为了实验室研究和生物医学目的，深部组织的光学成象被用于探察生物 样本中结构。这包括对例如老鼠、斑马鱼或人这样的动物的内脏和皮下组织 的成象，一个目的是不用手术或其他侵入性方法来了解内部结构。
在一种深部组织成象技术中，与样本中的特定目标有关的荧光剂通过用 照明光激发它们，使它们发出荧光而被成象；荧光发射被阻挡滤光片从具有 不同的波长的照明光分开，然后被利用例如冷却CCD检测器的非常灵敏的 照相机检测出来。在其他技术中，使用制剂修改样本，制剂使其产生本质上 会发荧光的物质，最常见的例子是绿色荧光蛋白(GFP)。其他的技术涉及 使用量子点作为发光探针。
如此处所用的，例如荧光燃料、荧光蛋白象GFP、量子点、表面增强拉 曼试剂，以及相关的化合物或者用于类似目的的其他材料的化合物，都是测 量的靶化合物的例子。
在这种实验中产生的信号通常是微弱的。一般，对从深部组织发出的微 弱水平的光线的强力检测是有益的，因为它提供被研究结构的更早的或更可 靠的检测。而且，它使得能够检测较低水平的靶化合物。因此，用于深部组 织成象的技术和装置是宝贵的，如果它们提供低检测阈值的话。
发明内容
本发明已经认识到一个人可以成功地使用光谱识别技术来精确地成象 在深部组织样品，例如在动物或人中的皮下组织或器官中的一个或更多靶化 合物。例如，一个人收集关于从样品中不同空间位置上来的光线的光谱解析 信息，然后从对纯粹光谱的估量将该光谱解析信息分解为与样品中的不同成 分(例如自发荧光和一个或更多靶化合物)相对应的贡献。此分解可用于重 建优先示出选定成分的一个或更多图象。该光谱解析信息通常对应一光谱图 象立方体，其中每个象素包括从对应的空间位置来的样品发射光谱。
发明人还发展了算法，它对从这样的光谱图象立方体数据中估量一个或 更多样品成分的纯粹光谱特别有用，即使在该一个或更多成分仅以混合形式 出现的情况(即从一个成分来光线与从另一成分来的光线既在空间上也在光 谱上重叠)。然后这些纯粹的光谱可用于将光谱图象立方体数据分解为选定 成分的图象。这些算法不仅对深部组织样品有用，而且对一般的生物样品也 有用。此外，在一些实施例中，该算法需要很少或不需要用户输入。
在一些实施例中，该算法认识到，对仅以混合形式出现在图象立方体中 的第一成分的纯粹光谱的精确估量，可以通过使用至少部分图象立方体数据 以及对至少出现在混合中的第二成分的纯粹光谱的分别估量来确定。对第二 成分的纯粹光谱的估量可基于图象立方体数据的其他部分或者来自现有的 知识。在最简单的例子中，比例数量的对第二成分的光谱估量被从混合信号 光谱中减去以显露出第一成分的纯粹光谱的估量。例如，该比例可被设定为 在每个光谱波道中达到较小的但非零的信号值。
现在我们概括地总结本发明的至少一些不同的方面和特征。
一般，在一方面中，本发明特征为一种方法包括：(i)提供关于响应于 对样品的照明而从样品(例如深部组织样品)中的不同空间位置上来的光线 的光谱解析信息，其中光线包括来自样品中的不同成分的贡献；及(ii)基 于该光谱解析信息构建样品的图象以优先示出一个选定的成分。典型地，该 光谱解析信息包括对应至少三种，优选为四或更多种不同光谱加权函数(例 如不同光谱波段)的信息。
该方法可进一步包括，从光谱估量，将对于至少一些不同空间位置的每 一个的光谱解析信息分解成来自与样品种的至少一个或更多成分的每一个 相关的光谱估量的贡献。图象的构建可基于此分解。而且，一个或更多光谱 估量可以是对于成分的纯粹光谱的估量。给定成分的纯粹光谱对应会观测到 的光谱解析信息，只要该成分对被测量的光线作出贡献(对给定的空间位 置)。
该方法可进一步包括下面的任何特征。
该光谱解析信息可包括关于其中从样品来的光线被光谱滤波的一组图 象的信息，其中对每个图象的光谱滤波对应不同的光谱加权函数。
该光谱解析信息可包括关于其中用于照明样品的光线被光谱滤波的一 组图象的信息，其中对每个图象的光谱滤波对应不同的光谱加权函数。
典型地，不同的空间位置对应在该组图象中的公共象素。不同的光谱加 权函数可对应不同的光谱波段。在该组图象中可以有三个，或更优选为四个 或更多图象。
关于该组图象的信息可包括在每个象素处的一系列值，其中每个值与从 样品来的光线相对于光谱加权函数的对应的那个的强度有关。典型地，对每 个空间位置的光谱解析信息包括与至少三个更优选为四个或更多不同光谱 加权函数相对应的信息。
该光谱解析信息可包括光谱图象立方体。
来自样品的光线可包括来自样品的荧光、来自样品的反射、磷光、散射、 或者拉曼散射，或者它可以包括传输通过样品的光线。
至少成分之一可涉及自发荧光。
至少成分之一可包括靶化合物(即荧光蛋白或量子点)。例如选定的成 分可以是包括靶化合物的成分。
该方法可进一步包括照明样品和收集光谱解析信息。例如收集光谱解析 信息可包括使用液晶可调光谱滤波器、声光可调光谱滤波器、一组光谱滤波 器、光谱滤波器轮、色散棱镜、光栅、分光计或单色仪。
选定成分的图象可包括一图象，其中从其他成分来的信号相对于从选定 成分的信号被减小。
该方法可进一步包括，基于该分解构建样品的第二图象以优先示出成分 中的第二个。该方法还可包括基于该分解构建样品的第三图象以优先示出成 分中的第三个。
该样品可以是活着的有机体(例如哺乳动物)。
样品可以包括深部组织、组织切片、细胞、皮下组织，或者携带生物材 料的显微镜载物片。
基于该分解构建图象可包括基于与选定成分有关的光谱估量在不同空 间位置处的贡献来构建深部组织图象。
该分解可以是线性分解。例如，该分解可包括求解矩阵方程中的至少一 个元素，其中，方程中的一个矩阵是基于光谱解析信息而方程中另一个矩阵 是基于光谱估量。
可独立于该光谱解析信息提供至少一个光谱估量。
至少对成分中的第一个的至少第一个光谱估量可以从光谱解析信息中 确定。例如，可以从该光谱解析信息中确定所有的光谱估量。可以通过使用 无监督分类技术或者有监督的分类技术从光谱解析信息中确定光谱估量。无 监督分类技术的一个例子包括对那些多重空间位置求其光谱解析信息的平 均值。有监督分类技术的一个例子从一包括一个或更多空间位置的区域的光 谱解析信息确定第一光谱估量，其中该区域与第一成分有关。
第一光谱估量可以从来自一个或更多空间位置的第一组的光谱解析信 息得到，在这些空间位置中光线包括来自那些多重成分的贡献。在这种情况 中，第一光谱估量可以从来自第一组空间位置的光谱解析信息以及对成分中 的第二个的光谱估量而得到。
例如，得到第一光谱估量可包括基于来自第一组的光谱解析信息和对第 二成分的光谱估量来计算剩余光谱。可以在第一组空间位置中的一个或更多 空间位置的每一个上计算剩余光谱。可选择的，剩余光谱的计算可基于第一 组空间位置的光谱解析信息和对第二成分的光谱估量的平均。
对第二成分的光谱估量可以从光谱解析信息得到。例如，对第二成分的 光谱估量可以通过使用无监督分类技术例如求平均值，而从光谱解析信息得 到。可选择的，对第二成分的光谱估量可以从包括一个或更多空间位置的区 域得到，其中该区域与第二成分有关。
得到第一光谱估量可包括对于第一组空间位置调整对应光谱解析信息 的值以基于对第二成分的光谱估量从第二成分中去掉一贡献(例如最大贡 献)。最大贡献可基于在调整值的每个光谱波道中的信号的误差函数分析。 例如，误差函数分析趋向于在调整值的每个光谱波道中保持非负数的信号。
例如，该值可包括一系列的对第一组中的每个空间位置的至少一些值， 基于对第二成分的光谱估量从第二成分中去掉贡献可包括从该一系列值中 减去对第二成分的光谱估量的最优量。
对于至少该一系列值的第一个的最优量可基于使包括在第一系列值和 由对第二成分的光谱估量乘上去的要被最优化的量之间的差异的差值光谱 的误差函数最小，其中该误差函数在光谱波道上被最小化。该差值光谱可进 一步包括同样在光谱波道上被最优化的一个常数。典型地，该误差函数偏爱 差值光谱正值多于差值光谱负值。例如，一个有用的误差函数包括(e-Δ+1) Δ2，其中Δ是差值光谱。误差函数也可被第一系列值的大小和对第二成分的 光谱估量归一化。
分解可包括：(i)将在多重空间位置上的光谱解析信息第一分解为来自 与至少样品中的一些成分相关的初始光谱估量的贡献；(ii)基于第一分解提 高至少一些初始光谱估量的精确度；及(iii)至少一第二分解，其将在多重 空间位置上的光谱解析信息分解为来自改进的光谱估量的贡献。
在另一方面，本发明特征为一装置，包括：(i)构建为支撑样品(例如 深部组织样品)的样品架；(ii)照明样品的照明源；安置为检测来自样品的 光线的检测器；及(iii)耦合到检测器上的电子处理器。该电子处理器构建 为完成上面描述的任何方法步骤，包括按照需要与使用者互动。
该装置可进一步包括安置在样品和检测器之间的光谱滤波装置。例如光 谱滤波装置可包括液晶可调光谱滤波器、声光可调光谱滤波器、一组光谱滤 波器、光谱滤波器轮、色散棱镜、光栅、分光计或单色仪。
可选择的，或另外，该装置可包括安置在照明源和样品之间的光谱滤波 装置。
而且，照明源自身可提供可调激发光。例如，它可以是多谱段二极管或 LED阵列。
一般，在又一方面，本发明特征为一方法，包括：(i)响应于照明提供 从生物样品发出的光谱滤波辐射的一组图象，其中样品包括支撑靶化合物的 成分，发出的辐射包括来自靶化合物的发射和来自样品中的一个或更多另外 的成分的发射，对一公共组象素每个图象对应不同的光谱加权函数；及(ii) 处理光谱滤波辐射的图象以构建样品的输出图象，其中来自另外的成分的信 号相对于来自靶化合物的信号被减小。该处理包括基于对至少成分之一的发 射光谱的估量，对该组图象中的一个或更多象素计算剩余光谱。
在再一方面中，本发明特征为一方法，包括：(i)照明样品以使样品发 出辐射，其中样品包括支撑靶化合物的深部组织，其中发出的辐射包括来自 靶化合物的发射和来自样品中的一个或更多其他成分的发射；(ii)用多个不 同的光谱加权函数中的每一个对发出的辐射进行光谱滤波；(iii)对光谱加 权函数的每一个储存光谱滤波辐射的图象；及(iv)处理储存的图象以构建 样品的深部组织图象，其中来自其他化合物的信号相对于来自靶化合物的信 号被减小。
在另一方面中，本发明特征为一方法，包括：(i)响应于照明提供从样 品发出的光谱滤波辐射的多个图象，其中样品包括支撑靶化合物的深部组 织，其中发出的辐射包括来自靶化合物的发射和来自样品中的一个或更多其 他成分的发射，其中每个图象对应不同的光谱加权函数；及(ii)处理光谱 滤波辐射的图象以构建样品的深部组织图象，其中来自其他成分的信号相对 于来自靶化合物的信号被减小。
在又一方面中，本发明特征为一装置，包括：储存一程序的计算机可读 介质，该程序使处理器：(i)响应于照明，接收从样品发出的光谱滤波辐射 的多个图象，其中样品包括支撑靶化合物的深部组织，其中发出的辐射包括 来自靶化合物的发射和来自样品中的一个或更多其他成分的发射，其中每个 图象对应不同的光谱加权函数；及(ii)处理光谱滤波辐射的图象以构建样 品的深部组织图象，其中来自其他成分的信号相对于来自靶化合物的信号被 减小。
在再一方面中，本发明特征为一装置，包括：(i)构建为保持包括深部 组织的样品的样品架，其中该深部组织支撑靶化合物；(ii)构建为照明样品 以使它发出辐射的照明源，其中发出的辐射包括来自靶化合物的发射和来自 样品中的一个或更多其他成分的发射；(iii)构建为将发出的辐射对检测器 成象的成象系统；(iv)可调光谱滤波器，其构建为用多个不同的光谱加权函 数的每一个对发出的辐射进行光谱滤波；(v)检测器，其构建为对每个光谱 加权函数储存光谱滤波辐射的图象；及(vi)电子处理器，其构建为处理储 存的图象以构建样品的深部组织图象，其中来自其他化合物的信号相对于来 自靶化合物的信号被减小。例如，样品架可构建为保持动物例如哺乳动物， 象老鼠、兔子或人。而且，例如，成象系统可具有大于或等于1的缩小率， 例如成象系统可构建为对一视场成象，该视场具有在检测器上大于2cm的 对角线尺寸。
这些各种方面的实施例可包括下面的任何特征。
包括深部组织的样品可以是活的有机体，例如动物或哺乳动物。例如动 物可包括老鼠、兔子、斑马鱼或者人。而且，深部组织可以是该活的有机体 的内脏，该深部组织可位于不超过该活的有机体的约2mm或更深处。
该深部组织可以是皮下组织。
来自样品其他成分的发射可包括来自覆盖在深部组织上的组织的自发 荧光。
来自样品的其他成分的发射可包括样品中的不同于包括该深部组织的 那层组织的一个或更多层组织的自发荧光。
靶化合物可以是，例如，固定到至少该深部组织的一部分上的荧光探针、 固定到至少该深部组织的一部分上的量子点、固定到至少该深部组织的一部 分上的绿色荧光蛋白(GFP)、固定到至少该深部组织的一部分上的黄色荧 光蛋白(YFP)，和固定到至少该深部组织的一部分上的红色荧光蛋白(RFP) 中的任何一个。
来自靶化合物的发射可以是荧光。
至少一些光谱加权函数可对应特定波长波段。例如，所有的光谱加权函 数对应特定波长波段。可选择的，至少一些光谱加权函数可对应多重波段的 正弦加权。
光谱滤波可包括使用液晶可调光学滤波器、干涉光学滤波器、包含多个 带通滤波器的滤波器轮中的任一。
每个储存的图象可包括对每个多重象素的强度值。
处理储存图象可包括基于在储存的图象中的信号的加权叠加构建深部 组织图象。
处理记录的图象可包括基于记录的图象和对样品中的其他成分的至少 一发射光谱来构建深部组织图象。例如，构建深部组织图象可包括基于对其 他成分的该至少一发射光谱来计算对于在该组储存图象中的每个象素的剩 余光谱。
类似地，处理记录图象可包括基于记录图象和对靶化合物的发射光谱来 构建深部组织图象。例如构建深部组织图象可包括基于对靶化合物的发射光 谱来计算对在该组储存图象中的每个象素的剩余光谱。
还有，处理记录图象可包括基于记录的图象、对样品中的其他成分的至 少一发射光谱，和对靶化合物的发射光谱来构建深部组织图象。例如，构建 深部组织图象可包括求解一矩阵方程中的至少一元素，在该矩阵方程中一个 矩阵是基于储存的图象而另一个矩阵是基于发射光谱。
该深部组织可支撑多重靶化合物，而处理储存的图象可包括对每个靶化 合物构建深部组织图象。例如，处理记录的图象可包括基于记录的图象和对 靶化合物的发射光谱来构建深部组织图象。此外，处理记录的图象可包括基 于记录的图象、对靶化合物的发射光谱，和对样品中的其他成分的至少一发 射光谱来构建深部组织图象。
多个不同光谱加权函数可包括四个或更多光谱加权函数。
除非另外限定，此处所用的所有技术和科学术语具有本发明所属的领域 中的技术人员通常所理解的相同意思。此处的所有出版物、专利申请、专利 和其他参考文献都全部合并与此作为参考。在相冲突的情形中，以本说明书， 包括定义为准。
从下面的详细描述中，本发明的其他特征、目的和优点将会变得显而易 见。
附图说明
参考附图，现在仅作为示例来进一步描述本发明。
图1示出光谱成象系统的示意图。
图2示出老鼠在λ＝503nm单一光谱波段上成象的图象，该老鼠被植入 被荧光标记的肿瘤。
图3示出对图2的样品的自发荧光的发射光谱和靶化合物的估量的发射 光谱的图示，浅颜色的线标示对自发荧光的光谱而深颜色的线标示对靶化合 物的估量光谱。
图4A和4B为分别示出被用作光谱端项的光谱不混合操作的结果测得 的老鼠自发荧光信号光谱和在肿瘤的区域上检测的混合的信号光谱的图象。
图5示出形成图象立方体的一组图象。
图6示出来自图2的老鼠的靶化合物发射的图象，使用光谱技术和被估 计出来以及被直接测得的端项光谱，来除去自发荧光信号。
图7示出来自图2的老鼠的自发荧光发射的图象，使用光谱技术和被估 计出来以及被直接测得的端项光谱，来分离靶化合物发射。
图8示出基于光谱立方体的获得和随后通过线性不混合的分析的，一实 施例的流程图。
图9示出在图8的实施例中的每个光谱波段的光谱特性的图示。
图10示出又一实施例的流程图，其中用干涉法完成光谱滤波。
图11示出在图10的实施例中所用的光谱加权的光谱特性的图示。在各 个图中的相同附图标记标示相同的元件。
图12示出另一实施例的流程图，其中结合光谱成分分解来估量自发荧 光和靶化合物的光谱。
图13A、13B和13C示出典型无生命科学端项检测算法产生的示例性的 图象组分丰度图象。
图14A、14B和14C示出由无监督重复剩余技术产生的输出图象。
图15A和15B示出由监督重复剩余技术产生的输出图象。
图16示出用于引出光谱矢量的流程图。
图17示出光谱成象系统的示意图。

概论
本发明特征在于方法和装置，其用于通过光谱识别来降低在生物样品 (包括在样品中的深部组织)中的靶化合物的检测灵敏度水平。这涉及测量 关于从样品中的每个多重空间位置来的光线的光谱解析信息。有时，数据被 称作是“图象立方体”，光谱解析信息对应沿立方体的一个维度上的值以及 空间位置(或象素)对应立方体的另外两个维度。尽管用于深部组织成象典 型为低光线水平，可以获得有益的结果。此外，公开了用于处理光谱解析图 象数据的算法，其不仅对深部组织成象有用而且对处理一般的生物样品的光 谱解析图象数据也有用。在一些情况中，可以以高度自动化的方式来进行处 理，有很少或没有用户控制，同时对生物样品的一个或更多选定成分仍然产 生精确的图象。
光谱成象技术(例如荧光成象)可以和样品一起使用，该样品用荧光标 签标记或者被基因修改从而一个或更多靶化合物发出荧光或者真是靶的那 些发出荧光。这种来自一个或更多靶化合物的荧光叫做“靶荧光”。然而， 除了例如靶化合物这样的成分，样品可包括其他成分，其每一个按照对应的 发射光谱发出辐射。例如在样品中可以有其他成分或材料，其没被标记或者 没被基因修改，其也可以在某些水平上发出荧光。这种未知的及/或背景荧光 叫做“自发荧光”。
这种自发荧光干扰对靶荧光的定量测量，在一些情况中，可以比靶荧光 亮很多倍。一些所关心的特殊应用是在生命科学上，包括活体内荧光成象及 荧光显微镜法；然而，这里描述的技术在例如在明视场显微镜法的其他应用 中也有效。自发荧光也可包括其他光谱标记例如设备光谱响应，或者从其他 成分或者在传输的光线(例如明视场)应用中的chromaphores的吸收。此外， 有多重成分，其每一个产生不同的自发荧光光谱。
典型地，自发荧光具有不同于靶荧光发射光谱的发射光谱，提供一个机 会以应用光谱不混合技术以在被检测的图象立方体中的一象素处在每个测 得的信号光谱中将靶荧光与自发荧光分开。换句话说，信号光谱可以被分解 为来自靶荧光和自发荧光的单独贡献。这种光谱不混合通过去除测得信号可 对自发荧光作出贡献的部分，对样品的被标记的或被基因修改的部分产生高 对比的图象。在一些情况中，一种以上的成分被标记或修改，目的是产生多 重图象，其表示与自发荧光及其他靶化合物隔开的每种靶化合物的浓度。
为了精确地应用光谱不混合工具，获得每个靶化合物及每个可能对整个 的测得的光谱作出贡献的自发荧光成分的纯粹发射光谱是有用的。所知道的 这些成分光谱的光谱形状越精确，就可以越精确地将在图象立方体中的混合 信号光谱不混合或分解以产生表现靶化合物及/或自发荧光成分的数量的单 独的图象。对给定成分的纯粹发射光谱是信号光谱，其只要该成分对测得的 光线作出贡献，例如，如果该成分被从其他成分隔开，它就会被测量。
然而，靶化合物光谱很少会以它们的纯粹形式出现在测得的图象立方体 的给定象素处的信号光谱内。在一些情况中，可以使用各种荧光标签的公布 光谱。在这些情形中为了有精确的结果，应在使用的系统以及光谱最初被测 量的系统之外校准系统的响应。另一种获得来自每个靶化合物的光谱的方法 是将每个靶化合物单独隔绝并在要用于后面的活体内实验的同一系统上收 集每一个的光谱。然而，对靶化合物的这种隔绝经常是行不通的。而且，当 标签在活体样品内时，由标签产生的光谱经常改变，使从与活体内样品隔绝 的靶化合物收集的光谱不准确。
在一些情况中，在样品的现有状态中处理它，而没有对出现在从样品获 得的图象立方体的信号光谱中的成分光谱有先验了解是有用的。因此能够基 于图象立方体数据精确确定单独的成分光谱是有用的，从而可以完成光谱不 混合以及可以产生单独的靶化合物的图象。下面描述的技术，象“剩余技术”， 由于下面要更具体描述的所涉及的成分光谱的典型特征，而特别适用于生物 样品。
下面描述的这些技术的另一有用的方面是它们与自动化技术的兼容性。 例如，在一些实现过程中，不是必须要有一个使用者基于专业知识来直观确 定在图象中的特征。在其他的实现过程中，非熟练的使用者可以基于开始的 自动化的步骤而提供反馈。
成象系统
在图1中示出用于对生物样品成象的光谱成象系统100的示意图。系统 100包括适于固持样本112的样品架110。例如样本112可以是活的有机体， 例如动物或哺乳动物。靶化合物与样本112中的组织(例如深部组织)的选 定部分相联(绑上去或堆积在上面)。照明器120(例如金属卤化物灯或者其 他灯、激光、发光二极管阵列或者其他电磁辐射源)将激发光122指向样本 112以从组织中的靶化合物激发出发射(例如荧光)。典型地，激发光也会导 致从样本112中的其他成分发出自发荧光。因此，从样本112发出的电磁辐 射130包括来自靶化合物以及自发荧光的发射。发出的辐射130被成象系统 140收集并成象在照相机150上。
因为系统100设计为能够对在较大样本(例如活的有机体)中的深部组 织成象，典型地，成象系统提供一或更大，或者甚至二或更大的缩小率。就 是说，在照相机上的图象是相同尺寸或小于对成象系统的物体视场。还有， 典型地，对成象系统的物体视场在对角线尺寸上大于约2cm(或大于约3 cm)。
另外，虽然图1示出发出的辐射130是被从样本112相对于激发光122 的相反一侧来收集，在其他实施例中，发出的辐射可以从激发光照明的相同 的一侧或者成一定角度，来被收集。此外，可以从样本112的多个侧面提供 照明。
安置在样本112和照相机150之间的是可调光学滤波器模块160(例如 液晶可调光学滤波器、干涉光学滤波器或者电动滤波器轮)。光学滤波器模 块160按照多个光谱加权函数(例如四个或更多光谱加权函数)的每一个对 发出的辐射130进行光谱滤波。光谱加权函数可对应特定的波长波段，或者 可以是更复杂的函数例如通过波段的正弦分布。光学滤波器模块160也可以 光学上包括其他滤波器包括例如，减少能进入照相机150的激发光122的量 的滤波器。照相机150对不同光谱加权函数的每一个都记录被光谱滤波的发 出辐射170的图象，并将图象数据送到计算机180以用于分析。如下面要更 具体描述的那样，计算机基于不同的光谱加权函数、对应纯粹的靶化合物的 一个或更多发射光谱，样本112中一个或更多其他成分的纯粹自发荧光，或 两者，来处理图象数据，以构建一个抑制自发荧光信号以显露出靶化合物的 图象。
在一些实现过程中，系统100的一部分(例如系统100在照明器120和 照相机150之间的部分，照明器和照相机也包括在内)可选择为装入在外壳 190中，例如以减小能被成象到照相机150上或者能与样本相互影响的杂散 光(例如室内光线)的数量。
光谱成象技术
在下面，我们描述对生物样品的光谱成象的背景、包括深部组织成象的 特定实施例，以及用于构建图象的光谱不混合技术。
信号强度
通过靶化合物的生物样品(特别是在深部组织样品)中的成象结构的一 个特点是光学信号较弱。因此，许多专业人员把主要的重要性放在检测器的 特性、在光路中的所有元件例如透镜和用于阻挡激发光到达检测器的阻挡滤 波器的效率上面。然而当现有技术的CCD检测器等等适于检测低水平光线 信号时，它不能充分解决在由靶化合物发出的光线和来自其他源例如自发荧 光的光线之间进行识别的问题。这样，一个人的实际上的检测水平可以由使 从样本内其他位置产生的光线混淆的水平来设定，而不是考虑在他的检测器 中的读出噪音，或者物镜的光收集能力。
说得更准确一些，一个人的检测限制可以看作是，一个人的检测器噪音 或者向检测器展现出的混淆信号流量较大；在任何一种情况中可表达为同样 的在样本中产生在检测器上的该信号水平的光线的靶化合物的浓度。
除非靶化合物发出的光线凌驾于样本中的所有其他源，技术人员经常要 受到混淆信号而不是他的检测装置的限制。在生物样品中一些水平的自发荧 光是固有的，当它们被可见范围的光照明，特别是当光线是绿色(550nm) 或更短时。因此即使使用最优的靶化合物，出现在样本表面处或其附近的自 发荧光也经常限定了检测界限。
另外，来自深部组织内的靶化合物的发射在它从发射的位置传播到样本 的表面时，会被散射或吸收衰减。因而到达成象系统的信号水平减小，而在 样本的表面层产生的光线则不会被类似地那样衰减。这种效果的具体情况取 决于样品样本相对于收集光学装置的几何形状，以及样品的光学特性。
同样的，照明光线在它从照明源通过样本的表面层沿其路线到达要成象 的结构时可能被减弱或散射。到达靶位置的激发信号被减弱，而在样本的表 面处产生的信号则不会类似地减弱。这一点的具体情况取决于照明和收集光 学装置的几何形状，以及样品样本的光学特性。
这些因素通过增大自发荧光发射对测得的信号与来自靶化合物的发射 相比的相对贡献，会加重自发荧光的效果。
问题的程度由图2示出，其是来自老鼠的自发荧光发射的图象。用约480 nm的光线照明老鼠，发射光线被中心在530nm的25nm带通滤波器滤波。 在老鼠的肺中有用绿色荧光蛋白(GFP)表达的肿瘤。然而，由于来自广泛 的明显产生在老鼠的皮肤层中的自发荧光的相等或更大的信号，不容易在图 象中识别该肿瘤。结果是，当能容易地量化图象中的任何点处的信号水平时， 由于设定了与涉及的靶化合物相比相同或更高的检测阈值的高水平的背景 自发荧光，而不能证实靶化合物及因此肿瘤的存在。
自发荧光也可以从样本到样本而改变，并是不可预测的。因而，如果绝 对通量水平用于对靶化合物进行估算，技术人员会得到错误的积极读数。差 异可以从例如在样本外皮上的霉菌或疾病这样的因素而产生。这些通常在样 本之间并不是一致的。因此，如果技术人员通过将在给定区域的局部信号水 平与样本的平均水平相比较来寻求检测处靶化合物的存在，结果也是不可靠 的。
光谱串扰
在某些情况中有可能通过对照明波长的选择来减少自发荧光。如本领域 已知的那样，一般使用较长的波长来照明是有利的，因为它们通常产生较少 的自发荧光。同样，选择发射光线出现在与样本的自发荧光范围不同的波长 处的靶化合物是有利的。然而，通常不可能选择一种照明波长使得没有串扰。 在图3示出的例子中，靶化合物、GFP(由深色阴影线表示的)及自发荧光 (由浅色阴影线表示的)发射光谱相重叠。在任何靶化合物具有实质发射的 波长处，自发荧光也较强，因而不能通过使用固定的光学滤波器或其他类似 的东西来消除自发荧光。也没有彩色照相机能在两个如此相似的绿色光谱之 间进行识别。
然而如图3所示，GFP和自发荧光发射的光谱仍然是不同的。因此光谱 成象方法可以识别这两者并消除或显著减小后者信号的贡献。
光谱不混合
一种用于将每个象素的信号光谱分成它的成分光谱的工具是线性分解 或不混合。例如，技术人员可以完成最小二次方最佳拟合趋近以确定需要多 少每个单独的成分光谱以最精确地重建测得的信号光谱。
光谱不混合使用一组输入光谱以在测得的图象立方体中表现成分光谱。 典型地，输入光谱为对不同成分的纯粹光谱的估量。如果不能从库中得到成 分光谱或者还没有从隔绝的材料中收集成分光谱的话，一种为不混合提供输 入光谱的方法是，假定每个单独的成分光谱可以用在图象立方体中的象素或 象素群的光谱来表达。
然而，典型地，这种方法对至少一个或更多纯粹光谱产生较弱的估量。 例如，靶荧光成分很少单独存在，与自发荧光成分分开，在图象立方体的隔 绝区域内。对其中出现靶化合物的象素区域的信号光谱通常是成分光谱的混 合。因此，如果技术人员基于这样的区域对靶成分之一的纯粹光谱估量，不 混合会较弱-它表达与混合成分光谱相关的化合物的混合。
同样，在某些情况中，为了在图象立方体内精确地分配测得的信号，难 以先验知道在样品中存在多少实际的荧光成分(每一种与对应的成分光谱有 关)。如果在不混合期间一些成分光谱没有被表现出来，那么剩余成分的相 对比率就无法精确确定。
在一些情况中，手工选择从哪里选择输入光谱和选择多少输入光谱来不 混合可以起作用，如果使用者基于专业的知识及/或经验给出有根据的推测的 话。一些使用者可以以这种方式有效地工作，如果它们具有明显的对该样品 的先验知识的话。
在图4A和4B中示出了这些方法的缺陷的一个好的例子。在图2的图 象中，一个熟练的使用者可以模糊地辨识处一个肺应该大致位于的区域(在 对应彩色图象中的偏蓝色调)。对未经训练的视力，这种由肿瘤导致的不规 则性是感觉不到的。如果一个人使用来自周围区域的信号光谱作为输入光谱 以表现自发荧光，及来自看起来象肿瘤的区域的信号光谱作为输入光谱来表 现靶荧光，并使用这些输入光谱完成不混合，他会得到图4A和4B中的图 象。图4A是光谱上最接近类似对应于确定为自发荧光的区域的象素的视场 部分的图象。图4B是光谱上最接近类似对应于确定为肿瘤的区域的象素的 视场部分的图象。与肿瘤有关的区域被很好地限定出来。然而，该图象有一 些问题。例如，留在自发荧光图象中的“孔”(图4A)，表明从这一区域发 出的光量子被不精确地分配到标记肿瘤的图象上。
如果一个人象测量靶荧光的量作为肿瘤的尺寸的估量，这种串扰会导致 明显的错误(例如，测得的大小大于实际的靶荧光)。在这个例子中出现这 个错误是因为，即使用于表现自发荧光的输入光谱主要是自发荧光，由于靶 化合物和自发荧光材料是共同定位，表现肿瘤的输入光谱是靶荧光和自发荧 光的混合。为了在这个例子中正确的完成不混合，不仅输入自发荧光光谱应 该是“纯粹的”，而且输入靶荧光光谱也应该是“纯粹的”(例如没有与相当 数量的其他成分光谱，在这个情形中为自发荧光，相混合)。
用纯粹光谱不混合
即使在一些样品中，一种成分光谱可能没有以其“纯粹”的形式(即基 本不混合的形式，例如与小于约10％的其他成分或优选小于约1％的其他成 分相混合，)表现在任何象素的信号光谱中，在某些情况中仍然可以从图象 立方体数据获得对纯粹成分光谱的估量以用作不混合的输入光谱。例如在某 些情况中，一种成分光谱(例如对应自发荧光)，其识别为光谱A，可以以 “纯粹”的形式得到(例如，从一象素的信号光谱或从其他已知的或能得到 的方面)。而另一种成分光谱，其识别为光谱B，可能不能以“纯粹”形式 得到。在这种情况中，如果光谱B在图象立方体中表现为在一个或更多能被 识别的象素中仅与光谱A混合，那么可以从该“A+B”混合的光谱中减去光 谱A以获得B的纯粹光谱。下面进一步描述用于从图象立方体精确估量纯 粹光谱的技术。但首先，我们描述一个例子，其中将图象立方体光谱不混合 或分解成为来自对样品的不同成分的纯粹光谱的估量的贡献被成功地使用， 以对在深部组织样品中的靶成分成象。
在此示例中，样本受到照明而照明光线被阻止进入检测器。这一点可以 一起使用例如来自Lighttools Research(Encinitas加利福尼亚)的LT-9500 MSYS的照明器与透射所有大致为λ＞510nm的光线的长通光学滤波器，其 安置在物方路径上，来实现。
光谱成象检测器包括一带有55mm F/2.8的Nikkor微距镜头(Nikon USA，Melville纽约)的QImaging 1300C数码冷却CCD照相机(Roper Scientific，Trenton新泽西)，其中一个VARISPEC可调光学滤波器(CRI Inc， Woburn马萨诸塞)以安装适配器耦合到其上。该VARISPEC滤波器为计算 机控制的光学滤波器，具有25nm带通和可调的中心波长。这些被连接到一 个IBM Thinkpad计算机上，其控制图象的获取并完成数据的分析。通讯是 通过到照相机上的IEEE-1394接口，以及到VARISPEC滤波器上的RS-232 接口。
VARISPEC滤波器使用向列液晶可变延迟元件来构建可调Lyot滤波器。 可变延迟器放在具有石英或其他材料的固定波板的光学系列中，以产生熟知 的且电学可调的延迟。在滤波器的连续节之间的线偏振器作用是阻止不想要 的阶这样仅有单一的峰被透过，如果希望的话，带外的泄漏可以被减小到 0.01％。通过选择延迟器的厚度，技术人员可以获得从0.1nm到50nm或更 高范围的带宽。调节动作是极快的(＜50ms)并且不会由于调节引起图象偏 移，这对于成象应用是很有价值的。
参考图5，图2的老鼠的成象是通过取得一系列的图象S(x，y，λi)(对i ＝1到n，光谱谱集的数量)，其每一个被使用由VARISPEC滤波器决定的光 谱加权函数Ii来记录，而VARISPEC滤波器的中心波长被从500nm调到650 nm。在图5中的这一系列图象是光谱图象立方体500的例子。在图9中示出 了不同的光谱加权函数(在此情况中，光谱通带)。结果是一个图象立方体 500，其具有对于给定中心波长λi的样品的全部的二维图象以及在图象的给 定象素(x，y)处的全部光谱。在给定象素处记录的精确的光谱取决于GFP 和自发荧光的数量，以及两个光谱，如下：
S(x，y，λ)＝a(x，y)*F(λ)+b(x，y)*G(λ)    [1]
其中(x，y)标记用于表示在图象中一给定的象素位置，星号*表示乘，λ用 于表示发射或检测的给定波长(波长波段)，及
S(x，y，λ)表示对给定象素位置和波长的净信号，
F(λ)表示自发荧光的发射光谱，
G(λ)表示GFP的发射光谱，
a(x，y)表示在给定的(x，y)象素位置的自发荧光的丰度，及
b(x，y)表示在给定的(x，y)象素位置的GFP的丰度。
方程[1]表明来自给定象素位置的净信号是两个贡献之和，由出现的自发 荧光和GFP的相对数量来加权。如果技术人员对一个单个的象素来写上面 的方程的话，可以看得更容易：
S(λ)＝aF(λ)+bG(λ)    [2]
F和G可以称作是系统的光谱本征态，因为它们对应根据自发荧光和GFP 发射的量合并成不同的数量的自发荧光和GFP发射的纯粹光谱，以产生观 测到的光谱或信号光谱S。这样，信号光谱为与来自自发荧光和GFP发射的 单独贡献相对应的加权叠加。
现在如果知道(或可以推导出，如下所述)自发荧光和GFP的发射光 谱，技术人员可以用线性代数对方程[2]求逆以求解a和b，假如光谱S具有 至少两项在其中；即，技术人员具有对至少两个发射波长λ的数据。方程[2] 可以被重写成S＝EA。那么我们可以写出
A＝E-1S    [3]
其中
A是带有分量a和b的列向量，而
E是其列为光谱本征态的矩阵，即[FG]。
使用方程[3]，技术人员可以获得观察到的信号光谱并计算在对应的象素 位置上的自发荧光和GFP源(例如产生自发荧光和GFP发光的成分)的丰 度。可以对图象中的每个象素重复这一过程，以产生没有来自自发荧光的贡 献的GFP的图象。结果是，检测水平被极大地提高。
请注意到对给定的一组自发荧光和靶化合物光谱矩阵E仅需要被求逆 一次，因此丰度的计算并不繁重，几乎可以容易地由个人电脑实时完成。
在分别呈现出对GFP和自发荧光的丰度图象的图6和7中，示出了此 光谱不混合处理的结果。如图6所示，一旦将GFP与自发荧光分开就能容 易地检测它。在GFP图象中改进的程度是惊人的。同样，能够看到自发荧 光图象(图7)是平滑的并在出现GFP的区域上未受影响，其与这样的事实 相一致，即在深部组织结构中出现的GFP不会改变从皮肤的上覆区域来的 自发荧光发光的数量。
在图8中将示例性的测量和分析过程从头到尾以结构图示出。准备和照 明样本(步骤805)以及确定要获得的光谱波段(步骤810)。然后光谱滤波 器被设定为透过光谱加权函数Ii，例如特定的波长波段(步骤815)，并获得 与该光谱加权函数相对应的图象(步骤820)。然后光谱滤波器被设定到下一 个光谱加权函数并获得对应的图象，直到获得所有波段的(步骤825和830)。 然后提供或从其他方面确定对靶化合物和自发荧光的光谱(步骤835)。基于 该光谱，产生矩阵E并确定它的逆矩阵(步骤840)。对每个图象象素，由 该系列得到的图象限定的信号光谱然后被乘以E的逆矩阵(步骤845)以产 僧靶化合物的丰度图象，即样品图象(步骤850)。
在这个例子中，光谱成象允许观察位于活的有机体约2mm内的组织中 的结构，其中上覆的皮肤至少为300微米厚并具有明显的自发荧光。光谱成 象也可以用于对其他样本在不同深度下的结构成象，样本包括非哺乳动物样 本，例如斑马鱼。在后者中，样本身体较薄，但再一次存在来自样本的其他 层的自发荧光的问题，其混淆对样本的内部的靶化合物的检测。尽管有用于 深度剖断的光学技术，例如共焦显微镜方法，此处描述的光谱成象技术提供 一种简单而实用的选择。
在红外范围600-1100nm中操作的实施例也可以使用近红外VARISPEC 滤波器例如VIS-NIR2-10-20HC型来构建。
这些技术中不会有什么会防止技术人员观看每个样本的多重靶化合物 (例如m靶化合物)。如果我们将光谱谱集的数目标记为n，矩阵E称为n ×m矩阵而不是在上面的例子中所用的n×2矩阵。因而，技术人员可以使 用这些技术从包含两个靶化合物的样品中去掉自发荧光；或者从带有一个或 更多靶化合物的样品中去掉两种类型的自发荧光。在任何情况中，结果是靶 化合物与自发荧光隔绝，以及能够量化这些成分的一个或全部。
对能够被隔绝的成分的数量以及对总体的信噪比的限制，由散粒噪声水 平和在被辨别的样本的发射光谱(包括自发荧光)之间光谱区分程度给出。 技术人员可以用光谱角距离θ描述在两个光谱之间的相关程度，θ定义为
θ＝arccos[(S1·S2)/(|S1||S2|)]    [4]
对两个分量的θ较小的光谱集不容易被分成它们的成分。物理上，对这 一点的原因是容易理解的：如果两个光谱仅在边缘上不同，更难以确定哪个 类型出现了，而噪音可以轻易地改变技术人员对相对丰度的估量。象θ一样 的标注可用于帮助决定什么光谱波段适于测量，而技术人员可以尽可能地尝 试和选择产生较大θ的波段。或者，技术人员可以通过实验和错误，作一个 什么波段产生最大分离的经验性研究。为了降低对来自预期形状的轻微光谱 偏移的灵敏度，其由于在样本等之间的差异该偏移是可能发生的，包括比看 起来单独从数学分析所需要的更多的波段会是有帮助的。
一般，对样品中的每个空间位置(即象素)测得的信号光谱和用于不混 合的纯粹光谱的估量，典型地，应包括足够的数值以提供对所关心的成分的 精确信息。例如，对一两个成分的样品分析，优选有至少三个值(或者更优 选，四个或更多值)对应不同的光谱加权函数(例如不同的光谱波段)。当 成分的数目增大时，对信号和纯粹光谱的数值的数量应该也增加。
在上面的实施例中考虑测量装置的光学效率是值得的，以理解这些技术 提供的可能改进来自哪里。首先，使用的镜头是F/2.8型而不是对于这种工 作更典型的F/1.2或F/1.8，这一选择导致2.4-5.4×的更少的光线收集。接着， VARISPEC滤波器具有约25％的透射，并收集25nm范围，和具有80％透 射和收集40nm范围的典型干涉滤波器形成对比。比起可能用于此项工作的 设备来说，这进一步使灵敏度降低了5.1×的因子，比起本领域的一些可选 择方案在光通量上的总体的减少为12.3×-27.8×。
CCD照相机被冷却在周围环境以下25°到约0℃，这对普通的CCD传 感器来说是典型的，而不象在例如来自Roper Scientific(Trenton，新泽西) 的ChemiPro系统的成象工作站中所用的传感器，其用液氮冷却以达到比周 围低100℃或更低的温度。
如这些所显出的那样，这些技术的有效不是来自在聚集或收集光线的极 端效率上；而是其来自使用光谱选择性以识别和去掉背景自发荧光的效果。
在其他实施例中，光谱加权函数可以与通带不同。重要的是不同图象的 光谱加权不同。例如，技术人员可以使用干涉仪来获取光谱信息，如图10 中以方块图形式示出那样。干涉仪对路径差异Z的一些选定值的光谱响应在 图11中示出。这样获得的图象可以用于实行本发明，或是直接地或是在从 干涉图转变到光谱之后。使用干涉图的适用性可以通过看它们在涉及种类之 间的辨识有多好来检验，其可以由例如cosθ这样的测量或由实验研究来决 定。
图10的方块图与图8中的类似，除了：步骤815、820、825和830由 相应的步骤1015、1020、1025和1030代替，其使用干涉图而不是特定光谱 波段作为光谱加权函数；有一个可选择步骤1032其描述将光谱滤波后的图 象傅立叶变换以产生光谱立方体；而步骤835被步骤1035代替，其与获得 的数据的形式相一致(及可选择的傅立叶变换)决定对靶化合物和自发荧光 的光谱或干涉图加权，用于产生矩阵E。
干涉仪可以是机械类型的例如Sagnac设计，或者它可以是如美国专利 6421131“双折射干涉仪”所描述的双折射干涉仪。后者使用固定的延迟元 件例如石英板，与切换装置一起，以使延迟器彼此相加或抵消，从而使用这 些元件，连同可变延迟元件，技术人员可以在较宽范围内产生任何想要的延 迟。当偏振光遇到该组合件，它的偏振状态以依赖于光线波长的方式而改变， 而这一点可以在出口的分析器检偏器上检测出来。在干涉仪的任何特定设定 上的光谱响应是在1/λ的正弦曲线，在允许离散之后。通过在已知的延迟值 上取一系列读数，并完成傅立叶变换，可以确定光线的光谱。这样的装置可 用在成象系统中以在图象中的每个点上获得一光谱，或者只是获得一组图 象，而不同的正弦曲线光谱响应函数在该组的组成项中。
一般地说，任何光谱成象装置都可以使用，假如它产生足够的光谱信息 以区别靶化合物和背景自发荧光的发射的话。
精确估量纯粹光谱
我们现在转到，怎样确定在上面的例子中的纯粹光谱F和G，以及更广 泛地，怎样首先精确估量纯粹光谱以用于在将信号光谱分解(即不混合)成 它们的成分光谱的问题上。图12示出在光谱不混合技术的方块图形式中的 步骤，其中技术人员估量纯粹光谱以用作在光谱不混合中的输入光谱。该步 骤有时叫作光谱成分分解以获得纯粹的输入光谱。其不应与在每个象素上的 信号光谱被分解(或不混合)成在不混合中的纯粹输入光谱的相对贡献相混 淆。该方块图与图8中的类似，除了步骤835被替代为，完成光谱成分分解 (步骤1235)和确定对应自发荧光和靶化合物的本征量(步骤1237)以用 在步骤840中的矩阵E中。
通常，可以使用任何产生所涉及光谱的适当估量的方法。对于一些靶化 合物，从出版的参考文献上有对该材料的已知光谱。可选择的，使用如此处 描述的光谱成象工作站，技术人员可以通过放置包含足够浓度的靶化合物的 样品在成象仪前并取得它的光谱而直接获得光谱。相反地，经常可以对技术 人员具有先验知识的样本一个区域成象，在那个区域上没有靶化合物，以这 种方式，技术人员可以获得对该成分的估量。多种数据分析技术可以被用在 对光谱不混合的成分光谱的确定当中，例如主要成分分析(PCA)，其从图 象立方体中识别最正交的光谱本征量，并产生分数图象示出在遍及图象中的 每个本征量的加权。如果在一个包含来自靶化合物和来自背景自发荧光的贡 献的图象上完成PCA分析，从PCA来的矢量可以被用于提出对所涉及光谱 的估量。
这些可以结合其他数学处理来实现，并且有其他已知的的用于识别低维 光谱矢量的方法，例如投影追踪，一种在L.Jimenez和D.Landgrebe， “Hyperspectral Data Analysis and Feature Reduction Via Projection Pursuit”， IEEE Transactions on Geoscience and Remote Sensing，Vol.37 No.6， pp2653-2667，1999年11月描述的技术。其他技术包括，例如独立成分分析 (ICA)，投影追踪和端项检测算法。
这些技术典型地并不很好地适合在生命科学中的应用。例如，一些技术 被最优化以用于给包含带有密集光谱形状的边界明确的窄峰的光谱的光谱 成象数据集。在一些技术中，比起用于分析的单独的光谱特征和峰，光谱范 围较大。然后，峰的出现，或者峰的比率可以被用于给要分开的“端项”分 类。不幸的，在生物学样品中的成分通常不具有这样的边界明确的窄峰。
对一些技术的另一问题是，它们输出与在原始图象立方体某处以纯粹形 式出现的光谱有关的图象。在生命科学的许多情况中，在图象立方体中出现 的信号光谱是成分的混合。在老鼠中的被标记的肿瘤情况中，不太可能发现 在老鼠上有存在肿瘤而没有自发荧光这样的位置。如果所关心的成分没有在 原始图象立方体的某处上为纯粹的形式，那么这些技术不太可能会输出准确 表现所关心成分的丰度的图象。
有一些技术，有时叫“凸壳”算法，其在即使端项没有以纯粹形式存在 于图象时也估量真实的端项，但是效果取决于在图象立方体中的信号光谱离 端项有多近。
对一些技术的另一问题是它们仅工作在非监督的方式下，这使得用从样 品的知识中得到的信息来指引它们到正确的方向上的机会更小。
当这些技术的大多数被用于生命科学的样品，代表成分的丰度的输出图 象经常不与已知的样品的生理或解剖特征密切相关。一些技术在某些情况下 工作地很好，而其他技术在其他情况下工作地很好。
在凸13A、13B和13C中示出的是由典型的无生命科学(例如遥感)端 项检测算法基于对图2的老鼠的图象立方体产生的示例性的成分丰度图象。 请注意到没有输出图象看起来刚好对应肿瘤或者刚好对应皮肤中的自发荧 光。
在生命科学中，以及在特定的荧光应用中，光谱特征是宽广和平滑的， 经常横越检测的光谱范围的大部分。通常，所关心的成分光谱、靶荧光，示 出为对经常更大和压倒性的自发荧光信号的更改。用于分析样品和决定成分 的关键信息在于对高度重叠的光谱成分的单独的检测和定量。获得这样的信 息更适于能够在光谱形状中实行细微偏移的技术。更适合生命科学的技术应 该首先善于抛弃最大的成分，自发荧光，然后精确分离和量化更小的重叠的 光谱成分。这些特性与无生命科学(例如遥感)的应用的那些有明显的不同。
我们已经发现，一种对精确估量深部组织成象的纯粹光谱起作用的方法 是，对较容易获得的一个成分的纯粹光谱使用一个估量并使用它帮助从两个 成分都出现的图象立方体中的数据中显露出另一成分的纯粹光谱。这一点的 实行包括计算剩余光谱技术，其将在下面被更详细地描述。
剩余技术
一些用于降低自发荧光并没有对靶化合物光谱有先验知识的技术包括， 考虑对给定象素的信号光谱S(λ)，从它减去自发荧光F(λ)的最大量同时使剩 余的信号在所有光谱波导中是正定的。就是说，技术人员对每个象素定义一 个所谓的剩余光谱Ra(λ)：
Ra(λ)＝S(λ)-aF(λ)    [5a]
然后选择参数a的最大值与具有在每个光谱波道中的非负值的Ra(λ)相一致。 然后得到的光谱Ra(λ)被用作擦去了自发荧光的信号光谱。技术人员也可以 不基于上面列举的严格的非负准则，而是合并小的负的分布的一些相关准则 来进行对参数“a”的确定，以考虑对例如散粒噪声或检测器噪声的这样的 因素。用于去掉自发荧光光谱的最大数量的最优化准则的另外的例子包括使 用不同的误差函数，下面会更详细地描述其中的一些。
可选择的，技术人员可以寻求当靶化合物的发射光谱是已知而自发荧光 光谱是未知的时候通过类似的方法，通过寻求从S(λ)中减去与正的剩余相一 致的靶发光G(λ)的最大数量，然后汇报在每个象素上减去的数量作为靶化合 物的图象，来确定靶化合物的分布。在这种情况中，给出对每个象素的剩余 光谱Rb(λ)如下：
Rb(λ)＝S(λ)-bG(λ)    [5b]
其中技术人员选择参数b的最大值与在每个光谱波道中具有非负值的Rb(λ) 相一致。
另外，上面描述的与方程5a和5b有关的剩余技术可以被扩展到已知样 品的一个或更多额外成分的光谱且技术人员想要去掉它们对信号的贡献时 的情况。在这种情况中，剩余光谱被重写以基于该额外光谱并符合在每个光 谱波道中正的剩余，从观察到的信号中减去每个这样的成分的贡献。
剩余技术假定提供了对成分光谱至少其中之一的初始估量。其可以通过 前面的知识或测量而提供，或者其可基于图象立方体数据本身而确定。在后 面的情况中，其可以由用户的引导(即监督技术)或者没有用户的引导(即 无监督技术)而确定。例如使用者可以能够识别光谱图象立方体的其中一个 成分名义上被隔绝的至少一个区域，由此从在该区域的数据上确定对该成分 的纯粹光谱(例如，通过平均来自在该区域的象素的信号光谱)。在另一例 子中，没有用户的引导，可以假定因为自发荧光会主宰图象立方体中的光谱 信息，技术人员可以只是简单地平均在每个象素中的光谱信息以确定对自发 荧光的纯粹光谱的估量。
此外，可以在一个、一些或所有象素上计算剩余光谱。例如，在上面描 述的两个成分的情况中，可以从每个象素中的剩余光谱直接构建深部组织图 象，其现在假定为仅与靶化合物相关。然而，在其他例子中，可以对仅一个 或一些象素计算剩余光谱作为用于估量纯粹光谱的更复杂的处理的一部分。 另外，剩余技术可以应用到从图象立方体中获得的预处理数据集上。例如， 来自图象立方体中一些或所有象素的信号光谱可以被平均以产生随后剩余 技术被应用的已处理信号光谱。
下面的同样涉及计算剩余光谱更详细的技术，说明这些各种各样的可能 性。这些技术即使对表现更难的样品的图象立方体也能起作用，这些样品是 技术人员在荧光体内成象、荧光显微镜方法和明视场显微镜方法中会遇到 的。
剩余技术的更具体的例子
步骤1：确定成分的数量
在用于获得纯粹光谱的一些技术中第一个步骤是确定在给定样品中出 现了多少成分。一些剩余技术包括一自动步骤以描画或识别样品中的表现出 或显示出很可能是单独的成分的位置的区域。
剩余技术能够无监督操作，或者用使用者提供的光谱作为起点。在无监 督模式中，第一迭代使用在图象立方体中的所有信号光谱的平均值作为要被 减去的第一“光谱矢量”。在每个象素上完成最优拟合近似以确定能向光谱 矢量分配的象素的信号光谱的数量。然后这个数量的光谱矢量被从图象立方 体中减去，并产生表现被减去的数量的成分图象。在随后的迭代中，假定最 高强度的区域(在减去后)为下一个光谱最纯粹成分并使用这些区域以获得 下一个光谱矢量。(在一象素位置处的“强度”由对在该象素处所有波长的 信号光谱求积分来计算。)被完成的减去光谱矢量的迭代次数可以被预先指 定，或者可以继续下去知道剩下的剩余信号的量减少到指定百分比以下。
这种方法具有这样的优点即，“剥离”并放入到单独的成分图象中的光 谱差异经常是非常接近来自成分的纯粹光谱。在并非是这样的情况中，一些 使用者输入可能能够引导它。例如，如果第一光谱矢量是整个图象立方体的 平均光谱并且并不接近成分光谱之一，这种情况对例如用剃光的老鼠而不是 裸鼠时可能会发生，那么使用者可以在图象中指向应该是自发荧光的那里， 而处理可以使用它作为第一光谱矢量。
图14A、14B和14C示出由在对图2的老鼠的图象立方体上的由上述的 无监督迭代剩余技术产生的输出图象。请注意到这些第一三个成分对应解剖 上有意义的特征-来自皮肤的自发荧光图象(图14A)、来自毛囊周围皮脂 的自发荧光图象(图14B)，及来自其他成分的相对较低信号的被标记的肿 瘤图象(图14C)。
这种光谱成分分解技术在用于提供成分图象其向使用者表示出最有意 义的成分在哪里和表示出图象光谱应该被从哪里选取以作为进入下一迭代 的输入，是有用的。有时分解的成分光谱足够接近实际光谱而成为对纯粹成 分光谱的良好估量。如果情况是这样，由迭代剩余技术产生的成分图象对任 何计划的定量分析例如肿瘤测量或协同定位测定，都足够纯粹。然而，有时 因为初始的光谱矢量使用来自整个图象的平均光谱，以及成分图象表现了成 分的一些混合，分解的成分光谱不是足够精确。
步骤2：计算纯粹成分光谱
在确定了在给定样品中出现了多少成分之后，可以使用从图象立方体数 据使用来自步骤1中的迭代剩余技术的成分图象选取的光谱来计算纯粹成分 光谱。
一种进行这一点以及进一步改进信号的精确分配到合适的成分图象中 的方法是，使用来自步骤1的成分图象作为进一步分析的引导。换句话说， 步骤1提供了对纯粹光谱的初始估量并基于那些初始估量提供了成分图象， 其然后可被用于改进对纯粹光谱的初始估量。
例如使用者可以基于对样品的知识，该样品被认为是表现了预期的成分 (例如包括特定靶化合物的成分)以及与该预期成分公共定位的自发荧光成 分，从步骤1中的迭代剩余技术中选择成分图象。使用者首先使用成分图象 来选择图象立方体的对应没有预期成分的自发荧光成分的区域(例如，一组 一个或更多毗邻或不毗邻的象素)，其被指定为光谱“A”。然后使用者使用 该成分图象来选择示出与该共同定位的自发荧光在一起的大强度的预期成 分(例如肿瘤)的一区域的一个或更多象素，其被指定为光谱“A+B”。
然后这些区域被用于表示在图象立方体数据中的象素位置，从图象立方 体数据中提取剩余技术使用的光谱“A”SA(λ)和光谱A+B”SA+B(λ)。对于多 个所希望的分量这个过程可以重复。近似SA(λ)的量Q的剩余技术使用最优 化误差函数出现在SA+B(λ)中。这个SA(λ)的量然后被从SA+B(λ)中减去以留下 最优值被用于估量纯粹光谱“B”SB(λ)的差值光谱Δ(λ)(有一个光学偏移常 数C)。该差值光谱给出为：
Δ(λ)＝SA+B(λ)-QSA(λ)+C    [6]
剩余技术通过最小化一误差函数，对Q＝Qopt以及可选择的C＝Copt确定 最优值。可以使用各种可能的误差函数的任何一种。一个示例性的误差函数 err1(Δ)(其中Δ≡Δ(λ)隐含地为λ的函数)给出为：
err1(Δ)＝(e-Δ+1)Δ2    [7]
该剩余技术使err1在λ上的平均值最小化。选择此误差函数err1(Δ)以偏 爱正的Δ值，因为负的光谱SB(λ)在物理上是不相容的。可选择的，最小均方 差(MMSE)准则(例如err2(Δ)＝Δ2)可以和Δ为正的约束条件一起使用。 然而，这样的严格约束条件对应与特定类型的最小化技术可能不相容的间断 的误差函数。
也可以进行其他修正。例如，归一化的误差函数：
err3(Δ)＝err1(Δ)/[SA+B(λ)+SA(λ)]    [8]
可以被用于对由具有相同的相对量的较大数值的SA+B(λ)和SA(λ)引起的 较大数值的err1(Δ)进行修正。其大小在噪声阈值之下的err1(Δ)(或err3(Δ)) 的值可以被设定为零。
一旦已经计算了最优化值Qopt和Copt，则如下所示计算纯粹光谱SB(λ)：
SB(λ)＝SA+B(λ)-QoptSA(λ)+Copt    [9]
步骤3：使用纯粹成分光谱不混合
在纯粹成分光谱在步骤2中被确定以后，可以使用这些纯粹成分光谱在 图象立方体数据上完成不混合。在简单的系统中如果已经知道成分，这有时 是有效的。然而，在某些情况中因为它假定所有测得的信号属于一个或另一 个成分图象，从而使不混合的图象中的信号之和等于总的检测到的信号，它 可能不是最理想的。如果在图象立方体中特定象素处的光谱由比确定的纯粹 成分光谱表现出来的更多的成分组成，那么未料到的成分可以并很可能会被 不精确地分配到靶化合物图象中。
为了解决这一问题，可以以“有监督”的方式来使用步骤1中的迭代剩 余技术，其中来自步骤2的光谱被用作到每个迭代中的输入以“剥出”成分 图象。每个迭代产生与被用作那个迭代的输入的光谱相对应的成分图象。这 样具有的优点是它不会强加100％的总和，而留下留在残余图象中的那些以 用于进一步的处理，如果希望的话。
在图15A和15B中示出了这种方法能起多大作用的例子。图15A示出 在越过肿瘤区域上具有相同强度的自发荧光，显示出信号是精确分配在正确 的图象中的。图15B示出被标记的肿瘤，看起来与其他荧光成分很好地隔开。
可以以各种方式来配置这种能力以提供非常有效的检查和分析样品的 工具。例如，它可以被配置为从数据集中去掉成分，当它们被使用者用输入 装置(例如鼠标)指出时。可以去掉具有相同光谱记号的不仅在使用者选定 位置的光谱成分以及在图象立方体的其他位置上的光谱成分。对选定成分的 光谱可以使用步骤2予以确定，并如步骤3所述那样被去掉。而且，包含了 没使它进入成分图象的信号的残余图象可以被检查以看出是否有没预料到 或不知道的其他成分。
它们本身的以及在任何组合中的任何步骤都是有用的。步骤1和2在许 多情况中本身具有价值。
图16是处理1600的流程图，该处理说明在上面步骤1处理中的迭代剩 余技术。处理1600提取可用于从图象立方体数据计算纯粹成分光谱的光谱 矢量。得到的纯粹成分光谱可用作输入光谱，起用于不混合及/或储存用于在 光谱数据库中以后的使用。使用者或者通过从样品中获得数据，或者通过载 入前面获得的图象立方体数据，而提供1602图象立方体数据。
然后，用各种方法中的任何方法提供第一光谱矢量。使用者可以从光谱 库(例如表现各种类型的对要被成象的样品的类型的自发荧光的光谱库)中 选择1604第一光谱矢量。使用者可以从研究区(ROI)基于表现自发荧光(例 如在图象立方体中的一个图象)的图象选择1606第一光谱矢量。使用者可 以从前面获得的图象立方体选择1608第一光谱矢量。可选择的，处理1600 从图象立方体数据自动确定1610第一光谱矢量(例如通过求来自所有象素 的信号光谱的平均值来计算“平均光谱”)。
然后处理1600在图象立方体上完成非负的约束不混合以确定1612对每 个象素的量，其表现要被从该象素的信号光谱中减去的当前的光谱矢量的数 量。在每个象素上，处理1600从能被减去又不会使得到的剩余光谱在任何 波长上变负的信号光谱上减去1614当前光谱矢量的最大量。处理输出1616 成分图象其表现在每个象素上被减去的当前的光谱矢量以及能在后面的处 理(例如在成分图象中提供的信息可用于定位优选的用于输入到PCSC处理 的光谱)中使用的对应的当前的光谱矢量的数量。
然后处理1600从一组在得到的“剩余图象立方体”(例如一图象立方体 其具有如上计算的作为信号光谱的剩余光谱)中表现最大“误差”的一个或 更多象素确定下一个光谱矢量。例如，处理1600选择1618下一个光谱矢量 作为在剩余图象立方体中最强烈的N个象素(例如N＝25)的光谱的平均。 可选择的，处理1600选择最强烈的N个象素并然后选择该N个象素的子集 R，其在最强烈的N个象素的指定光谱角距离θ内。
处理1600重复这些步骤1612、1614、1616和1618，直到已经达到最小 强度水平或者已经发现指定数量的光谱矢量1620。
另外的实施例
上面的技术可以应用到更宽范围的深部组织样品中，包括，例如，活的 有机体、哺乳动物(例如人、啮齿动物灯)、皮下组织、器官等等。例如样 品也可以使在水性样品场所的斑马鱼。一般地说，上面的技术，例如用于估 量纯粹光谱的技术，可以用于无深部组织的生物样品，包括例如组织切片、 细胞、显微镜载物片样品。
样品架将取决于样品，但除了包括用于固持动物例如老鼠的样品架之 外，它们可以包括，例如培养皿、微滴定盘、蛋白质阵列、DNA阵列、凝 胶盘，或者组织微阵列盘。对于体内成象，样品可以是研究对象或动物坐、 搁放或被固定于其上的表面。
当然，可以使用不同于GFP的靶化合物。例如同样的装置可用于观看 老鼠或其他样品，其被转染以表达或者黄色荧光蛋白(YFP)或是红色荧光 蛋白(RFP)或两者并在去掉自发荧光信号以后产生靶化合物的图象。也有 发展出来的突变株，其也可以使用。当产生有用的结果时，这些中的任何都 可以和GFP结合。此外，例如，靶化合物可以基于量子点，其尺寸分布被 修改以提供各种光谱记号。
除了可调液晶光谱滤波器，用于光谱滤波的其他实施例是可能的，包括 例如，声光可调光谱滤波器、一组光谱滤波器、光谱滤波器轮、色散棱镜、 光栅、分光计，或者单色仪。例如，技术人员可以使用包含多个带通滤波器 的电动滤波器轮。又一实施例可以使用来自Optical Insights(Tucson，AZ) 的双象系统一次在四个光谱波段上观看样本，虽然空间分辨率较低。波段被 选择以给出在靶化合物和背景自发荧光之间有所区别的光谱，即具有明显不 同于1的cosθ，优选为0.8或更小。
也有许多用于获得光谱解析图象的技术。例如，一些这样的技术包括： “光栅扫描”系统其中每个象素被照明并获得发射光谱，通过顺序探测每个 象素获得图象；“推帚”系统，其中通过从一排或一条样品中取发射光线从 一排样品中获得光谱，并输入它通过成象光栅以获得来自样品的一排光谱， 然后沿成象系统下面移动样品(或者成象系统在样品上移动)而获得另一排 直到建立图象；以及“真实成象”系统，其取样品的光谱解析图象。
此外，当上面的技术和分析集中在来自样品的光线被光谱滤波以在选定 成分之间区分开的情形时。同样的算法可以应用到用于照明样品的光线被光 谱滤波以在选定成分之间区分开的情形。换句话说，除了注重样品中的不同 成分的发射光谱，技术人员可注重样品中的不同成分的激发光谱。在这样的 实施例中，从样品的特定区域测得的光线被光谱解析为对于激发光线的不同 的光谱加权函数的函数。用于光谱不混合的基本原理保持不变，然而，因为 对每个光谱加权函数测得的光线的强度会根据这些成分在对应该光谱加权 函数处被光线激发的程度而包括来自不同成分的贡献。例如，图17示出光 谱成象系统100’，其包括用于在多重激发波长波段之间切换的激发侧光谱滤 波器1700。得到的图象立方体数据可以象上面描述那样被处理，其中例如在 方程[1]中的波长λ被用于表示给定的激发波长(或波长波段)。用于这种技 术的照明源可以是宽带源其然后象上面描述那样被光谱滤波，或者可以是具 有不同光谱发射的源的阵列，例如LED或二极管阵列。这种技术也在美国 申请号10/226,592(公开号US-2003-0081204-A1)中得到进一步的描述，其 在此并入作为参考。其他也可以使用的用于提供激发光线的技术如在美国申 请号10/163,233(公开号US-2003-0223248-A1)中描述的，其在此并入作为 参考。
另外，在一些实施例中，可以收集数据作为激发和发射波长这两者的函 数。
虽然是按照测量荧光来描述上面的技术，同样的技术可以被应用以基于 其他类型的光测量来确定一个或更多靶化合物的浓度。光发射现象可以基于 任何荧光、透射、反射、散射、拉曼散射，或磷光。例如，可以从Menlo Park， 加利福尼亚的Nanoplex Technologies Inc.，(www.nanoplex.com)得到的纳米 颗粒可用于提供拉曼发射的靶化合物。一些这样的测量可以包括将测得的信 号转变为其他单位。重要的是该测量提供有用的光谱信息以将想要的对应靶 化合物的信号与其他信号成分区分开来，因而提高测量的完整性和灵敏度。
例如，一些实施例涉及光线传输通过吸收性的介质。在这种情况下，测 得的光线的强度以对靶化合物的浓度的指数关系减少。然而，转换成“光学 密度”(例如通过使用对数函数)使得可以进行线性不混合技术。这种光学 密度技术在美国申请号10/226,592(公开号US-2003-0081204-A1)中得到进 一步的描述，其在此并入作为参考。其他实施例可包括基于在几个选定的波 长或波长波段上的亮度比的测量。
用于估量纯粹光谱的实施例也可以包括无监督技术，例如群集分析。群 集分析通过将光谱分成群来识别样品的具有相似光谱响应的区域，使得在群 内的光谱响应差异为最小，同时使在光谱响应的群之间差异最大。在这一实 现过程中，群集分析的结果包括，对每个群的群心光谱(即对该群的加权平 均光谱)，以及对应的群成员地图(即群的空间分布)。放在一起，它们回答 了两个通常提出的关于光谱成象的问题：不同类型的光谱出现在哪里，以及 该光谱的光谱特征是什么。
一旦通过探索性的无监督分析识别出带有特定成分的区域，可以使用有 监督分选器更彻底地调查这些成分的位置。用于有监督分选器的训练集光谱 可以被从由无监督分析识别为包含特定成分的区域中提取出来，或者可以使 用对样品的组成的先前的知识从数据集中选择它们。然后有监督的分选器可 以通过定位具有与训练光谱相匹配的光谱轮廓的区域来提纯图象的分段。无 监督分析，结合有监督分选器，提供了一种没有对样品中出现的成分的数量 和性质有先验了解时定位组成成分的方法。另外，使用为训练集选择的光谱 作为在库光谱搜寻程序中的靶也能使得可以进行成分的自动识别。
有监督图案识别方法可能更适合临床或产业上有用的数据分析方法的 发展。有监督图案识别技术例如线性判别分析(LDA)或神经网络利用了研 究者经常已经具有相当数量的可得到的光谱数据(或是生化的或临床的)这 一事实。例如，研究者可能知道光谱产生自明确的样品成分或组织类型。然 后此信息可用于训练一LDA算法以识别在光谱中的变量(峰值频率、带宽、 相对强度等)的特殊组合，其为这些样品成分或组织类型的特征。
样品图象的光谱分析和构建可以在硬件或软件或两者的结合中完成。可 以使用标准的编程技术遵循此处描述的方法在计算机程序中完成电子处理。 程序代码被应用到输入数据以完成在此处描述的光谱不混合功能及产生输 出信息例如样品图象。该输出信息被施加到一个或更多输出装置例如显示监 视器。
每个程序优选为在高水平的程序性或面向对象的编程语言中完成以与 一计算机系统通讯。然而，该程序可以在汇编语言或机器语言中完成，如果 希望的话。在任何情况中，语言可以是编译过的或翻译过的语言。此外，该 程序可以在为该目的而预编程序的专用的集成电路上运行。
每个这样的计算机程序优选为存储在可由一般的或特殊用途编程的计 算机读取的储存介质或装置(例如CD-ROM或磁盘)上。用于在该储存介 质或装置被计算机读取时设定和操作该计算机以完成此处描述的过程。计算 机程序也可以在程序执行期间驻留在高速缓冲存储器或者主存当中。例如， 图1中的计算机180可以包括处理器、输入/输出控制卡、用户界面例如键盘 和监视器，以及存储器。储存在计算机可读介质中的程序被储存在计算机的 存储器中，当被执行时，该程序使处理器执行分析光谱滤波图象的步骤。
其他的方面、特征和优点在下面的权利要求的范围内。
本申请要求2003年9月23日提交的题目为“SPECTRAL IMAGING OF DEEP TISSUE”的美国专利申请序号10/669101的优先权。