[0002] 本申请要求2013年1月21日提交的美国临时申请No.61/754,917的优先权。将上述申请的整个内容特意按引用并入本文中。
背景技术
[0003] 抗-细胞因子
治疗已经成为用于治疗炎性疾病的症状和抑止炎性疾病进展的护理标准。但是，尽管有多种治疗选择，许多患者仍然不能获得疾病活性的实质降低。原则上，通过组合药剂提高免疫抑制
水平用于获得提高的效率的似乎可行的策略。但为此目的组合抗细胞因子治疗的尝试遇到了不可接受的安全性和耐受性问题的麻烦(Genovese等，Arthritis & Rheumatism,50(5):1412-1419，2004)。尽管如此，发现可以同时提供提高的反应和可接受的安全性的用于炎性疾病治疗的正确联合疗法仍然是个问题。
[0004] 类
风湿性关节炎(RA)是具有未知病因学的慢性全身性
自身免疫性疾病。其主要的器官表现包括导致
疼痛、肿胀以及渐进性骨和软骨破坏的关节发炎，具有包括贫血的许多并发症和提高的心血管事件的风险。RA的特征在于激活的淋巴细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞的滑膜浸润，导致滑膜增生和新血管形成。到2012年，已经有超过5百万人受到RA的折磨，大约26％具有轻度疾病，49％具有中度疾病和25％具有严重疾病，受影响的女性比男性多三(3)倍。在许多病例中，目前的
治疗方案不是完全有效的。
[0005] 抗-TNF治疗是医生最多
指定的用于RA的抗-细胞因子治疗。TNF是提高疼痛、
炎症和关节破坏的许多介质的表达的促炎性细胞因子，包括趋化因子、细胞因子、类花生酸和基质金属蛋白酶。在不能获得缓解的许多RA患者中以及在啮齿动物疾病模型中，抗-TNF治疗在抑制这种促炎性级联的表达中是仅部分有效的。基于多种体外研究，TNF似乎在调控促炎性基因表达中与IL17协同，使得这两种治疗成为用于联合疗法的有吸引
力的候选。实际上，最近的公开出版物证明了小鼠CIA中联合抗-TNF/抗-IL17的提高的功效(Koenders等，Arthritis Rheum,2011,63(8):2329-2339)。
[0006] 因此，本领域对炎性疾病治疗以及可用于评估或预测对包括抗-TNF和抗-IL17的联合炎性疾病治疗的
反应性的方法和组合物存在需求。
发明内容
[0007] 本发明是基于用于抗-TNF和抗-IL17联合疗法的新型生物标志物的
鉴别。具体地，本发明至少部分地基于如下观察：抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法可以相对于对照标志物降低患有炎性疾病的受试者中CXCL1和/或CXCL5标志物的表达水平，表明该联合疗法在治疗受试者的炎性疾病中是或将是有效的。因此，本发明可用于(i)确定受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法有反应；(ii)监测包括抗-TNF和抗-IL17治疗的联合疗法的效力；(iii)选择参与针对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的临床试验的受试者；和(iv)鉴别用于治疗患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法。
[0008] 因此，在一个方面中，本发明提供了一种用于确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法的治疗有反应的方法。该方法包括测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平并将该标志物的表达水平与对照标志物的表达水平进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。或者，在包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法后，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0009] 在另一个方面中，本发明提供了一种确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法的治疗有反应的方法。该方法包括处理获自受试者的样品以使得样品被转化，由此允许测定CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平和将该标志物的表达水平与对照标志物的表达水平(例如，正常或疾病标准或实验室数值范围)进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。或者，在包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法后，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0010] 再在另一个方面中，本发明提供了一种使用包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法治疗患有炎性疾病的受试者的方法。该方法包括选择与对照标志物的表达水平(例如，正常或疾病标准或实验室数值范围)相比呈现出CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平的受试者并且将
治疗有效量的联合疗法施用于受试者的步骤。或者，在包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法后，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0011] 再在另一个方面中，本发明提供了一种确定患有炎性疾病的受试者对于包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的禁忌的方法。该方法包括选择与对照标志物的表达水平(例如，正常或疾病标准或实验室数值范围)相比呈现出CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平的受试者的步骤。
[0012] 在再另一个方面中，本发明提供了一种用于监测包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗的效力的方法。该方法包括测定在将治疗有效量的联合疗法施用于受试者后获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平并且将该标志物的表达水平与对照标志物的表达水平(例如，正常或疾病标准或实验室数值范围)进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中是有效的。
[0013] 在另一个方面中，本发明提供了一种选择参与用于炎性疾病治疗的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的临床试验的受试者的方法。该方法包括测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平并将该标志物的表达水平与对照标志物的表达水平(例如，正常或疾病标准或实验室数值范围)进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示受试者适合参与临床试验。或者，在包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法后，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0014] 在再另一个方面中，本发明提供了一种鉴别适用于治疗患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的方法。该方法包括测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平并将该标志物的表达水平与与对照标志物的表达水平(例如，正常或疾病标准或实验室数值范围)进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。该方法可以包括测试多种不同的联合疗法。或者，在将联合疗法施用于受试者后，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0015] 在再另一个方面中，本发明提供了一种确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNFα
抗体和抗-IL17抗体的联合疗法的治疗有反应的方法。该方法包括使用与CXCL1和CXCL5标志物中至少一种相互作用并转化样品以使得可以检测CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的
试剂测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平并将该CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平与对照标志物的表达水平进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平(例如，正常或疾病标准或实验室数值范围)相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。或者，在施用包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法后，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0016] 在再另一个方面中，本发明提供了一种
试剂盒，其用于(i)确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗有反应；(ii)监测联合疗法的效力；(iii)选择参与联合疗法的临床试验的受试者；和/或(iv)鉴别用于患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法。该试剂盒包括用于测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种和对照标志物(例如，正常值范围)的表达水平的试剂。试剂盒还包括用于(i)确定受试者是否对联合疗法有反应；(ii)监测联合疗法的效力；(iii)选择参与联合疗法的临床试验的受试者；和/或(iv)鉴别用于患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的说明。说明可以对应于本文中所述的任一个或多个方面。
[0017] 在一个实施方案中，以上所述的任一个或多个方面可以与以下所述的任一个或多个特征结合。
[0018] 在一个实施方案中，将预定量的抗-TNF治疗和抗-IL7治疗施用于受试者后，测定样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平。在一个实施方案中，预定量可以包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗中的至少一种的亚治疗剂量。在另一个实施方案中，预定量可以包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的亚治疗剂量。在另一个实施方案中，预定量可以包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗中的至少一种的治疗剂量。在另一个实施方案中，预定量可以包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的治疗剂量。
[0019] 在一个实施方案中，对照标志物的表达水平是将预定量的抗-TNF治疗和抗-IL17治疗施用于受试者之前样品中对照标志物的表达水平。
[0020] 在一个实施方案中，对照标志物的表达水平是患有炎性疾病的受试者群体中对照标志物的平均表达水平。在另一个实施方案中，对照标志物的表达水平是抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法前受试者中标志物的表达水平。
[0021] 在一个实施方案中，对照标志物包括CXCL1标志物或CXCL5标志物。在另一个实施方案中，对照标志物包括CXCL1标志物和CXCL5标志物两者。
[0022] 在一个实施方案中，患有炎性疾病的受试者群体已经接受抗-TNF治疗和抗-IL17治疗中的至少一种。在一个实施方案中，患有炎性疾病的受试者群体已经接受了抗-TNF治疗和抗-IL17治疗。
[0023] 在一个实施方案中，抗-TNF治疗包括抗-TNF结合蛋白。在一个实施方案中，抗-TNF结合蛋白包括特异性结合
蛋白质的抗体或其
抗原结合
片段。在另一个实施方案中，抗-TNF抗体或其抗原结合片段是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、
嵌合抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、SMIP、亲和体(affibody)、avimer、versabody、纳米抗体(nanobody)、域抗体或前述任一种的抗原结合片段。
[0024] 在一个实施方案中，抗-TNF抗体是抗-TNFα抗体，例如，人抗-TNFα抗体(例如， 或其抗原结合片段)。在另一个实施方案中，抗-TNF抗体包括人源化抗-TNF抗体(例如，英夫利昔单抗(infliximab)或其抗原结合片段)。
[0025] 在一个实施方案中，抗-TNFα结合蛋白包括融合蛋白(例如，依那西普(etanercept)或其抗原结合片段)。
[0026] 在一个实施方案中，抗-IL17治疗包括抗-IL17结合蛋白。在一个实施方案中，抗-IL17结合蛋白包括特异性结合蛋白质的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗-IL17抗体或其抗原结合片段是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、SMIP、亲和体、avimer、versabody、纳米抗体、域抗体或前述任一种的抗原结合片段。
[0027] 在一个实施方案中，抗-IL17抗体包括人抗体(例如，secukinumab或RG7624，或其抗原结合片段)。在一个实施方案中，抗-IL17抗体包括人源化抗体(例如，10F7、B6-17，或其抗原结合片段)。
[0028] 在一个实施方案中，抗-IL17结合蛋白包括融合蛋白。
[0029] 在一个实施方案中，抗-TNF治疗包括
氨甲喋呤、其类似物或其药物学上可接受的盐。在一个实施方案中，抗-IL17治疗包括氨甲喋呤、其类似物或其药物学上可接受的盐。在一个实施方案中，抗-TNF治疗和抗-IL17治疗中的至少一种包括氨甲喋呤、其类似物或其药物学上可接受的盐。在一个实施方案中，抗-TNF治疗和抗-IL17治疗两者包括氨甲喋呤、其类似物或其药物学上可接受的盐。
[0030] 在一个实施方案中，联合疗法包括施用结合TNF和IL17中至少一种的多特异性结合蛋白。在一个实施方案中，联合疗法包括施用结合TNF和IL17的多特异性结合蛋白。在一个实施方案中，多特异性结合蛋白包括结合TNF和IL17中至少一种的双可变结构域免TM疫球蛋白(DVD-Ig )分子、半体(half-body)DVD-Ig(hDVD-Ig)分子、三可变结构域免疫球蛋白(tDVD-Ig)分子、受体可变结构域免疫球蛋白(rDVD-Ig)分子、多价DVD-Ig(pDVD-Ig)分子、
单体(monobody)DVD-Ig(mDVD-Ig)分子、交叉(cross over)(coDVD-Ig)分子、血脑屏障(bbbDVD-Ig)分子、可切割接头DVD-Ig(clDVD-Ig)分子或重定向细胞毒性DVD-Ig(rcDVD-Ig)分子。
[0031] 在一个实施方案中，测定了CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平。在另一个实施方案中，测定了CXCL1和CXCL5标志物的表达水平。在一个实例中，与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示联合疗法将是有效的。在另一个实例中，与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物两者的较高表达水平指示联合疗法将是有效的。在一个实例中，与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法是有效的。在另一个实例中，与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物两者的较低表达水平指示联合疗法是有效的。
[0032] 在一个实施方案中，受试者之前没有用包括抗-TNF治疗的单一疗法或包括抗-IL17治疗的单一疗法治疗。
[0033] 在一个实施方案中，联合疗法与包括抗-TNF治疗的单一疗法相比更大程度地降低CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平。在一个实施方案中，联合疗法与包括抗-TNF治疗的单一疗法相比更大程度地降低CXCL1和CXCL5标志物的表达水平。
[0034] 在一个实施方案中，联合疗法具有比包括抗-TNF治疗的单一疗法更好的临床结果或临床终点。
[0035] 在一个实施方案中，受试者对包括抗-TNF治疗的单一疗法没有反应。
[0036] 在一个实施方案中，联合疗法与包括抗-IL17治疗的单一疗法相比更大程度地降低CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平。
[0037] 在一个实施方案中，联合疗法具有比包括抗-IL17治疗的单一疗法更好的临床结果或临床终点。
[0038] 在一个实施方案中，受试者对包括抗-IL17治疗的单一疗法没有反应。
[0039] 在一个实施方案中，联合疗法与包括抗-TNF治疗的单一疗法和包括抗-IL17的单一疗法两者相比更大程度地降低CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平。
[0040] 在一个实施方案中，联合疗法具有比包括抗-TNF治疗的单一疗法和包括抗-IL17治疗的单一疗法两者更好的临床结果或临床终点。
[0041] 在一个实施方案中，受试者对包括抗-TNF治疗的单一疗法或包括抗-IL17治疗的单一疗法没有反应。
[0042] 在一个实施方案中，在核酸水平测定CXCL1和/或CXCL5标志物的表达水平。在一个实施方案中，可以通过检测RNA，例如，mRNA、miRNA或hnRNA，来测定CXCL1和/或CXCL5标志物的表达水平。在另一个实施方案中，通过检测DNA(例如，cDNA)来测定CXCL1和/或CXCL5标志物的表达水平。在一个实施方案中，可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、定量逆转录酶PCR分析、Northern印迹分析、RNA酶保护试验、数字RNA检测/定量及其组合或亚组合来测定CXCL1和/或CXCL5标志物的表达水平。
[0043] 在一个实施方案中，CXCL1和/或CXCL5标志物包括蛋白质。可以使用结合CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的结合蛋白来检测蛋白质。在一个实施方案中，结合蛋白是结合CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗体是特异性结合CXCL1的抗-CXCL1抗体或其抗原结合部分和/或特异性结合CXCL5的抗-CXCL5抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗体是特异性结合CXCL1和CXCL5的抗体或其抗原结合部分。
[0044] 在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含标记，例如，
放射性标记、生物素标记、发色团、
荧光团和酶。
[0045] 在一个实施方案中，通过使用免疫试验、western印迹分析、放射性免疫试验、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡
透析、免疫扩散、电
化学发光免疫试验(ECLIA)、ELISA试验、免疫聚合酶链式反应或其组合或亚组合来测定CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平。在一个实施方案中，免疫试验包括基于溶液的免疫试验，例如，包括电化学发光、化学发光、荧光化学发光、荧光偏振或时间解析荧光。在一个实施方案中，免疫试验包括夹心免疫试验，例如，包括电化学发光、化学发光或荧光化学发光。
[0046] 在一个实施方案中，体外测定样品中CXCL1和/或CXCL5标志物的表达水平。
[0047] 在一个实施方案中，通过使用生物试验来测定CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平，例如，其中取出患者的细胞(例如，单核细胞)并在培养物中使用联合疗法进行测试的活体外试验。
[0048] 在一个实施方案中，样品包括获自受试者的
流体或其组分。在一个实施方案中，所述流体包括
羊水、房水、玻璃体液、胆汁、血液、乳汁、
脑脊液、
耳垢、乳糜、囊液、内淋巴、
粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液、
乳头吸出物、心包液、外淋巴、腹膜液、
血浆、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、汗液、血清、痰液、滑液、泪液、尿液、
阴道分泌物以及从活检收集的流体中的至少一种。
[0049] 在一个实施方案中，样品包括获自受试者的组织或细胞，或其组分。
[0050] 在一个实施方案中，样品来自呈现出炎性疾病的至少一种症状的人类受试者。在一个实施方案中，样品来自呈现出类风湿性关节炎的至少一种症状的人类受试者。类风湿性关节炎的症状包括，但不限于，肿胀的关节、疼痛的关节、炎症和/或骨丢失。在一个实施方案中，样品来自呈现出
牛皮癣(其可以包括，但不限于，
皮肤炎症、皮肤刺激、皮肤发红、皮肤损伤、凹陷甲、指甲分离、指甲增厚和/或指甲变色)、
银屑病性关节炎(其可以包括，但不限于，
手指的关节炎、脊柱的关节炎、残毁性关节炎和/或牛皮癣相关的骨质侵蚀)、强直性脊柱炎(其可以包括，但不限于，scroilitis、硬化、一个或多个脊椎的炎症、骶髂关节的炎症和/或脊柱或骨盆之间关节的炎症)、幼年特发性关节炎(其可以包括，但不限于，关节疼痛、关节肿胀、关节僵直、
睡眠障碍、行走问题和/或发烧和皮疹)、贝切特氏病(其可以包括，但不限于，口疮、皮肤损伤、生殖器疱疹(genital sore)或损伤、葡萄膜炎、关节疼痛和/或肿胀、静脉和动脉中的炎症、血管炎、腹痛、腹泻和/或大脑和/或神经系统中的炎症)、脊柱关节炎(其可以包括，但不限于，背痛、手臂和/或腿的疼痛和肿胀和/或脊柱融合)、葡萄膜炎(其可以包括，但不限于，葡萄膜的肿胀、视力模糊、红眼、眼睛刺激、眼疼和/或视力中的漂浮点)或全身性红斑狼疮(其可以包括，但不限于，疲劳、关节和肌肉疼痛、皮疹、对光的敏感性、心包炎和/或胸膜炎)的至少一种症状的人类受试者。
[0051] 在一个实施方案中，受试者是人类受试者。在一个实施方案中，受试者具有炎性疾病。在一个实施方案中，炎性疾病是类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，炎性疾病是牛皮癣、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、贝切特氏病、脊柱关节炎、葡萄膜炎或全身性红斑狼疮(SLE)。
[0052] 在一个实施方案中，联合疗法包括针对TNF和IL17的DVD-IgTM分子。在一个实施TM方案中，DVD-Ig 分子结合TNFα和IL17。
[0053] 在一个实施方案中，与CXCL1和CXCL5标志物中至少一种相互作用的试剂是抗-CXCL1或抗-CXCL5抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性地结合CXCL1和/或CXCL5。在一个实施方案中，该方法包括处理来自受试者的样品并进行结合试验，包括将处理的样品
接触CXCL1和/或CXCL5的抗体以形成抗体与样品中存在的CXCL1和/或CXCL5之间的
复合体，并检测复合体的形成。
[0054] 示例 性 抗-CXCL1抗 体 包 括，但不 限 于，EMD Millipore：AP1151-100UG；Everest Biotech:EB09637；Lifespan Biosciences:LS-B2843、LS-B2513 和
LS-C108147；eBioscience:50-7519-42 和 50-7519-41；AbD Serotec:AAM40B、AAM40和 AAR22B；Thermo Fisher Scientific,Inc.:PA1-32959、PA1-32924 和 PA1-20861；
Abbiotec:251349、12335-1-AP 和 AP08852PU-N；NovaTeinBio:63059；Abgent:AT1688a；
Aviva Systems Biology:AVARP07032_P050、OASA08635 和 OAEB00281；United States Biological:C8297-97A、C8298-01B 和 C8298-01C；Creative Biomart:CAB-1005MH、CAB-3086MH和CAB-115MH；Novus Biologicals:NBP1-61297、NBP1-51486和NBP1-19301；
Abnova:H00002919-M01、H00002919-D01P和H00002919-M03；和Fitzgerald:70R-10502；以及ProSci:31-057、42-129和42-196。
[0055] 示 例 性 抗 -CXCL5 抗 体 包 括 Lifespan Biosciences:LS-B5529；和 AbD Serotec:AHP1279、AAM42 和 AHP1279B；Proteintech Group:10809-1-AP 和 PA1-29657；Biorbyt:orb13909和orb13450；AcrisAntibodies:AM31037PU-N、PP1003B2和 PP1003P1；
NovaTeinBio:63066、AT1694a和AT1693a；Aiva Systems Biology:OASA07658、OASA08449和 OASA07657；United States Biological:C8297-98H1、C8297-98H 和 E2275-07；
Creative Biomart:CAB-5426MH 和 CAB-5425MH；Novus Biologicals:33140002；以 及Abnova:H00006374-M05、H00006374-M03和H00006374-B01。
[0056] 在一个实施方案中，与CXCL1和CXCL5标志物中至少一种相互作用的试剂包括对于CXCL1和CXCL5标志物中至少一种特异性的核酸探针。在一个实施方案中，该方法包括处理来自受试者的样品并进行结合试验，包括将处理的样品接触CXCL1和/或CXCL5的探针以形成探针与样品中存在的CXCL1和/或CXCL5之间的复合体，并检测复合体的形成。
[0057] 在一个实施方案中，测定样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平包括使用抗-CXCL1或抗-CXCL5抗体进行免疫试验。在一个实施方案中，测定样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平包括使用抗-CXCL1和抗-CXCL5抗体进行免疫试验。
[0058] 在一个实施方案中，测定样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平包括分析方法的新的组合。
[0059] 在一个实施方案中，炎性疾病包括类风湿性关节炎。在其他实施方案中，炎性疾病包括牛皮癣、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、贝切特氏病、脊柱关节炎、葡萄膜炎或全身性红斑狼疮中的至少一种。
[0060] 在一个实施方案中，确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗有反应的方法进一步包括向患者施用包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的步骤。
[0061] 在一个实施方案中，标志物包括基因产物。所述基因产物可以包括蛋白质或RNA。
[0062] 在再另一个方面中，本发明提供了一种试剂盒，其用于(i)确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗有反应；(ii)监测联合疗法的效力；(iii)选择参与联合疗法的临床试验的受试者；和/或(iv)鉴别用于患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法。试剂盒包括用于测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种和对照标志物的表达水平的试剂。试剂盒还包括用于(i)确定受试者是否对联合疗法有反应；(ii)监测联合疗法的效力；(iii)选择参与联合疗法的临床试验的受试者；和/或(iv)鉴别用于患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的说明。说明可以对应于本文中所述的任一个或多个方面。
[0063] 在一个实施方案中，试剂盒的用于测定CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平的试剂包括用于扩增和检测CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的探针。
[0064] 在一个实施方案中，试剂盒的用于测定CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平的试剂包括抗体或其抗原结合片段。
[0065] 在一个实施方案中，试剂盒进一步包括用于从受试者获得生物样品的试剂。
附图说明
[0066] 图1A显示了人CXCL1蛋白质的氨基酸序列。
[0067] 图1B显示了人CZCL1基因的核酸序列。
[0068] 图2A显示了人CXCL5蛋白质的氨基酸序列。
[0069] 图2B显示了人CXCL5基因的核酸序列。
[0070] 图3显示抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法与单独的抗-TNF治疗或单独的抗-IL17治疗相比，在小鼠
胶原蛋白诱导关节炎(CIA)模型中提供了更好的保护。
[0071] 图4显示联合的抗-TNF和抗-IL17治疗与单独的抗-TNF治疗或单独的抗-IL17治疗相比显示了更好的骨保护。
[0072] 图5显示IL17和TNF在小鼠和人滑膜细胞中协同上调CXCL1和CXCL5基因的基因表达。
[0073] 图6显示IL17和TNF在小鼠软骨细胞中协同上调CXCL1和CXCL5基因。
[0074] 图7显示了用单独的抗-TNF抗体、单独的抗-IL17抗体和组合的抗-TNF抗体和抗-IL17抗体治疗的CIA小鼠的爪裂解物(paw lysate)和血清中的CXCL1和CXCL5蛋白质水平。
[0075] 图8显示了与正常对照相比，RA患者中CXCL1和CXCL5的上调。
[0076] 图9显示在用抗-TNF治疗的RA患者vs.用抗TNF+氨甲喋呤治疗的RA患者中CXCL1和CXCL5水平之间不存在显著差异并且这些患者对任一单一疗法都不敏感。
[0077] 图10显示了图9中图示描绘的实验的数值结果。
具体实施方式
[0078] 本发明是基于鉴别用于抗-TNF和抗-IL17联合疗法的新的生物标志物。具体地，本发明至少部分基于如下观察：抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法相对于对照标志物降低患有炎性疾病的受试者中CXCL1和/或CXCL5的表达水平，表明该联合疗法在治疗受试者的炎性疾病中是或将是有效的。因此，本发明可用于(i)确定受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法有反应；(ii)监测包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的效力；(iii)选择参与包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的临床试验的受试者；和/或(iv)鉴别用于治疗患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法。
[0079] 除非本文中另外限定，结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当是清楚的，然而，在任何潜在歧义的情况中，本文中提供的定义优先于任何字典或外部定义。此外，除非上下文另外要求，单数术语，例如，通过“一(a)”或“一个(an)”表征的那些，应当包括复数，例如，一种或多种标志物(例如，生物标志物)；“一些”、“特定”和“各种”。在本申请中，“或”的使用表示“和/或”，除非另外
声明或区分。此外，术语“包括(including)”和“包含(comprising)”以及所述术语的其他形式如“包括(includes)”、“包括的(included)”、“包含(comprises)”和“包含的(comprised of)”的使用是非限制性的。此外，如“元素”或“组分”的术语包括包含一个单位的元素和组分以及包含超过一个单位的元素和组分，除非另外特意声明。
[0080] 短语“确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗有反应”是指评估用一定剂量的联合疗法治疗受试者在受试者中是治疗有效的(例如，对受试者提供治疗益处)或不是治疗有效的可能性。通常可以在治疗开始前或重新开始治疗前，进行治疗治疗有效或无效的可能性的评估。可选地或组合地，可以在治疗过程中进行有效治疗可能性的评估，例如，以确定治疗是否应当继续或停止。
[0081] 术语“抗-TNF治疗”包括用于TNF相关疾病的任何治疗和/或影响(例如，抑制)TNF途径的任何治疗。该术语包括具有结合或中和、抑制、降低或负向调节
肿瘤坏死因子(TNF)活性的作用的TNF拮抗剂。在一个实施方案中，抗-TNF治疗包括抗-TNF结合蛋白。在一个实施方案中，抗-TNF治疗可以包括抗-TNF抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、ScFv、SMIP、亲和体、avimer、versabody、纳米抗体、域抗体及前述任一种的抗原结合片段。
[0082] 在一个实施方案中，抗-TNF抗体包括抗-TNFα抗体，例如，人抗-TNF抗体，例如，人抗-TNFα抗体，例如， 或其抗原结合片段(参见美国
专利No.6,090,382)。在另一个实施方案中，抗-TNF抗体包括人源化抗-TNF抗体，例如，英夫利昔单抗或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗-TNF结合蛋白包括融合蛋白，例如，依那西普或其抗原结合片段。在其他实施方案中，抗-TNF治疗包括氨甲喋呤、其类似物或其药物学上可接受的盐。
[0083] 在一个实施方案中，抗-TNF包括多特异性结合蛋白。在一个实施方案中，多特TM异性结合蛋白包括双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig )分子、半体DVD-Ig(hDVD-Ig)分子、三可变结构域免疫球蛋白(tDVD-Ig)分子、受体可变结构域免疫球蛋白(rDVD-Ig)分子、多价DVD-Ig(pDVD-Ig)分子、单体DVD-Ig(mDVD-Ig)分子、交叉(coDVD-Ig)分子、血脑屏障(bbbDVD-Ig)分子、可切割接头DVD-Ig(clDVD-Ig)分子或重定向细胞毒性DVD-Ig(rcDVD-Ig)分子。
[0084] 术语“抗-IL17治疗”包括用于IL17相关疾病的任何治疗和/或影响(例如，抑制)IL17途径的任何治疗。该术语包括具有结合或中和、抑制、降低或负向调节白细胞介素17(IL17)活性的作用的IL17拮抗剂。在一个实施方案中，抗-IL17治疗包括抗-IL17结合蛋白。在另一个
实施例中，抗-IL17结合蛋白包括融合蛋白。在一个实施方案中，抗-IL17治疗包括抗-IL17抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗-IL17抗体包括人抗体，例如，secukinumab或RG7624或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗-IL17抗体包括人源化抗体，例如ixekizumab、10F7、B6-17或其抗原结合片段。在其他实施方案中，抗-IL17治疗包括氨甲喋呤、其类似物或其药物学上可接受的盐。在一个实施方案中，抗-IL17包括如上所述并且以下更详细描述的多特异性结合蛋白。
[0085] 可以用可检测标记来标记免疫试验中用于测定生物标志物的表达水平的抗体。关于探针或抗体的术语“标记的”意图包括通过合并标记(例如，放射性
原子)的探针或抗体的直接标记、将可检测物质与探针或抗体偶联(即，物理连接)以及通过与直接标记的另一试剂反应的探针或抗体的间接标记。间接标记的实例包括使用荧
光标记的二抗来检测一抗以及使用生物素的DNA探针的末端标记，以使得可以用荧光标记的抗生物素蛋白链菌素来检测。
[0086] 在一个实施方案中，抗体是标记的，例如，放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体。在另一个实施方案中，使用特异性结合生物标志物的抗体衍生物(例如，与基质或者与蛋白质-配体对(例如，生物素-抗生物素蛋白链菌素)的蛋白质或配体偶联的抗体或抗体片段(例如，单链抗体或分离的抗体超变结构域)。
[0087] 短语“炎性疾病”是指特征在于慢性或急性炎症的疾病或失调。许多炎性疾病是本领域已知的，如关节炎，包括类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、幼年特发性关节炎；坏死性小肠结肠炎(NEC)；胃肠炎；肠流感；胃流感；盆腔炎性疾病(PID)；
肺气肿；胸膜炎；肾盂炎；咽炎；喉咙痛；咽峡炎；寻常痤疮；发红；尿道感染；阑尾炎；滑囊炎；结肠炎；膀胱炎；皮炎；静脉炎；鼻炎；
腱炎；扁桃腺炎；脉管炎；哮喘；自身免疫性疾病；
乳糜泻；慢性前列腺炎；肾小球性肾炎；超敏性；炎性肠病；盆腔炎性疾病；
再灌注损伤；结节病；移植排斥；脉管炎；间质性膀胱炎；干草热；
牙周炎；动脉粥样硬化；牛皮癣；强直性脊柱炎；幼年特发性关节炎；贝切特氏病；脊柱关节炎；葡萄膜炎；全身性红斑狼疮和一些癌症(例如，胆囊癌)。
[0088] 术语“标志物”或“生物标志物”在本文中可互换使用以用来指用作生物状态指示剂的物质，例如，基因、信使RNA(mRNA、微RNA(miRNA))；异源核RNA(hnRNA)和蛋白质，或其部分。
[0089] “表达水平”或“表达模式”是指受试者中一种或多种标志物或生物标志物表达的定量或定性总结，如与标准或对照比较。
[0090] CXCL1和/或CXCL5的“较高表达水平”或“表达水平的提高”是指测试样品中高于用于评估表达的试验的标准误差的表达水平，并且优选是对照样品(例如，来自未患炎性疾病(例如，RA)的健康受试者的样品，和/或来自具有缓慢疾病进展的受试者的样品，和/或几个对照样品中CXCL1和/或CXCL5平均表达水平)中CXCL1和/或CXCL5表达水平的至少两倍，并且更优选三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍或者更多倍。
[0091] CXCL1和/或CXCL5的“较低表达水平”或“表达水平的降低”是指测试样品中低于用于评估表达的试验的标准误差的表达水平，并且优选低于对照样品(例如，来自具有快速疾病进展的受试者的样品和/或在施用一部分炎性疾病(例如，RA)的治疗之前来自受试者的样品，和/或几个对照样品中CXCL1和/或CXCL5的平均表达水平)中CXCL1和/或CXCL5表达水平至少两倍，并且更优选三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍或者更多倍。
[0092] 术语“CXCL1”是指趋化因子配体1的基因，趋化因子配体1属于之前称为GRO1致癌基因、CROα、KC、嗜中性粒细胞-激活蛋白3(NAP-3)和黑素瘤生长刺激活性α(MSGA-α)的CXC趋化因子家族的小细胞因子。在人类中，这种蛋白质由CXCL1基因编码。在其他动物中，这种蛋白质由直系同源(orthologous)基因编码。CXCL1的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的并且可以在例如公众可用的
数据库(如NCBI GenBank)中找到。可以依据GenBank Accession No.AAH11976找到人CXCL1基因，并且依据NCBI Reference Sequence NM_001511.3找到人CXCL1蛋白。人CXCL1蛋白和基因的序列可以在图1A和1B中找到。
[0093] 术语“CXCL5”是指CXCL5的基因，CXCL5是属于也称为上皮衍生嗜中性粒细胞-激活肽78(ENA-78)的CXC趋化因子家族的小细胞因子。用炎性细胞因子白细胞介素-1或肿瘤坏死因子-α刺激细胞后产生CXCL5。在人类中，这种蛋白质由CXCL5基因编码。在其他动物中，这种蛋白质由直系同源基因编码。CXCL5的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的并且可以在例如公众可用的数据库(如NCBI GenBank)中找到。可以依据GenBank Accession No.EAX05696.1找到人CXCL1基因，并且依据NCBI Reference Sequence NM_002994.3找到人CXCL1蛋白。人CXCL1蛋白和基因的序列可以在图2A和2B中找到。
[0094] 基因的引用包括该基因的天然产生的基因或内源的形式，包括该基因的野生型、多态性或等位基因变体或突变体(例如，种系突变、
体细胞突变)，其可以在受试者中找到。在一个实施方案中，生物标志物基因的序列与CXCL1和/或CXCL5序列至少约80％，至少约
85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％相同。可以例如通过使用NCBI BLAST(例如，使用缺省参数的Megablast)比较序列来测定序列同一性。
[0095] 在一个实施方案中，相对于对照样品，如正常组织中生物标志物的表达水平(例如，从正常组织样品中观察到的生物标志物的表达水平测定的范围)，来测定生物标志物的表达水平。在一个实施方案中，相对于对照样品，如来自患有炎性疾病的其他受试者的样品中生物标志物的表达水平，来测定生物标志物的表达水平。例如，可以测定来自其他受试者的样品中生物标志物的表达水平来限定与使用抗-TNF治疗和/或抗-IL17治疗的治疗的敏感性相关的表达水平，并且将来自目标受试者的样品中的生物标志物的表达水平与这些表达水平进行比较。
[0096] 术语“已知标准水平”或“对照水平”是指公认的或预定的生物标志物(例如CXCL1和/或CXCL5)的表达水平，其用于比较源自受试者的样品中生物标志物的表达水平。在一个实施方案中，生物标志物的对照表达水平是源自受试者群体的样品中生物标志物的平均表达水平，例如，患有炎性疾病(如RA)的受试者群体中生物标志物的平均表达水平。在另一个实施方案中，所述群体包括一组对抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法没有反应的受试者，或一组以高或正常水平表达各自生物标志物的受试者。在另一个实施方案中，对照水平构成正常组织中生物标志物的表达范围。在另一个实施方案中，对照水平构成来自患有RA的多个受试者的细胞或血浆中生物标志物的表达范围。在另一个实施方案中，“对照水平”还指受试者中的治疗前水平。
[0097] 因为更多的信息作为本文中所述方法的常规进行的结果而成为可得的，可以使用针对本发明生物标志物的“对照”表达水平的群体-平均值。在其它实施方案中，可以通过测定在怀疑受试者中炎性疾病发作前获自受试者的、获自存档的受试者样品等的受试者样品中相应生物标志物表达水平来确定生物标志物的“对照”表达水平。
[0098] 本发明生物标志物的对照表达水平可以获自公众可利用的数据库。此外，Universal Total RNA(Clontech Laboratories) 和 Universal Human Reference RNA(Stratagene)等可以用作对照。例如，可以使用qPCR来测定生物标志物的表达水平，以及相对于使用该对照检测需要的循环数，检测来自受试者的样品中生物标志物表达需要的循环数的增加指示生物标志物的低表达水平。
[0099] 如本文中使用的，术语“受试者”或“患者”是指人和非人动物，例如，兽医患者。术语“非人动物”包括
脊椎动物，例如，
哺乳动物，如非人灵长类、小鼠、啮齿动物、兔、
绵羊、狗、猫、
马、母牛、羊科动物、犬科动物、猫科动物、
马科动物或牛科动物物种。在一个实施方案中，受试者是人(例如，患有炎性疾病(例如RA)的人)。
[0100] 术语“样品”是指获自或分离自受试者的细胞、组织或流体，以及受试者体内存在的细胞、组织或流体。术语“样品”包括来自受试者的任何体液、组织或细胞或细胞集合，及其任何组分，如级分或提取物。在一个实施方案中，组织或细胞从受试者取出。在另一个实施方案中，组织或细胞存在于受试者体内。在一个实施方案中，流体包括羊水、房水、玻璃体液、胆汁、血液、乳汁、脑脊液、耳垢、乳糜、囊液、内淋巴、粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液、淋巴吸出物、心包液、外淋巴、腹膜液、血浆、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、汗液、血清、痰液、滑液、泪液、尿液、阴道分泌物或从活检收集的流体。在一个实施方案中，样品含有来自受试者的蛋白质(例如，蛋白质或肽)。在另一个实施方案中，样品含有来自受试者的RNA(例如，mRNA)或来自受试者的DNA(例如，基因组DNA分子)。
[0101] 以下分段中将进一步详细地描述本发明的各个方面。
[0102] I.患有炎性疾病的受试者中对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的反应性的预测，和相关方法。
[0103] 在各个方面中，本发明提供了一种用于确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗有反应的方法。该方法包括测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中的至少一种的表达水平；和将标志物的表达水平与对照标志物的表达水平进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。或者，与使用联合疗法治疗前的对照标志物的表达水平相比，包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法后CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0104] 在另一个方面中，本发明提供了一种确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗有反应的方法。该方法包括处理获自受试者的样品以使得样品被转化，由此允许测定CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平，以及将该标志物的表达水平与对照标志物的表达水平(例如，正常或疾病标准或实验室数值范围)进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。或者，在包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法后，，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平表明联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0105] 再在另一个方面中，本发明提供了一种使用包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法治疗患有炎性疾病的受试者的方法。该方法包括选择与对照标志物的表达水平相比呈现出CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平的受试者并且将治疗有效量的联合疗法施用于受试者的步骤。或者，在包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法后，，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0106] 再在另一个方面中，本发明提供了一种确定患有炎性疾病的受试者对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的禁忌的方法。该方法包括选择与对照标志物的表达水平或正常实验室数值范围相比呈现出CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平的受试者的步骤。
[0107] 在再另一个方面中，本发明提供了一种用于监测包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗的效力的方法。该方法包括在将治疗有效量的联合疗法施用于受试者后测定获自受试者的样品中CXCL1和CXCL5标志物中的至少一种的表达水平并且将该标志物的表达水平与对照标志物的表达水平(例如，正常实验室数值范围)进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中是有效的。
[0108] 在另一个方面中，本发明提供了一种选择参与用于炎性疾病治疗的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的临床试验的受试者的方法。该方法包括测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中的至少一种的表达水平并将该标志物的表达水平与对照标志物的表达水平进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示受试者适于参与临床试验。或者，在包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法后，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0109] 在再另一个方面中，本发明提供了一种鉴别适用于治疗患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的方法。该方法包括测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中的至少一种的表达水平和将该标志物的表达水平与与对照标志物的表达水平进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。该方法可以包括测试多种不同的联合疗法。或者，与使用联合疗法治疗前的对照标志物的表达水平相比，将联合疗法施用于受试者后CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0110] 在再另一个方面中，本发明提供了一种确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNFα抗体和抗-IL17抗体的联合疗法的治疗有反应的方法。该方法包括使用与CXCL1和CXCL5标志物中至少一种相互作用并转化样品以使得可以检测CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的试剂测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中的至少一种的表达水平和将该CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平与对照标志物的表达水平进行比较的步骤。与对照标志物的表达水平(例如，正常实验室数值范围)相比，CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较高表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。或者，在施用包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法后，与对照标志物的表达水平相比CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示联合疗法在治疗受试者中将是有效的。
[0111] 在再另一个方面中，本发明提供了一种试剂盒，其用于(i)确定患有炎性疾病的受试者是否对包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗有反应；(ii)监测联合疗法的效力；(iii)选择参与联合疗法的临床试验的受试者；和/或(iv)鉴别用于患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法。试剂盒包括用于测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平和对照标志物的表达水平(例如，正常数值范围)的试剂。试剂盒还包括用于(i)确定受试者是否对联合疗法有反应；(ii)监测联合疗法的效力；(iii)选择参与联合疗法的临床试验的受试者；和/或(iv)鉴别用于患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的说明。说明可以对应于本文中所述的任一个或多个方面。
[0112] 在本发明的方法中可以利用任何合适的分析方法来评估(直接或间接地)样品中生物标志物的表达水平。在一个实施方案中，观察到与生物标志物的对照表达水平相比，生物标志物表达水平之间的差异。在一个实施方案中，该差异是大于用于测定生物标志物表达水平的方法的检测极限。在进一步的实施方案中，差异大于或等于评估方法的标准误差，例如，差异大于评估方法的标准误差至少约2-、约3-、约4-、约5-、约6-、约7-、约8-、约9-、约10-、约15-、约20-、约25-、约100-、约500-或约1000-倍。在一个实施方案中，使用参数或非参数描述统计、比较、回归分析等来评估与对照表达水平相比的样品中生物标志物的表达水平。
[0113] 在一个实施方案中，相对于对照检测源自受试者的样品中生物标志物的表达水平的差异，并且该差异大于对照样品中生物标志物的表达水平约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约
150％、约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、约450％、约500％、约600％、约
700％、约800％、约900％或约1000％。
[0114] 在一个实施方案中，相对于对照检测源自受试者的样品中生物标志物的表达水平的差异，并且该差异低于对照样品中生物标志物的表达水平约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。
[0115] 可以通过多种技术和方法中的任何一种来测试获自受试者的样品中生物标志物(例如CXCL1和/或CXCL5)的表达水平，所述技术和方法将样品内的生物标志物转
化成可以检测和/或定量的部分。此类方法的非限制性实例包括使用用于蛋白质检测的免疫方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性试验、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法、免疫印迹、Western印迹、Northern印迹、
电子显微术、质谱(例如，MALDI-TOF和SELDI-TOF)、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学、酶联
免疫吸附试验(ELISA)(例如，扩增ELISA)、定量的基于血液的试验(例如，血清ELISA)、定量的基于尿液的试验、流式细胞术、Southern杂交、阵列分析等，及其组合或子组合来分析样品。
[0116] 在一个实施方案中，通过检测生物标志物基因的转录多核苷酸或其部分，例如，mRNA或cDNA，来测定样品中生物标志物的表达水平。可以使用RNA提取技术，包括例如，使用酸性
苯酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasy RNA制备试剂盒(Qiagen)或PAXgene(PreAnalytix，瑞士)，从细胞提取RNA。利用核糖核酸杂交的典型试验形式包括核连缀(run-on)试验、RT-PCR、定量PCR分析、RNase保护试验(Melton等，Nuc.Acids.Res.12:7035)、Nothern印迹和原位杂交。用于mRNA样品分析的其他合适系统包括微阵列分析(例如，使用Affymetrix’s微阵列系统或Illumina’s珠阵列技术)。
[0117] 在一个实施方案中，使用核酸探针来测定生物标志物的表达水平。如本文中使用的，术语“探针”是指能够选择性地结合特定生物标志物的任何分子。探针可以通过本领域技术人员来合成，或源自合适的生物制剂。可以通过添加或掺入标记特别地将探针设计成标记的。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于，RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
[0118] 如上所示，分离的mRNA可以用于杂交或扩增试验中，包括，但不限于，Southern或Northern分析、聚合酶链式反应(PCR)分析和探针阵列。用于测定mRNA水平的一种方法涉及将分离的mRNA接触可以与生物标志物mRNA杂交的核酸分析(探针)。核酸探针可以是，例如，全长cDNA或其一部分，如至少约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、250或约500个核苷酸长并且在合适的杂交条件下足以与生物标志物基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。在特定的实施方案中，探针将在严格条件下结合生物标志物基因组DNA。这样的严格条件，例如，在6X
氯化钠/
柠檬酸钠(SSC)中45℃下杂交，之后在0.2X SSC、0.1％ SDS中
50-65℃一次或多次洗涤，也是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学通用实验方案)，Ausubel等编辑，John Wiley & Sons，Inc.(1995)，2、4和6部分中找到，在此将其教导按引用并入本文中。另外的严格条件可以在Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Sambrook等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，第7、9和11章中找到，在此将其教导按引用并入本文中。
[0119] 在一个实施方案中，将mRNA固定于固体表面上并且接触探针，例如，通过将分离的mRNA在琼脂糖凝胶上跑胶并将mRNA多凝胶转移至膜，如硝基
纤维素。在可替代的实施方案中，将探针固定于固体表面上，例如，Affymetrix
基因芯片阵列中，并将探针接触mRNA。本领域技术人员可以容易地调整用于测定生物标志物mRNA水平的mRNA检测方法。
[0120] 还可以使用涉及使用样品中的例如mRNA的核酸扩增和/或逆转录酶(来制备cDNA)，接着检测扩增的分子的方法来测定样品中生物标志物的表达水平，例如，通过RT-PCR(Mullis，1987，美国专利No.4,683,202中所列的实验实施方案)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)、自主序列复制(Guatelli等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-Beta复制酶(Lizardi等，(1988)Bio/Technology
6:1197)、滚环复制(Lizardi等，美国专利No.5,854,033)或任何其他核酸扩增方法。如果这些分子以非常低的数量存在，这些方法对于核酸分子的检测尤为有用。在本发明的特定TM
方面中，通过定量荧光RT-PCR(例如，TaqMan 系统)来测定生物标志物的表达水平。这样的方法通常利用对于生物标志物特异性的寡核苷酸引物对。用于设计对于已知序列特异性的寡核苷酸引物的方法是本领域公知的。
[0121] 可以使用膜印迹(如杂交分析中使用的，如Northern印迹、Southern印迹、斑点印迹，等等)，或微孔、样品管、凝胶、珠子或纤维(或包括结合的核酸的任何固体支持物)来监测生物标志物mRNA的表达水平。参见，例如，美国专利No.5,770,722；5,874,219；5,774,305；5,667,195；和5,445,934，将它们涉及这些试验的完整内容按引用并入本文中。生物标志物表达水平的测定还可以包括使用溶液中的核酸探针。
[0122] 在本发明的一个实施方案中，使用微阵列来检测或定量生物标志物的表达水平。由于不同实验之间的可重复性，微阵列特别适用于这一目的。DNA微阵列提供一种用于同时测量大量基因的表达水平的方法。各个阵列由连接于固体支持物的捕获探针的可复制图案组成。标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描检测。测定阵列上每个探针的杂交强度并转化成表示相对基因表达水平的定量值。参见，例如，美国专利No.6,040,138；5,800,992；6,020,135；6,033,860；和6,344,316，将涉及这些试验的完整内容按引用并入本文中。高
密度寡核苷酸阵列对于测定样品中的大量RNA的基因表达谱特别有用。
[0123] 还可以使用直接或间接检测由生物标志物的mRNA编码的蛋白质产物的检测试剂，在蛋白质水平评估生物标志物的表达。例如，如果特异性结合待检测的生物标志物蛋白质产物的抗体试剂是可用的，那么这样的抗体试剂可以用于检测来自受试者的样品中生物标志物的表达，使用如免疫组织化学、ELISA、FACS分析等等的技术。
[0124] 用于在蛋白质水平检测生物标志物的其他已知方法包括如
电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱等等的方法，或各种免疫方法，如流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射性免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验和Western印迹。
[0125] 可以使用多种技术从样品分离蛋白质，包括本领域技术人员公知的那些。所用的蛋白质分离方法可以是，例如，Harlow和Lane中所述的那些(Harlow和Lane，1988，Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
[0126] 在一个实施方案中，将抗体或抗体片段用于如Western印迹或免疫荧光技术的方法中来检测表达的蛋白质。用于检测本发明生物标志物的表达的抗体是可商业购得的。
[0127] 抗-CXCL1抗体可以容易地从多个商业供应商获得。例如，EMDMillipore:AP1151-100UG，Everest Biotech:EB09637，Lifespan Biosciences:LS-B2843、LS-B2513、LS-C108147，eBioscience:50-7519-42、50-7519-41，AbD Serotec:AAM40B、AAM40、AAR22B，Thermo Fisher Scientific,Inc.:PA1-32959、PA1-32924、PA1-20861，Abbiotec:251349、12335-1-AP、AP08852PU-N，NovaTeinBio:63059，Abgent:AT1688a，Aviva Systems Biology:AVARP07032_P050、OASA08635、OAEB00281，United States Biological:C8297-97A、C8298-01B、C8298-01C，Creative Biomart:CAB-1005MH、CAB-3086MH、CAB-115MH，Novus Biologicals:NBP1-61297、NBP1-51486、NBP1-19301，Abnova:H00002919-M01、H00002919-D01P、H00002919-M03，Fitzgerald:70R-10502，ProSci:31-057、42-129、42-196。
[0128] 抗-CXCL5抗体可以容易地从多个商业供应商获得。例如，LifespanBiosciences:LS-B5529，AbD Serotec:AHP1279、AAM42、AHP1279B，Proteintech Group:10809-1-AP、PA1-29657，Biorbyt:orb13909、orb13450，Acris
Antibodies:AM31037PU-N、PP1003B2、PP1003P1，NovaTeinBio:63066、AT1694a、AT1693a，Aiva Systems Biology:OASA07658、OASA08449、OASA07657，United States Biological:C8297-98H1、C8297-98H、E2275-07，Creative Biomart:CAB-5426MH、CAB-5425MH，Novus Biologicals:33140002，Abnova:H00006374-M05、H00006374-M03、H00006374-B01。
[0129] 例如，在一个实施方案中，本发明的方法可以包括将来自受试者的样品接触特异性结合CXCL1和/或CXCL5的抗体，从而在抗体与CXCL1和/或CXCL5之间形成复合体，添加标记的并与结合于CXCL1和/或CXCL5的抗体反应的检测试剂或抗体来检测复合体，洗涤以除去任何未结合的检测试剂或抗体，将标记转化成可检测
信号并将测量的CXCL1和/或CXCL5的水平与获自对照样品的CXCL1和/或CXCL5参照水平进行比较。
[0130] 在一个实施方案中，可以将抗体或蛋白质固定于固体支持物上用于Western印迹和免疫荧光技术。合适的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。公知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龙、
淀粉酶、天然和修饰的
纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁
铁矿。
[0131] 本领域技术人员知道许多其他用于结合抗体或抗原的合适载体，并且将能够调整这样的支持物以用于本发明。例如，可以将从细胞分离的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳上跑样并固定于固相支持物(如硝基纤维素)上。然后可以用合适的缓冲液洗涤支持物，接着用可检测地标记的抗体处理。然后可以用缓冲液第二次洗涤固相支持物以除去未结合的抗体。然后可以通过常规方式来检测固相支持物上结合的标记的量。使用电泳技术检测蛋白质的方式是本领域技术人员公知的(总体地参见，R.Scopes(1982)Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.；Deutscher,(1990)Methods in Enzymology Vol.182:Guide to Protein Purification,Academic Press,Inc.,N.Y.)。
[0132] 其他标准方法包括免疫试验技术，其是本领域普通技术人员公知的并且可以在Principles And Practice Of Immunoassay(免疫试验原理和实践)，第2版，Price和Newman编辑，MacMillan(1997)和Antibodies,A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Harlow和Lane编辑，Cold Spring Harbor Laboratory，Ch.9(1988)中找到。
[0133] 在本发明的一个实施方案中，使用蛋白质组方法，例如，质谱法。质谱法是包括
离子化化合物以产生带电分子(或其片段)并测量其质荷比的分析技术。在典型的质谱程序中，从受试者获得样品，加载于质谱仪上，并且通过不同的方法(例如，通过用电子束撞击)将其组分(例如，生物标志物)离子化而导致带电颗粒(离子)的形成。然后随着它们通过
电场从离子的运动计算颗粒的质荷比。
[0134] 例如，基质相关激光
解吸/离子飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)或表面增强激光解吸/离子飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)，其涉及将生物样品(如血清)施加于蛋白质结合芯片(Wright,G.L.,Jr.等，(2002)Expert Rev Mol Diagn 2:549；Li,J.等，(2002)Clin Chem 48:1296；Laronga,C.等，(2003)Dis biomarkers 19:229；Petricoin,E.F.等，(2002)359:572；Adam,B.L. 等，(2002)Cancer Res 62:3609；Tolson,J. 等，(2004)Lab Invest 84:845；Xiao,Z.等(2001)Cancer Res 61:6029)，可以用于在蛋白质水平测定生物标志物的表达。
[0135] 此外，用于测定生物标志物的表达水平的体内技术包括将针对生物标志物的标记抗体引入受试者中，其结合生物标志物并将生物标志物转化成可检测的分子。如以上所讨论的，可以通过标准成像技术来检测受试者中可检测生物标志物的存在、水平乃至
位置。
[0136] 通常，在检测生物标志物与对照的表达水平差异的情况中，优选获自患有炎性疾病并用抗-TNF治疗和抗-IL17治疗进行治疗或正考虑这样治疗的受试者的样品中生物标志物表达水平与对照样品中生物标志物的量之间的差异尽可能地高。尽管这种差异可以小至用于测定表达水平的方法的检测极限，但优选差异大于方法的检测极限或大于评估方法的标准误差，并且优选高于评估方法的标准误差至少约2-、约3-、约4-、约5-、约6-、约7-、约8-、约9-、约10-、约15-、约20-、约25-、约100-、约500-或约1000-倍的差异。或者，差异大于方法的检测极限或大于评估方法的标准误差，并且优选低于评估方法的标准误差至少约2-、约3-、约4-、约5-、约6-、约7-、约8-、约9-、约10-、约15-、约20-、约25-、约100-、约500-或约1000-倍的差异。
[0137] 获自患有炎性疾病(例如，RA)的受试者的任何合适样品可以用于评估生物标志物(例如，CXCL1和/或CXCL5)的表达水平，包括缺少表达。例如，样品可以是获自受试者的任何流体或其组分，如级分或提取物，例如，血液、血浆、淋巴、滑液、囊液、尿液、乳头吸出物或从活检收集的流体、羊水、房水、玻璃体液、胆汁、血液、乳汁、脑脊液、耳垢、乳糜、囊液、内淋巴、粪便、胃酸、胃液、粘液、心包液、外淋巴、腹膜液、血浆、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、汗液、血清、痰液、滑液、关节组织或关节液、泪液或阴道分泌物。在典型的情况中，流体可以是获自受试者的血液或其组分，包括
全血或其组分，包括血浆、血清和血细胞，如红细胞、白细胞和血小板。在另一种典型的情况中，流体可以是滑液、关节组织或关节液，或反映炎性疾病(例如，RA)的任何其他样品。样品还可以是获自受试者的任何组织或其组分、结缔组织、淋巴组织或肌肉组织。
[0138] 用于从受试者获得样品的技术或方法是本领域公知的，并且包括，例如，通过
口腔拭子或漱口水获得样品；抽血；获得活检样品；或从患有炎性疾病的受试者获得滑液或其他样品(例如，皮肤，如在牛皮癣或银屑病性关节炎的情况中)。可以使用多种技术来分离流体或组织样品的组分(例如，细胞或RNA或DNA)。获得样品后，其可以进一步处理。
[0139] II.包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗。
[0140] 既然观察到患有炎性疾病(例如，RA)的受试者中CXCL1和/或CXCL5的表达水平影响受试者对抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的反应性，本领域技术人员可以基于受试者中CXCL1和/或CXCL5生物标志物的表达水平来选择用于该受试者的合适治疗方案。
[0141] 因此，本发明提供了用包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法治疗患有炎性疾病的受试者的方法。
[0142] 在一个实施方案中，受试者之前已经用包括抗-TNF治疗或抗-IL17治疗的单一疗法、包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法和/或替代疗法治疗过。在其他实施方案中，受试者可能正在考虑第一次用包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法进行治疗。测定了CXCL1标志物和CXCL5标志物中至少一种的表达水平。如果CXCL1标志物和CXCL5标志物中至少一种的表达水平测定为高于对照表达水平，则包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗很可能是有效的。然而，不是必需所有测试的生物标志物与相应对照相比具有高的表达水平。例如，尽管特定的生物标志物可以以正常或高表达水平存在，可以在例如CXCL1或CXCL5以低于对照水平的水平表达时指定使用包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗。
[0143] 所选择的用于包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗方案通常包括以下参数中的至少一个，并且更通常包括以下参数中的许多或全部：剂量、制剂、
给药途径和/或给药
频率。治疗方案的特定参数的选择可以基于本领域之前建立的针对抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的已知治疗参数，如FDA针对 、英夫利昔单抗和secukinumab批准标签中所列的剂量和给药方案中所述的那些，其完整内容按引用并入本文中。可以基于各种因素，包括，例如，受试者的疾病、年龄、性别和体重以及炎性疾病(例如，RA)的严重程度或阶段，通过本领域已知的方法来进行剂量、制剂、给药途径和/或给药频率的各种改变。
[0144] 可以在同时或在不同时间施用抗-TNF治疗和抗-IL17治疗。联合疗法可以包括同时或近乎同时地施用抗-TNF治疗和抗-IL17治疗。在其他实施方案中，联合疗法可以包括施用抗-TNF治疗，接着施用抗-IL17治疗，其中这样的分离使得抗-TNF治疗和抗-IL17治疗伴随地起作用和/或获得协同作用。在其他实施方案中，联合疗法可以包括施用抗-IL17治疗，接着施用抗-TNF治疗，其中这样的分离使得抗-TNF治疗和抗-IL17治疗伴随地起作用和/或获得协同作用。在一个实施方案中，联合疗法在同一制剂包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗两者(例如，作为单个分子或作为两个单独的分子)。在其他实施方案中，联合疗法包括两个单独的制剂，一个包括抗-TNF治疗，而另一个包括抗-IL17。
[0145] 在一个实施方案中，联合疗法可以是例如WO/2010/102251中所述的DVD-Ig结合蛋白(例如，和抗-TNF-抗-IL17 DVD-Ig)，将其全部按引用并入本文中。
[0146] 在一个实施方案中，联合疗法可以是例如WO/2010/102251中所述的DVD-Ig结合蛋白(例如，和抗-TNF-抗-IL17 DVD-Ig)，将其全部按引用并入本文中。
[0147] 如本文中使用的，术语“治疗有效量”意思是如本文中所述的抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的量，其能够治疗炎性疾病(例如，RA)。当然，根据本发明施用的治疗剂量根据围绕病例的特定情况来确定，包括，例如，给予的治疗、给药途径、患者的状况和正在治疗的病理状况，例如，受试者的RA的严重程度。
[0148] 为了施用于受试者，联合疗法通常配制成包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗以及药物学上可接受的载体的药物组合物。治疗组合物通常应当是无菌的并且在制造和储存条件下是充分稳定的。
[0149] 如本文中使用的，术语“药物学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有
溶剂、分散基质、涂层、抗细菌剂和抗
真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适用于肠胃外(例如，静脉内、肌内、皮下、鞘内)施用(例如，通过注射或输注)。根据给药途径，活性化合物可以包被在材料中以保护化合物免受可能使化合物失活的酸和其他自然条件的作用。
[0150] 存在多种类型的可以与根据本发明的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法结合使用的抗炎方法。这些包括，例如，非类固醇抗炎药(NSAID)、类固醇、缓解疾病的抗风湿药(DMARD)，包括氨甲喋呤(Trexall)、来氟米特(Arava)、羟基氯喹(Plaquenil)、柳氮磺胺吡啶(Azulfidine)和米诺环素(Dynacin，Minocin)及免疫
抑制剂，包括咪唑硫嘌呤(Imuran，Azasan)、环孢霉素(Neoral，Sandimmune，Gengraft)和环磷酰胺(Cytoxan)。
[0151] 本发明的方法可以使用这些方法来治疗本领域已知用来治疗的那些相同类型的炎性疾病，以及其他的，如可以通过本领域技术人员来确定的。此外，可以根据与本领域对其使用已知的那些相似的参数(例如，给药方案和剂量)来进行这些方法。然而，如本领域所理解的，由于与这些方法另外一起使用抗-TNF治疗和抗-IL17治疗，可能希望调整这些参数中的一些。例如，如果另一种药物通常作为唯一治疗剂来施用，当与根据本发明的抗-TNF治疗和抗-IL17治疗结合时，可能希望降低该药物的剂量，如可以通过本领域技术人员来确定的。
[0152] III.本发明的试剂盒
[0153] 在再另一个方面中，本发明提供了一种试剂盒，其用于(i)确定患有炎性疾病的受试者是否对用包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗有反应；(ii)监测联合疗法的效力；(iii)选择参与炎性疾病联合疗法的临床试验的受试者；或(iv)鉴别用于患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法。试剂盒包括用于测定获自受试者的样品中的CXCL1和CXCL5标志物中的至少一种和对照标志物的表达水平的试剂。试剂盒还包括用于(i)确定受试者是否对包括的联合疗法有反应；(ii)监测联合疗法的效力；(iii)选择参与联合疗法的临床试验的受试者；或(iv)鉴别用于患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的说明。说明可以对应于本文中所述的任一个或多个方面。
[0154] 本发明的试剂盒可以任选包括可用于进行本发明方法的其他组分。
[0155] 例如，试剂盒可以包括用于从受试者获得生物样品和/或获得对照样品的试剂。
[0156] 此外，试剂盒包括用于测定CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平的试剂。在一个实例中，用于测定CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平的试剂包括用于扩增和检测CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的探针。在另一个实例中，用于测定CXCL1和CXCL5标志物中至少一种的表达水平的试剂包括抗体或其抗原结合片段。
[0157] 关于对照标志物，试剂盒可以包括预定的对照值(例如，基于预定的受试者群体)。或者，试剂盒可以包括用于测定受试者(例如，用于治疗的潜在候选者或接受治疗的受试者)中对照的表达水平的另外的试剂和说明。
[0158] 在一个实施方案中，用于测定来自受试者的生物样品中至少一种生物标志物的表达水平的试剂包括足以检测编码标志物的核酸(例如，mRNA)的表达的核酸制剂。该核酸制剂包括至少一种，并且可以包括超过一种核酸探针或引物，其序列设计为使得核酸制剂可以检测来自受试者的样品中编码生物标志物的核酸(例如，mRNA)的表达。优选的核酸制剂包括两种或更多种允许PCR扩增编码目标生物标志物的mRNA的区段的PCR引物。在其他实施方案中，试剂盒包括用于CXCL1和/或CXCL5的核酸制剂。
[0159] 用于测定CXCL1和/或CXCL5表达水平的方式还包括，例如，缓冲剂或用于评估表达(例如，在核酸或蛋白质水平)的试验中的其他试剂。试验可以是生物分析，例如，活体外试验，其中取出患者细胞(例如，单核细胞)并在培养物中使用联合疗法进行测试。
[0160] 在另一个实施方案中，试剂盒可以进一步包括用于治疗如本文中所述的炎性疾病的联合疗法，所述联合疗法包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗。例如，联合疗法包括针对TNF和IL17或更特别地针对TNFα和IL17的DVD-Ig分子。
[0161] 优选地，试剂盒设计用于人类受试者。
[0162] 通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当解释为进一步限制。整个本申请以及附图中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容将其全部特别地按引用并入本文中。
[0163] 实施例
[0164] 实施例1-单独和联合的抗-TNF和抗-IL17在小鼠胶原蛋白诱导关节炎模型中的功效
[0165] 在这个实施例中，在小鼠的胶原蛋白诱导关节炎模型中评价了抗-TNF或抗-IL17或其组合的功效，并且结果显示于图3中。在尾根部对雄性DBA/1J小鼠i.d.注射100μl含有溶解于0.1N
醋酸中的100μg II型牛胶原蛋白的乳液和100μl含有100μg结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculois)H37Ra的完全弗氏佐剂。21天后通过用200μL
磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1.0mg zymosan A对小鼠i.p.加强。在加强3天内疾病开始发作。第一周每天监测小鼠的关节炎，此后每周三次。通过以下标准给每只爪评分：0＝正常；1＝一个部位(足或踝)肿胀；2＝足和踝肿胀；3＝关节僵硬。对每只动物的所有四只爪的评分进行总计(最大评分为12)，并且将总评分表示为每个组中所有动物的平均值和表示为平均关节炎评分(MAS)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中通过腹膜内注射施用的12mg/kg抗-TNF抗体8C11、12mg/kg抗-IL17抗体MAB421或12mg/kg每种抗体处理动物2×/周。
在一个实验中，在
预防性处理模型中，动物在呈现关节炎体征前接受抗体治疗。在第二个实验中，动物在治疗性处理模型中在关节液体征发作后接受抗体治疗。在两种类型的实验中，抗-TNF或抗-IL17的治疗在减轻爪的关节炎中都是部分有效的，而抗-TNF和抗-IL17组合的治疗给予了高于任一单一疗法的功效。
[0166] 实施例2：在小鼠胶原蛋白诱导关节炎模型中单独和组合的抗-TNF和抗-IL17的骨保护的比较
[0167] 在这个实施例中，证明了TNF和IL17的联合阻断对防止骨丢失的更高功效，并且显示于图4中。按照实施例1中所述的，在DBS/1J小鼠中诱发关节炎。在研究结束时，关节炎体征发作后三周，评价骨丢失的水平。在接受了治疗性处理方案的动物中测量防止骨丢失的保护功效。后爪在胫骨/腓骨的中间移除并储存在10％中性缓冲福尔马林中。爪子使用Scanco μCT40(Scanco Medical AG)，在55kVp和145μA下利用高
分辨率设置(1000投射/180°，在2048×2048
像素重构下)和Isotropic Voxels以180微秒积分时间成像，获得18μm×18μm×18μm的最终各向同性三维像素大小。从根骨和舟骨的近端连接点并且延伸至跗骨100个切片的固定高度(1.8mm)，围绕目标区域手动画出圆柱状轮廓。内部原始对照已经显示出该区域给出用于分析的高度保守的并且统计学可重现的体积区域。通过3
针对骨体积(mm)以及表面积-体积比的ScancoAG分析
软件进行3-D定量评价，获得了跗-1
骨表面粗糙度(mm )的近似值。使用了0.8希格玛高斯和1.0的分析设置，具有1000的上限域值和320的下限域值。如图4中所示，接受媒介处理的关节炎小鼠中存在明显的骨体积损失。相反，单独的抗-TNF或抗-IL17的治疗分别导致骨丢失的显著保护，42或66％(p值<0.05vs.媒介对照)。抗-TNF和抗-IL17的
联合治疗导致相对于媒介80％的更高骨丢失保护(p<0.05)。
[0168] 实施例3：TNF和IL-17在CIA和RA中的相互作用
[0169] 在这个实施例中，将基因表达谱用作工具来研究反映抗-TNF和抗-IL17治疗的协同作用的生物标志物。在这种情况中，将8C11抗体用作抗-TNF治疗，和将大鼠抗-小鼠抗-IL17抗体MAB421用作抗-IL17治疗，除非另外指出。使用本领域已知的方法，表征疾病相关RNA的反应并鉴别对联合的抗-TNF和抗-IL17治疗敏感但对抗-TNF或抗-IL17单一疗法显著较不敏感的同期组。鉴别出CXCL1和CXCL5为生物标志物，因为它们在临床现场需要最少制备或操作的容易获取的生物流体中随着时间是稳定的。使用小鼠中的胶原蛋白诱导关节炎(CIA)模型，全爪匀浆中CXCL1和CXCL5生物标志物的测量表明RNA水平的变化是蛋白质水平变化的良好预测子。此外，结果确定抗-TNF和抗-IL17治疗的联合疗法存在协同作用，如以下讨论的。
[0170] CXCL1和CXCL5-反应性和非反应性的统计学分析
[0171] 如果治疗者和患病者之间的差异显著性的p-值(使用Student’s t检验，没有对于多重比较的校正)高于0.05或由于治疗引起的倍数变化低于0.1log(25％)(与变化的显著性无关)，认为CXCL1和/或CXCL5对于给定的治疗没有反应。
[0172] CIA模型和RNA制备
[0173] 在尾根部对雄性DBA/1J小鼠i.d.注射100μL含有100μg溶解于0.1N醋酸中的II型牛胶原蛋白的乳液和100μL含有100μg结核分枝杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂。21天后用200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1.0mg Zymosan A给小鼠i.p.加强。在加强3天内，出现疾病发作。
[0174] 第一周每天监测小鼠的关节炎，且之后每周三次。通过以下标准给每只爪评分：0＝正常；1＝一个部位(足或踝)肿胀；2＝足和踝都肿胀；3＝关节僵硬。对每只动物的所有四只爪的评分进行总计(最大评分为12)，并且将总分表示为每个组中所有动物的平均值且表示为平均关节炎评分。用Capliper Thickness-Gage(Dyer，310-115)测量爪肿胀的变化。对于治疗性给药，在最大评分为2的疾病头一个临床体征时，将小鼠登记入组。
[0175] 第一次呈现疾病症状后七天，从去皮的小鼠后爪制备RNA。入组时，将小鼠随机分成由单一疗法(6mg/kg，任一种抗体)、联合疗法(每种抗体6mg/kg)或用同种型对照处理的小鼠组成的治疗同期组。基于之前确定6mg/kg为最大有效剂量的剂量-反应实验来选择剂量。
[0176] 途径分析
[0177] 对比途径分析使用了Ingenuity Pathway AssistTM和Fisher’s Exact Test方法。对于本分析，所示的途径具有<0.05的显著性和至少两个受调控的转录物。
[0178] 结果：
[0179] IL17和TNF表现为协同调节CIA小鼠中的基因表达
[0180] 分析来自CIA小鼠的爪总RNA以研究两种细胞因子途径在调控疾病活性中的相互作用。与健康动物相比，CXCL1和CXCL5基因表达在患病动物中显著上调。聚类结果表明接受了相似治疗方案的小鼠具有相似的RNA表达谱。用单独的抗-IL17抗体治疗的动物与媒介处理的动物聚类，表明对基因表达的最小作用。抗-TNF抗体治疗的小鼠聚类在一起，但与用抗-TNF和抗-IL17两者治疗的小鼠分离，因而具有相对于抗-IL17单一疗法的中等作用。因此，基于无偏
聚类分析，三个治疗方案中存在功效梯度。
[0181] 根据聚类分析，少数疾病相关基因对抗-TNF治疗具有显著反应，而甚至更少的量对抗-IL17治疗具有显著反应。然而，与对抗-TNF单一疗法具有反应的基因数量相比，约两倍数量的基因对联合疗法有反应。使用相同统计学标准的进一步分析表明大部分受到单独的抗-IL17调控的mRNA也受到组合的调控。通过比较，仅有一半受到单独的抗-TNF调控的基因也受到组合的调控。
[0182] 途径分析表明联合疗法比单一疗法实质上影响更多系统
[0183] 观察到的提高的mRNA调控可能是提高的效能的结果，导致检测或多或少受单一疗法影响的相同途径内的更多mRNA。另一方面，提高的mRNA调控也可能具有定性结果，表明对未受单一疗法影响的途径的效应。为了帮助区分这两种机制，使用策划的途径数据库TM(curated pathway database)(Ingenuity Pathway Assist )进行每个处理组中受调控基因的途径分析。这一分析表明尽管几条途径共同地受到调控，但明显实质上更多的受到联合疗法影响的途径，表明可归因于联合抗-TNF和抗-IL17治疗的另外的非丰余功能。
[0184] 为了确定mRNA水平的提高是否反映在蛋白质水平的变化，使用Ingenuity TMPathway Assist 分析CXCL1蛋白和CXCL5蛋白的水平。在全爪匀浆中检测的CXCL1蛋白和CXCL5蛋白水平都存在显著的疾病相关的提高。发生响应于单独和联合的抗-TNF和抗-IL17治疗的这些蛋白质水平的至不同程度的降低。在所有情况中，与单一疗法相比，响应于联合疗法的CXCL1蛋白和CXCL5蛋白水平存在更高的降低。因此，CXCL1 RNA和CXCL5 RNA水平的变化是小鼠CIA模型中CXCL1蛋白和CXCL5蛋白表达的可靠定量预测子以及是对抗-TNF和抗-IL17治疗反应性的指示。
[0185] 图7显示了小鼠爪裂解物(左栏)和血清(右栏)中的蛋白质表达。血清中观察到的趋势总体地反映出爪裂解物中针对CXCL1观察到的那些。患病小鼠中的CXCL1蛋白水平上调，通过单一疗法只存在少量地下调(如果有的话)，但通过联合治疗显著下调。因此，爪和血清趋化因子水平之间存在总体相关性。
[0186] 为了确定分泌的CXCL1和CXCL5蛋白水平是否在人中得到相似的调控，从患有确认的RA的患者和健康对照获得血清样品。图8显示了与非-RA对照相比，RA患者中的CXCL1和CXCL5蛋白水平高度上调。因为需要对现有的商业联合疗法有反应的生物标志物，图8中所描绘的研究的RA同期组包括用单独的氨甲喋呤或 加氨甲喋呤治疗的患者，以确定在另外的TNF阻断存在下CXCL1和CXCL5标志物是否继续过表达。图9显示单独的氨甲喋呤或对抗-TNF治疗增加氨甲喋呤对CXCL1和CXCL5水平没有显著影响。图
10显示了图9中所示实验的数值结果。
[0187] 按引用并入
[0188] 可能在这整个申请中引用的所有引用的参考文献(包括文献参考书目、专利、专利申请、数据库和
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[0189] 等同
[0190] 本发明可以以其他特定形式来实施而不脱离其精神或实质性特征。因此认为之前的实施方案在所有方面都是说明性的，而非本文中所述发明的限制。因此本发明的范围由所附
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