
6抗体的结合结构域，例如，EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/
073890，其通过引用完全并入本文中)，司妥昔单抗(siltuximab) 奥鲁凯
珠单抗(olokizumab)，克莱赞珠单抗(clazakizumab)，sirukumab，艾西莫单抗
(elsilimomab)，gerilimzumab，OPR-003，MEDI-5117，PF-04236921，或它们的变体。
6抗体的结合结构域，例如，EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/
073890，其通过引用完全并入本文中)，司妥昔单抗(siltuximab) 奥鲁凯
珠单抗(olokizumab)，克莱赞珠单抗(clazakizumab)，sirukumab，艾西莫单抗
(elsilimomab)，gerilimzumab，OPR-003，MEDI-5117，PF-04236921，或它们的变体。
[0229] 在一些情形中，双特异性抗体是双特异性抗VEGF/抗IL-6R抗体。在一些情形中，抗VEGF/抗IL-6R双特异性抗体可包括结合VEGF的第一结合结构域(诸如本文所述的任何抗VEGF抗体)和结合IL-6R的第二结合结构域。第二结合结构域可以是本领域已知的任意抗IL-6R抗体的结合结构域，例如，托珠单抗(tocilizumab) (参见，例如，WO 1992/019579，其通过引用完全并入本文中)，sarilumab，vobarilizumab(ALX-0061)，SA-
237，或它们的变体。
237，或它们的变体。
[0230] 用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983)),WO 93/08829,和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))，及“凸起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见，例如，美国专利号5,731,168)。也可通过以下方法制备多特异性抗体：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程改造静电导引作用(WO 2009/089004A1)；将两个或多个抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980，及Brennan等人，Science，229:81(1985))；
使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见，例如Kostelny等人，J.Immunol.，148(5):
1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见，例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.，152:5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见，例如Kostelny等人，J.Immunol.，148(5):
1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见，例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.，152:5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
[0231] 本文中也包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的经工程改造抗体，包括”章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见例如US 2006/0025576A1)。
[0232] 本文中的抗体或片段也包括“双重作用FAb”或“DAF”，所述“双重作用FAb”或“DAF”包含结合至VEGF以及另一不同抗原的抗原结合位点(例如，参见US 2008/0069820)。
[0233] 8.抗体变体
[0234] 在某些实施方案中，设想了本文所提供的抗体的氨基酸序列变体(例如，包括一个或多个氨基酸残基改变的抗体变体)。例如，可能需要其来提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基的缺失和/或向其中插入和/或对其置换残基。可以进行缺失、插入和置换的任何组合，以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
[0235] a)置换、插入和缺失变体
[0236] 在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换性诱变的感兴趣的位点包括HVR和FR。保守性置换显示在表1中的“优选的置换”的标题下。更多实质性变化在表1中的“示例性置换”的标题下提供，且如下文关于氨基酸侧链种类进一步所描述的。可将氨基酸置换引入目的抗体中，并筛选产物的所需活性，例如保持/提高的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
[0237] 表1
[0238]
[0239]
[0240] 可根据常见侧链特性将氨基酸分组：
[0241] (1)疏水性：正亮氨酸，Met、Ala、Val、Leu、Ile；
[0242] (2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
[0243] (3)酸性：Asp、Glu；
[0244] (4)碱性His、Lys、Arg；
[0245] (5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
[0246] (6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
[0247] 非保守性置换将需要将这些种类之一的成员换成另一种类。
[0248] 一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基和/或FR残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面将具有修饰(例如提高)(例如，增加的亲和力、提高的稳定性、增加的表达、改变的pI和/或降低的免疫原性)，和/或将基本上保持亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟的抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文中所述的那些，方便地产生。简言之，一个或多个HVR残基被突变，且变体抗体展示在噬菌体上，并对其进行筛选以获得特定生物学活性(例如结合亲和力)。
[0249] 可在HVR中进行改变(例如置换)，例如以提高抗体亲和力。这些改变可在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基)中进行(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))；和/或在接触抗原的残基中进行，其中测试所得的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建并且自第二文库重新选择而获得的亲和力成熟已于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，(2001))中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR(error-prone PCR)、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入经选择用于成熟的可变基因中。随后建立第二文库。随后筛选该文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。另一引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中随机化若干个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，特定地鉴别抗原结合中所涉及的HVR残基。特定地，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
[0250] 在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个HVR内进行，只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中所提供的保守性置换)。例如，这些改变可在HVR中的抗原接触残基的外部。在上文提供的变体VH及VL序列的某些实施方案中，每个HVR未经改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
[0251] 在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个FR内进行，只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。例如，所述改变可以提高抗体亲和力和/或稳定性(例如，通过增加的解链温度评估的)。
[0252] 适用于鉴别可被靶向用于诱变的抗体的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述。在此方法中，残基或靶残基的组(例如，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu的带电残基)被鉴别且由中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换，以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可在对初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体与抗原之间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为置换候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定其是否含有所需特性。
[0253] 氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，针对ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
[0254] b)糖基化变体
[0255] 在某些实施方案中，本文所提供的抗体被改变，以增加或降低抗体被糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便建立或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
[0256] 若抗体包含Fc区，则与其连接的糖类可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N-连接与Fc区CH2结构域的Asn297附接的支链双触角寡糖。参见，例如，Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及岩藻糖，其与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc附接。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改良特性的抗体变体。
[0257] 在一个实施方案中，提供具有缺乏与Fc区(直接或间接)附接的岩藻糖的糖结构的抗体变体。举例来说，该抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于如MALDI-TOF质谱法所测量的所有与Asn 297附接的糖结构(例如复合、杂合及高甘露糖结构)的总和，计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量，例如如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即介于位置294与300之间。这些岩藻糖基化变体可具有提高的ADCC功能。参见，例如美国专利公开号US 2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖基”或“岩藻糖缺乏”抗体变体有关的公开文本的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US
2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO
2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,
J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。
能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/
0157108A1，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其实施例11)；和基因敲除细胞系，例如敲除α1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda等人，Biotechnol.Bioeng，94(4):680-688(2006)；
和WO 2003/085107)。
2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO
2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,
J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。
能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/
0157108A1，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其实施例11)；和基因敲除细胞系，例如敲除α1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda等人，Biotechnol.Bioeng，94(4):680-688(2006)；
和WO 2003/085107)。
[0258] 进一步提供具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体Fc区附接的双触角寡糖被GlcNAc平分。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。这些抗体变体的实例例如在WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和US 2005/0123546(Umana等)中描述。也提供在与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有提高的CDC功能。这些抗体变体在例如WO 1997/
30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764(Raju，S.)中描述。
30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764(Raju，S.)中描述。
[0259] c)Fc区变体
[0260] 在某些实施方案中，可在本文所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，所述人Fc区序列在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸残基改变(例如置换)。
[0261] 在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应子功能的抗体变体，这使其成为应用的理想候选物，在所述应用中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(例如补体及ADCC)是不必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达总结于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。
[0262] 评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见，例如Hellstrom等人.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986)和Hellstrom，I等人.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,
337；和Bruggemann等人.，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CYTOTOX 非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。
用于这些测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可在体内评估，例如，在诸如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。也可进行C1q结合测定，以证明抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见，例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg等人，Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg等人，Blood 103:2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合及体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
337；和Bruggemann等人.，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CYTOTOX 非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。
用于这些测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可在体内评估，例如，在诸如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。也可进行C1q结合测定，以证明抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见，例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg等人，Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg等人，Blood 103:2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合及体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
[0263] 具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个置换的那些抗体(美国专利号6,737,056)。这些Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括具有残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
[0264] 描述了某些与FcR的结合提高或减少的抗体变体。(参见，例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人.，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
[0265] 在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的置换。
[0266] 在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，提高或降低)，例如，如美国专利号6,194,551，WO 99/51642和Idusogie等人.，J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
[0267] US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述具有增加的半衰期及提高的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其中FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含具有一个或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体包括在Fc区残基238、
256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、
424或434中的一处或多处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些Fc变体(美国专利号
7,371,826)。还参见Duncan&Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351，它们涉及Fc区变体的其他实例。
256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、
424或434中的一处或多处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些Fc变体(美国专利号
7,371,826)。还参见Duncan&Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351，它们涉及Fc区变体的其他实例。
[0268] d)半胱氨酸工程改造的抗体变体
[0269] 本发明提供半胱氨酸工程改造的抗体，其中野生型或亲本抗体(例如抗VEGF抗体，包括本文所述的任何抗VEGF抗体)的一个或多个氨基酸被半胱氨酸氨基酸取代(即“置换”或“突变”)(即“工程改造的半胱氨酸”)。任何形式的抗体都可以被如此工程改造，即突变。例如，可以工程改造亲本单克隆抗体，以形成“THIOMABTM抗体”。THIOMABTM抗体的一个实例是具有工程改造的半胱氨酸的抗体片段(即Fab)。这种Fab THIOMABTM抗体可被称为
“ThioFab”。应注意，由于IgG抗体的二聚体性质，单位点突变在ThioFab中产生单个工程改TM
造的半胱氨酸残基，而单位点突变在THIOMAB 抗体中产生两个工程改造的半胱氨酸残基。
“ThioFab”。应注意，由于IgG抗体的二聚体性质，单位点突变在ThioFab中产生单个工程改TM
造的半胱氨酸残基，而单位点突变在THIOMAB 抗体中产生两个工程改造的半胱氨酸残基。
[0270] 可以评价具有工程改造的半胱氨酸(Cys)残基的突变体的新引入的工程改造的半胱氨酸巯基基团的反应性。巯基反应性值是相对的，数值术语在0至1.0的范围内，并且可以对任何半胱氨酸工程改造的抗体进行测量。本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.0至1.0的范围内。具体地，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.1至1.0的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.0至0.1、0.1至0.5、0.1至0.6、0.1至0.7、0.1至0.8、0.1至0.9或0.1至1.0的范围内。
在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.2至1.0、0.3至
1.0、0.4至1.0、0.5至1.0、0.6至1.0、0.7至1.0或0.8至1.0的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.6至1.0的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.7至1.0的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.8至10的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.5至0.8的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.5至0.9的范围内。
在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.5至0.7的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.5至1.0的范围内。
在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.2至1.0、0.3至
1.0、0.4至1.0、0.5至1.0、0.6至1.0、0.7至1.0或0.8至1.0的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.6至1.0的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.7至1.0的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.8至10的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.5至0.8的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.5至0.9的范围内。
在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.5至0.7的范围内。在某些实施方案中，本发明的半胱氨酸工程改造的抗体的巯基反应性值在0.5至1.0的范围内。
[0271] 本发明提供了用于产生与亲电子官能度反应的半胱氨酸工程改造的抗体的设计、选择和制备方法。这些方法进一步使抗体缀合物化合物，例如具有在指定的、设计的、选择性位点缀合的聚合物部分的抗体-聚合物缀合物，成为可能。抗体表面上的反应性半胱氨酸残基允许通过巯基反应性基团(例如马来酰亚胺或卤代乙酰基)特异性地缀合聚合物。与蛋白质中的任何其它氨基酸官能度，例如赖氨酸残基的氨基或N-末端氨基相比，Cys残基的巯基功能性与马来酰亚胺基团的亲核反应性是约1000倍高。碘乙酰基和马来酰亚胺试剂中的巯基特异性官能度可以与胺基反应，但是需要更高的pH(＞9.0)和更长的反应时间(Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach,Academic Press,伦敦)。
[0272] 本发明的半胱氨酸工程改造的抗体优选保留其野生型、亲本抗体对应物的抗原结合能力。因此，半胱氨酸工程改造的抗体能够结合，优选特异性地结合抗原。示例性的非限制性抗原包括VEGF；IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF(例如PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2(Ang2)；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR)；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质(例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；
COL10A1；和TNFRSF10A)。
COL10A1；和TNFRSF10A)。
[0273] 本文所述的任何抗体(例如，任何上述的抗VEGF抗体)可以是用于产生半胱氨酸工程改造的抗体的亲本抗体。通过应用本文所述的设计和筛选步骤，可以将本文所述的示例性方法通常应用于抗体的鉴定和生产。
[0274] 本发明的半胱氨酸改造的抗体可以与巯基反应试剂位点特异性地和有效地偶联。巯基反应试剂可以是，例如，清除修饰剂如聚合物(例如，HA聚合物或聚乙二醇的各种异构体)、结合第三组分的肽、或另一种碳水化合物或亲脂性试剂、多功能接头试剂、捕获(即亲和)标记试剂(例如，生物素-接头试剂)、检测标记(例如，荧光团试剂)、固相固定试剂(例如，SEPHAROSETM、聚苯乙烯或玻璃)、或药物-接头中间体。巯基反应试剂的一个实例是N-乙基马来酰亚胺(NEM)。在一个示例性实施方案中，THIOMABTM抗体与生物素-接头试剂的反应TM
提供了生物素化的THIOMAB 抗体，通过该抗体可以检测和测量工程改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。THIOMABTM抗体与多功能接头试剂的反应提供了具有官能化接头的
THIOMABTM抗体，所述官能化接头可以进一步与聚合物、药物部分试剂或其它标记反应。
THIOMABTM抗体与药物-接头中间体的反应提供了THIOMABTM抗体药物缀合物。在某些实施方TM
案中，THIOMAB 抗体是ThioFab。
提供了生物素化的THIOMAB 抗体，通过该抗体可以检测和测量工程改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。THIOMABTM抗体与多功能接头试剂的反应提供了具有官能化接头的
THIOMABTM抗体，所述官能化接头可以进一步与聚合物、药物部分试剂或其它标记反应。
THIOMABTM抗体与药物-接头中间体的反应提供了THIOMABTM抗体药物缀合物。在某些实施方TM
案中，THIOMAB 抗体是ThioFab。
[0275] 半胱氨酸工程改造的抗体可以与巯基反应试剂缀合，其中反应基团是例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫或其它巯基反应性缀合配偶体(参见，例如Haugland,2003,Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.；Brinkley,1992,Bioconjugate Chem.3:2；Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach,Academic Press,London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Hermanson,G.in Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press,San Diego,pp.40-55,643-671)。所述配偶体可以是细胞毒性剂(例如，毒素如阿霉素或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、用于成像或放射治疗金属的螯合剂、肽基或非肽基标记或检测标签、或清除修饰剂如聚合物(例如，HA聚合物或聚乙二醇的各种异构体)、结合第三组分的肽、或另一种碳水化合物或亲脂性试剂。
[0276] PHESELECTOR(用于选择反应性巯基的噬菌体ELISA)测定法允许以ELISA噬菌体格式检测抗体中的反应性半胱氨酸基团。参见美国专利号7,521,541和美国专利公开号20110301334，其全部内容通过引用并入本文。具体地，PHESELECTOR测定法包括将目的蛋白(例如抗体)包被在孔表面上的过程，随后与噬菌体颗粒温育，然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二级抗体温育，与吸光度检测。可以以快速、稳健和高通量方式筛选展示在噬菌体上的突变蛋白。可以产生半胱氨酸过程改造的抗体文库，并使用相同的方法进行结合选择，以从抗体或其它蛋白质的随机蛋白-噬菌体文库中适当鉴定游离Cys掺入的反应位点。该技术包括使展示在噬菌体上的半胱氨酸突变蛋白与也是巯基反应性的亲和试剂或报道基团反应。
[0277] 在某些实施方案中，PHESELECTOR测定法包括以下步骤：(1)将牛血清白蛋白(BSA)、靶蛋白(例如VEGF)的部分或全部和链霉亲和素(100μl，2μg/ml)分别包被在
96孔板上；(2)用0.5％ (在PBS中)封闭后，将生物素化的和
非生物素化的THIOMABTM抗体-噬菌体(2×1010个噬菌体颗粒)在室温下温育1小时；(3)与噬菌体一起温育之后，然后与HRP标记的二级抗体(抗M13噬菌体外壳蛋白，pVIII蛋白抗体)一起温育；(4)进行标准HRP反应，在450nm处测量吸光度；(5)通过计算链霉亲和素的OD450/靶蛋白(例如VEGF)的OD450之间的比率，来测量巯基反应性，使得巯基反应性值为1指示半胱氨酸巯基的完全生物素化。
96孔板上；(2)用0.5％ (在PBS中)封闭后，将生物素化的和
非生物素化的THIOMABTM抗体-噬菌体(2×1010个噬菌体颗粒)在室温下温育1小时；(3)与噬菌体一起温育之后，然后与HRP标记的二级抗体(抗M13噬菌体外壳蛋白，pVIII蛋白抗体)一起温育；(4)进行标准HRP反应，在450nm处测量吸光度；(5)通过计算链霉亲和素的OD450/靶蛋白(例如VEGF)的OD450之间的比率，来测量巯基反应性，使得巯基反应性值为1指示半胱氨酸巯基的完全生物素化。
[0278] 使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针),可容易地分离和测序编码半胱氨酸工程改造的抗体的DNA。杂交瘤细胞作为这种DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293T细胞或不另外产生抗体蛋白质的其它哺乳动物宿主细胞，例如骨髓瘤细胞(美国专利号5,807,715；US2005/00448572；US2004/0229310)，以便在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。在大多数情况下，半胱氨酸工程改造的抗体的产量与野生型抗体相似。
[0279] 在设计和选择之后，具有高反应性的未配对Cys残基的半胱氨酸工程改造的抗体，例如THIOMABTM抗体，可以通过以下步骤产生：(i)在细菌，例如大肠杆菌系统或哺乳动物细胞培养系统(WO01/00245)，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或HEK293细胞(例如HEK293T细胞)中表达；和(ii)使用普通蛋白质纯化技术(例如Lowman等(1991)J.Biol.Chem.266(17):TM
10982-10988)进行纯化。在具体的实施方案中，THIOMAB 抗体在哺乳动物细胞表达系统中表达。在具体的实施方案中，哺乳动物细胞表达系统是HEK293T细胞。
10982-10988)进行纯化。在具体的实施方案中，THIOMAB 抗体在哺乳动物细胞表达系统中表达。在具体的实施方案中，哺乳动物细胞表达系统是HEK293T细胞。
[0280] 可以根据序列编号系统对重链和轻链的工程改造的Cys残基的结构位置进行编号。这种序列编号系统与图13A和13B中4D5抗体的Kabat编号系统(Kabat等人,(1991)
Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)相关。使用Kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少的或另外的与可变结构域的FR或CDR的缩短或插入相对应的氨基酸。通过在图13A和13B中的顺序编号和Kabat编号,来鉴定半胱氨酸工程改造的重链变体位点和轻链变体位点。
Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)相关。使用Kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少的或另外的与可变结构域的FR或CDR的缩短或插入相对应的氨基酸。通过在图13A和13B中的顺序编号和Kabat编号,来鉴定半胱氨酸工程改造的重链变体位点和轻链变体位点。
[0281] 巯基反应性也可以推广到抗体的某些结构域，例如轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域，CH1、CH2和CH3。在以下完整抗体的重链恒定结构域α、δ、ε、γ和μ中可以进行半胱氨酸取代(所述半胱氨酸取代导致约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和0.95以及更高的巯基反应性值)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
[0282] 半胱氨酸工程改造的抗体可以如例如美国专利号7,521,541或国际专利公开号WO2006/034488中所述产生，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体变体是在美国专利号7,521,541或国际专利公开号WO2006/034488中描述的半胱氨酸工程改造的抗体变体。在一些情形中，半胱氨酸工程改造的抗体变体是在国际专利申请公开号WO2011/156328或美国专利号9,000,130(其通过引用整体并入本文)中描述的半胱氨酸工程改造的抗体变体。在一些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体变体是在国际专利申请公开号WO2016/040856(其通过引用整体并入本文)中,例如在WO2016/040856的表1-4中描述的半胱氨酸工程改造的抗体变体。
[0283] 例如，在某些实施方案中，半胱氨酸突变选自由以下各项组成的组:HC-I195C、HC-S420C、HC-Y432C和LC-G64C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，半胱氨酸突变选自由HC-Y432C和LC-G64C(根据Kabat编号)组成的组。在某些实施方案中，半胱氨酸突变是重链突变，并且选自由以下各项组成的组：Y33C、G162C、V184C、I195C、S420C、Y432C和Q434C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，半胱氨酸突变是重链突变，并且选自由以下各项组成的组：R19C、E46C、T57C、Y59C、A60C、M100cC、W103C、G162C、I195C、V258C、S420C、H425C和N430C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，半胱氨酸突变是重链突变，并且选自由以下各项组成的组：Y33C、G162C、V184C和I195C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，半胱氨酸突变是重链突变，并且选自由以下各项组成的组：R19C、E46C、Y59C、A60C、M100cC、W103C、V258C、H425C和N430C(根据Kabat编号)。
[0284] 在某些实施方案中，半胱氨酸突变是轻链突变，并且选自由以下各项组成的组：Y55C、G64C、T85C、T180C和N430C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，半胱氨酸突变是轻链突变，并且选自由以下各项组成的组：T31C,S52C,G64C,R66C,A193C和N430C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，半胱氨酸突变是轻链突变，并且选自由以下各项组成的组：
G64C、T85C、T180C和N430C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，半胱氨酸突变是轻链突变，并且选自由以下各项组成的组：S52C、G64C、R66C、A193C和N430C(根据Kabat编号)。在具体的实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变选自包括以下各项的半胱氨酸突变组：LC-I106C、LC-R108C、LC-R142C和LC-K149C(根据Kabat编号)(参见图13A；表2)。在特定的实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变是LC-K149C(根据Kabat编号)(参见图13A)。在特定的实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变是LC-V205C(根据Kabat编号)。
G64C、T85C、T180C和N430C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，半胱氨酸突变是轻链突变，并且选自由以下各项组成的组：S52C、G64C、R66C、A193C和N430C(根据Kabat编号)。在具体的实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变选自包括以下各项的半胱氨酸突变组：LC-I106C、LC-R108C、LC-R142C和LC-K149C(根据Kabat编号)(参见图13A；表2)。在特定的实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变是LC-K149C(根据Kabat编号)(参见图13A)。在特定的实施方案中，轻链中的半胱氨酸突变是LC-V205C(根据Kabat编号)。
[0285] 表2示例性轻链半胱氨酸突变
[0286]残基 序列(+/-5个残基) SEQ ID NO. EU编号 Kabat编号
I GTKVECKRTVA 70 106 106
R KVEIKCTVAAP 71 108 108
R NNFYPCEAKVQ 72 142 142
K AKVQWCVDNAL 73 149 149
I GTKVECKRTVA 70 106 106
R KVEIKCTVAAP 71 108 108
R NNFYPCEAKVQ 72 142 142
K AKVQWCVDNAL 73 149 149
[0287] 在特定的实施方案中，重链中的半胱氨酸突变选自由以下各项组成的半胱氨酸突变组:HC-T114C、HC-A140C、HC-L174C、HC-L179C、HC-T187C、HC-T209C、HC-V262C、HC-G371C、HC-Y373C、HC-E382C、HC-S424C、HC-N434C和HC-Q438C(根据EU编号)(参见图13B；表3)。在特定的实施方案中，重链中的半胱氨酸突变是根据Kabat编号的HC-A143C(即根据EU编号的HC-A140C)(参见图13B；表3)。在特定的实施方案中，重链中的半胱氨酸突变是根据EU编号的HC-A174C(参见图13B；表3)。在特定的实施方案中，重链中的半胱氨酸突变是根据EU编号的HC-A118C(即根据Kabat编号的HC-A114C)。
[0288] 在特定的实施方案中，本文所述的任何半胱氨酸工程改造的抗体具有以下半胱氨酸突变之一：根据Kabat编号的LC-K149C，和根据EU编号的HC-A140C(参见表2和3以及图13A和13B)。
[0289] 表3示例性重链半胱氨酸突变
[0290] 残基 序列(+/-5个残基) SEQ ID NO. EU编号 Kabat编号T QGTLVCVSSAS 74 114 110
A TSGGTCALGCL 75 140 136
L TFPAVCQSSGL 76 174 170
L LQSSGCYSLSS 77 179 175
T LSSVVCVPSSS 78 187 183
T HKPSNCKVDKK 79 209 205
V PEVTCCVVDVS 80 262 258
G TCLVKCFYPSD 81 371 367
Y LVKGFCPSDIA 82 373 369
E IAVEWCSNGQP 83 382 378
S QGNVFCCSVMH 84 424 420
N HEALHCHYTQK 85 434 430
Q HNHYTCKSLSL 86 438 434
A TSGGTCALGCL 75 140 136
L TFPAVCQSSGL 76 174 170
L LQSSGCYSLSS 77 179 175
T LSSVVCVPSSS 78 187 183
T HKPSNCKVDKK 79 209 205
V PEVTCCVVDVS 80 262 258
G TCLVKCFYPSD 81 371 367
Y LVKGFCPSDIA 82 373 369
E IAVEWCSNGQP 83 382 378
S QGNVFCCSVMH 84 424 420
N HEALHCHYTQK 85 434 430
Q HNHYTCKSLSL 86 438 434
[0291] 在某些实施方案中，下列残基中的任何一个或多个可被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。
[0292] 在某些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体可包括一个或多个重链半胱氨酸突变,所述突变选自由以下各项组成的组:V2C,L4C,V5C,L11C,R19C,F27C,I29C,T32C,Y33C,Q39C,A40C,K43C,L45C,E46C,T53C,G55C,T57C,R58C,Y59C,A60C,T68C,N76C,Y79C,Q81C,W95C,G96C,D101C,W103C,T116C,K117C,T135C,N155C,A158C,G162C,G174C,L175C,T183C,V184C,I195C,N199C,S203C,F239C,M248C,E254C,V258C,N272C,V278C,L305C,T331C,S333C,R340C,Q343C,K356C,E384C,S399C,K410C,Q414C,G416C,N417C,Y432C,T433C,
K435C,S438C,L439C,M100cC,和N82aC(根据Kabat编号)。还参见国际专利申请号WO2016/
040856的表3。
K435C,S438C,L439C,M100cC,和N82aC(根据Kabat编号)。还参见国际专利申请号WO2016/
040856的表3。
[0293] 在某些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体可包括一个或多个轻链半胱氨酸突变,所述突变选自由以下各项组成的组:S12C,S14C,G16C,R18C,T22C,R24C,Q27C,T31C,A32C,Q38C,K39C,G41C,K42C,P44C,Y49C,S50C,S52C,F53C,L54C,Y55C,S63C,G64C,R66C,D70C,T72C,T74C,S76C,Q79C,T85C,H91C,Y92C,P95C,T97C,F98C,K103C,E105C,K107C,
P119C,K126C,T129C,S131C,Q147C,W148C,A153C,Q155C,S156C,S159C,Q160C,S162C,
Q166C,T172C,T180C,V191C,A193C,E195C,V205C,T206C,和N210C(根据Kabat编号)。还参见国际专利申请号WO2016/040856的表4。
P119C,K126C,T129C,S131C,Q147C,W148C,A153C,Q155C,S156C,S159C,Q160C,S162C,
Q166C,T172C,T180C,V191C,A193C,E195C,V205C,T206C,和N210C(根据Kabat编号)。还参见国际专利申请号WO2016/040856的表4。
[0294] 在某些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体可包括一个或多个半胱氨酸突变，所述突变选自由HC-I195C、HC-S420C、HC-Y432C和LC-G64C(根据Kabat编号)组成的组。还参见国际专利申请号WO2016/040856的表5。
[0295] 在某些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体包括轻链半胱氨酸突变，所述突变选自由以下各项组成的组：LC-T22C,LC-K39C,LC-Y49C,LC-Y55C,LC-T85C,LC-T97C,LC-I106C,LC-R108C,LC-R142C,LC-K149C和LC-V205C(根据Kabat编号)。
[0296] 半胱氨酸工程改造的抗体可以包括任何合适数目的工程改造的半胱氨酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个工程改造的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体可包括1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10个工程改造的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体可包括1个工程改造的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体可包括2个工程改造的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体可包括3个工程改造的半胱氨酸残基。
[0297] 在任何前述的实施方案中，半胱氨酸工程改造的抗体可在与上述任何半胱氨酸突变的等同位置处包括工程改造的半胱氨酸。例如，如果抗体在位置118(EU编号)处包括天然丝氨酸，则丝氨酸可以突变为半胱氨酸以形成S118C突变。
[0298] 例如，本发明提供了半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体，其包含在重链中的半胱氨酸突变，所述突变选自由HC-A118C、HC-A140C和HC-L174C(EU编号)组成的组，或包含在轻链中的半胱氨酸突变，所述突变选自由LC-V205C和LC-K149C(Kabat编号)组成的组，其中抗VEGF抗体是本文所述的任何抗VEGF抗体，例如表8-10中所述的任何抗VEGF抗体。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是N94A.F83A.N82aR.Y58R(G6.31 AARR)。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是G6.31 WT。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是LC-N94A。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是LC-N94A.LC-F83A。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是LC-N94A.LC-F83A。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是HC-A40E.HC-T57E(G6.31 AAEE)。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是HCcombo。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是HCLC2。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是HCLC4。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是HCLC5。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是HCLC3。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是HCLC1。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是R19HCcombo。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是R19HCLC2。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是R19HCLC4。在一些实施方案中，抗VEGF抗体是R19HCLC5。
[0299] 在特定的实例中，本发明提供了半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体，其在重链中包含选自由HC-A118C、HC-A140C和HC-L174C(EU编号)组成组的半胱氨酸突变，或在轻链中包含选自由LC-V205C和LC-K149C(Kabat编号)组成的组的半胱氨酸突变，其中所述抗体包含以下六个HVR：(a)HVR-H1，其包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在一些情形中，半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体包括以下四个重链可变结构域FR：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；和(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在进一步的情形中，半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；(b)FR-L2，其包含
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体包括(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在一些情形中，亲本抗体是G6.31AARR。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是HC-A118C。在其他的实施方案中，半胱氨酸突变是HC-A140C。在其他的实施方案中，半胱氨酸突变是HC-L174C(EU编号)。在其他的实施方案中，半胱氨酸突变是LC-V205C(Kabat编号)。在其他的实施方案中，半胱氨酸突变是LC-K149C(Kabat编号)。
WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列；和(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在一些情形中，半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体包括(a)VH结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，和(b)VL结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在一些情形中，亲本抗体是G6.31AARR。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是HC-A118C。在其他的实施方案中，半胱氨酸突变是HC-A140C。在其他的实施方案中，半胱氨酸突变是HC-L174C(EU编号)。在其他的实施方案中，半胱氨酸突变是LC-V205C(Kabat编号)。在其他的实施方案中，半胱氨酸突变是LC-K149C(Kabat编号)。
[0300] 在一些情形中，本发明提供了抗体，所述抗体包含(a)重链，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，和/或(b)轻链，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
[0301] 在一些情形中，本发明提供了抗体，所述抗体包含(a)重链，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，和/或(b)轻链，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。
[0302] 在一些情形中，本发明提供了抗体，所述抗体包含(a)重链，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，和/或(b)轻链，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列。
[0303] e)抗体衍生物
[0304] 在某些实施方案中，本文所提供的抗体可经进一步修饰，以含有本领域中已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三氧己环、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性可能具有生产优势。聚合物可以是任何分子量的，且可有分支或无分支。与抗体附接的聚合物的数目可以变化，且若附接多于一个聚合物，则其可以是相同的或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于包括但不限于以下的考虑因素来确定：待改善的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的疗法等。本文记载了另外的抗体缀合物，例如，在下文的G部分和实施例1和2中。
[0305] 在另一实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人 .，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。该辐射可具有任何波长，且包括但不限于，不损伤普通细胞但能将非蛋白质部分加热至可杀死抗体-非蛋白质部分附近的细胞的温度的波长。
[0306] f)等电点变体
[0307] 本发明提供了具有改变的等电点的抗体变体。例如，本发明提供了例如与抗VEGF抗体(例如，G6.31)相比具有减小的等电点(pI)的抗体变体。在一些情形中，在生理pH下，表面电荷减少。在一些情形中，抗VEGF抗体具有等于或低于约8(例如，约8，约7，约6，约5，或约4)的pI。在一些情形中，抗体具有约4至约8(例如，约4，约5，约6，约7，或约8)的pI。在一些情形中，抗VEGF抗体具有约5至约7(例如，约5，约6，或约7)的pI。在一些情形中，抗VEGF抗体具有约5至约6(例如，约5.1，约5.2，约5.3，约5.4，约5.5，约5.6，约5.7，约5.8，约5.9，或约6)的pI。
[0308] 本发明的抗体可以进行工程改造以具有减小的pI，例如，通过用具有较低pI的氨基酸置换给定位置上的野生型氨基酸残基进行改造。氨基酸的pI可以基于所述氨基酸的胺(-NH2)、羧酸(-COOH)和侧链的pKa值确定，这是本领域中已知的。在一些实施方案中，可以置换表面暴露的氨基酸残基，以减小抗体的pI。在一个实施方案中，可以用谷氨酸(E)置换表面暴露的氨基酸残基。在一个实施方案中，可以用天冬氨酸(D)置换表面暴露的氨基酸残基。
[0309] B.重组方法和组合物
[0310] 本文所述的任何抗体(例如，抗VEGF抗体，包括半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)可以使用例如在美国专利号4,816,567中描述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗VEGF抗体的分离的核酸。该核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供了包含该核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含该核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗VEGF抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
[0311] 为了重组产生抗体(例如抗VEGF抗体，包括半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可以易于使用常规程序分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
[0312] 用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。在表达后，抗体可以以可溶级分与细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。
[0313] 除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是用于编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
[0314] 适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
[0315] 还可利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978，和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中产生抗体的TM
PLANTIBODIES 技术)。
PLANTIBODIES 技术)。
[0316] 也可将脊椎动物细胞用作宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977)中所描述的)；
幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，
Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；
人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in
Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，
Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；
人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in
Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
[0317] C.测定法
[0318] 抗体(例如，本文所述的抗VEGF抗体，包括半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)以及抗体缀合物(例如，包括抗VEGF抗体的抗体缀合物(例如，本文提供的任何抗VEGF抗体))，可以通过本领域已知的各种测定法鉴定、筛选或表征它们的物理/化学特性和/或生物学活性。
[0319] 1.结合测定法和其他测定法
[0320] 在一个方面中，测试抗体(例如抗VEGF抗体，包括半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或其抗体缀合物的抗原结合活性，例如，通过已知方法，如ELISA、蛋白印迹法等。
[0321] 在另一方面中，可以使用竞争测定法来鉴别与本文所述的抗体或其抗体缀合物竞争与抗原(例如，VEGF)结合的抗体。在某些实施方案中，所述竞争抗体结合与本文所述的抗体所结合的相同的表位(例如，线性表位或构象表位)。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”Methods in Molecular Biology卷66(Humana Press，Totowa，NJ)中提供了用于绘制抗体所结合的表位的详细的示例性方法。
[0322] 在示例性的竞争测定中，将固定的VEGF在包含第一标记抗体和第二未标记的抗体的溶液中温育，所述第一标记抗体与VEGF结合，所述第二未标记的抗体被检测其与第一抗体竞争结合VEGF的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清中。作为对照，将固定的VEGF在包含第一标记的抗体而不包含第二未标记的抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与VEGF结合的条件下温育后，去除过量的未结合的抗体，并且测量与固定的VEGF结合的标记的量。如果相对于对照样品，在测试样品中，与固定的VEGF结合的标记的量实质性减少，则表示第二抗体与第一抗体竞争与VEGF的结合。可以对其它抗原进行类似的测定。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
[0323] 2.活性测定法
[0324] 在一方面中，提供了用于鉴别具有生物学活性的抗体(例如，抗VEGF抗体，包括半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或其抗体缀合物的测定法。例如，生物学活性可以包括，在体外、体内或离体与抗原(例如，VEGF(例如，血流中的VEGF))或其肽片段的结合。在某些实施方案中，生物学活性可包括阻断或中和抗原。例如，在某些实施方案中，生物学活性可以包括阻断或中和VEGF，或防止VEGF与配体结合，所述配体如受体，诸如KDR或Flt-1。还提供了在体内和/或体外具有这种生物学活性的抗体或其抗体缀合物。在某些实施方案中，测试本发明的抗体或其抗体缀合物的这种生物活性。
[0325] 3.稳定性测定法
[0326] 在一个方面，提供了用于确定抗体(例如抗VEGF抗体，包括半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或其抗体缀合物的稳定性(例如热稳定性)的测定法。例如，可以使用本领域已知的任何方法确定抗体或其抗体缀合物的稳定性，所述方法例如，差示扫描荧光分析法(DSF)，圆二色性(CD)，内在蛋白荧光，差示扫描量热法，光谱学，光散射(例如，动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS)，自身相互作用色谱(SIC)。可以如本文所述确定抗体或其抗体缀合物的稳定性，例如,如在例如国际专利申请号PCT/US2016/053454的实施例1和2中所述使用DSF确定。在一些情形中，抗体缀合物的稳定性可以通过串联折射率和多角度光散射检测器的大小排阻层析(SEC-RI-MALS)来确定，例如，如实施例1中所述。
[0327] D.药物制剂
[0328] 本文提供的抗体(例如抗VEGF抗体，包括半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或其抗体缀合物的药物制剂通过以下制备:将具有所需纯度的抗体或抗体缀合物与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))，所述药物制剂为冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；
亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-
20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20( Baxter International，Inc.)。某些示
例性sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/
0104968中。在一方面中，sHASEGP与一个或多个另外的葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-
20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20( Baxter International，Inc.)。某些示
例性sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/
0104968中。在一方面中，sHASEGP与一个或多个另外的葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
[0329] 示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
[0330] 本文的制剂还可以含有超过一种的活性化合物，所述活性化合物是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是进一步提供免疫抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量合适地组合存在。
[0331] 可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊中，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。在Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中公开了这些技术。
[0332] 用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可以容易地实现，例如，通过经由无菌滤膜过滤实现。
[0333] 在某些实施方案中，药物制剂包含一种或多种另外的化合物。在某些实施方案中，所述另外的化合物结合选自由以下各项组成的组的第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2(Ang2)；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；
β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；
和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；
LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。
β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；
和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；
LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。
[0334] 例如，在一些情形中，另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体)。
[0335] 在另一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6抗体，例如，EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/073890)，司妥昔单抗 奥鲁凯珠单抗，克莱赞珠单抗，sirukumab，艾西莫单抗，gerilimzumab，OPR-003，MEDI-5117，PF-04236921，或它们的变体。
[0336] 在又一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6R抗体，例如，托珠单抗(参见，例如，WO 1992/019579)，sarilumab，vobarilizumab(ALX-0061)，SA-237，或它们的变体。
[0337] E.治疗方法和组合物
[0338] 本文提供的任何抗体(例如抗VEGF抗体，包括半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或其抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可用于治疗方法。
[0339] 在一个方面中，提供了用作药物的抗VEGF抗体(例如，工程改造的半胱氨酸抗VEGF抗体)。在另一方面中，提供了用作药物的抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)。在进一步的方面，本发明提供了用于治疗与病理性血管发生相关的病症的抗VEGF抗体(例如，工程改造的半胱氨酸抗VEGF抗体)。在另一方面中，本发明提供了用于治疗与病理性血管发生相关的病症的抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)。在一些实施方案中，与病理性血管发生相关的病症是眼部病症。在一些情形中，所述眼部病症是AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中间性AMD、晚期AMD、或地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，局部、非中心DME或弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其它局部缺血相关的视网膜病、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病、眼的组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如多病灶脉络膜炎)、眼部组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、外伤性眼损伤或舍格伦氏病。
[0340] 在另一方面中，提供了用于治疗方法的抗VEGF抗体(例如，工程改造的半胱氨酸抗VEGF抗体)。在另一方面中，提供了用于治疗方法的抗体缀合物(例如，单分散HA缀合物)。在某些情形中，本发明提供用于治疗患有与病理性血管发生相关的病症的受试者的方法的抗VEGF抗体(例如，工程改造的半胱氨酸抗VEGF抗体)，所述方法包括向个体施用有效量的抗VEGF抗体。本发明还提供用于治疗患有与病理性血管发生相关的病症的受试者的方法的抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)，所述方法包括向个体施用有效量的抗体缀合物。在一些情形中，与病理性血管发生相关的病症是眼部病症。在一些情形中，所述眼部病症是AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中间性AMD、晚期AMD、或地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，局部、非中心DME或弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其它局部缺血相关的视网膜病、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病、眼的组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如多病灶脉络膜炎)、眼部组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、外伤性眼损伤或舍格伦氏病。
[0341] 在一些情形中，本发明提供了用于减少或抑制受试者中血管发生的抗VEGF抗体(例如，工程改造的半胱氨酸抗VEGF抗体)。在另一方面，提供了用于减少或抑制受试者中血管发生的抗体缀合物(例如，单分散HA缀合物)。在某些实施方案中，本发明提供了用于减少或抑制受试者中血管发生的方法的抗VEGF抗体(例如，工程改造的半胱氨酸抗VEGF抗体)，所述方法包括向个体施用有效量的抗VEGF抗体以减少或抑制血管发生。本发明还提供了用于减少或抑制受试者中血管发生的方法中的抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)，所述方法包括向个体施用有效量的抗体缀合物。根据任意上述应用的“受试者”可以是人。
[0342] 本发明提供了抗VEGF抗体(例如，工程改造的半胱氨酸抗VEGF抗体)在制造或制备药物中的用途。本发明还提供了抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)在制造或制备药物中的用途。例如，在一个情形中，所述药物用于治疗与病理性血管发生相关的病症。在进一步的情形中，所述药物用于治疗与病理性血管发生相关的病症的方法，所述方法包括向患有与病理性血管发生相关病症的受试者施用有效量的所述药物。在一些情形中，与病理性血管发生相关的病症是眼部病症。在一些情形中，所述眼部病症是AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中间性AMD、晚期AMD、或地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，局部、非中心DME或弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其它局部缺血相关的视网膜病、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病、眼的组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如多病灶脉络膜炎)、眼部组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、外伤性眼损伤或舍格伦氏病。在进一步的情形中，所述药物用于减少或抑制受试者中的血管发生。在进一步的情形中，所述药物用于减少或抑制受试者中的血管发生的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的药物，以减少或抑制血管发生。在药物的任一种前述应用中，所述方法可以包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。
[0343] 本发明提供了用于治疗与病理性血管发生相关的病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有与病理性血管发生相关的病症的个体施用有效量的抗VEGF抗体(例如，工程改造的半胱氨酸抗VEGF抗体)。在另一个实例中，所述方法包括向患有与病理性血管发生相关的病症的个体施用有效量的抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)。在一些情形中，与病理性血管发生相关的病症是眼部病症。在一些情形中，所述眼部病症是AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中间性AMD、晚期AMD、或地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，局部、非中心DME或弥散性、中心累及DME)、视网膜病、糖尿病性视网膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其它局部缺血相关的视网膜病、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央性(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新生血管形成、与角膜新生血管形成相关的疾病、视网膜新生血管形成、与视网膜/脉络膜新生血管形成相关的疾病、病理性近视、冯·希佩尔·林道病、眼的组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、发红、眼新生血管疾病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如多病灶脉络膜炎)、眼部组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、外伤性眼损伤或舍格伦氏病。在进一步的情形中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下文所述。根据任意上述方法的“受试者”可以是人。
[0344] 设想本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，将抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)施用给非人哺乳动物，例如，用于获得临床前数据的目的。示例性的待治疗的非人哺乳动物包括非人灵长类动物、狗、猫、啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)和其中进行临床前研究的其他哺乳动物。这样的哺乳动物可以是用于使用抗体治疗的疾病的建立的动物模型，或可以用于研究目的抗体的毒性或药物代谢动力学。在每一个这些实施方案中，可以在哺乳动物中进行剂量递增的研究。例如，可以将抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)施用给实体瘤模型的宿主啮齿动物。可以将抗体或抗体缀合物施用给宿主(例如，啮齿动物，例如，兔)，用于眼部药代动力学研究，例如，通过玻璃体内施用(例如，玻璃体内注射)或使用通道递送装置。
[0345] 在另一方面，本发明提供了包含本文提供的任何抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)的药物制剂，例如，用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)和至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。在某些实施方案中，药物制剂包含一种或多种另外的化合物。在某些实施方案中，所述另外的化合物结合选自由以下各项组成的组的第二生物学分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。例如，在一些情形中，另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或它们的变体)。在另一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6抗体，例如，EBI-
031(Eleven Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/073890)，司妥昔单抗
奥鲁凯珠单抗，克莱赞珠单抗，sirukumab，艾西莫单抗，gerilimzumab，
OPR-003，MEDI-5117，PF-04236921，或它们的变体。在又一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6R抗体，例如，托珠单抗 (参见，例如，WO 1992/019579)，
sarilumab，vobarilizumab(ALX-0061)，SA-237，或它们的变体。
031(Eleven Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/073890)，司妥昔单抗
奥鲁凯珠单抗，克莱赞珠单抗，sirukumab，艾西莫单抗，gerilimzumab，
OPR-003，MEDI-5117，PF-04236921，或它们的变体。在又一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6R抗体，例如，托珠单抗 (参见，例如，WO 1992/019579)，
sarilumab，vobarilizumab(ALX-0061)，SA-237，或它们的变体。
[0346] 在疗法中，抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以单独使用或与其它试剂组合使用。例如，抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。在某些实施方案中，另外的治疗剂是另一种抗体、抗血管发生剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、止痛剂或它们的组合。
[0347] 例如，在某些实施方案中，任何前述方法进一步包含施用一种或多种另外的化合物。在某些实施方案中，抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)与另外的化合物同时施用。在某些实施方案中，抗体或抗体缀合物在另外的化合物之前或之后施用。在某些实施方案中，另外的化合物结合选自由以下各项组成的组的第二生物学分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；
HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；
CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。
HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；
CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。
[0348] 在根据(或应用于)上述任意实施方案的某些实施方案中，眼部病症是选自由下述组成的组的眼内新生血管病：增生性视网膜病，脉络膜新生血管形成(CNV)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病和其他缺血相关的视网膜病，糖尿病性黄斑水肿，病理性近视，冯·希佩尔·林道病，眼的组织胞浆菌病，视网膜静脉闭塞(RVO)，包括CRVO和BRVO，角膜新生血管形成，视网膜新生血管形成，和早产儿视网膜病(ROP)。例如，在一些情形中，另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或它们的变体)。在另一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6抗体，例如，EBI-031(Eleven
Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/073890)，司妥昔单抗 奥鲁凯珠单
抗，克莱赞珠单抗，sirukumab，艾西莫单抗，gerilimzumab，OPR-003，MEDI-5117，PF-
04236921，或它们的变体。在又一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6R抗体，例如，托珠单抗 (参见，例如，WO 1992/019579)，sarilumab，
vobarilizumab(ALX-0061)，SA-237，或它们的变体。
Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/073890)，司妥昔单抗 奥鲁凯珠单
抗，克莱赞珠单抗，sirukumab，艾西莫单抗，gerilimzumab，OPR-003，MEDI-5117，PF-
04236921，或它们的变体。在又一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6R抗体，例如，托珠单抗 (参见，例如，WO 1992/019579)，sarilumab，
vobarilizumab(ALX-0061)，SA-237，或它们的变体。
[0349] 在一些情况下，本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与至少一种另外的治疗剂组合施用，用于治疗眼部病症，例如，本文所述的眼部病症(例如，AMD(例如，湿性AMD)，DME，DR，或RVO)。用于治疗眼部病症的联合疗法的示例性的另外的治疗剂包括，但不限于，抗血管发生剂，诸如VEGF拮抗剂，包括，例如，抗VEGF抗体(例如，抗VEGF Fab (雷珠单抗))，可溶的受体融合蛋白(例如，重组可溶的受体融合蛋白 (阿柏西普，还称作VEGF Trap Eye；Regeneron/
Aventis))，适体(例如，抗VEGF聚乙二醇化的适体 (培加尼布钠；NeXstar
Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals))，和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)，伐他拉尼
(PTK787)，semaxaminib(SU5416；SUGEN)，和 (舒尼替尼))；色氨酰-tRNA合成酶
(TrpRS)；角鲨胺； (用于储库混悬剂的乙酸阿奈可他(anecortave
acetate)；Alcon，Inc.)；考布他汀(Combretastatin)A4前药(CA4P)； (米非
司酮(mifepristone)-ru486)；眼球筋膜囊下曲安奈德(subtenon triamcinolone
acetonide)；玻璃体内结晶曲安奈德；基质金属蛋白酶抑制剂(例如，普啉司他
(Prinomastat)(AG3340；Pfizer))；氟轻松(fluocinolone acetonide)(包括氟轻松眼内植入物；Bausch&Lomb/Control Delivery Systems)；利诺胺(linomide)；整联蛋白β3功能抑制剂；制管张素，和它们的组合。可以与本发明的抗体缀合物组合施用的这些和其他治疗剂描述于，例如，美国专利申请号US 2014/0017244中，其通过引用完全并入本文中。
Aventis))，适体(例如，抗VEGF聚乙二醇化的适体 (培加尼布钠；NeXstar
Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals))，和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)，伐他拉尼
(PTK787)，semaxaminib(SU5416；SUGEN)，和 (舒尼替尼))；色氨酰-tRNA合成酶
(TrpRS)；角鲨胺； (用于储库混悬剂的乙酸阿奈可他(anecortave
acetate)；Alcon，Inc.)；考布他汀(Combretastatin)A4前药(CA4P)； (米非
司酮(mifepristone)-ru486)；眼球筋膜囊下曲安奈德(subtenon triamcinolone
acetonide)；玻璃体内结晶曲安奈德；基质金属蛋白酶抑制剂(例如，普啉司他
(Prinomastat)(AG3340；Pfizer))；氟轻松(fluocinolone acetonide)(包括氟轻松眼内植入物；Bausch&Lomb/Control Delivery Systems)；利诺胺(linomide)；整联蛋白β3功能抑制剂；制管张素，和它们的组合。可以与本发明的抗体缀合物组合施用的这些和其他治疗剂描述于，例如，美国专利申请号US 2014/0017244中，其通过引用完全并入本文中。
[0350] 可以与本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)组合用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)的另外的治疗剂的其他实例包括，但不限于， (维替泊芬(verteporfin)；一种通常与使用非热效应激光的光动力学疗法联合使用的光活化的药物)，PKC412，Endovion(NS 3728；
NeuroSearch A/S)，神经营养因子(例如，神经胶质衍生的神经营养因子(GDNF)和睫状神经营养因子(CNTF))，地尔硫卓(diltiazem)，多佐胺(dorzolamide)， 9-顺
式-视黄醛，眼用药物(例如，依可碘酯(phospholine iodide)，二乙氧膦酰硫胆碱
(echothiophate)，或碳酸酐酶抑制剂)，veovastat(AE-941；AEterna Laboratories，Inc.)，Sirna-027(AGF-745；Sima Therapeutics，Inc.)，神经营养蛋白(包括，仅举例而言，NT-4/5，Genentech)，Cand5(Acuity Pharmaceuticals)，INS-37217(Inspire
Pharmaceuticals)，整联蛋白拮抗剂(包括来自Jerini AG和Abbott Laboratories的那些)，EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)，BDM-E(BioDiem Ltd.)，沙立度胺(thalidomide)(例如，如EntreMed，Inc.所用的)，心脏营养素-1(Genentech)，2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)，DL-8234(Toray Industries)，NTC-200(Neurotech)，四硫钼酸盐(University of Michigan)，LYN-002(Lynkeus Biotech)，微藻化合物(Aquasearch/Albany，Mera
Pharmaceuticals)，D-9120(Celltech Group plc)，ATX-S10(Hamamatsu Photonics)，TGF-β2(Genzyme/Celtrix)，酪氨酸激酶抑制剂(例如，来自Allergan，SUGEN，或Pfizer的那些)，NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)，Opt-24(OPTIS France SA)，视网膜细胞神经节神经保护剂(Cogent Neurosciences)，N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)，KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)，环孢菌素A，用于光动力学疗法的治疗剂(例如， 受体-靶向的PDT，Bristol-Myers Squibb，Co.；用于与
PDT注射的卟吩姆钠(porfimer sodium)；维替泊芬，QLT Inc.；具有PDT的罗培泊芬
(rostaporfin)，Miravent Medical Technologies；具有PDT的他拉泊芬钠(talaporfin sodium)，Nippon Petroleum；和莫特沙芬镥(motexafin lutetium)，Pharmacyclics，Inc.)，反义寡核苷酸(包括，例如，由Novagali Pharma SA和ISIS-13650检测的产品，Isis Pharmaceuticals)，和它们的组合。
NeuroSearch A/S)，神经营养因子(例如，神经胶质衍生的神经营养因子(GDNF)和睫状神经营养因子(CNTF))，地尔硫卓(diltiazem)，多佐胺(dorzolamide)， 9-顺
式-视黄醛，眼用药物(例如，依可碘酯(phospholine iodide)，二乙氧膦酰硫胆碱
(echothiophate)，或碳酸酐酶抑制剂)，veovastat(AE-941；AEterna Laboratories，Inc.)，Sirna-027(AGF-745；Sima Therapeutics，Inc.)，神经营养蛋白(包括，仅举例而言，NT-4/5，Genentech)，Cand5(Acuity Pharmaceuticals)，INS-37217(Inspire
Pharmaceuticals)，整联蛋白拮抗剂(包括来自Jerini AG和Abbott Laboratories的那些)，EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)，BDM-E(BioDiem Ltd.)，沙立度胺(thalidomide)(例如，如EntreMed，Inc.所用的)，心脏营养素-1(Genentech)，2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)，DL-8234(Toray Industries)，NTC-200(Neurotech)，四硫钼酸盐(University of Michigan)，LYN-002(Lynkeus Biotech)，微藻化合物(Aquasearch/Albany，Mera
Pharmaceuticals)，D-9120(Celltech Group plc)，ATX-S10(Hamamatsu Photonics)，TGF-β2(Genzyme/Celtrix)，酪氨酸激酶抑制剂(例如，来自Allergan，SUGEN，或Pfizer的那些)，NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)，Opt-24(OPTIS France SA)，视网膜细胞神经节神经保护剂(Cogent Neurosciences)，N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)，KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)，环孢菌素A，用于光动力学疗法的治疗剂(例如， 受体-靶向的PDT，Bristol-Myers Squibb，Co.；用于与
PDT注射的卟吩姆钠(porfimer sodium)；维替泊芬，QLT Inc.；具有PDT的罗培泊芬
(rostaporfin)，Miravent Medical Technologies；具有PDT的他拉泊芬钠(talaporfin sodium)，Nippon Petroleum；和莫特沙芬镥(motexafin lutetium)，Pharmacyclics，Inc.)，反义寡核苷酸(包括，例如，由Novagali Pharma SA和ISIS-13650检测的产品，Isis Pharmaceuticals)，和它们的组合。
[0351] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)的疗法或手术程序组合施用，所述疗法或手术程序包括，例如，激光光凝术(例如，广泛视网膜光凝术(panretinal photocoagulation，PRP))，玻璃疣激光术，黄斑裂孔手术，黄斑转位手术，可植入的微型望远镜，PHI-运动血管造影术(也称作显微激光疗法和给料容器治疗(feeder vessel treatment))，质子束疗法，微刺激疗法，视网膜脱离和玻璃体手术，巩膜扣带(scleral buckle)，黄斑下手术，经瞳孔温热疗法，光系统I疗法，使用RNA干扰(RNAi)，体外流变术(extracorporeal rheopheresis)(还称为膜微分过滤(membrane differential
filtration)和流变疗法)，微型芯片植入，干细胞疗法，基因替代疗法，核酶基因疗法(包括用于缺氧反应元件的基因疗法，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；和PDEF基因疗法，GenVec)，光感受器/视网膜细胞移植(包括可移植的视网膜上皮细胞，Diacrin，Inc.；视网膜细胞移植，Cell Genesys，Inc.)，针灸，和它们的组合。
filtration)和流变疗法)，微型芯片植入，干细胞疗法，基因替代疗法，核酶基因疗法(包括用于缺氧反应元件的基因疗法，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；和PDEF基因疗法，GenVec)，光感受器/视网膜细胞移植(包括可移植的视网膜上皮细胞，Diacrin，Inc.；视网膜细胞移植，Cell Genesys，Inc.)，针灸，和它们的组合。
[0352] 在一些情形中，本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与抗血管发生剂组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)。任意适当的抗血管发生剂可以与本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物组合使用，其包括但不限于，Carmeliet等人Nature 407:249-257，2000中所列出的那些。在一些实施方案中，抗血管发生剂是VEGF拮抗剂，包括但不限于，抗VEGF抗体(例如，抗VEGF Fab (雷珠单抗)，RTH-258(以前为ESBA-
1008，抗VEGF单链抗体片段；Novartis)，或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成素2双特异性抗体，如RG-7716；Roche))，可溶的重组受体融合蛋白(例如， (阿柏
西普))，VEGF变体，可溶的VEGFR片段，能够阻断VEGF或VEGFR的适体(例如，培加尼布)，中和性抗VEGFR抗体，VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂，抗VEGF (例如，abicipar
pegol)，抑制VEGF或VEGFR表达的小干扰RNA，VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-
5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)，伐他拉尼(PTK787)，semaxaminib(SU5416；SUGEN)，和 (舒尼替尼))，和它们的组合。在一些情形中，
双特异性抗-VEGF抗体结合第二生物学分子，所述第二生物学分子包括，但不限于，IL-1β；
IL-6；IL-6R；PDGF(例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，mbVEGFR，或sVEGFR)；ST-2受体；和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。例如，在一些情形中，另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或它们的变体)。
1008，抗VEGF单链抗体片段；Novartis)，或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成素2双特异性抗体，如RG-7716；Roche))，可溶的重组受体融合蛋白(例如， (阿柏
西普))，VEGF变体，可溶的VEGFR片段，能够阻断VEGF或VEGFR的适体(例如，培加尼布)，中和性抗VEGFR抗体，VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂，抗VEGF (例如，abicipar
pegol)，抑制VEGF或VEGFR表达的小干扰RNA，VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-
5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)，伐他拉尼(PTK787)，semaxaminib(SU5416；SUGEN)，和 (舒尼替尼))，和它们的组合。在一些情形中，
双特异性抗-VEGF抗体结合第二生物学分子，所述第二生物学分子包括，但不限于，IL-1β；
IL-6；IL-6R；PDGF(例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，mbVEGFR，或sVEGFR)；ST-2受体；和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。例如，在一些情形中，另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或它们的变体)。
[0353] 可以与本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)组合施用用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)的其他适当的抗血管发生剂包括皮质类固醇，抑制血管生成的类固醇，乙酸阿奈可他(anecortave acetate)，制管张素，内皮生长抑制素，酪氨酸激酶抑制剂，基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)，间质来源的因子(SDF-1)拮抗剂(例如，抗-SDF-1抗体)，色素上皮来源的因子(PEDF)，γ-分泌酶，δ-样配体4，整联蛋白拮抗剂，缺氧-诱导的因子(HIF)-1α拮抗剂，蛋白激酶CK2拮抗剂，抑制干细胞(例如，内皮祖细胞)归巢到新生血管形成部位的试剂(例如，抗-血管内皮钙粘蛋白(CD-144)抗体和/或抗-SDF-1抗体)，和它们的组合。
[0354] 在进一步的实例中，在一些情形中，本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与具有针对新生血管形成的活性的试剂组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)，所述试剂诸如抗炎药，雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)抑制剂(例如，雷帕霉素， (依维莫司(everolimus))，和 (temsirolimus))，环孢菌素(cyclosporine)，肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂
(例如，抗-TNFα抗体或其抗原结合片段(例如，英夫利昔单抗(infliximab)，阿达木单抗(adalimumab)，赛妥珠单抗(certolizumab pegol)，和戈利木单抗(golimumab))或可溶的受体融合蛋白(例如，依那西普(etanercept)))，抗补体剂，非类固醇性抗炎剂(NSAID)，或它们的组合。
(例如，抗-TNFα抗体或其抗原结合片段(例如，英夫利昔单抗(infliximab)，阿达木单抗(adalimumab)，赛妥珠单抗(certolizumab pegol)，和戈利木单抗(golimumab))或可溶的受体融合蛋白(例如，依那西普(etanercept)))，抗补体剂，非类固醇性抗炎剂(NSAID)，或它们的组合。
[0355] 在进一步的实例中，在一些情形中，本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与这样的试剂组合施用，所述试剂是神经保护的并且能够潜在地减少干性AMD向湿性AMD的进展，诸如称为“神经类固醇类”的药物种类，其包括诸如脱氢表雄酮(DHEA)(商品名:PRASTERATM和 )，硫酸脱氢表雄酮，和硫酸孕烯醇酮的药物。
[0356] 任意适当的AMD治疗剂可以作为另外的治疗剂与本发明的抗体(例如，半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，单分散HA缀合物)组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)，其包括，但不限于，VEGF拮抗剂，例如，抗VEGF抗体(例如，(雷珠单抗)，RTH-258(之前的ESBA-1008，抗VEGF单链抗体片段；Novartis)，或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成素2双特异性抗体，如RG-
7716；Roche))，可溶的VEGF受体融合蛋白(例如， (阿柏西普))，抗VEGF
(例如，abicipar pegol；Molecular Partners AG/Allergan)，或抗VEGF适体
(例如， (培加尼布钠))；血小板衍生的生长因子(PDGF)拮抗剂，例如，抗-
PDGF抗体，抗-PDGFR抗体(例如，REGN2176-3)，抗-PDGF-BB聚乙二醇化的适体(例如，Ophthotech/Novartis)，可溶的PDGFR受体融合蛋白，或双重PDGF/VEGF拮抗
剂(例如，小分子抑制剂(例如，DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或双特异性抗-PDGF/抗-VEGF抗体))；与光动力学疗法组合的 (维替泊芬)；抗氧化剂；补体系统
拮抗剂，例如，补体因子C5拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，ARC-1905；Opthotech)或抗-C5抗体(例如，LFG-316；Novartis)，备解素(properdin)拮抗剂(例如，抗-备解素抗体，例如，CLG-561；Alcon)，或补体因子D拮抗剂(例如，抗-补体因子D抗体，例如，lampalizumab；
Roche))；视觉周期改良剂(visual cycle modifier)(例如，盐酸依米司他(emixustat hydrochloride))；角鲨胺(例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；维生素和矿物质补充剂(例如，在年龄相关的眼病研究1(Age-Related Eye Disease Study 1，AREDS1；锌和/或抗氧化剂)和研究2(AREDS2；锌，抗氧化剂，叶黄素，玉米黄素(zeaxanthin)，和/或ω-3脂肪酸)中所述的那些)；基于细胞的疗法，例如，NT-501(Renexus)；PH-05206388(Pfizer)，huCNS-SC细胞移植(StemCells)，CNTO-2476(Janssen)，OpRegen(Cell Cure
Neurosciences)，或MA09-hRPE细胞移植(Ocata Therapeutics)；组织因子拮抗剂(例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)；α-肾上腺素能受体激动剂(例如，酒石酸溴莫尼定(brimonidine tartrate))；肽疫苗(例如，S-646240；Shionogi)；β淀粉样蛋白拮抗剂(例如，抗-β淀粉样蛋白单克隆抗体，例如，GSK-933776)；S1P拮抗剂(例如，抗-S1P抗体，例如，iSONEPTM；Lpath Inc)；ROBO4拮抗剂(例如，抗-ROBO4抗体，例如，DS-7080a；Daiichi Sankyo)；表达内皮抑制素和制管张素(例如，RetinoStat)的慢病毒载体；和它们的任意组合。在一些情形中，可以共同配制AMD治疗剂(包括任何前述AMD治疗剂)。例如，抗-PDGFR抗体REGN2176-3可以与阿柏西普 共同配制。在一些情形中，所述共同制剂可以与
本发明的抗体组合施用。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
7716；Roche))，可溶的VEGF受体融合蛋白(例如， (阿柏西普))，抗VEGF
(例如，abicipar pegol；Molecular Partners AG/Allergan)，或抗VEGF适体
(例如， (培加尼布钠))；血小板衍生的生长因子(PDGF)拮抗剂，例如，抗-
PDGF抗体，抗-PDGFR抗体(例如，REGN2176-3)，抗-PDGF-BB聚乙二醇化的适体(例如，Ophthotech/Novartis)，可溶的PDGFR受体融合蛋白，或双重PDGF/VEGF拮抗
剂(例如，小分子抑制剂(例如，DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或双特异性抗-PDGF/抗-VEGF抗体))；与光动力学疗法组合的 (维替泊芬)；抗氧化剂；补体系统
拮抗剂，例如，补体因子C5拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，ARC-1905；Opthotech)或抗-C5抗体(例如，LFG-316；Novartis)，备解素(properdin)拮抗剂(例如，抗-备解素抗体，例如，CLG-561；Alcon)，或补体因子D拮抗剂(例如，抗-补体因子D抗体，例如，lampalizumab；
Roche))；视觉周期改良剂(visual cycle modifier)(例如，盐酸依米司他(emixustat hydrochloride))；角鲨胺(例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；维生素和矿物质补充剂(例如，在年龄相关的眼病研究1(Age-Related Eye Disease Study 1，AREDS1；锌和/或抗氧化剂)和研究2(AREDS2；锌，抗氧化剂，叶黄素，玉米黄素(zeaxanthin)，和/或ω-3脂肪酸)中所述的那些)；基于细胞的疗法，例如，NT-501(Renexus)；PH-05206388(Pfizer)，huCNS-SC细胞移植(StemCells)，CNTO-2476(Janssen)，OpRegen(Cell Cure
Neurosciences)，或MA09-hRPE细胞移植(Ocata Therapeutics)；组织因子拮抗剂(例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)；α-肾上腺素能受体激动剂(例如，酒石酸溴莫尼定(brimonidine tartrate))；肽疫苗(例如，S-646240；Shionogi)；β淀粉样蛋白拮抗剂(例如，抗-β淀粉样蛋白单克隆抗体，例如，GSK-933776)；S1P拮抗剂(例如，抗-S1P抗体，例如，iSONEPTM；Lpath Inc)；ROBO4拮抗剂(例如，抗-ROBO4抗体，例如，DS-7080a；Daiichi Sankyo)；表达内皮抑制素和制管张素(例如，RetinoStat)的慢病毒载体；和它们的任意组合。在一些情形中，可以共同配制AMD治疗剂(包括任何前述AMD治疗剂)。例如，抗-PDGFR抗体REGN2176-3可以与阿柏西普 共同配制。在一些情形中，所述共同制剂可以与
本发明的抗体组合施用。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
[0357] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与 (雷珠单抗)组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)。 (雷珠单抗)可以例如每月通过玻璃体内注射例如以
0.3mg/眼或0.5mg/眼施用。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
0.3mg/眼或0.5mg/眼施用。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
[0358] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与 (阿柏西普)组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)。 (阿柏西普)可以例如通过玻璃体注射以2mg/眼施用，例如，每四周
(Q4W)，或前三个月Q4W，之后每两个月注射一次用于维持。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
(Q4W)，或前三个月Q4W，之后每两个月注射一次用于维持。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
[0359] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与 (培加尼布钠)组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)。 (培加尼布钠)可以每六周通过玻璃体内注射例如以
0.3mg/眼施用。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
0.3mg/眼施用。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
[0360] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与 (维替泊芬)组合与光动力学疗法组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)。 可以例如以任意适当的剂量(例如，
6mg/m2体表面积)通过静脉内输注施用，每三个月递送一次(例如，输注10分钟)。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
6mg/m2体表面积)通过静脉内输注施用，每三个月递送一次(例如，输注10分钟)。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
[0361] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与PDGF拮抗剂组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)。可以与本发明的抗体组合使用的示例性PDGF拮抗剂包括抗-PDGF抗体，抗-PDGFR抗体，小分子抑制剂(例如，角鲨胺)，抗-PDGF-B聚乙二醇化的适体，如 (E10030；Ophthotech/Novartis)，或双重PDGF/VEGF拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或双特异性抗PDGF/抗VEGF抗体)。例如，可以施用
作为本发明的抗体的辅助疗法。 可以以任意适当的剂量施用，
例如，0.1mg/眼-2.5mg/眼，例如，0.3mg/眼或1.5mg/眼，例如，通过玻璃体内注射，例如，每四周施用(Q4W)。OHR-102(乳酸角鲨胺眼用溶液，0.2％)可以通过滴眼液施用，例如，每天施用两次。OHR-102可以与VEGF拮抗剂(如 或 )组合施用。在一些实
施方案中，本发明的抗体缀合物可以与OHR-102， 和/或 组合施
用。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
作为本发明的抗体的辅助疗法。 可以以任意适当的剂量施用，
例如，0.1mg/眼-2.5mg/眼，例如，0.3mg/眼或1.5mg/眼，例如，通过玻璃体内注射，例如，每四周施用(Q4W)。OHR-102(乳酸角鲨胺眼用溶液，0.2％)可以通过滴眼液施用，例如，每天施用两次。OHR-102可以与VEGF拮抗剂(如 或 )组合施用。在一些实
施方案中，本发明的抗体缀合物可以与OHR-102， 和/或 组合施
用。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
[0362] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与RTH-258组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)。RTH-258可以例如通过玻璃体内注射或眼睛输注施用。对于玻璃体内注射，RTH-258可以以任意适当的剂量(例如，3mg/眼或6mg/眼)施用，例如，前三个月每四周施用一次(Q4W)作为负载，之后每12周(Q12W)或每八周(Q8W)注射一次用于维持。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
[0363] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与abicipar pegol组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)。abicipar pegol可以例如通过玻璃体内注射施用。Abicipar pegol可以以任意适当的剂量(例如，1mg/眼，2mg/眼，3mg/眼，4mg/眼，或4.2mg/眼)施用，例如，前三个月每四周一次(Q4W)作为负载，之后每12周(Q12W)或每八周(Q8W)注射一次用于维持。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
[0364] 任意适当的DME和/或DR治疗剂可以与本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)组合施用，用于治疗眼部病症(例如，AMD，DME，DR，或RVO)，所述治疗剂包括，但不限于，VEGF拮抗剂(例如， 或)，皮质类固醇(例如，皮质类固醇植入物(例如， (地塞米松
(dexamethasone)玻璃体内植入物)或 (氟轻松玻璃体内植入物))或配制用于
通过玻璃体内注射施用的皮质类固醇(例如，曲安奈德))，或它们的组合。在一些情形中，眼部病症是DME和/或DR。
(dexamethasone)玻璃体内植入物)或 (氟轻松玻璃体内植入物))或配制用于
通过玻璃体内注射施用的皮质类固醇(例如，曲安奈德))，或它们的组合。在一些情形中，眼部病症是DME和/或DR。
[0365] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与 (雷珠单抗)组合施用，用于治疗DME和/或DR(例如，NPDR或PDR)。 (雷珠单抗)可以例如每四周(Q4W)通过玻璃体内注射例如以
0.3mg/眼或0.5mg/眼施用。
0.3mg/眼或0.5mg/眼施用。
[0366] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与 (阿柏西普)组合施用，用于治疗DME和/或DR(例如，NPDR或PDR)。 (阿柏西普)可以例如通过玻璃体内注射以2mg/眼施用，例如，每四周
(Q4W)，或前五个月Q4W，之后每八周(Q8W)注射一次用于维持。
(Q4W)，或前五个月Q4W，之后每八周(Q8W)注射一次用于维持。
[0367] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与 (地塞米松玻璃体内植入物)组合施用，用于治疗DME和/或DR。 可以作为0.7mg地塞米松玻璃体内植入物施用，其可以多至每六个月施
用。
用。
[0368] 本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以与 (地塞米松玻璃体内植入物)组合施用，用于治疗DME和/或DR。 可以作为0.19mg氟轻松玻璃体内植入物施用，其可以以0.25μg/天的速
率冲洗，并且能够持续长达约36个月。
率冲洗，并且能够持续长达约36个月。
[0369] 在一些情形中，TAO/PRN治疗方案或TAE治疗方案可以用于施用与本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)组合的AMD治疗剂(例如，雷珠单抗或阿柏西普)。对于TAO/PRN方案，在每四周(Q4W)初始玻璃体内注射(通常持续约3个月)后，每月或每隔一月(或甚至更长的时间间隔)监测受试者，如果有疾病活动证据(例如，光学相干性层析成像(optical coherence tomography，OCT)上的视敏度或流体减少)，施用注射。对于TAE方案，受试者可以每四周(Q4W)治疗，之后对于每次后续的随访将治疗间隔延长固定的周数(例如，+2周)，直至最大的时间间隔(例如，每6周，每8周，每10周，或每12周)。即使没有疾病活动证据，也可以在每次随访观察并治疗眼睛。如果黄斑出现湿性(例如，通过OCT)，则可以缩短注射的时间间隔(例如，-2周)，直到黄斑再次出现干性。在一些情形中，眼部病症是AMD(例如，湿性AMD)。
[0370] 上文所述的所述组合疗法包括组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在相同或分开的制剂中)，和分开施用，在该情形中，本发明的抗体或抗体缀合物的施用可以发生在一种或多种另外的治疗剂的施用之前、同时和/或之后。在一个实施方案中，抗体或抗体缀合物的施用和另外的治疗剂的施用彼此在约一个月、两个月、三个月、四个月或五个月内发生，或在约一周、两周或三周内发生，或在约一天、两条、三天、四天、五天或六天内发生。
[0371] 用于预防或治疗眼部疾病或病况的本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)(和任意另外的治疗剂)可以通过任意适当的方式施用，所述方式包括，但不限于，例如，眼部、眼内、和/或玻璃体内注射，和/或近巩膜注射，和/或眼球筋膜囊下注射，和/或脉络膜上注射，和/或以滴眼液和/或软膏形式局部施用。本发明的所述抗体或抗体缀合物可以通过多种方法递送，例如，作为允许将化合物缓慢释放到玻璃体中的装置和/或储库制剂玻璃体内递送，包括在诸如Intraocular Drug
Delivery，Jaffe，Jaffe，Ashton，和Pearson，编，Taylor&Francis(2006年3月)的参考文献中记载的那些。在一个实例中，装置可以是微型泵和/或基质和/或被动扩散系统和/或包封的细胞的形式，它们在延长的时间期间释放化合物(Intraocular Drug Delivery，Jaffe，Jaffe，Ashton，和Pearson，编，Taylor&Francis(2006年3月))。可以使用的另外的途径记述在下述G部分中。
Delivery，Jaffe，Jaffe，Ashton，和Pearson，编，Taylor&Francis(2006年3月)的参考文献中记载的那些。在一个实例中，装置可以是微型泵和/或基质和/或被动扩散系统和/或包封的细胞的形式，它们在延长的时间期间释放化合物(Intraocular Drug Delivery，Jaffe，Jaffe，Ashton，和Pearson，编，Taylor&Francis(2006年3月))。可以使用的另外的途径记述在下述G部分中。
[0372] 用于眼部、眼内或玻璃体内施用的制剂可以通过本领域已知的方法和使用本领域已知的赋型剂制备。有效治疗的重要特征是通过眼适当的渗透。与可以局部递送药物的眼前部的疾病不同，视网膜疾病通常受益于更加位点特异性的方法。滴眼液和软膏很少渗透到眼后部，并且血-眼屏障阻碍系统性施用的药物渗透到眼组织中。因此，用于治疗视网膜疾病(如AMD和CNV)的药物递送的所选方法通常是直接的玻璃体内注射。玻璃体内注射通常以一定的时间间隔重复，这取决于患者的病况和所递送的药物的特性和半衰期。可以使用的另外的途径记述在下述G部分中。
[0373] 抗体或抗体缀合物有效治疗特定的眼部病症或病况的量将取决于所述病症或病况的性质，并且可以通过标准临床技术确定。可能的是，需要首先在体外确定剂量-响应曲线和本发明的药物组合物，然后在人体内测试之前在有用的动物模型系统中确定。
[0374] 另外适当的施用方式包括肠胃外，肺内，和鼻内，并且如果需要局部治疗，病变内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何适当的途径，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短期的还是长期的。本文考虑多种给药时间方案，包括但不限于，单次或在多个时间点多次施用，推注施用和脉冲输注。在一些情形中，本发明的抗体缀合物可以静脉内、肌肉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜内、腹膜、心室内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眶内、口服、局部、经皮、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以霜剂、或以脂质组合物施用。
[0375] 为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)的适当的剂量将取决于待治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重性和病程，抗体是为预防还是治疗目的施用，之前的治疗，患者的临床病史和对抗体的响应，和主治医师的判断。抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)一次或在一系列的治疗中适当地施用给患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)抗体或抗体缀合物可以是用于施用给患者的起始候选剂量，不管例如是通过一次或多次分开的施用还是通过连续输注。
在一些实施方案中，所用的抗体或抗体缀合物为约0.01mg/kg至约45mg/kg，约0.01mg/kg至约40mg/kg，约0.01mg/kg至约35mg/kg，约0.01mg/kg至约30mg/kg，约0.01mg/kg至约25mg/kg，约0.01mg/kg至约20mg/kg，约0.01mg/kg至约15mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约
0.01mg/kg至约5mg/kg，或约0.01mg/kg至约1mg/kg。对于抗体缀合物，给药可以基于缀合物的抗体组分的重量。一种典型的每日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内，这取决于上文提及的因素。对于在数天或更长的时间的重复施用，取决于病况，通常维持治疗，直到发生疾病症状的需要的抑制。
在一些实施方案中，所用的抗体或抗体缀合物为约0.01mg/kg至约45mg/kg，约0.01mg/kg至约40mg/kg，约0.01mg/kg至约35mg/kg，约0.01mg/kg至约30mg/kg，约0.01mg/kg至约25mg/kg，约0.01mg/kg至约20mg/kg，约0.01mg/kg至约15mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约
0.01mg/kg至约5mg/kg，或约0.01mg/kg至约1mg/kg。对于抗体缀合物，给药可以基于缀合物的抗体组分的重量。一种典型的每日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内，这取决于上文提及的因素。对于在数天或更长的时间的重复施用，取决于病况，通常维持治疗，直到发生疾病症状的需要的抑制。
[0376] 在一些实施方案中，所述方法可以进一步包含另外的疗法。另外的疗法可以是放射疗法、手术、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。另外的疗法可以采用辅助疗法或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用限制副作用的试剂(例如，旨在减少治疗副作用发生和/或严重性的试剂，如止吐剂等)。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐射。在一些实施方案中，另外的疗法可以是上述治疗剂中的一种或多种的分开施用。
[0377] 应该理解，可以使用本发明的免疫缀合物替代抗VEGF抗体，或除抗VEGF抗体之外还使用本发明的免疫缀合物，来进行任意上述制剂或治疗方法。
[0378] 应该理解，可以使用本发明的抗体缀合物(例如，本文所述的任一种，例如，在下文G部分中所述),进行任意上述制剂或治疗方法。
[0379] F.制品
[0380] 在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗和/或预防上述病症的材料。该制品包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物组合，并且容器可具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的抗体组合物(例如，抗体(例如，半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或其抗体缀合物)。标签或包装插页标明该组合物是用于治疗选择的病况。此外，制品可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体或其抗体组合物；和任选地(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品可进一步包含包装插页，所述包装插页指明所述组合物可以用于治疗特定病况。备选地，或另外地，制品可进一步包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户立场，它可进一步包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
[0381] 应该理解，任何上述制品可包括本文所述的任何抗体或其抗体缀合物和/或任何另外的治疗剂。
[0382] G.眼部长久作用递送方法
[0383] 本发明提供用于治疗眼部病症的组合物，其可以用于向眼睛长久作用递送抗体(例如抗VEGF抗体(包括本文所述的任何抗VEGF抗体，例如G6.31 AARR))。例如，本发明提供了抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)，其包括本文所述的抗VEGF抗体(例如Fab、Fab-C或半胱氨酸工程改造的抗体(例如ThioFab)缀合物)。本发明还提供可用于眼部施用本文所述的抗体或抗体缀合物的装置。本发明进一步提供了包括本文所述抗体或抗体缀合物的药物组合物。这些组合物可以用在本文所述的任何治疗方法中，例如，治疗眼部病症(例如，AMD(例如，湿性AMD)，DME，DR(例如，NPDR或PDR)，或RVO(例如，CRVO或BRVO))的方法中。
[0384] 1.抗体缀合物
[0385] 本发明提供了抗体缀合物，其包括抗体(例如抗VEGF抗体)和共价附接于所述抗体的单分散聚合物。抗体(例如抗VEGF抗体)可以以不可逆的方式或可逆的方式共价附接到单分散聚合物上。可以使用任何合适的单分散聚合物，包括本文所述的那些或本领域已知的其它聚合物。
[0386] 本发明提供了抗体缀合物，其包括抗体和共价附接于抗体的单分散聚合物(例如，单分散HA聚合物)。聚合物可具有约1.1或更低的多分散指数(PDI)。应该理解，PDI值可以指用于制备抗体缀合物的聚合物的PDI值。例如，在一些实施方案中，聚合物具有在1.0至约1.1之间的PDI(例如，在1至约1.1之间，在1至约1.09之间，在1至约1.08之间，在1至约1.07之间，在1至约1.06之间，1至约1.05、1至约1.04、1至约1.03、1至约1.02、1至约1.01、1至约
1.005、约1.001至约1.1、约1.001至约1.09，约1.001至约1.08，约1.001至约1.07，约1.001至约1.06，约1.001至约1.05，约1.001至约1.04，约1.001至约1.03，约1.001至约1.02之间、约1.001至约1.01之间、约1.001至约1.005之间、约1.001至约1.004之间、约1.001至约
1.003之间、约1.001至约1.002之间、约1.0001至约1.1之间，约1.0001至约1.09之间、约
1.0001至约1.08之间、约1.0001至约1.07之间、约1.0001至约1.06之间、约1.0001至约1.05之间、约1.0001至约1.04之间、约1.0001至约1.03之间，约1.0001至约1.02之间、约1.0001至约1.01之间、约1.0001至约1.005之间、约1.0001至约1.004之间、约1.0001至约1.003之间、约1.0001至约1.002之间，或约1.0001至约1.005之间)。
1.005、约1.001至约1.1、约1.001至约1.09，约1.001至约1.08，约1.001至约1.07，约1.001至约1.06，约1.001至约1.05，约1.001至约1.04，约1.001至约1.03，约1.001至约1.02之间、约1.001至约1.01之间、约1.001至约1.005之间、约1.001至约1.004之间、约1.001至约
1.003之间、约1.001至约1.002之间、约1.0001至约1.1之间，约1.0001至约1.09之间、约
1.0001至约1.08之间、约1.0001至约1.07之间、约1.0001至约1.06之间、约1.0001至约1.05之间、约1.0001至约1.04之间、约1.0001至约1.03之间，约1.0001至约1.02之间、约1.0001至约1.01之间、约1.0001至约1.005之间、约1.0001至约1.004之间、约1.0001至约1.003之间、约1.0001至约1.002之间，或约1.0001至约1.005之间)。
[0387] 例如，在一些实施方案中，单分散聚合物(例如，单分散HA聚合物)具有1.001、约1.0001、约1.00001、约1.000001、约1.0000001或更低的PDI。在一些实施方案中，单分散聚合物(例如单分散HA聚合物)具有1.0、约1.001、约1.002、约1.003、约1.004、约1.005、约
1.006、约1.007、约1.008、约1.009、约1.01、约1.011，约1.012，约1.013，约1.014，约1.015，约1.016，约1.017，约1.018，约1.019，约1.02，约1.021，约1.022，约1.023，约1.024，约
1.025，约1.026，约1.027，约1.028，约1.029、约1.03、约1.031、约1.032、约1.033、约1.034、约1.035、约1.036、约1.037、约1.038、约1.039、约1.04、约1.041、约1.042、约1.043、约
1.044、约1.045，约1.046、约1.047、约1.048、约1.049、约1.05、约1.051、约1.052、约1.053、约1.054、约1.055、约1.056、约1.057、约1.058、约1.059、约1.06、约1.061、约1.062，约
1.063、约1.064、约1.065、约1.066、约1.067、约1.068、约1.069、约1.07、约1.071、约1.072、约1.073、约1.074、约1.075、约1.076、约1.077、约1.078、约1.079，约1.08、约1.081、约
1.082、约1.083、约1.084、约1.085、约1.086、约1.087、约1.088、约1.089、约1.09、约1.091、约1.092、约1.093、约1.094、约1.095、约1.096，约1.097、约1.098、约1.099或约1.1的PDI。
在一些实施方案中，聚合物(例如，HA聚合物)具有约1.001的PDI。
1.006、约1.007、约1.008、约1.009、约1.01、约1.011，约1.012，约1.013，约1.014，约1.015，约1.016，约1.017，约1.018，约1.019，约1.02，约1.021，约1.022，约1.023，约1.024，约
1.025，约1.026，约1.027，约1.028，约1.029、约1.03、约1.031、约1.032、约1.033、约1.034、约1.035、约1.036、约1.037、约1.038、约1.039、约1.04、约1.041、约1.042、约1.043、约
1.044、约1.045，约1.046、约1.047、约1.048、约1.049、约1.05、约1.051、约1.052、约1.053、约1.054、约1.055、约1.056、约1.057、约1.058、约1.059、约1.06、约1.061、约1.062，约
1.063、约1.064、约1.065、约1.066、约1.067、约1.068、约1.069、约1.07、约1.071、约1.072、约1.073、约1.074、约1.075、约1.076、约1.077、约1.078、约1.079，约1.08、约1.081、约
1.082、约1.083、约1.084、约1.085、约1.086、约1.087、约1.088、约1.089、约1.09、约1.091、约1.092、约1.093、约1.094、约1.095、约1.096，约1.097、约1.098、约1.099或约1.1的PDI。
在一些实施方案中，聚合物(例如，HA聚合物)具有约1.001的PDI。
[0388] 单分散聚合物可以是亲水聚合物或疏水聚合物。应该理解，亲水性聚合物可以是水溶性聚合物。可以使用任意适当的亲水聚合物，例如，国际专利申请公开号WO 2011/066417和/或Pelegri-O’Day等人J.Am.Chem.Soc.136:14323-14332,2014中所述的亲水聚合物，它们通过引用完全并入本文。可以使用的示例性的非限制性亲水聚合物包括透明质酸(HA)，聚乙二醇(PEG；还称为聚(乙二醇))(例如，直链PEG，分支的PEG，蜂巢样PEG，和树枝状PEG)，聚[氧化乙烯)-共-(亚甲基氧化乙烯)]，聚(聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯)
(pPEGMA)，琼脂糖，海藻酸盐，鹿角菜胶，羧甲纤维素，纤维素，纤维素衍生物，壳聚糖，硫酸软骨素，胶原蛋白，硫酸皮肤素，葡聚糖，硫酸葡聚糖，纤维蛋白，纤维蛋白原，纤连蛋白，岩藻依聚糖(fucoidan)，明胶，糖胺聚糖(GAG)，糖聚合物，肝素，硫酸肝素，高分支的多糖(例如，半乳糖树状聚合物)，硫酸角质素，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(pHPMA)，果胶，果胶衍生物，聚硫酸戊聚糖，淀粉，羟乙基淀粉(HES)，苯乙烯，玻连蛋白，聚(丙烯酸)，聚(甲基丙烯酸)，聚(丙烯酰胺)，聚(丙烯酸)，聚(胺)，聚(氨基酸)，聚(羧基甜菜碱)(PCB)，聚电解质，聚(谷氨酸)(PGA)，聚(甘油)(PG)(例如，线性的，中功能性，多分支的，或线性的多分支的PG)，聚(马来酸)，聚(2-噁唑啉)(POZ)，聚(2-乙基-2-噁唑啉，聚唾液酸(PSA)，聚苯乙烯，聚苯乙烯衍生物(例如，带电荷的聚苯乙烯衍生物)，聚(磺酸苯乙烯-共-PEGMA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(N-丙烯酰吗啉)(pNAcM)，和它们的共聚物。在一些情形中，聚合物是疏水聚合物，例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，聚丙交酯(PLA)，和聚乙醇酸交酯(PGA)。聚合物可以是可生物降解的和/或生物相容的。在特定的实施方案中，聚合物是HA。
(pPEGMA)，琼脂糖，海藻酸盐，鹿角菜胶，羧甲纤维素，纤维素，纤维素衍生物，壳聚糖，硫酸软骨素，胶原蛋白，硫酸皮肤素，葡聚糖，硫酸葡聚糖，纤维蛋白，纤维蛋白原，纤连蛋白，岩藻依聚糖(fucoidan)，明胶，糖胺聚糖(GAG)，糖聚合物，肝素，硫酸肝素，高分支的多糖(例如，半乳糖树状聚合物)，硫酸角质素，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(pHPMA)，果胶，果胶衍生物，聚硫酸戊聚糖，淀粉，羟乙基淀粉(HES)，苯乙烯，玻连蛋白，聚(丙烯酸)，聚(甲基丙烯酸)，聚(丙烯酰胺)，聚(丙烯酸)，聚(胺)，聚(氨基酸)，聚(羧基甜菜碱)(PCB)，聚电解质，聚(谷氨酸)(PGA)，聚(甘油)(PG)(例如，线性的，中功能性，多分支的，或线性的多分支的PG)，聚(马来酸)，聚(2-噁唑啉)(POZ)，聚(2-乙基-2-噁唑啉，聚唾液酸(PSA)，聚苯乙烯，聚苯乙烯衍生物(例如，带电荷的聚苯乙烯衍生物)，聚(磺酸苯乙烯-共-PEGMA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(N-丙烯酰吗啉)(pNAcM)，和它们的共聚物。在一些情形中，聚合物是疏水聚合物，例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，聚丙交酯(PLA)，和聚乙醇酸交酯(PGA)。聚合物可以是可生物降解的和/或生物相容的。在特定的实施方案中，聚合物是HA。
[0389] 例如，单分散聚合物(例如，HA聚合物)可包括任何合适数目的单体，例如，在2和约1×104个单体之间(例如，约10、约50、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约
800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000或约1×104个单体)或更多。例如，聚合物(例如HA聚合物)可包括约50至约250个单体、约50至约
500个单体、约50至约1000个单体、约50至约2000个单体、约50至约3000个单体，约50至约
4000个单体、约50至约5000个单体、约50至约6000个单体、约50至约7000个单体、约50至约
8000个单体、约50至约9000个单体、约50至约10000个单体、约100至约250个单体、约100至约500个单体、约100至约1000个单体、约100至约2000个单体、约100至约3000个单体，约100至约4000个单体、约100至约5000个单体、约100至约6000个单体、约100至约7000个单体、约
100至约8000个单体、约100至约9000个单体，约100至约10000个单体、约250至约500个单体、约250至约1000个单体、约250至约2000个单体、约250至约3000个单体、约250至约4000个单体、约250至约5000个单体、约250至约6000个单体、约250至约7000个单体、约250至约
8000个单体、约250至约9000个单体、约250至约10000个单体、约500至约1000个单体、约500至约2000个单体、约500至约3000个单体、约500至约4000个单体、约500至约5000个单体、约
500至约6000个单体、约500至约7000个单体、约500至约8000个单体、约500至约9000个单体或约500至约10000个单体。在一些情形中，聚合物(例如，HA聚合物)可以包括约500个单体。
800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000或约1×104个单体)或更多。例如，聚合物(例如HA聚合物)可包括约50至约250个单体、约50至约
500个单体、约50至约1000个单体、约50至约2000个单体、约50至约3000个单体，约50至约
4000个单体、约50至约5000个单体、约50至约6000个单体、约50至约7000个单体、约50至约
8000个单体、约50至约9000个单体、约50至约10000个单体、约100至约250个单体、约100至约500个单体、约100至约1000个单体、约100至约2000个单体、约100至约3000个单体，约100至约4000个单体、约100至约5000个单体、约100至约6000个单体、约100至约7000个单体、约
100至约8000个单体、约100至约9000个单体，约100至约10000个单体、约250至约500个单体、约250至约1000个单体、约250至约2000个单体、约250至约3000个单体、约250至约4000个单体、约250至约5000个单体、约250至约6000个单体、约250至约7000个单体、约250至约
8000个单体、约250至约9000个单体、约250至约10000个单体、约500至约1000个单体、约500至约2000个单体、约500至约3000个单体、约500至约4000个单体、约500至约5000个单体、约
500至约6000个单体、约500至约7000个单体、约500至约8000个单体、约500至约9000个单体或约500至约10000个单体。在一些情形中，聚合物(例如，HA聚合物)可以包括约500个单体。
[0390] 本发明提供了抗体缀合物，其包括共价附接于单分散HA聚合物的抗体(例如抗VEGF抗体，如G6.31 AARR)。这样的抗体缀合物在本文中有时称为“单分散HA缀合物”。单分散HA聚合物可具有约1.1或更低的多分散指数(PDI)。例如，在一些实施方案中，单分散HA聚合物具有在1.0至约1.1之间的PDI(例如，在1至约1.1之间，在1至约1.09之间，在1至约1.08之间，在1至约1.07之间，在1至约1.06之间，1至约1.05、1至约1.04、1至约1.03、1至约1.02、
1至约1.01、1至约1.005、约1.001至约1.1、约1.001至约1.09，约1.001至约1.08，约1.001至约1.07，约1.001至约1.06，约1.001至约1.05，约1.001至约1.04，约1.001至约1.03，约
1.001至约1.02之间、约1.001至约1.01之间、约1.001至约1.005之间、约1.001至约1.004之间、约1.001至约1.003之间、约1.001至约1.002之间、约1.0001至约1.1之间，约1.0001至约
1.09之间、约1.0001至约1.08之间、约1.0001至约1.07之间、约1.0001至约1.06之间、约
1.0001至约1.05之间、约1.0001至约1.04之间、约1.0001至约1.03之间，约1.0001至约1.02之间、约1.0001至约1.01之间、约1.0001至约1.005之间、约1.0001至约1.004之间、约
1.0001至约1.003之间、约1.0001至约1.002之间，或约1.0001至约1.005之间)。
1至约1.01、1至约1.005、约1.001至约1.1、约1.001至约1.09，约1.001至约1.08，约1.001至约1.07，约1.001至约1.06，约1.001至约1.05，约1.001至约1.04，约1.001至约1.03，约
1.001至约1.02之间、约1.001至约1.01之间、约1.001至约1.005之间、约1.001至约1.004之间、约1.001至约1.003之间、约1.001至约1.002之间、约1.0001至约1.1之间，约1.0001至约
1.09之间、约1.0001至约1.08之间、约1.0001至约1.07之间、约1.0001至约1.06之间、约
1.0001至约1.05之间、约1.0001至约1.04之间、约1.0001至约1.03之间，约1.0001至约1.02之间、约1.0001至约1.01之间、约1.0001至约1.005之间、约1.0001至约1.004之间、约
1.0001至约1.003之间、约1.0001至约1.002之间，或约1.0001至约1.005之间)。
[0391] 例如，在一些实施方案中，单分散HA聚合物具有1.001、约1.0001、约1.00001、约1.000001、约1.0000001或更低的PDI。在一些实施方案中，单分散HA聚合物具有1.0、约
1.001、约1.002、约1.003、约1.004、约1.005、约1.006、约1.007、约1.008、约1.009、约1.01、约1.011，约1.012，约1.013，约1.014，约1.015，约1.016，约1.017，约1.018，约1.019，约
1.02，约1.021，约1.022，约1.023，约1.024，约1.025，约1.026，约1.027，约1.028，约1.029、约1.03、约1.031、约1.032、约1.033、约1.034、约1.035、约1.036、约1.037、约1.038、约
1.039、约1.04、约1.041、约1.042、约1.043、约1.044、约1.045，约1.046、约1.047、约1.048、约1.049、约1.05、约1.051、约1.052、约1.053、约1.054、约1.055、约1.056、约1.057、约
1.058、约1.059、约1.06、约1.061、约1.062，约1.063、约1.064、约1.065、约1.066、约1.067、约1.068、约1.069、约1.07、约1.071、约1.072、约1.073、约1.074、约1.075、约1.076、约
1.077、约1.078、约1.079，约1.08、约1.081、约1.082、约1.083、约1.084、约1.085、约1.086、约1.087、约1.088、约1.089、约1.09、约1.091、约1.092、约1.093、约1.094、约1.095、约
1.096，约1.097、约1.098、约1.099或约1.1的PDI。在一些实施方案中，单分散HA聚合物具有约1.001的PDI。
1.001、约1.002、约1.003、约1.004、约1.005、约1.006、约1.007、约1.008、约1.009、约1.01、约1.011，约1.012，约1.013，约1.014，约1.015，约1.016，约1.017，约1.018，约1.019，约
1.02，约1.021，约1.022，约1.023，约1.024，约1.025，约1.026，约1.027，约1.028，约1.029、约1.03、约1.031、约1.032、约1.033、约1.034、约1.035、约1.036、约1.037、约1.038、约
1.039、约1.04、约1.041、约1.042、约1.043、约1.044、约1.045，约1.046、约1.047、约1.048、约1.049、约1.05、约1.051、约1.052、约1.053、约1.054、约1.055、约1.056、约1.057、约
1.058、约1.059、约1.06、约1.061、约1.062，约1.063、约1.064、约1.065、约1.066、约1.067、约1.068、约1.069、约1.07、约1.071、约1.072、约1.073、约1.074、约1.075、约1.076、约
1.077、约1.078、约1.079，约1.08、约1.081、约1.082、约1.083、约1.084、约1.085、约1.086、约1.087、约1.088、约1.089、约1.09、约1.091、约1.092、约1.093、约1.094、约1.095、约
1.096，约1.097、约1.098、约1.099或约1.1的PDI。在一些实施方案中，单分散HA聚合物具有约1.001的PDI。
[0392] 在一些情形中，单分散HA聚合物具有约2.5兆道尔顿(MDa)或更低(例如，约2.5MDa或更低，约2.4MDa或更低，约2.3MDa或更低，约2.2MDa或更低，约2.1MDa或更低，约2.0MDa或更低，约1.9MDa或更低，约1.8MDa或更低，约1.7MDa或更低，约1.6MDa或更低，约1.5MDa或更低，约1.4MDa或更低，约1.3MDa或更低，约1.2MDa或更低，约1.1MDa或更低，约1.0MDa或更低，约900kDa或更低，约800kDa或更低，约700kDa或更低，约600kDa或更低，约500kDa或更低，约400kDa或更低，约300kDa或更低，约200kDa或约100kDa或更低)的分子量。在一些情形中，HA聚合物具有约1MDa或更低(例如，约1.0MDa或更低，约900kDa或更低，约800kDa或更低，约700kDa或更低，约600kDa或更低，约500kDa或更低，约400kDa或更低，约300kDa或更低，约200kDa或更低，或约100kDa或更低)的分子量。在某些情形中，HA聚合物具有约25kDa至约2.5MDa的分子量(例如，约25kDa至约2.5mDa、约25kDa至约2MDa、约25kDa至约1.5MDa、约25kDa至约1MDa，约25kDa至约900kDa，约25kDa至约800kDa，约25kDa至约700kDa，约25kDa至约600kDa，约25kDa至约500kDa，约100kDa至约2.5mDa，约100kDa至约2MDa，约100kDa至约1.5MDa，约100kDa至约1MDa，约100kDa至约900kDa，约100kDa至约800kDa，约100kDa至约
700kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约500kDa，约250kDa和约2.5MDa之间、约250kDa和约2MDa之间、约250kDa和约1.5MDa之间、约250kDa和约1MDa之间、约250kDa和约900kDa之间、约250kDa至约800kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约
500kDa，约500kDa至约2.5MDa，约500kDa至约2MDa，约500kDa至约1.5MDa，约500kDa至约
1MDa，约500kDa至约900kDa，约500kDa至约800kDa，约500kDa至约700kDa，约500kDa至约
600kDa，约1MDa至约2.5MDa，约1MDa至约2MDa，约1MDa至约1.5MDa，约1MDa至约1.25MDa，约
1.25MDa至约2.5MDa，约1.25MDa至约2MDa，约1.25MDa至约1.5MDa，约1.5MDa至约2.5MDa，约
1.5MDa至约2MDa，约1.5MDa至约1.75MDa，或1.75MDa至约2.5MDa)。
700kDa，约100kDa至约600kDa，约100kDa至约500kDa，约250kDa和约2.5MDa之间、约250kDa和约2MDa之间、约250kDa和约1.5MDa之间、约250kDa和约1MDa之间、约250kDa和约900kDa之间、约250kDa至约800kDa，约250kDa至约700kDa，约250kDa至约600kDa，约250kDa至约
500kDa，约500kDa至约2.5MDa，约500kDa至约2MDa，约500kDa至约1.5MDa，约500kDa至约
1MDa，约500kDa至约900kDa，约500kDa至约800kDa，约500kDa至约700kDa，约500kDa至约
600kDa，约1MDa至约2.5MDa，约1MDa至约2MDa，约1MDa至约1.5MDa，约1MDa至约1.25MDa，约
1.25MDa至约2.5MDa，约1.25MDa至约2MDa，约1.25MDa至约1.5MDa，约1.5MDa至约2.5MDa，约
1.5MDa至约2MDa，约1.5MDa至约1.75MDa，或1.75MDa至约2.5MDa)。
[0393] 在某些情形中，单分散HA聚合物具有约25kDa至约500kDa的分子量(例如，约25kDa至约500kDa，约25kDa至约450kDa，约25kDa至约400kDa，约25kDa至约350kDa，约25kDa至约300kDa，约25kDa至约300kDa，约25kDa至约250kDa，约25kDa至约200kDa，约25kDa至约
150kDa，约25kDa至约100kDa，约25kDa至约50kDa，约40kDa至约500kDa，约40kDa至约
450kDa，约40kDa至约400kDa，约40kDa至约350kDa，约40kDa至约300kDa，约40kDa至约
300kDa，约40kDa至约250kDa，约40kDa至约200kDa，约40kDa至约150kDa，约40kDa至约
100kDa，约40kDa至约50kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约
400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约
250kDa，约50kDa至约200kDa，约50kDa至约150kDa，约50kDa至约100kDa，约50kDa至约
75kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约
350kDa，约100kDa至约300kDa，约100kDa至约300kDa，约100kDa至约250kDa，约100kDa至约
200kDa，约100kDa至约150kDa，约150kDa至约500kDa，约150kDa至约450kDa，约150kDa至约
400kDa，约150kDa至约350kDa，约150kDa至约300kDa，约150kDa至约300kDa，约150kDa至约
250kDa，约150kDa至约200kDa，约175kDa至约500kDa，约175kDa至约450kDa，约175kDa至约
400kDa，约175kDa至约350kDa，约175kDa至约300kDa，约175kDa至约300kDa，175 200kDa至约250kDa，约175kDa至约225kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约200kDa至约350kDa，约200kDa至约300kDa，约200kDa至约300kDa，约200kDa至约250kDa，或约200kDa至约225kDa)。
150kDa，约25kDa至约100kDa，约25kDa至约50kDa，约40kDa至约500kDa，约40kDa至约
450kDa，约40kDa至约400kDa，约40kDa至约350kDa，约40kDa至约300kDa，约40kDa至约
300kDa，约40kDa至约250kDa，约40kDa至约200kDa，约40kDa至约150kDa，约40kDa至约
100kDa，约40kDa至约50kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约
400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约
250kDa，约50kDa至约200kDa，约50kDa至约150kDa，约50kDa至约100kDa，约50kDa至约
75kDa，约100kDa至约500kDa，约100kDa至约450kDa，约100kDa至约400kDa，约100kDa至约
350kDa，约100kDa至约300kDa，约100kDa至约300kDa，约100kDa至约250kDa，约100kDa至约
200kDa，约100kDa至约150kDa，约150kDa至约500kDa，约150kDa至约450kDa，约150kDa至约
400kDa，约150kDa至约350kDa，约150kDa至约300kDa，约150kDa至约300kDa，约150kDa至约
250kDa，约150kDa至约200kDa，约175kDa至约500kDa，约175kDa至约450kDa，约175kDa至约
400kDa，约175kDa至约350kDa，约175kDa至约300kDa，约175kDa至约300kDa，175 200kDa至约250kDa，约175kDa至约225kDa，约200kDa至约500kDa，约200kDa至约450kDa，约200kDa至约400kDa，约200kDa至约350kDa，约200kDa至约300kDa，约200kDa至约300kDa，约200kDa至约250kDa，或约200kDa至约225kDa)。
[0394] 在一些情形中，单分散HA聚合物具有约100kDa至约250kDa的分子量(例如，约100kDa、约110kDa、约120kDa、约130kDa、约140kDa、约150kDa、约160kDa、约170kDa、约
180kDa、约190kDa、约200kDa、约210kDa、约220kDa、约230kDa、约240kDa或约250kDa)。在特定的情况下，HA聚合物具有约200kDa的分子量。
180kDa、约190kDa、约200kDa、约210kDa、约220kDa、约230kDa、约240kDa或约250kDa)。在特定的情况下，HA聚合物具有约200kDa的分子量。
[0395] 任何前述分子量可以是重均分子量(也称为重均摩尔质量)。
[0396] 在一些情形中，任何前述单分散HA聚合物是线性的，即未交联的。
[0397] 在其它情形中，本发明提供了抗体缀合物，其包括共价附接于单分散PEG聚合物的抗体(例如抗VEGF抗体，如G6.31 AARR)。这样的抗体缀合物在本文中有时被称为“PEG缀合物”。可以使用任何合适的单分散PEG聚合物。应当理解，与单分散HA聚合物相比，单分散PEG聚合物可具有不同的PDI值。例如，市售可得的PEG聚合物可具有低于1.1的PDI；因此，单分散PEG聚合物将由与单分散HA聚合物相比不同范围的PDI值限定。例如，单分散PEG聚合物可以具有约1至约1.02的PDI(例如，1、约1.001、约1.002、约1.003、约1.004、约1.005、约1.006、约1.007、约1.008、约1.009、约1.01、约1.011、约1.012、约1.013、约1.014、约1.015、约1.016、约1.017、约1.018、约1.019或约1.02的PDI)。PEG可以是分支的PEG，星形PEG，或蜂巢型PEG。例如，PEG聚合物可以是PEG四聚体、PEG六聚体或PEG八聚体。在一些情形中，抗体缀合物包括共价附接于PEG树状聚合物的抗VEGF抗体(例如，本文所述的抗VEGF抗体，例如G6.31 AARR)。PEG聚合物是可商购的，例如，购自JenKem Technology，Quanta BioDesign，NOF America Corporation，和其他供应商。
[0398] 在某些情形中，单分散PEG聚合物具有约1kDa至约500kDa的分子量(例如，约1kDa至约500kDa，约1kDa至约450kDa，约1kDa至约400kDa，约1kDa至约350kDa，约1kDa至约300kDa，约1kDa至约300kDa，约1kDa至约250kDa，约1kDa至约200kDa，约1kDa至约150kDa，约
1kDa至约100kDa，约1kDa至约50kDa，约10kDa至约500kDa，约10kDa至约450kDa，约10kDa至约400kDa，约10kDa至约350kDa，约10kDa至约300kDa，约10kDa至约300kDa，约10kDa至约
250kDa，约10kDa至约200kDa，约10kDa至约150kDa，约10kDa至约100kDa，约10kDa至约
50kDa，约20kDa至约500kDa，约20kDa至约450kDa，约20kDa至约400kDa，约20kDa至约
350kDa，约20kDa至约300kDa，约20kDa至约300kDa，约20kDa至约250kDa，约20kDa至约
200kDa，约20kDa至约150kDa，约20kDa至约100kDa，约20kDa至约75kDa，约30kDa至约
500kDa，约30kDa至约450kDa，约30kDa至约400kDa，约30kDa至约350kDa，约30kDa至约
300kDa，约30kDa至约300kDa，约30kDa至约300kDa，约30kDa至约250kDa，约30kDa至约
200kDa，约30kDa至约150kDa，约40kDa至约500kDa，约40kDa至约450kDa，约40kDa至约
400kDa，约40kDa至约350kDa，约40kDa至约300kDa，约40kDa至约300kDa，约40kDa至约
250kDa，约40kDa至约200kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约
400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约
250kDa，或约50kDa至约225kDa)。
1kDa至约100kDa，约1kDa至约50kDa，约10kDa至约500kDa，约10kDa至约450kDa，约10kDa至约400kDa，约10kDa至约350kDa，约10kDa至约300kDa，约10kDa至约300kDa，约10kDa至约
250kDa，约10kDa至约200kDa，约10kDa至约150kDa，约10kDa至约100kDa，约10kDa至约
50kDa，约20kDa至约500kDa，约20kDa至约450kDa，约20kDa至约400kDa，约20kDa至约
350kDa，约20kDa至约300kDa，约20kDa至约300kDa，约20kDa至约250kDa，约20kDa至约
200kDa，约20kDa至约150kDa，约20kDa至约100kDa，约20kDa至约75kDa，约30kDa至约
500kDa，约30kDa至约450kDa，约30kDa至约400kDa，约30kDa至约350kDa，约30kDa至约
300kDa，约30kDa至约300kDa，约30kDa至约300kDa，约30kDa至约250kDa，约30kDa至约
200kDa，约30kDa至约150kDa，约40kDa至约500kDa，约40kDa至约450kDa，约40kDa至约
400kDa，约40kDa至约350kDa，约40kDa至约300kDa，约40kDa至约300kDa，约40kDa至约
250kDa，约40kDa至约200kDa，约50kDa至约500kDa，约50kDa至约450kDa，约50kDa至约
400kDa，约50kDa至约350kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约300kDa，约50kDa至约
250kDa，或约50kDa至约225kDa)。
[0399] 在一些情形中，单分散PEG聚合物具有约5kDa至约250kDa的分子量(例如，约1kDa、约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa、约35kDa、约40kDa、约50kDa、约60kDa、约70kDa、约80kDa、约90kDa、100kDa、约110kDa、约120kDa、约130kDa、约140kDa、约
150kDa、约160kDa、约170kDa、约180kDa、约190kDa、约200kDa、约210kDa、约220kDa、约
230kDa、约240kDa或约250kDa)。在特定的情形中，PEG聚合物具有约20kDa的分子量。在其他的情形中，PEG聚合物具有约40kDa的分子量。
150kDa、约160kDa、约170kDa、约180kDa、约190kDa、约200kDa、约210kDa、约220kDa、约
230kDa、约240kDa或约250kDa)。在特定的情形中，PEG聚合物具有约20kDa的分子量。在其他的情形中，PEG聚合物具有约40kDa的分子量。
[0400] 任何前述分子量可以是重均分子量(也称为重均摩尔质量)。
[0401] 在一些情形中，单分散PEG聚合物是PEG四聚体。PEG四聚体可商购，例如，NOF America PTE-400MA，PTE-200MA，PTE-100MA，和JenKem Technology USA 4臂PEG马来酰亚胺(Cat.No.4ARM-MAL)。在一些情形中，PEG四聚体具有季戊四醇核心。例如，在一些情形中，PEG四聚体包括式(I)的结构，其中n独立地是任何适当的整数：
[0402] 式I:
[0403]
[0404] 在另一个实例中，在一些情形中，单分散PEG聚合物是PEG六聚体。PEG六聚体可商购，例如，JenKem Technology USA 6臂PEG胺(Cat.No.6ARM(DP)-NH2HCl)，或购自Quanta BioDesign的PEG六聚体。在一些情形中，PEG六聚体包括二季戊四醇核心。
[0405] 在一些情形中，单分散PEG聚合物是PEG八聚体。PEG八聚体可商购，例如，NOF America HGEO系列或JenKem Technology USA 8臂PEG马来酰亚胺(Cat.No.8ARM(TP)-MAL)。在一些情形中，PEG八聚体可以包括三季戊四醇核心。例如，在一些情形中，PEG八聚体包括式(II)的结构，其中n独立地是任意适当的整数：
[0406] 式II:
[0407]
[0408] 在另一个实例中，在一些情形中，所述PEG八聚体包括三季戊四醇核心。
[0409] 应该理解，任意适当的缀合方法，包括本文所述的那些和本领域已知的其他缀合方法，可以用于将本发明的抗VEGF抗体缀合到单分散聚合物上。例如，单分散聚合物可以缀合在任何适当的蛋白质官能团上，包括伯胺基，羧基，巯基，或羰基。任意适当的化学反应基团可用于靶向蛋白质官能团，例如，碳二亚胺(例如，EDC)，NHS酯，亚氨酸酯，五氟苯基酯，羟甲基膦，马来酰亚胺，卤代乙酰基(例如，溴代乙酰基或碘代乙酰基)，吡啶基二硫，硫代磺酸盐，乙烯砜，肼，烷氧基胺，双吖丙啶，芳基叠氮化物，异氰酸酯，或本领域已知的其他化学反应基团。参见，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，第3版，2013。在特定的实施方案中，HA(例如单分散HA)用马来酰亚胺基团修饰(HA-马来酰亚胺)，其次，将在半胱氨酸上包含游离巯基的抗体(例如Fab-C或半胱氨酸变体(例如THIOMABTM或ThioFab))与HA-马来酰亚胺反应以形成共价HA-Fab缀合物，例如，如实施例1中所述。
[0410] 任意前述抗体缀合物可以具有约5nm至约200nm(例如，约5nm，约10nm，约20nm，约30nm，约40nm，约50nm，约60nm，约70nm，约80nm，约90nm，约100nm，约110nm，约120nm，约
130nm，约140nm，约150nm，约160nm，约170nm，约180nm，约190nm，或约200nm)的流体动力学半径。在一些情形中，抗体缀合物具有约5nm至约150nm(例如，约5nm，约10nm，约20nm，约
30nm，约40nm，约50nm，约60nm，约70nm，约80nm，约90nm，约100nm，约110nm，约120nm，约
130nm，约140nm，或约150nm)的流体动力学半径。在一些情形中，抗体缀合物具有约5nm至约
100nm(例如，约5nm，约10nm，约20nm，约30nm，约40nm，约50nm，约60nm，约70nm，约80nm，约
90nm，或约100nm)的流体动力学半径。在一些情形中，抗体缀合物具有约5nm至约60nm(例如，约5nm，约10nm，约20nm，约30nm，约40nm，约50nm，或约60nm)的流体动力学半径。在一些情形中，抗体缀合物具有约25nm至约35nm(例如，约25nm，约26nm，约27nm，约28nm，约29nm，约30nm，约31nm，约32nm，约33nm，约34nm，或约35nm)的流体动力学半径。在一些情形中，流体动力学半径为约28nm。
130nm，约140nm，约150nm，约160nm，约170nm，约180nm，约190nm，或约200nm)的流体动力学半径。在一些情形中，抗体缀合物具有约5nm至约150nm(例如，约5nm，约10nm，约20nm，约
30nm，约40nm，约50nm，约60nm，约70nm，约80nm，约90nm，约100nm，约110nm，约120nm，约
130nm，约140nm，或约150nm)的流体动力学半径。在一些情形中，抗体缀合物具有约5nm至约
100nm(例如，约5nm，约10nm，约20nm，约30nm，约40nm，约50nm，约60nm，约70nm，约80nm，约
90nm，或约100nm)的流体动力学半径。在一些情形中，抗体缀合物具有约5nm至约60nm(例如，约5nm，约10nm，约20nm，约30nm，约40nm，约50nm，或约60nm)的流体动力学半径。在一些情形中，抗体缀合物具有约25nm至约35nm(例如，约25nm，约26nm，约27nm，约28nm，约29nm，约30nm，约31nm，约32nm，约33nm，约34nm，或约35nm)的流体动力学半径。在一些情形中，流体动力学半径为约28nm。
[0411] 一些情形中，抗体缀合物具有约10nm至约200nm，约10nm至约180nm，约10nm至约160nm，约10nm至约140nm，约10nm至约120nm，约10nm至约100nm，约10nm至约80nm，约10nm至约60nm，约10nm至约50nm，约10nm至约40nm，约10nm至约30nm，约20nm至约200nm，约20nm至约180nm，约20nm至约160nm，约20nm至约140nm，约20nm至约120nm，约20nm至约100nm，约
20nm至约80nm，约20nm至约60nm，约20nm至约50nm，约20nm至约40nm，约20nm至约30nm，约
30nm至约200nm，约30nm至约180nm，约30nm至约160nm，约30nm至约140nm，约30nm至约
120nm，约30nm至约100nm，约30nm至约80nm，约30nm至约60nm，约30nm至约50nm，约30nm至约
40nm，约40nm至约200nm，约40nm至约180nm，约40nm至约160nm，约40nm至约140nm，约40nm至约120nm，约40nm至约100nm，约40nm至约80nm，约40nm至约60nm，约40nm至约50nm，约50nm至约200nm，约50nm至约180nm，约50nm至约160nm，约50nm至约140nm，约50nm至约120nm，约
50nm至约100nm，约50nm至约80nm，约50nm至约60nm，约60nm至约200nm，约60nm至约180nm，约60nm至约160nm，约60nm至约140nm，约60nm至约120nm，约60nm至约100nm，或约60nm至约
80nm的流体动力学半径。
20nm至约80nm，约20nm至约60nm，约20nm至约50nm，约20nm至约40nm，约20nm至约30nm，约
30nm至约200nm，约30nm至约180nm，约30nm至约160nm，约30nm至约140nm，约30nm至约
120nm，约30nm至约100nm，约30nm至约80nm，约30nm至约60nm，约30nm至约50nm，约30nm至约
40nm，约40nm至约200nm，约40nm至约180nm，约40nm至约160nm，约40nm至约140nm，约40nm至约120nm，约40nm至约100nm，约40nm至约80nm，约40nm至约60nm，约40nm至约50nm，约50nm至约200nm，约50nm至约180nm，约50nm至约160nm，约50nm至约140nm，约50nm至约120nm，约
50nm至约100nm，约50nm至约80nm，约50nm至约60nm，约60nm至约200nm，约60nm至约180nm，约60nm至约160nm，约60nm至约140nm，约60nm至约120nm，约60nm至约100nm，或约60nm至约
80nm的流体动力学半径。
[0412] 在任何前述抗体缀合物中，抗体可以是结合VEGF的抗体片段，例如，本文所述的结合VEGF的抗VEGF抗体的抗体片段。在一些情形中，抗VEGF抗体是半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体，如本文所述(参见，例如，上文第1(8)(d)节)。在一些情形中，抗体片段选自由以下各项组成的组：Fab、Fab’、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。在特定的情形中，抗体片段是Fab、Fab’或Fab-C。在一些情形中，抗体片段是Fab-C。
[0413] 相对于没有共价附接到聚合物(例如，亲水聚合物)上的参考抗体，任意前述抗体缀合物可以具有增加的眼部半衰期。在一些情形中，相对于参考抗体，眼部半衰期增加至少约2倍(例如，约2倍，约3倍，约4倍，约5倍，约6倍，约7倍，约8倍，约9倍，约10倍，约12倍，约14倍，约16倍，约18倍，约20倍，或更多)。在一些情形中，相对于参考抗体，眼部半衰期增加至少约4倍。在一些情形中，眼部半衰期是玻璃体半衰期。在一些情形中，参考抗体与抗体缀合物的抗体相同。在另一些情形中，参考抗体与抗体缀合物的抗体不同。
[0414] 相对于没有共价附接到聚合物(例如，亲水聚合物)上的参考抗体，任意前述抗体缀合物可以具有减小的眼部清除率。在一些情形中，相对于参考抗体，清除率减小至少约2倍(例如，约2倍，约3倍，约4倍，约5倍，约6倍，约7倍，约8倍，约9倍，约10倍，约12倍，约14倍，约16倍，约18倍，约20倍，或更多)。在一些情形中，相对于参考抗体，清除率减小至少约4倍。在一些情形中，清除率是自玻璃体的清除率。在一些情形中，参考抗体与抗体缀合物的抗体相同。在另一些情形中，参考抗体与抗体缀合物的抗体不同。
[0415] 在一些情形中，在任何前述抗体缀合物(例如，HA缀合物)的两次眼内施用(例如，通过玻璃体内注射)之间的时间期间是至少1个月，例如，至少1个月，至少5周，至少6周，至少7周，至少8周，至少9周，至少10周，至少11周，至少12周，至少13周，至少14周，至少15周，至少16周，至少20周，至少24周，至少28周，至少32周，至少36周，至少40周，至少44周，至少48周，至少52周或更久。在一些情形中，在两次眼内施用之间的最大时期不超过四年，例如，不超过三年，不超过两年，或不超过一年。抗体缀合物可以例如每二至十二个月施用，例如，每四至十个月施用。在一些情形中，抗体缀合物每六个月施用。
[0416] 本发明还提供包含上文所述的任何抗体缀合物的组合物(例如，药物组合物)。在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种另外的化合物。在某些实施方案中，所述另外的化合物结合选自由以下各项组成的组的第二生物学分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。
例如，在一些情形中，另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或它们的变体)。在另一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6抗体，例如，EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/073890)，司妥昔单抗奥鲁凯珠单抗，克莱赞珠单抗，sirukumab，艾西莫单抗，gerilimzumab，
OPR-003，MEDI-5117，PF-04236921，或它们的变体。在又一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6R抗体，例如，托珠单抗 (参见，例如，WO 1992/019579)，
sarilumab，vobarilizumab(ALX-0061)，SA-237，或它们的变体。
例如，在一些情形中，另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或它们的变体)。在另一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6抗体，例如，EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/073890)，司妥昔单抗奥鲁凯珠单抗，克莱赞珠单抗，sirukumab，艾西莫单抗，gerilimzumab，
OPR-003，MEDI-5117，PF-04236921，或它们的变体。在又一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6R抗体，例如，托珠单抗 (参见，例如，WO 1992/019579)，
sarilumab，vobarilizumab(ALX-0061)，SA-237，或它们的变体。
[0417] 本发明进一步提供了组合物(例如，药物组合物),其包含上文所述的任何抗体缀合物和另外的VEGF拮抗剂。
[0418] 2.装置
[0419] 本文所述的任何抗体(例如半胱氨酸工程改造的抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如单分散HA缀合物)可以使用通道递送装置施用至眼。通道递送装置是可植入的、可重复充填的装置，其可以在数月的时间期间(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12个月，或更多个月)释放治疗剂(例如，抗VEGF抗体缀合物)。可使用的示例性的通道递送装置包括来自ForSight Labs，LLC和/或ForSight VISION4的那些，例如，如在国际专利申请公开号WO
2010/088548，WO2015/085234，WO 2013/116061，WO 2012/019176，WO 2013/040247，和WO
2012/019047中所记载的，它们通过引用完全并入本文。
2010/088548，WO2015/085234，WO 2013/116061，WO 2012/019176，WO 2013/040247，和WO
2012/019047中所记载的，它们通过引用完全并入本文。
[0420] 例如，本发明提供包含含有本文所述的任何抗体或抗体缀合物的储库的通道递送装置。所述通道递送装置进一步包含近端区、与近端区偶联的管状体部，所述近端区与所述储库流体连通，和一个或多个排出口，所述排出口与所述储库流体连通并且设置成将组合物释放到眼中。管状体部可以具有设置成通过切口或开口插入到眼中的约0.5mm或更小的外径。装置的长度可以为约1mm至约15mm(例如，长度为约1mm，约2mm，约4mm，约5mm，约6mm，约7mm，约9mm，约11mm，约13mm，或约15mm)。储库可以具有任意适当的体积。在一些情形中，储库具有约1μl至约100μl(例如，约1μl，约5μl，约10μl，约20μl，约50μl，约75μl，或约100μl)的体积。装置或其组成部分可以由任意适当的材料制成，例如，由聚酰亚胺制成。
[0421] 在一些情形中，通道递送装置包含储库,所述储库含有本文所述的任何抗体或抗体缀合物和一种或多种另外的化合物。在某些实施方案中，所述另外的化合物结合选自由以下各项组成的组的第二生物学分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整联蛋白αvβ3、αvβ5和α5β1；β动物纤维素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和与AMD风险遗传相关的蛋白质，例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；
TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。例如，在一些情形中，另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或它们的变体)。在另一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6抗体，例如，EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/
073890)，司妥昔单抗 奥鲁凯珠单抗，克莱赞珠单抗，sirukumab，艾西莫单
抗，gerilimzumab，OPR-003，MEDI-5117，PF-04236921，或它们的变体。在又一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6R抗体，例如，托珠单抗 (参见，例如，
WO 1992/019579)，sarilumab，vobarilizumab(ALX-0061)，SA-237，或它们的变体。
TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。例如，在一些情形中，另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中公开的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或它们的变体)。在另一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6抗体，例如，EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见，例如，WO 2016/
073890)，司妥昔单抗 奥鲁凯珠单抗，克莱赞珠单抗，sirukumab，艾西莫单
抗，gerilimzumab，OPR-003，MEDI-5117，PF-04236921，或它们的变体。在又一个实例中，在一些情形中，另外的化合物是抗-IL-6R抗体，例如，托珠单抗 (参见，例如，
WO 1992/019579)，sarilumab，vobarilizumab(ALX-0061)，SA-237，或它们的变体。
[0422] 在一些情形中，通道递送装置包含本文所述的任何抗体或抗体缀合物和另外的VEGF拮抗剂。
[0423] III.实施例
[0424] 以下是本发明的方法和组合物的实施例。应该理解，在上文提供的一般性描述下，可以实施多种其他的实施方案。
[0425] 实施例1:用于改善稳定性的由单分散HA制备的线性透明质酸(HA)抗体缀合物
[0426] Fab与生物聚合物透明质酸(HA)的缀合可以显著提高Fab在眼中的保留时间，例如，通过减慢Fab的扩散，从而减慢从玻璃体液中清除。HA-Fab缀合物的生产采用两步法：首先，用马来酰亚胺基团修饰商购HA(HA-马来酰亚胺)，其次，Fab-C(在半胱氨酸上具有游离巯基的Fab)与HA-马来酰亚胺反应以形成共价HA-Fab缀合物。
[0427] 当通过典型方式生产时，HA-蛋白缀合物可以具有两个正交的可变性的成分。可变性的第一个来源是多分散性，其是由HA主链的多分散性引起的(图1A)。第二个来源是异质性，这是由与给定HA链附接的Fab分子数量的差异造成的。这种可变性的第二个来源是由HA缀合过程的第一步中HA链的马来酰亚胺修饰的随机性质决定的。图1B显示了蒙特卡罗模拟的结果，其中200kDa HA链的每个酸基被给予5％的机会与含马来酰亚胺的接头反应，重复1000个独立的HA链。结果表明，尽管在整个模拟过程中每个HA链的马来酰亚胺平均数是预期值24.7，但绝对范围是11-42。
[0428] 可能需要维持抗体缀合物(例如，包含线性HA和抗VEGF抗体G6.31AARR的抗体缀合物；本文中称为HA-G6.31 AARR的抗体缀合物)在水相和玻璃体液中的物理和胶体稳定性。部分基于上述模拟，认为HA主链分子量和Fab负载水平可能是物理稳定性的重要参数。Fab负载水平是指附接于每个HA链的抗体(例如G6.31.AARR)分子的平均数，并以HA主链上被Fab部分共价修饰的酸基的百分比表示(每个HA重复单元在葡糖醛酸糖上含有一个可修饰的酸基)。虽然其它参数可能有助于缀合物的稳定性(例如Fab的具体特性，包括净电荷、表面电荷分布、疏水性)，但它们通常在该特定分子的范围内是不可控制的。
[0429] 为了评估HA MW和Fab负载水平对HA-G6.31.AARR物理稳定性的影响，制备具有三种不同HA起始MW(大约40kDa、200kDa和600kDa)和不同的Fab负荷水平的缀合物，在生理条件下应激,并在几个月内监测其物理稳定性,以模拟生物学暴露。
[0430] (A)材料和方法
[0431] (i)材料
[0432] 在本研究中使用了三种不同分子量的透明质酸钠(HA，Lifecore Biomedical，Chaska，MN)。它们的性质，如通过串联折射率和多角度光散射检测器的大小排阻层析(SEC-RI-MALS)所评估的，总结在表4中。Mn表示数均分子量；Mw表示重均分子量；PDI表示多分散指数；RH表示流体动力学半径。表5显示了与单分散样品相比，各种多分散HA样品的Mn、Mw和PDI的数据，如通过SEC-RI-MALS所确定。表4和5的数据来自两个不同批次的HA-200K，它们具有不同的多分散性。
[0433] 表4本研究中使用的HA的性质
[0434]标记名称 Mn,kDa Mw,kDa PDI RH,nm
40K 28.8 45.5 1.581 8.7
200K 143.4 204.3 1.424 23.7
600K 481.6 619.8 1.287 35.6
40K 28.8 45.5 1.581 8.7
200K 143.4 204.3 1.424 23.7
600K 481.6 619.8 1.287 35.6
[0435] 表5与单分散样品相比，多分散HA样品的性质
[0436]样品 Mn(kDa) Mw(kDa) PDI(Mw/Mn)
HA10K 13.7 19.6 1.43
HA20K 21.0 32.9 1.57
HA40K 28.7 44.7 1.56
HA100K 66.0 107 1.62
HA200K 116 204 1.76
HA350K 206 314 1.53
HA700K 473 657 1.39
单分散HA150K 137.2 137.3 1.001
HA10K 13.7 19.6 1.43
HA20K 21.0 32.9 1.57
HA40K 28.7 44.7 1.56
HA100K 66.0 107 1.62
HA200K 116 204 1.76
HA350K 206 314 1.53
HA700K 473 657 1.39
单分散HA150K 137.2 137.3 1.001
[0437] (ii)马来酰亚胺官能化HA(HA-mal)的合成
[0438] 使用具有偶联剂4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓盐酸盐(DMTMM)和接头N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(AEM)的水性反应,用马来酰亚胺基团来修饰HA。将HA以2.5mg/mL溶解在100mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)(pH5.5)中，并在搅拌下向该溶液中加入DMTMM和AEM。DMTMM和AEM的加入量是变化的，并且选择该加入量，以靶向马来酰亚胺官能化的不同水平，范围为2-10％。将反应物加热至70℃,持续2小时。
[0439] 通过脱盐程序从反应物中除去过量的AEM和DMTMM。将HIPREPTM26/10脱盐柱安装在纯化系统(GE Life Sciences)上，并用10mM乙酸钠(pH4.0)150mM NaCl平衡。将反应物纯净地注入到柱中，根据302nm处的吸光度收集HA-mal峰，并使用离心超滤装置浓缩至大于5mg/mL。使用UV-可见光分光光度计通过302nm处的吸光度测量HA-mal储备溶液中的马来酰亚胺浓度，并通过具有多角度光散射的大小排阻层析法(SEC-MALS)评价每个HA链的马来酰亚胺基团的摩尔比。
[0440] (iii)Fab-C与HA-mal的缀合
[0441] 用1M磷酸盐(pH6.5)将Fab-C溶液的pH调节至6.5，使其最终磷酸盐浓度为50mM，并掺入乙二胺四乙酸(EDTA)至最终浓度为2.5mM。搅拌Fab-C溶液，并向其中加入在由10mM磷酸盐(pH6.5)、150mM NaCl和2.5mM EDTA组成的反应缓冲液中稀释的HA-mal。在最终反应中，化学计量设定为每摩尔马来酰亚胺1.2摩尔Fab-C，体积设定为使最终蛋白质浓度为1mg/mL。缀合反应在室温下搅拌进行。在3小时时，以每摩尔马来酰亚胺2摩尔加入巯基乙醇，以帽化未反应的马来酰亚胺基团。30分钟后，用10mM磷酸盐(pH6.5)将反应物稀释至小于50mM NaCl。
[0442] 使用大小排阻层析法(SEC)进行纯化，以从缀合物中分离游离的Fab-C和Fab二聚体。用10mM HisHCl(pH5.5)150mM NaCl平衡 26/600 200pg柱(GE Healthcare)，并以纯净形式注射反应物。分别洗脱与缀合物、Fab二聚体和Fab单体相关的峰，并收集缀合物峰。
[0443] (iv)通过SEC-RI-MALS分析HA-Fab缀合物
[0444] 在具有串联的Wyatt T-rEXTM折射率(RI)检测器和Wyatt HELEOSTM-II多角度光散射(MALS)检测器的Agilent1200 HPLC上，通过SEC-RI-MALS-QELS(大小排阻层析(SEC)、折射率(RI)多角度光散射(MALS)和准弹性光散射(QELS)的组合)，评估残余的游离Fab含量、总缀合物摩尔质量和蛋白质质量分数。对于SEC，两个柱顺序运行：
ACCLAIMTM7.8x150 mm 孔径，随后是ACCLAIMTM7.8x150mm 孔径，用磷酸盐缓
冲盐水(PBS)(pH7.4)作为运行缓冲液。牛血清白蛋白(BSA)对照用于归一化MALS检测器并校正检测器之间的带加宽。通过整合对应于Fab和HA-Fab缀合物的UV A280峰来测量游离Fab含量。将缀合物摩尔质量作为缀合物峰的重均分子量(Mw)。使用示差折光率(dRI)和UV A280信号，使用蛋白质缀合物分析计算蛋白质质量分数。
ACCLAIMTM7.8x150 mm 孔径，随后是ACCLAIMTM7.8x150mm 孔径，用磷酸盐缓
冲盐水(PBS)(pH7.4)作为运行缓冲液。牛血清白蛋白(BSA)对照用于归一化MALS检测器并校正检测器之间的带加宽。通过整合对应于Fab和HA-Fab缀合物的UV A280峰来测量游离Fab含量。将缀合物摩尔质量作为缀合物峰的重均分子量(Mw)。使用示差折光率(dRI)和UV A280信号，使用蛋白质缀合物分析计算蛋白质质量分数。
[0445] (v)HA-G6.31.AARR缀合物生理应激和分析
[0446] 将纯化的缀合物缓冲液交换成PBS，并掺入2mM叠氮化钠和0.01％聚山梨醇酯20(PBSTN)。以Fab为基础，最终浓度为约5mg/mL。密封样品，在37℃下温育。该条件可用作玻璃体液的替代物(模拟玻璃体的pH、温度和离子强度)。5mg/mL浓度代表用于评估玻璃体中沉淀倾向的“应激”浓度(在4mL人玻璃体中2mg剂量等同于0.5mg/mL Fab)。在指定的时间点，取出样品，在具有0.01％聚山梨醇酯20和10％(w/v)海藻糖的10mMHisHCl(pH5.5)中稀释至1mg/mL，并测定可溶性蛋白浓度(A280)、浊度(A450)、SEC保留时间和分子量(Mn和Mw，通过如上SEC-RI-MALS测定)。
[0447] (B)结果
[0448] (i)材料的表征
[0449] 表6列出了本研究中所用的9种缀合物的SEC-RI-MALS表征结果。缀合物在HA主链MW(40kDa、200kDa或600kDa)和Fab负载水平上都不同。样品名称以HA主链MW(kDA)和随后的Fab负载水平(％)给出。
[0450] 表6HA-G6.31.AARR起始材料的SEC-RI-MALS表征结果
[0451]样品名称 Mn,kDa Mw,kDa Fab负载％
40K 2.8％ 146 178.7 2.78
40K 2.9％ 149.4 182.4 2.85
40K 4.7％ 191.2 272.4 4.65
40K 6.3％ 305.9 354.8 6.31
200K 1.3％ 442.6 518.7 1.28
200K 2.5％ 664.3 813.1 2.45
200K 4.7％ 1106.2 1362.5 4.66
200K 6.2％ 1297.4 1739.3 6.17
600K 2.1％ 1730.6 2141.3 2.06
40K 2.8％ 146 178.7 2.78
40K 2.9％ 149.4 182.4 2.85
40K 4.7％ 191.2 272.4 4.65
40K 6.3％ 305.9 354.8 6.31
200K 1.3％ 442.6 518.7 1.28
200K 2.5％ 664.3 813.1 2.45
200K 4.7％ 1106.2 1362.5 4.66
200K 6.2％ 1297.4 1739.3 6.17
600K 2.1％ 1730.6 2141.3 2.06
[0452] 用SEC-RI-MALS来实验性评价HA-G6.31.AARR缀合物的多分散性(图1C)。对于HA40K、HA200K和HA600K缀合物，多分散指数分别为1.58、1.78和1.41。
[0453] (ii)生理应激下的缀合物稳定性
[0454] 在生理应激条件下，一些HA-G6.31.AARR缀合物在PBSTN中延长温育后显示出显著的物理变化。如图2所示，平均分子量(Mw，重均分子量)随时间的变化最清楚地证明了这种变化。虽然在12周的研究中一些样品的Mw没有变化，但那些变化的样品却都显示Mw随时间的降低。Mw降低的程度取决于HA主链分子量和Fab负载水平。通常，在HA分子量和Fab负载较高的样品中观察到发生沉淀。
[0455] 为了理解这种Mw的变化，对温育的HA-G6.31.AARR缀合物的SEC保留概况进行分析。延长温育后,SEC保留时间移动到稍后的时间，表明缀合物的平均群体随着时间逐渐变小(图3)。因为SEC保留时间完全由主链HA分子量(而不是Fab负载)限定，因此这个观察结果表明了：(a)缀合物分子的整个群体随着时间而变小，或(b)较高分子量的亚群从溶液中沉淀出来，导致明显转移到更小的缀合物。这些数据也总结在表7中，其中显示了研究开始时(T0)和第12周的保留时间之间的差异。
[0456] 表7研究开始时和暴露于生理条件后12周时，HA-G6.31.AARR稳定性样品的SEC保留时间
[0457]
[0458] 通过SEC和MALS测量的这些变化与目测观察结果平行,目测观察结果即较高的HA主链分子量和较高的Fab负载样品在稍后的时间点包含可见的沉淀物。这个观察结果支持了对SEC保留概况中观察到的偏移的后一种解释，即，HA的较高分子量亚群沉淀并导致溶液中剩余的平均群体偏移。
[0459] 进一步支持这一假设的是对SEC-RI-MALS数据的重新分析，检查了HA-G6.31.AARR缀合物的分子量的分布，如图4所示。对于40K HA主链样品(左图)，在延长暴露于生理条件下，缀合物分子的分子量的总体分布没有明显变化。对于600K HA主链样品(右图)，所有群体级分都连续偏移到较小的分子量，这表明一大群缀合物分子从溶液中沉淀出来。对于200K HA主链样品(中心图)，群体级分的偏移主要发生在较高分子量的缀合物分子中。这表明在200K HA主链样品中存在相对稳定和不稳定的缀合物分子的混合群体。随着时间的推移，较高分子量的缀合物分子(相对不稳定的亚群)从溶液中沉淀出来，仅留下相对稳定的亚群保留在溶液中。
[0460] (iii)单分散HA缀合物
[0461] 基于这样的理解，在多分散HA200K-G6.31.AARR群体内，仅较高MW亚群驱动物理不稳定性和沉淀，我们假设了从多分散HA主链到单分散HA主链的转换可产生更稳定的抗体缀合物。
[0462] 标准的市售HA通过多步骤方法生产，其中：(a)通过细菌发酵合成HA，产生极高的MW HA(Mw 1-4MDa)，(b)从细胞培养物中纯化HA，和(c)以受控方式化学降解HA，导致HA分子的随机断裂。该方法的最后步骤对于较低分子量HA的生产是关键的，否则通过单独发酵是不可行的。然而，随机断裂降解过程也导致HA分子量的广泛(即多分散)分布。
[0463] HA也可以经由同步化的化学-酶促方法以商业规模合成(参见Jin等人J.Biol.Chem.279:42345-42349,2004；Jing等人.Anal.Biochem.355:183-188,2006；和美国专利号8,088,604，其全部内容通过引用并入本文)。在该方法中，将纯化的乙酰透明质酸合酶加入到小HA寡糖(通常为HA四聚体，HA4)和尿苷二磷酸(UDP)糖UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰葡糖胺的混合物中。乙酰透明质酸合酶以交替方式使用可得的糖延伸寡糖片段，导致HA的同步化聚合。所得HA聚合物的分子量可以通过起始反应中HA底物(例如HA4)与糖的比例来控制。该方法的结果是高度单分散的HA聚合物。
[0464] 为了比较，在图5中比较了类似大小的多分散和单分散商业HA的SEC-RI-MALS表征。最值得注意的是多分散指数的差异，其对于多分散HA200K为1.779，对于单分散HA150K为1.001。从HA-蛋白缀合物的角度来看，认为单分散HA的这种较低水平的多分散性提供了几个关键优势：(a)更容易的分析表征，因为HA多分散性的消除使得蛋白质负载水平的差异成为样品中异质性的唯一来源；(b)消除总体群体中较低和较高分子量HA主链，这可消除在HA-G6.31.AARR缀合物内的较高分子量HA主链亚群中观察到的不稳定性和沉淀；和(c)潜在地降低配制的HA-抗体缀合物的粘度。
[0465] 在使用多分散和单分散HA起始材料制备G6.31.AARR缀合物的情况下，观察到相同的多分散性差异：多分散HA200K-G6.31.AARR具有1.228的多分散指数，而单分散HA150K-G6.31.AARR具有1.003的多分散指数(图6)。预期这种单分散性将改善HA-G6.31.AARR缀合物的稳定性，这是由于不存在较高HA主链分子量的亚群，据推测这是造成在多分散HA-G6.31.AARR缀合物的生理应激下观察到的不稳定性和沉淀的原因。
[0466] 实施例2:线性HA抗体缀合物的优化的Fab负载和半胱氨酸工程改造位点
[0467] 单克隆抗体(mAb)或抗体片段(Fab)与聚合物支架的共价缀合可通过多种化学方法进行，所述化学方法的范围从胺化学(通过溶剂可及的赖氨酸残基直接酰胺化)到使用底物识别酶如转谷氨酰胺酶的化学-酶促缀合。最近，巯基-马来酰亚胺缀合化学已经获得了显著的兴趣，因为它提供了优于其它方法的几个关键优点：(a)它是位点选择性的，仅与还原的、溶剂可及的半胱氨酸残基反应，(b)它是极其快速的反应，(c)含马来酰亚胺的接头是容易获得的，并且通常容易合成获得，(d)半胱氨酸残基通常可以容易地掺入到蛋白质结构中，和(e)巯基-马来酰亚胺缀合可以在接近中性pH处在水性条件中进行。
[0468] 为了产生适合马来酰亚胺缀合的Fab，一种策略是产生Fab-C，其中重链序列通过铰链肽延伸至第一或第二铰链二硫化物半胱氨酸位置处，并在该半胱氨酸残基处截短(图7)。实际上，这种方法可能潜在地引入影响与聚合物支架缀合的许多复杂情况。这种游离半胱氨酸残基与链间二硫键在空间上接近的主要结果是巯基杂乱，其中这三个邻近的半胱氨酸残基可以形成三种可能的二硫化物构型。图8A-8C中图示了三种可能的二硫化物构型。在每种构型中，不同的半胱氨酸残基被还原，使其成为与含马来酰亚胺的聚合物主链缀合的潜在位点。其结果就是Fab与HA主链之间的附接位点的异质性，从产物质量、Fab稳定性或缀合材料的安全性的角度看，这可能具有后果。
[0469] 我们假设将游离半胱氨酸残基从柔性的、空间上接近的铰链序列重新定位到FabTM上的另外表面位置可以减少或消除这些缀合变体。这种方法在本质上与THIOMAB 半胱氨酸工程改造的单克隆抗体所采用的方法相似，其中表面残基被突变为半胱氨酸,以用于以后的缀合。在Fab形式中，我们将表面突变的含半胱氨酸的Fab称为“ThioFabs”。
[0470] 使用巯基-马来酰亚胺化学方法产生的蛋白质-聚合物缀合物也可能遭受通过反向迈克尔加成反应从聚合物主链上解缀合蛋白质。这可导致游离蛋白质以pH和温度依赖性的方式从聚合物主链中缓慢释放。这种行为也受半胱氨酸残基周围的局部化学环境和含马来酰亚胺的接头的结构(例如吸电子基团或胺的存在)的影响。基于THIOMABTM开发中不同半胱氨酸位置的反向迈克尔敏感性的发现(参见Shen等人.Nat.Biotechnol.30:184-189,2012)，我们还预测了将游离半胱氨酸从铰链肽移至表面位置将降低反向迈克尔游离Fab从聚合物主链释放的速率。我们还研究了在生理条件下，Fab-C和ThioFab形式分子上模型聚乙二醇(PEG)-马来酰亚胺聚合物的反向迈克尔解缀合的速率。
[0471] (A)材料和方法
[0472] (i)材料
[0473] Lys-C酶购自Promega(目录号V1671，Madison，WI)，透明质酸酶(重组人PH20，也称为HAase)酶购自Halozyme(San Diego，CA)，N-乙基马来酰亚胺(NEM)购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。定义的甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(d-mPEG4-Mal，Part#10745)购自Quanta Biodesign(Plain City，OH)。
[0474] (ii)G6.31.AARR.Fab-C的限制性Lys-C消化
[0475] 在G6.31.AARR.Fab-C样品上进行限制性Lys-C消化。与蛋白质更传统的Lys-C消化相比，“限制性”Lys-C消化是在非变性条件下用减少量的Lys-C酶进行的。这导致G6.31.AARR.Fab-C分子(KTHTC(SEQ ID NO:61))的铰链肽部分的选择性消化，其在赖氨酸残基后被切割。存在着4个用不同条件测试的G6.31.AARR.Fab-C的样品：(a)+NEM，消化，(b)+NEM+消化，(c)-NEM，+消化，和(d)-NEM，-消化。
[0476] 对于每个样品，向在500μL 10mM组氨酸-乙酸盐+150mM氯化钠(pH5.5)中的500μg Fab-C中加入50μL的1M Tris+10mM NEM(pH7.5)；对于-NEM样品省略了NEM。将样品在37℃温育30分钟，以便将任何游离的巯基加帽。然后以1:500Lys-C:Fab-C的质量比，将Lys-C酶加入到+Lys-C样品中。将样品在37℃温育30分钟。消化后，将样品冷冻以猝灭反应，并通过RP-UPLC-TOF分析。
[0477] (iii)HA200K-G6.31.AARR的限制性Lys-C消化
[0478] 向在500μL 10mM组氨酸-乙酸盐+150mM氯化钠缓冲液(pH 5.5)中的500μg(基于蛋白质)HA200K-G6.31.AARR中加入50μL的1M Tris(pH 7.5)。以1:500Lys-C:Fab-C的质量比，加入Lys-C酶。将样品在37℃温育过夜。消化后，将样品冷冻以猝灭反应，并通过RP-UPLC-TOF分析。
[0479] (iv)HA200K-G6.31.AARR的透明质酸酶消化
[0480] 将500μg(基于蛋白质)HA200K-G6.31.AARR稀释在500μL 10mM组氨酸-乙酸盐+150mM氯化钠(pH5.5)中。以缀合物中每1μg HA 10个单位(U)加入HAase。反应混合物在37℃温育4小时。消化后，将样品冷冻以猝灭反应，并通过RP-UPLC-TOF分析。
[0481] (v)模型G6.31.AARR-PEG缀合物的反向迈克尔介导的解缀合
[0482] 将G6.31.AARR.Fab-C、G6.31.AARR.A140C、G6.31.AARR.L174C和G6.31.AARR.K149C缓冲液交换成0.2-0.5mg/mL的10mM磷酸盐(pH6.5)、150mM NaCl、2.5mM EDTA，并以20倍摩尔过量加入d-mPEG4-Mal。将反应物在室温温育2小时，然后通过在PD-10柱(GE Healthcare，Pittsburgh，PA)上脱盐到PBS(pH7.4)中进行纯化。然后通过离心超滤将缀合物浓缩至1mg/mL，并掺入氧化型谷胱甘肽(GSSG)至终浓度为2mM。将构建体在37℃温育，并定期取样品用于RP-UPLC-TOF分析。
[0483] (vi)反相超高效液相色谱飞行时间(RP-UPLC-TOF)质谱(MS)分析
[0484] 使用Agilent 6230电喷雾电离(ESI)-飞行时间(TOF)质谱仪串联Agilent 1290超高效液相色谱(UPLC)系统，通过液相色谱-质谱(LC/MS)分析，获得样品的完整质量。每个样品注射大约2.5μg蛋白质，并通过反相超高效液相色谱(RP-UPLC)脱盐，用于直接在线MS分析。使用MassHunter工作站软件/定性分析(Agilent Technologies公司，Santa Clara，CA)，将所得的光谱去卷积至零电荷状态。
[0485] (B)结果
[0486] (i)G6.31.AARR.Fab-C中的二硫化物状态
[0487] 为了证实图8A-8C所示的三个二硫化物状态是否存在于G6.31.AARR.Fab-C中并保持在动态热力学平衡中，我们进行了一系列实验，使用NEM和限制的Lys-C消化物进行马来酰亚胺加帽，以探测三个半胱氨酸残基的瞬时状态和它们动态重排的能力。
[0488] 在第一个实验中，用NEM给G6.31.AARR.Fab-C加帽(由于消除任何游离巯基而冻结了二硫化物状态)，然后进行限制性Lys-C消化，在预期的游离半胱氨酸残基之前切割重链铰链肽序列(图9，第二个色谱图)。在RP-UPLC-TOF上变性分析后，观察到与图8A-8C中所示的三个二硫化物状态相关的种类：(a)完整的Fab减去铰链肽(与图8A相关)；(b)轻链加NEM和环化重链(与图8B相关)；和(c)轻链加铰链肽和重链减铰链肽加NEM(与图8C相关)。该实验具体证明了G6.31.AARR.Fab-C不以均质状态存在，而是含有具有不同二硫化物构型和因此不同反应性半胱氨酸残基的三个不同种类。
[0489] 在第二个实验中，G6.31.AARR.Fab-C进行限制性Lys-C消化而不进行NEM加帽，使半胱氨酸有可能动态重排(图9，第三个色谱图)。在该实验中，几乎所有RP-UPLC-TOF分析的蛋白质都处于相同的状态：Fab减去铰链肽。考虑到第一个实验的发现，该第二组数据表明了，三个游离半胱氨酸动态重排并且在相对快的时间尺度(30分钟的实验持续时间)上重排。Lys-C切割铰链肽之后，三个可能的二硫化物状态在三个半胱氨酸残基之间动态地“混杂”。如果在某一时间点形成正确的链间二硫键，则由于先前被Lys-C切割，铰链肽序列被留给在溶液中释放。结果是，样品被驱使通过该重排过程形成完全正确形成的链间二硫化物。
[0490] 这两个实验证实，就三个近端半胱氨酸残基而言，G6.31.AARR.Fab-C可以三种不同的状态存在，并且它们的相对丰度由动态热力学平衡定义。后一发现是重要的，因为它表明了没有再处理步骤可以完全消除两种不正确的二硫化物构型，因为考虑到给定的任何短时间，三个半胱氨酸将重新混杂，以形成在第一个实验中观察到的三种变体。
[0491] (ii)HA-G6.31.AARR.Fab-C缀合物中的缀合变体
[0492] 尽管这三种二硫化物变体存在于G6.31.AARR.Fab-C中，但仍显示它们也作为变体存在于HA-G6.31.AARR缀合物中。为了阐明单个G6.31.AARR.Fab-C分子与HA-马来酰亚胺缀合的精确位置，我们使用了两种酶消化程序。第一种，限制性Lys-C消化，在预期的游离重链半胱氨酸残基之前的铰链肽处切割G6.31.AARR。在正确缀合的G6.31.AARR分子中，该处理应当将游离的完整G6.31.AARR释放到溶液中。然而，通过变性RP-UPLC-TOF分析消化的样品，鉴定了溶液中的另外的种类：游离轻链加切割的铰链肽(图10A)。这个种类的存在证实了G6.31.AARR.Fab-C群体通过通常被链间二硫化物占据的重链半胱氨酸与HA缀合，推测所述链间二硫化物源自图8C中描述的二硫化物变体。
[0493] 第二种酶消化程序保持所有缀合物完整，但用透明质酸酶(HAase)彻底消化HA主链。这不仅允许分析溶液中的游离分子，而且允许分析具有共价附接的小HA寡糖的缀合蛋白质。该方法允许在单个水平上直接观察缀合的种类。在本实验中，观察到通过预期的重链末端半胱氨酸正确缀合至HA的G6.31.AARR分子；然而，还发现了通过图8B中描述的二硫化物变体缀合的直接证据。这得到两个观察结果的支持：(a)在溶液中存在游离的环化重链分子；和(B)存在具有共价附接的马来酰亚胺接头加轻链的HA寡糖(图10B)。这些种类的存在证实了G6.31.AARR.Fab-C群体通过通常被链间二硫化物占据的轻链半胱氨酸与HA缀合，推测所述链间二硫化物源自图8B中描述的二硫化物变体。
[0494] 这两个消化实验证实了二硫化物重排确实导致G6.31.AARR.Fab-C和HA-马来酰亚胺之间的附接位点的改变。预期这种观察适用于用于缀合的任何含马来酰亚胺的聚合物主链和含有这种紧密接近的三个半胱氨酸残基的构型的任何Fab-C。
[0495] (iii)设计含游离半胱氨酸的Fab，用于更同质的缀合
[0496] 上述数据显示，当将Fab-C分子附接到含马来酰亚胺的聚合物主链时，存在三种缀合变体。这种缀合物异质性是由热力学平衡中存在三种不同的二硫化物构型所引起的，其中每种构型留下了可用于影响缀合的不同的半胱氨酸残基。这三种二硫化物构型可能受几种因素的影响，包括预期的游离铰链半胱氨酸残基与链间二硫化物的接近和游离半胱氨酸所附接的铰链肽序列的柔性。
[0497] 为了避免游离半胱氨酸与链间二硫化物混杂，我们设想将游离半胱氨酸从链间二硫化物进一步移出。因此，我们截短了标准Fab形式分子典型的铰链序列，并将Fab的表面残基突变为半胱氨酸残基。选择位点，使得它们距离HVR足够远，以便不负面影响抗原结合，并且距离链间二硫化物足够远以防止混杂。
[0498] 对于初始的筛选研究，基于来自THIOMABTM开发的先前报告选择了三个位置以满足这些标准：LC-K149(EU编号)、HC-A140(EU编号)和HC-L174(EU编号)。每个位点突变为半胱氨酸残基，并且在第一铰链二硫化物半胱氨酸之前立即终止铰链肽(即KTHT；SEQ ID NO:87)。
[0499] 为了证实这些半胱氨酸位点仍然与HA-马来酰亚胺反应，我们在典型的条件下(10mM磷酸盐(pH6.5)，150mM NaCl，和2.5mM EDTA)进行了试验性缀合，并在过夜温育后通过SEC-RI-MALS评估产物。与G6.31.AARR.Fab-C缀合反应对照相比，缀合正常进行，在正确的保留时间产生HA-G6.31.AARR缀合物(图11)。在ThioFab样品中注意到的唯一主要差异是Fab向缀合物的转化较低。这可能是由缀合反应的相对低的pH(pH6.5)引起的，与ThioFab工程改造的半胱氨酸残基相比，其可能更适于铰链半胱氨酸的pKa。预期增加缀合反应的pH将提高ThioFab缀合的产量。
[0500] (iv)Fab-C和ThioFab格式的反向迈克尔加成敏感性
[0501] 将Fab-C和ThioFab形式中的G6.31.AARR缀合至模型PEG-马来酰亚胺构建体，并在PBS中于37℃与GSSG一起温育，以作为游离巯基陷阱(trap)(即，防止释放的游离巯基与PEG-马来酰亚胺的反向迈克尔加成)，随后通过RP-UPLC-TOF进行周期性分析。在Fab-C-PEG构建体中，在最初的7天中观察到显著的反向Michael解缀合，导致完整缀合物的9.8％损失(图12)。ThioFab缀合物显示出比Fab-C不同的改进水平，其中A140C变体在14天内几乎没有显示解缀合，L174C变体显示5.9％解缀合，K149C变体在相同的时间内显示7.1％解缀合。这些数据表明半胱氨酸突变变体可以防范反向迈克尔介导的蛋白质解偶联，并且在保留完整的蛋白质-聚合物缀合物方面可以提供优于Fab-C形式的显著优点。
[0502] 实施例3：用于本发明抗体缀合物的示例性抗VEGF抗体
[0503] 本文所述的任何抗VEGF抗体可用于制备如实施例1和2中所述的抗体缀合物。例如，可以使用国际专利申请号PCT/US2016/053454中描述的任何抗VEGF抗体。表8描述了可使用的示例性抗VEGF抗体，以及每种抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列。表9描述了表8中所述的抗VEGF抗体的VL HVR氨基酸序列。表10描述了表8中描述的抗VEGF抗体的VH HVR氨基酸序列。在特定的实施方案中，使用抗VEGF抗体G6.31 AARR(在本文中也称为“G6.31.AARR”)。
[0504] 表8：示例性抗VEGF抗体的VH和VL氨基酸序列
[0505]
[0506]
[0507] 表9：来自表8的抗体的VL HVR序列
[0508]
[0509]
[0510] 表10：来自表8的抗体的VH HVR序列
[0511]
[0512] 上面列出的任何抗体(例如G6.31 AARR)的Fab重链的上铰链区均可被突变，以去除文献中已报道的对抗IgG1铰链自身抗体的反应性。参见，例如，Brezski等,J.Immunol.181:3183-3192,2008和Brezski等人,mAbs 2:3,212-220,2010。因此，G6.31 AARR重链的C-末端氨基酸可以是T(野生型(WT)形式)或L(变体形式，其缺乏与抗人IgG Fab的反应性)。野生型G6.31 AARR的全长重链氨基酸序列为SEQ ID NO:48。缺乏与抗人IgG Fab反应性的变体形式的全长重链氨基酸序列为SEQ ID NO:49。G6.31 AARR和缺乏与抗人IgG Fab反应性的变体形式的全长轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:50。
[0513] G6.31.AARR.LC-K149C半胱氨酸工程改造的抗体变体轻链和重链的氨基酸序列如下所示(LC-C149为粗体和下划线字体)。
[0514] 轻链(LC)：
[0515]
[0516] 重链(HC)：
[0517]
[0518] G6.31AARR.HC-A140C半胱氨酸工程改造的抗体变体轻链和重链的氨基酸序列如下所示(HC-C140为粗体下划线字体)。
[0519] LC:
[0520]
[0521] HC:
[0522]
[0523] G6.31AARR.HC-L174C半胱氨酸工程改造的抗体变体轻链和重链的氨基酸序列如下所示(HC-C174为粗体下划线字体)。
[0524] LC:
[0525]
[0526] HC:
[0527]
[0528] 实施例4：相对于由多分散HA生产的HA-G6.31.AARR缀合物，由单分散HA生产的HA-G6.31.AARR缀合物在生理应激下显示出改善的物理稳定性
[0529] (A)材料和方法
[0530] 使用多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)透明质酸合酶(PmHAS)通过化学酶法方式合成的单分散HA来自于Hyalose(Oklahoma City，OK)。所有其它化学品和试剂来自Sigma Aldrich(密苏里州圣路易斯)。
[0531] 如前所述，用N-(2-氨基乙基马来酰亚胺)修饰单分散HA(monoHA,Mw 137kDa,RH 21.2nm)，使其含有4.0％马来酰亚胺基团。然后，如前所述，将G6.31.AARR.Fab-C缀合至monoHA-马来酰亚胺主链，并通过SEC在 200pg柱上用PBS
pH7.4运行缓冲液纯化。合并缀合物级分，并通过SEC-RI-MALS确认。
pH7.4运行缓冲液纯化。合并缀合物级分，并通过SEC-RI-MALS确认。
[0532] 纯化的monoHA-G6.31.AARR在PBS中通过超滤浓缩至5mg/mL(基于Fab)，分别掺入叠氮化钠和聚山梨醇酯20(PS20)至终浓度为2mM和0.01％，并在37℃下温育。在取样时间点，取出样品，并在含有10mMHis-HCl(pH5.5)、150mM NaCl、10％(w/v)海藻糖和0.01％聚山梨醇酯20的缓冲液中稀释至1mg/mL，然后测定可溶性蛋白质浓度(A280)、浊度(A450)、SEC保留时间和分子量(Mn和Mw，通过SEC-RI-MALS)。
[0533] (B)结果
[0534] 与在相同Fab负载水平下使用相似大小的多分散HA生产的HA-G6.31.AARR缀合物相比，使用单分散HA生产的HA-G6.31.AARR缀合物在四周后显示出极大的改善的物理稳定性(图14)。从第0周至第2周和第4周，monoHA-G6.31.AARR的分子量(Mw)略微降低，但这种损失可完全归因于由于反向迈克尔解缀合而导致的游离Fab损失，如通常对于巯基-马来酰亚胺缀合的蛋白质所观察到的。对于monoHA-G6.31.AARR，SEC保留时间也没有可辨别的偏移，表明缀合物的物理大小不随时间变化。
[0535] 这些结果清楚地支持了以下假设，即在由多分散HA起始材料产生的HA-G6.31.AARR缀合物群体中，高分子量的基于HA的亚群是造成生理应激后观察到的物理不稳定性的原因。通过均质化HA起始材料(即，从单分散HA开始)除去该亚群导致更稳定的缀合物分子，其在生理应激条件下更不易于沉淀。这些数据进一步支持使用由单分散HA材料产生的HA-G6.31.AARR缀合物作为体内使用的治疗剂。
[0536] 尽管为了清楚理解的目的，通过说明和实施例的方式对前述发明进行了详细描述，但不应将这些描述和实施例理解为对本发明范围的限制。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用全部并入本文。
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