技术领域
[0001] 本
发明涉及超分辨显微领域，尤其涉及一种基于切向偏振光的受激发射损耗显微方法和装置。
背景技术
[0002] 由阿贝衍射极限理论可知，光束经一般透镜聚焦后所成光斑的尺寸用半高全宽可以表示为 其中λ为入射光束的
波长，NA为所用透镜的数值孔径，因此常规远场
荧光显微镜的极限
分辨率一般被限制在了半波长左右。
[0003] 为了突破阿贝衍射极限的限制，使得荧光显微镜可以在远场实现超分辨显微，科研人员们提出了多种超分辨显微方法。其中，受激发射损耗显微术（STED：Stimulated Emission Depletion Microscopy）目前的发展最为成熟，应用最为广泛。在STED显微方法中，当激发光使其所成光斑范围内的荧光分子跃迁到激发态后，损耗光（STED光，一般为中空型光斑）使得其中处于激发光斑边缘部分的荧光分子通过受激发射作用回到基态，从而大大减小了实际有效荧光的发光面积，实现了超衍射极限的分辨率。
[0004] 目前，在STED显微方法中，一般将激发光和STED光均设置为圆偏振光，以获得较高的受激发射损耗效率。然而，经研究发现，切向偏振光型的激发光和STED光同样可以用于STED显微方法中实现超分辨显微，并且在相同的条件下，这种方法可以实现更高的分辨率。
[0005] 公开号为101907766A的中国
专利公开了一种基于切向偏振的超分辨荧光显微方法和装置，包括：将第一
光源发出的用于激发荧光样品产生荧光的激发光（第一激光光束）经第一切向偏振转换器转换为切向偏振光，通过0~2π涡旋位相板位相编码后投射到荧光样品上形成激发光斑；将第二光源发出的用于抑制荧光样品发出荧光的受激发射损耗光（第二激光光束）经第二切向偏振转换器转换为切向偏振光后投射到位于纳米平台上荧光样品上形成中心点与激发光斑中心点重合的聚焦光斑；收集荧光样品发出的荧光，经探测成像系统处理后得到相应的显微图像。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种基于切向偏振光的受激发射损耗显微方法和装置。当采用与
现有技术的STED显微方法相同的STED光强时，本发明可以实现更高的分辨率。
[0007] 一种基于切向偏振光的受激发射损耗显微方法，包括将第一激光光束和第二激光光束分别转换为第一切向偏振光和第二切向偏振光；所述第一切向偏振光经
相位调制后投射到荧光样品上形成激发光斑；所述第二切向偏振光分解为第一工作光束和第二工作光束，所述第一工作光束和所述第二工作光束分别进行相位调制形成第一STED光束和第二STED光束，所述第一STED光束和所述第二STED光束经显微物镜投射到荧光样品上通过非相干
叠加形成相应的STED光斑，该STED光斑的中心点与所述激发光斑的中心点重合得到聚焦光斑；收集荧光样品在该聚焦光斑作用下发出的荧光，经处理后得到相应的显微图像。
[0008] 所述的第一激光光束进行相位调制的调制函数 为： 所述θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径
角，所述的 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标
位置矢量与x轴的夹角。第一激光光束经第一位相板的调制作用，所形成的激发光束经显微物镜投射后在待测荧光样品上呈现为一个实心光斑。
[0009] 所 述 的 第 一 工 作 光 束 进 行 相 位 调 制 的 调 制 函 数 为：所述θ为入射光束垂直光轴
剖面内各点所对应的孔径角，所述的 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角，θ1、θ2、θ3、θ4均为对应的位相板的结构参数，所述α为由显微物镜的数值孔径NA所决定的最大孔径角， n为待测荧光样品周围介质的折射率。
第一工作光束经第二位相板的调制作用，所形成的第一STED光束经显微物镜投射后在待测荧光样品上呈现为一个横向（xy平面）中空型光斑，在该第一STED光斑中，电矢量的x分量主要集中于y轴附近，而电矢量的y分量主要集中于x轴附近。
[0010] 优选的，所述显微物镜的数值孔径NA=1.4，所述位相板的结构参数θ1、θ2、θ3、θ4分别为θ1=0.1、θ2=0.4、θ3=0.62、θ4=0.77。当位相板的结构参数按上述方式设置时，本发明可以实现最佳的分辨效果。
[0011] 所 述 的 第 二 工 作 光 束 进 行 相 位 调 制 的 调 制 函 数 为：所述θ为入射光束垂直光轴剖面内各
点所对应的孔径角，所述的 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角。第二工作光束经第三位相板的调制作用，所形成的第二STED光束经显微物镜投射后在待测荧光样品上同样呈现为一个横向中空型光斑，在该第二STED光斑中，电矢量的x分量主要集中于x轴附近，电矢量的y分量主要集中于y轴附近。
[0012] 一种基于切向偏振光的受激发射损耗显微装置，包括：沿第一光路依次布置的第一光源、第一切向偏振转换器和第一位相板；沿第二光路依次布置的第二光源、第二切向偏振转换器；用于承载荧光样品的纳米平移台；用于将所述第一光路和第二光路的光线投射至荧光样品的投射装置；检测所述荧光样品发光的探测成像系统；在所述第二切向偏振转换器与投射装置之间依次设有：
[0013] 用于将所述第二切向偏振转换器的出射光分解为第一工作光束和第二工作光束的第一分光棱镜；
[0014] 用于将所述第一工作光束和所述第二工作光束分别进行相位调制的第二位相板和第三位相板；
[0015] 用于汇聚所述第二位相板和第三位相板的出射光的第二分光棱镜。
[0016] 所述第一位相板为0~2π涡旋位相板，其对应的调制函数 为：所述θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角，所述的 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角。第一激光光束经第一位相板的调制作用，所形成的激发光束经显微物镜投射后在待测荧光样品上呈现为一个实心光斑。
[0017] 所 述第 二 位 相 板 为0/π位 相 板，其 对应 的 调 制 函 数 为：所述θ为入射光束垂直光轴剖面内
各点所对应的孔径角，所述的 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角，θ1、θ2、θ3、θ4均为对应的位相板的结构参数，所述α为由显微物镜的数值孔径NA所决定的最大孔径角， n为待测荧光样品周围介质的折射率。第一工
作光束经第二位相板的调制作用，所形成的第一STED光束经显微物镜投射后在待测荧光样品上呈现为一个横向（xy平面）中空型光斑，在该第一STED光斑中，电矢量的x分量主要集中于y轴附近，而电矢量的y分量主要集中于x轴附近。
[0018] 所述第三位相板为四象限型0/π位相板，其对应的调制函数 为：所述θ为入射光束垂直光轴剖面内各点
所对应的孔径角，所述的 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角。第二工作光束经第三位相板的调制作用，所形成的第二STED光束经显微物镜投射后在待测荧光样品上同样呈现为一个横向中空型光斑，在该第二STED光斑中，电矢量的x分量主要集中于x轴附近，电矢量的y分量主要集中于y轴附近。
[0019] 在所述第一光源与所述第一切向偏振转换器及所述第二光源与所述第二切向偏振转换器之间依次设有：用于对光束进行
准直作用的单模光纤和
准直透镜。保证相应的光源所发出的激光光束在转换为切向偏振光之前为准直光束。
[0020] 本发明的工作原理如下：
[0021] 在本发明的受激发射损耗显微方法中，当第一激光光束在荧光样品上使其所成光斑范围内的荧光分子跃迁到激发态后，中空型的STED光斑通过受激发射作用使得激发光斑边缘部分中的荧光分子回到基态，从而抑制了这部分荧光分子发射荧光。这样，只有位于激发光斑中心部分的荧光分子最终可以发出荧光，由此实际有效荧光的发光面积大大减小，分辨率得以提高。
[0022] 然而，STED光束的这种消光能
力与荧光分子的分子指向有关。研究表明，只有当STED光束的偏振方向和荧光分子的分子指向一致时，STED光束的消光能力才达到最强。
[0023] 在本发明中，由于第一位相板的调制作用，第一激光光束经显微物镜投射后在待测荧光样品上呈现为一个实心光斑，该实心激发光斑使得其光斑范围内的具有不同指向的荧光分子被激发。需要注意的是，由于切向偏振光的特殊聚焦特性，其所成聚焦光斑中的电矢量将不具有z分量，因此，仅有分子指向位于xy平面内的荧光分子被激发。同时，由于第二位相板的调制作用，第一STED光束经显微物镜投射后在待测荧光样品上呈现为一个横向（xy平面）中空型光斑。在该第一STED光斑中，电矢量的x分量主要集中于y轴附近，而电矢量的y分量主要集中于x轴附近。因此，如果只有第一STED光束单独作用，此时对于位于y轴附近，分子指向具有y分量的荧光分子以及于x轴附近，分子指向具有x分量的荧光分子并不具备很好的消光效果。引入第二STED光束可以解决这一问题。由于第三位相板的调制作用，第二STED光束经显微物镜投射后在待测荧光样品上同样呈现为一个横向中空型光斑，并且在该光斑中，电矢量的x分量主要集中于x轴附近，电矢量的y分量主要集中于y轴附近。因此，当所述第一STED光斑和第二STED光斑在荧光样品上通过非相干叠加形成横向中空型的合STED光斑进行作用时，对于各处不同指向的荧光分子均能实现较好的消光效果。
[0024] 同时，由于所用切向偏振光特有的聚焦特性，它所形成的STED中空型光斑与由常规圆偏振光所形成的相比收敛更快，因此在相同的STED光强下，有效荧光的发光面积可以被压缩得更小，从而实现比已有技术更高的分辨率。
[0025] 相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
[0026] （1）在相同的工作光强下，可以实现更高的分辨率；
[0027] （2）可以在更低的工作光强下，实现与现有技术相同的分辨率，从而降低样品的漂白，避免了对样品的损坏。
附图说明
[0028] 图1为本发明的一种基于切向偏振光的受激发射损耗显微装置示意图；
[0029] 图2为本发明中所用第一位相板的示意图；
[0030] 图3为本发明中所用第二位相板的示意图；
[0031] 图4为本发明中所用第三位相板的示意图；
[0032] 图5为本发明中所生成的激发光斑的横向归一化光强分布曲线图；
[0033] 图6为本发明中所生成的合STED光斑与常规圆偏振光所生成的STED光斑的横向归一化光强分布曲线比较示意图；
[0034] 图7为本发明中有效荧光光斑与相同功率圆偏振光条件下的有效荧光光斑的横向归一化光强分布曲线比较示意图。
具体实施方式
[0035] 如图1所示，一种基于切向偏振光的受激发射损耗显微装置，包括：第一
激光器1，第二激光器2，第一单模光纤3，第二单模光纤4，第一准直透镜5，第二准直透镜6，第一切向偏振转换器7，第二切向偏振转换器8，第一分光棱镜9，第一位相板10，第二位相板11，第三位相板12，第一反射镜13，第二反射镜14，第二分光棱镜15，第一二向色镜16，第二二向色镜17，显微物镜18，纳米平移台19，
带通滤波片20，场镜21，探测器22。
[0036] 投射装置包括：第一二向色镜16，第二二向色镜17和显微物镜18。探测成像系统由第一二向色镜16，第二二向色镜17，显微物镜18，纳米平移台19，带通滤波片20，场镜21和探测器22组成。
[0037] 其中，第一单模光纤3和第一准直透镜5位于第一激光器1发出的第一激光光束的光轴上，并对所述第一激光光束进行准直处理；第一切向偏振转换器7位于准直后的第一激光光束的光轴上，将所述准直后的第一激光光束转换为第一切向偏振光。
[0038] 第一位相板10位于所述第一切向偏振光的光轴上，用于对第一切向偏振光进行相位调制得到第一调制光束；第一位相板10为0~2π涡旋位相板，其相位调制函数设为且 其中，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角。第一位相板10的结构示意如图2所示。
[0039] 第二单模光纤4和第二准直透镜6位于第二激光器2发出的第二激光光束的光轴上，并对所述第二激光光束进行准直处理；第二切向偏振转换器8位于准直后的第二激光光束的光轴上，将所述准直后的第二激光光束转换为第二切向偏振光。
[0040] 第一分光棱镜9位于第二切向偏振光的光路上，用于将第二切向偏振光分解为
透射光束和反射光束；其中，透射光束为第一工作光束，反射光束为第二工作光束；第一工作光束和第二工作光束的光路相互垂直。
[0041] 第二位相板11位于第一工作光束的光路之上，用于对垂直入射的第一工作光束进行相位调制，得到第二调制光束；第二位相板11为0/π位相板，其相位调制函数设为且 其中，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角，θ1、θ2、θ3、θ4均为第二位相板的结构参数，α为由显微物镜的数值孔径NA所决定的最大孔径角， n为待测荧光样品周围介质的折射率。第
二位相板11的结构示意如图3所示，其中画斜线部分对应的相位调制函数为π，空白部分对应的相位调制函数为0。
[0042] 第一反射镜13位于第二调制光束的光路上，用于对第二调制光束进行光路折转，使其垂直入射到第二分光棱镜15上。
[0043] 第二反射镜14位于第二工作光束的光路上，用于对第二工作光束进行光路折转，使其垂直入射到第三位相板12上。
[0044] 第三位相板12用于对垂直入射的第二工作光束进行相位调制，得到第三调制光束；第三位相板12为四象限型0/π位相板，其相位调制函数设为 且其中，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所
对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角。第三位相板12的结构示意如图4所示，其中画斜线部分对应的相位调制函数为π，空白部分对应的相位调制函数为0。由第三位相板出射的第三调制光束垂直入射到第二分光棱镜15上。
[0045] 第二分光棱镜15，用于使垂直入射的第二调制光束反射，得到第一STED光束；同时还使垂直入射的第三调制光束透射，得到第二STED光束；第一STED光束和第二STED光束的光路重合。
[0046] 第一二向色镜16，用于使第一调制光束反射，得到激发光束；同时还使所述第一STED光束和第二STED光束透射；透射后的第一STED光束和第二STED光束的光路均与所述激发光束的光路重合；在对荧光样品所发射的荧光进行收集时，第一二向色镜16使得荧光光束以及经样品表面反射的第一STED光束和第二STED光束透射，同时还使经样品表面反射的激发光束反射，从而起到从荧光光束中滤去激发光束的作用。
[0047] 第二二向色镜17，用于使第一STED光束和第二STED光束反射，从而入射到第一二向色镜16上；对荧光样品所发射的荧光进行收集时，第二二向色镜17使得荧光光束透射，同时还使经样品表面反射的第一STED光束和第二STED光束反射，从而起到从荧光光束中滤去第一STED光束和第二STED光束的作用。
[0048] 显微物镜18，用于将激发光束、第一STED光束以及第二STED光束投射到待测荧光样品上分别形成激发光斑、第一STED光斑和第二STED光斑；同时显微物镜18还用于收集荧光样品上所发射的荧光。
[0049] 纳米平移台19，用于放置待测的荧光样品，使荧光样品位于显微物镜18的焦平面附近，并对荧光样品进行三维平移以实现对于荧光样品的
三维扫描。
[0050] 带通滤波片20，用于对透过第二二向色镜17后的荧光光束进行滤波，以进一步滤去杂散光。
[0051] 场镜21，用于将经带通滤波片20滤波后的荧光光束投射到探测器22的探测面上。
[0052] 探测器22，用于接收荧光光束，获取荧光光强
信号。
[0053] 上述装置中，显微物镜18的数值孔径NA=1.4；第二位相板11的结构参数θ1、θ2、θ3、θ4分别为θ1=0.1、θ2=0.4、θ3=0.62、θ4=0.77。
[0054] 在上述受激发射损耗显微装置中：
[0055] 第一位相板10的相位调制函数为 其中，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角。
[0056] 因此，经第一位相板10相位调制之后的第一调制光束的电矢量强度可由下式表示：
[0057]
[0058] 其中， 为入射到第一位相板10上的第一切向偏振光在 处的电矢量强度， 为第一调制光束在 处的电矢量强度，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角。
[0059] 第二位相板11的相位调制函数为
[0060]
[0061] 其中，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角，θ1、θ2、θ3、θ4均为第二位相板11的结构参数，α为由显微物镜的数值孔径NA所决定的最大孔径角， n为待测荧光样品周围介质的折射率。
[0062] 因此，经第二位相板11相位调制之后的第二调制光束的电矢量强度可由下式表示：
[0063]
[0064] 其中， 为入射到第二位相板11上的第一工作光束在 处的电矢量强度， 为第二调制光束在 处的电矢量强度，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角，θ1、θ2、θ3、θ4均为第二位相板11的结构参数，α为由显微物镜的数值孔径NA所决定的最大孔径角， n为待测荧光样品周围介质的折射率。
[0065] 第三位相板12的相位调制函数为
[0066]
[0067] 其中，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角。
[0068] 因此，经第三位相板12相位调制之后的第三调制光束的电矢量强度可由下式表示：
[0069]
[0070] 其中， 为入射到第三位相板12上的第二工作光束在 处的电矢量强度， 为第三调制光束在 处的电矢量强度，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角。
[0071] 第一调制光束经第一二向色镜16反射得到激发光束，激发光束经显微物镜18投射到荧光样品上，形成激发光斑；第二调制光束经第一反射镜13反射后垂直入射到第二分光棱镜15上并反射得到第一STED光束，第一STED光束经第二二向色镜17反射，之后透过第一二向色镜16，由显微物镜18投射到荧光样品上，形成第一STED光斑；第三调制光束垂直入射到第二分光棱镜15上并透射得到第二STED光束，第二STED光束经第二二向色镜17反射，之后透过第一二向色镜16，由显微物镜18投射到荧光样品上，形成第二STED光斑。第一STED光斑和第二STED光斑的中心点与激发光斑的中心点重合得到聚焦光斑。
[0072] 激发光斑、第一STED光斑和第二STED光斑的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：
[0073]
[0074] 式中， 是以显微物镜18的焦点位置为原点的柱
坐标系， 代表了 处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为入射光束垂直光轴剖面内各点所对应的孔径角， 为入射光束垂直光轴剖面内各点的极坐标位置矢量与x轴的夹角， 是入射光的振幅分布， 表征了显微物镜13的结构， 则表示了入
射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。
[0075] 利用德拜积分计算发现：在荧光样品上，激发光斑为一个实心光斑，其半高全宽值为0.34个波长。激发光斑的横向归一化光强分布曲线图如图5所示。
[0076] 同样利用德拜积分可以计算得到荧光样品上第一STED光斑和第二STED光斑的光场分布。将第一STED光斑和第二STED光斑的光场进行非相干叠加即可计算得到合STED光斑的光场分布。在荧光样品上，合STED光斑为一个横向中空型光斑，其半高全宽值为0.25个波长。与常规采用圆偏振光所形成的半高全宽值为0.32个波长的STED光斑相比，本发明中采用切向偏振光所形成的STED光斑收敛更快，因此在相同的光强条件下，可以将有效荧光光斑压缩得更小，可实现的分辨率就越高。本发明中所生成的合STED光斑与常规圆偏振光所生成的STED光斑的横向归一化光强分布曲线比较示意图如图6所示。
[0077] 经计算发现，当合STED光斑的极值光强为370MW/cm2时，本发明采用切向偏振光的受激发射损耗显微方法可实现的有效荧光光斑半高全宽值为1/28个波长。而相同的光强条件下，常规基于圆偏振光的受激发射损耗显微方法可实现的有效荧光光斑的半高全宽值为1/18个波长。由此说明在相同的工作光强下，本发明可以实现的分辨率更高。换句话说，为了实现相同的分辨率，本发明与常规基于圆偏振光的受激发射损耗显微方法相比，所需要的光强更低。本发明中有效荧光光斑与相同光强圆偏振光条件下的有效荧光光斑的横向归一化光强分布曲线比较示意图如图7所示。
