治疗虾类病毒感染的组合物和方法
阅读：556发布：2021-06-30
专利汇可以提供治疗虾类病毒感染的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供多种纳米颗粒，包含部分脱乙酰化的壳聚醣和单股双股RNA，其与在养殖的甲壳类动物中致病病毒的mRNA目标部分互补、结合或至少90％相同，多种组合物以及多种养殖的 水 生甲壳类动物包含相同成分，以及其用于在 水产养殖 中 治疗 或 预防 病毒感染 的方法。，下面是治疗虾类病毒感染的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述壳聚醣RNA纳米颗粒包括:部分脱乙酰化的壳聚醣以及至少一种RNA序列，其中所述脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰化程度在59％至
35％的范围内。
2.如权利要求1所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述至少一种RNA序列的长度为至少40个碱基。
3.如权利要求1或2所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述RNA序列能够通过一RNAi途径指导一目标RNA的切割。
4.如权利要求1或2所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述RNA序列在施用于一表达一基因的生物时，能够使所述基因的表达沉默。
5.如权利要求1至4中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述纳米颗粒是一种稳定的纳米颗粒，在一水性介质中保留至少60％的所述RNA。
6.如权利要求1至4中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述纳米颗粒是一种稳定的纳米颗粒，在一水性介质中保留至少70％的所述RNA。
7.如权利要求1至4中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述纳米颗粒是一种稳定的纳米颗粒，在一水性介质中保留至少80％的所述RNA。
8.如权利要求5至7中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述水性介质的pH值在4.2至8.0的范围内。
9.如权利要求5至7中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述水性介质的pH值为7.5。
10.如权利要求1至9中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述至少一RNA寡核苷酸是一种单股RNA(ssRNA)。
11.如权利要求1至9中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：所述至少一RNA寡核苷酸是双股RNA(dsRNA)。
12.如权利要求1至11中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒，其特征在于：喂食所述壳聚醣RNA纳米颗粒以增强虾的存活率。
13.一种营养药物组合物，其特征在于：所述营养药物组合物包括：养殖的甲壳类动物的食物；和如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒。
14.一种养殖甲壳类动物，其特征在于：所述甲壳类动物包括如权利要求1至12中任一项所述的纳米颗粒或如权利要求13所述的营养药物组合物。
15.一种治疗或预防与一致病病毒相关的一养殖甲壳类动物的一疾病或病症的方法，其特征在于：所述方法包括对所述养殖的甲壳类动物喂食如权利要求1至12中任一项所述的纳米颗粒或如权利要求13所述的营养药物组合物。
16.如权利要求15中所述的方法，其特征在于：通过一养殖的甲壳类动物摄取所述纳米颗粒或所述营养药物组合物，导致所述养殖的甲壳类动物中一致病病毒水平降低，所述降低是与所述相同的养殖的甲壳类动物摄入不含有以所述致病病毒的一基因产物为目标的RNA的饲料相比。
17.如权利要求15中所述的方法，其特征在于：通过一养殖的甲壳类动物摄取所述纳米颗粒或所述营养药物组合物，导致所述养殖的甲壳类动物的存活率、产量、生长速率、活力、生物量、饲料转化率、大小、味道和气味品质或胁迫耐受性提升，所述提升是与所述相同的养殖的甲壳类动物摄入不含有以所述致病病毒的一基因产物为目标的RNA的饲料相比。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其特征在于：所述养殖的甲壳类动物是虾，并且所述纳米颗粒或营养药物组合物以每生命周期1至3次的喂食频率提供。
19.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其特征在于：所述养殖的甲壳类动物是虾，并且每次所述喂食是以至少5天的一周期中至少两日喂食。
20.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其特征在于：所述养殖的甲壳类动物是虾，并且其中所述营养药物组合物是以每日喂食占虾体重的3至10％的剂量来提供。
21.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一RNA序列至少包括一序列，能够通过互补碱基配对，结合到多种养殖的甲壳类动物的一致病病毒的一目标mRNA分子。
22.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一RNA序列至少包括一序列，与多种养殖的甲壳类动物的一致病病毒的一目标mRNA分子具有至少90％的序列一致性。
23.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一RNA序列至少包括一序列，至少部分地与多种养殖的甲壳类动物的一致病病毒的一目标mRNA分子互补。
24.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一RNA序列包括至少一序列，与多种养殖的甲壳类动物的一致病病毒的一目标mRNA分子的至少20个连续碱基相同。
25.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一RNA序列至少包含一序列，能够通过互补碱基配对，结合到一种养殖甲壳类动物的一目标mRNA分子。
26.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一RNA序列包括至少一序列，与一种养殖的甲壳类动物的一目标mRNA分子的至少20个连续碱基相同。
27.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一RNA序列至少包含一序列，至少部分地与一种养殖的甲壳类动物的一目标mRNA分子互补。
28.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述至少一RNA至少包括一序列，与一养殖的甲壳类动物的一目标mRNA分子的至少20个连续碱基相同。
29.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述脱乙酰化的壳聚醣的所述脱乙酰化程度通过电位滴定而被确定。
30.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰化程度的范围为40％至59％、45％至55％、
43％至58％或45％至50％。
31.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述壳聚醣的所述脱乙酰化程度为55％。
32.如权利要求1至12中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述壳聚醣的所述脱乙酰化程度为35％。
33.如权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述多种养殖的甲壳类动物选自于由虾、对虾、螃蟹、龙虾和淡水龙虾所组成的一群组。
34.如权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述养殖的甲壳类动物是虾或对虾。
35.如权利要求13所述的营养药物组合物、权利要求14所述的养殖的甲壳类动物或权利要求15至20中任一项所述的方法，其特征在于：所述虾或对虾选自于由中南美白对虾(Litopanaeus vannamei)、草虾(Panaeus monodon)、日本对虾(Penaeus japonicas)以及淡水长臂大虾(Macrobrachium rosenbergii)所组成的一群组。
36.如权利要求21至24中任一项所述的壳聚醣双股RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述病毒选自于由下述所组成的一群组：白斑综合症病毒(WSSV，登录号为AF332093)、桃拉综合症病毒(TSV，登录号为NC_003005)、黄头病毒(YHV，登录号为FJ848673.1)、腮相关病毒(GAV，登录号为NC_010306.1)、传染性皮下组织和造血组织坏死病毒(IHHNV，登录号为NC_002190)、传染性肌坏死病毒(IMNV，登录号为KR815474.1)、白尾病(罗氏沼虾诺达病毒，MrNV，区段1的登录号为NC_005094.1，以及区段2的登录号为NC_005095.1)和传染性胰腺坏死病毒(IPNV，区段A的登录号为NC_001915.1以及区段B的登录号为NC_001916.1)。
37.如权利要求21至24中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述RNA与任何所述养殖的甲壳动物的宿主基因序列不具有任何显着的同源性或一致性。
38.如权利要求21或23所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述部分互补序列或所述能够通过互补碱基配对结合到所述至少一RNA序列的所述目标核酸分子的序列，与所述目标核酸分子的一序列互补至少20、至少
40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少250、至少400，至少500，至少600，至少
750个碱基的长度。
39.如权利要求22或24所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述至少一RNA序列包括至少一序列，与多种养殖的甲壳类动物中所述致病病毒的一目标mRNA分子的至少21个连续碱基相同，与所述目标mRNA分子的至少
30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少250、至少400、至少500、至少
600、至少600、至少750个碱基相同。
40.如权利要求21或23所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述RNA包含一核酸序列，与选自于由SEQ ID NO：1、2、3和5所组成的一群组的一核酸序列互补。
41.如权利要求22或24所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述RNA包含一序列，与选自于由SEQ ID NO：1、2、3和5所组成的一群组的一核酸序列的至少21个连续碱基相同。
42.如权利要求21或23所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述RNA包含一核酸序列，与选自于由SEQ ID NO：59、64、77、78和79所组成的一群组的一核酸序列互补。
43.如权利要求22或24所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述RNA包含一序列，与选自于由SEQ ID NO：59、64、77、78和79所组成的一群组的一核酸序列的至少21个连续碱基相同。
44.如权利要求25至28中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述养殖的甲壳类动物的所述目标mRNA分子是一mRNA，与所述养殖的甲壳动物对于所述多种养殖的甲壳类动物中的致病病毒的感染的易感性或反应性相关。
45.如权利要求42或44所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述养殖的甲壳类动物的所述目标mRNA分子包含：一Rab7mRNA序列，或所述Rab7mRNA序列的片段。
46.如权利要求45所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述壳聚醣RNA纳米颗粒包含选自于由SEQ ID NO：47、53和54所组成的一群组的一RNA序列。
47.如权利要求21至24中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法包含至少一额外的RNA序列，能够指导在多种养殖的甲壳类动物中的一致病病毒的一目标mRNA分子的切割。
48.如权利要求47所述的脱乙酰化的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述至少一RNA序列和所述至少一额外的RNA序列针对相同病毒的一目标mRNA。
49.如权利要求47所述的脱乙酰化的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述至少一RNA序列和所述至少一额外的RNA序列针对不同病毒的一目标mRNA。
50.如权利要求1至49中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：通过有效z-平均直径测量，所述纳米颗粒的颗粒尺寸在50至
500纳米、65至350纳米、75至300纳米、80至250纳米、100至200纳米、120至180纳米、150至
250纳米和140至160纳米的范围内。
51.如权利要求1至49中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：通过有效z-平均直径测量，所述纳米颗粒的颗粒尺寸在100至200纳米的范围内。
52.如权利要求1至50中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：当在pH值4.6下测量时，所述纳米颗粒的表面电荷(z-电位)在5至100毫伏、10至90毫伏、15至85毫伏、15至25毫伏、20至75毫伏、30至60毫伏、40至50毫伏和45至50毫伏的范围内。
53.如权利要求1至50中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：当在pH值4.6下测量时，所述纳米颗粒的表面电荷(z-电位)在150至250毫伏的范围内。。
54.如权利要求1至53中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述壳聚醣与生物素偶联。
55.如权利要求1至53中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述壳聚醣与葡醣醛酸偶联。
56.如权利要求1至55中任一项所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述壳聚醣与一聚合物偶联。
57.如权利要求56所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法，其特征在于：所述聚合物选自于由下述所组成的一群组：聚赖氨酸(PLL)、直链聚乙烯亚胺(l-PEI)、支链聚乙烯亚胺(b-PEI)、聚乙二醇(PEG)、G3树状的聚酰胺胺(PAMAM)、直链的聚氨基胺(PAA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)以及聚β氨基酯(PBAE)。
58.如权利要求56所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物、方法和水产养殖环境，其特征在于：所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
59.如权利要求58所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物、方法和水产养殖环境，其特征在于：所述壳聚醣RNA纳米颗粒的聚乙二醇化程度为1至60％、5至50％、10至40％、15至35％、5至40％和20至30％。
60.如权利要求58所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物、方法和水产养殖环境，其特征在于：所述壳聚醣RNA的聚合物/RNA比率对于壳聚醣在2：1至15：
1、4：1至12:1、5：1至10：1和6：1至8：1的范围内。
61.如权利要求58所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物、方法和水产养殖环境，其特征在于：所述壳聚醣RNA的聚合物/RNA比率对于高度脱乙酰化的壳聚醣为8：1，及对于55％脱乙酰化的壳聚醣为50：1。
治疗虾类病毒感染的组合物和方法
[0001] 技术领域和背景技术
[0002] 水产养殖已成为世界上增长最快的食用动物生产部分之一。野生渔业中的存量减少以及美国，欧洲和日本对海鲜需求的增加推动了此巨大增长。
[0003] 尽管虾类养殖业的快速增长并且其对于其他国家和地区的进一步扩张，但由于增加的虾类养殖业已经促使压力因素增加了虾类对疾病的易感性。发生疾病所涉及的因素包括池塘过度拥挤、过度喂养、缺乏营养需求和水质差。
[0004] 与野生存量相比，随着养殖产量在市场上所占的份额继续增加，疾病对虾类养殖业的影响也在增加。生产者采取的做法包括更高的放养密度、更小的内陆池塘养殖和更高的饲养率，以提高竞争力。这导致越来越容易感染传染病，特别是病毒病原体，继而是继发性细菌感染。诸如白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)等病毒性疾病已成为大流行病，导致全球数十亿美元的损失。例如在台湾虾类养殖场发生多次高死亡率疾病爆发后，1992年首次发现了WSSV。据估计，自1992年以来仅亚洲就已经损失了60多亿美元，而自1999年发生WSSV以来，美国已经损失了1-2亿美元。
[0005] 在另一例子中，厄瓜多尔经历了巨大的损失，在发生WSSV之后观察到65％的产量损失，这导致光是出口损失就超过5亿美元。此外，失去了130,000个职缺，超过100,000公顷的池塘被遗弃(有关WSSV的概述，请参阅McClennen，文学硕士论文，塔夫斯大学网站“fletcher”)。同样，1998年秘鲁的产量急剧下降到2000年产量的十分之一，其中85％的虾塘被废弃，仅饲料成本就损失了900万美元。在中国，估计每年总产量损失的80％归因于WSSV。
[0006] 白斑综合症病毒(WSSV)在过去二十年中一直是虾类养殖业最具威胁性的传染性病原体之一。WSSV相关的累积死亡率通常在临床症状发作后2至5天内达到100％。所述病毒感染多种的节肢动物群，包括淡水对虾(freshwater prawns)、龙虾(lobster)、淡水蟹(freshwater crabs)和几种海洋螃蟹(marine crabs)。WSSV属于病毒科Nimaviridae下的Whispovirus属(参见ICTV数据库下的NIH NCBI网站)。它是一个杆状的包膜双股(double strand)DNA病毒，长约275纳米，宽约120纳米，一端有尾状附属物。对WSSV全基因组的测序表明它具有184个ORF，但其许多病毒蛋白的作用仍然未知。
[0007] 已经在WSSV中鉴定了大约40种结构蛋白，包括22种包膜蛋白。WSSV基因组包含五种已知的主要结构蛋白：VP28、VP19、VP26、VP24和VP15。对WSS病毒蛋白的研究已经证明VP28和VP19与病毒体包膜(envolope)相关。VP26作为将两种核衣壳(nucleocapsid)相关蛋白VP24和VP15连接到包膜(envolope)的被膜蛋白(tegument protein)。
[0009] 已经发现对虾类(penaeid shrimp)具有针对双股(double strand)DNA进行基因特异性RNA干扰(RNAi)反应所需的细胞内机制，包括Dicer-1型核糖核酸酶(Su等人所著，2008)以及类似Argonaute的蛋白质(Unajak等人所著，2006和Dechklar等人所著，2008)。目前正在利用这种RNAi机制的存在来确定虾类的基因功能。此外，虾类的RNAi反应机制具有干扰病毒和其他病原体复制的手段，以保护虾类免对抗几种对水产养殖具有经济重要性的严重疾病。
[0010] 注射用针对病毒RNA的双股RNA或发夹双股RNA至各种虾种中已被证明会干扰病毒复制，并至少提供短期保护，防止由白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)(Robalino等人所著，2004、Robalino等人所著，2005、Sudhakaran等人所著，2011)、Taura综合征病毒(Taura syndrome virus，TSV)(Robalino等人所著，2004、Robalino等人所著，2005)、黄头病毒(yellow head virus，YHV)(Yadmuang等人所著，2006)和鳃相关病毒(Sellars等人所著，2011)所引起的疾病和死亡。
[0011] 除病毒DNA沉默外，还发现抑制与病毒包膜蛋白相互作用的病毒相关内源基因，如Rab7，可提高虾类对病毒性疾病的抵抗力(Ongvarrasopone，2008)。
[0012] 虽然双股RNA可以保护虾类免受病毒病影响的实验证据显示是很有希望的，但目前尚未开发出有效的递送双股RNA于商业养殖场的解决方案。
[0014] Loy等人所著的的美国专利公开号2014/0371295教示了通过饲食、注射、生物射弹递送(biolistic delivery)、浸渍、穿孔、使用脂质体、α病毒复制子颗粒以及各种形式的封装，对虾类和其他水生无脊椎动物(特别是肌肉坏死病毒)递送以病原生物为目标的双股RNA。Gross等人所著的美国专利公开号2005/0080032教示了通过注射、摄取、浸渍、包封，特别是通过表达双股RNA的基因工程微生物的微生物生物传递，递送以海洋无脊椎动物的致病性/寄生性微生物为目标的双股RNA。其他相关出版物包括Rozema等人所著的美国专利公开号2013/0245091和美国专利号9,011,919，Ward等人所著的美国专利公开号US2014/0335192，Kjems等人所述的美国专利公开号US2011/0033547和Besenbacher等人所著的PCT公开号WO 2008/003329。
发明内容
发明内容
[0015] 根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种壳聚醣RNA纳米颗粒，包括:部分脱乙酰化的壳聚醣以及至少一种RNA序列，其中所述脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰化程度在59％至35％的范围内。
[0016] 根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种营养药物组合物包括：养殖的甲壳类动物的食物，和本文所述的壳聚醣RNA纳米颗粒。
[0018] 根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种治疗或预防与一致病病毒相关的一养殖甲壳类动物的一疾病或病症的方法，所述方法包括对所述养殖的甲壳类动物喂食本文所述的纳米颗粒或所述的营养药物组合物。
[0019] 根据本发明的一些实施例，所述至少一种RNA序列的长度为至少40个碱基。
[0020] 根据本发明的一些实施例，所述RNA序列能够通过一RNAi途径指导一目标RNA的切割。
[0021] 根据本发明的一些实施例，所述RNA序列在施用于一表达一基因的生物时，能够使所述基因的表达沉默。
[0022] 根据本发明的一些实施例，：所述纳米颗粒是一种稳定的纳米颗粒，在一水性介质中保留至少60％的所述RNA。
[0023] 根据本发明的一些实施例，所述纳米颗粒是一种稳定的纳米颗粒，在一水性介质中保留至少70％的所述RNA。
[0024] 根据本发明的一些实施例，所述纳米颗粒是一种稳定的纳米颗粒，在一水性介质中保留至少80％的所述RNA。
[0025] 根据本发明的一些实施例，所述水性介质的pH值在4.2至8.0的范围内。
[0026] 根据本发明的一些实施例，所述水性介质的pH值为7.5。
[0027] 根据本发明的一些实施例，：所述至少一RNA寡核苷酸是一种单股RNA(ssRNA)。
[0028] 根据本发明的一些实施例，所述至少一RNA寡核苷酸是双股RNA(dsRNA)。
[0029] 根据本发明的一些实施例，喂食所述壳聚醣RNA纳米颗粒以增强虾的存活率。
[0030] 根据本发明的一些实施例，本文所述壳聚醣RNA纳米颗粒、所述营养药物组合物、所述的养殖甲壳类动物或所述方法中，所述至少一种RNA序列至少包括一种序列，能够通过互补碱基配对，结合到多种养殖的甲壳类动物的一致病病毒的一目标mRNA分子。
[0031] 根据本发明的一些实施例，本文所述壳聚醣RNA纳米颗粒、所述营养药物组合物、所述养殖的甲壳类动物或所述的方法中所述至少一RNA序列至少包括一序列，与多种养殖的甲壳类动物的一致病病毒的一目标mRNA分子具有至少90％的序列一致性。
[0032] 根据本发明的一些实施例，本文所述壳聚醣RNA纳米颗粒、所述营养药物组合物、所述养殖的甲壳类动物或所述的方法中，所述至少一RNA序列至少包括一序列，至少部分地与多种养殖的甲壳类动物的一致病病毒的一目标mRNA分子互补。根据本发明的一些实施例，本文所述壳聚醣RNA纳米颗粒、所述营养药物组合物、所述养殖的甲壳类动物或所述的方法中，所述至少一RNA序列包括至少一序列，与多种养殖的甲壳类动物的一致病病毒的一目标mRNA分子的至少20个连续碱基相同。
[0033] 根据本发明的一些实施例，本文所述壳聚醣RNA纳米颗粒、所述营养药物组合物、所述养殖的甲壳类动物或所述的方法中，所述至少一RNA序列至少包含一序列，能够通过互补碱基配对，结合到一种养殖甲壳类动物的一目标mRNA分子。
[0034] 根据本发明的一些实施例，本文所述壳聚醣RNA纳米颗粒、所述营养药物组合物、所述养殖的甲壳类动物或所述的方法中，所述至少一RNA序列包括至少一序列，与一种养殖的甲壳类动物的一目标mRNA分子的至少20个连续碱基相同。
[0035] 根据本发明的一些实施例，本文所述壳聚醣RNA纳米颗粒、所述营养药物组合物、所述养殖的甲壳类动物或所述的方法中，所述至少一RNA序列至少包含一序列，至少部分地与一种养殖的甲壳类动物的一目标mRNA分子互补。
[0036] 根据本发明的一些实施例，本文所述壳聚醣RNA纳米颗粒、所述营养药物组合物、所述养殖的甲壳类动物或所述的方法中，所述至少一RNA至少包括一序列，与一养殖的甲壳类动物的一目标mRNA分子的至少20个连续碱基相同。
[0037] 根据本发明的一些实施例，所述脱乙酰化的壳聚醣的所述脱乙酰化程度通过电位滴定而被确定。
[0038] 根据本发明的一些实施例，所述脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰化程度的范围为40％至59％、45％至55％、43％至58％或45％至50％。
[0039] 根据本发明的一些实施例，所述壳聚醣的所述脱乙酰化程度为55％。
[0040] 根据本发明的一些实施例，所述壳聚醣的所述脱乙酰化程度为35％。
[0041] 根据本发明的一些实施例，所述多种养殖的甲壳类动物选自于由虾、对虾、螃蟹、龙虾和淡水龙虾所组成的一群组。
[0042] 根据本发明的一些实施例，所述养殖的甲壳类动物是虾或对虾。
[0043] 根据本发明的一些实施例，所述虾或对虾选自于由中南美白对虾(Litopanaeus vannamei)、草虾(Panaeus monodon)、日本对虾(Penaeus japonicas)以及淡水长臂大虾(Macrobrachium rosenbergii)所组成的一群组。
[0044] 根据本发明的一些实施例，所述病毒选自于由下述所组成的一群组：白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV，登录号为AF332093)、桃拉综合症病毒(Taura syndrome virus,TSV，登录号为NC_003005)、黄头病毒(Yellow head virus,YHV，登录号为FJ848673.1)、腮相关病毒(Gill-associated virus,GAV，登录号为NC_010306.1)、传染性皮下组织和造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV，登录号为NC_002190)、传染性肌坏死病毒(Infectious myonecrosis virus,IMNV，登录号为KR815474.1)、白尾病(White Tail Disease,罗氏沼虾诺达病毒Macrobracium rosenbergii nodavirus，MrNV，区段1的登录号为NC_005094.1，以及区段2的登录号为NC_005095.1)和传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV，区段A的登录号为NC_001915.1以及区段B的登录号为NC_001916.1)。
[0045] 根据本发明的一些实施例，所述RNA与任何所述养殖的甲壳动物的宿主基因序列不具有任何显着的同源性或一致性。
[0046] 根据本发明的一些实施例，所述部分互补序列或所述能够通过互补碱基配对结合到所述至少一RNA序列的所述目标核酸分子的序列，与所述目标核酸分子的一序列互补至少20、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少250、至少400，至少500，至少600，至少750个碱基的长度。
[0047] 根据本发明的一些实施例，所述至少一RNA序列包括至少一序列，与多种养殖的甲壳类动物中所述致病病毒的一目标mRNA分子的至少21个连续碱基相同，与所述目标mRNA分子的至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少250、至少400、至少500、至少600、至少600、至少750个碱基相同。
[0048] 根据本发明的一些实施例，所述RNA包含一核酸序列，与选自于由SEQ ID NO：1、2、3和5所组成的一群组的一核酸序列互补。
[0049] 根据本发明的一些实施例，所述RNA包含一序列，与选自于由SEQ ID NO：1、2、3和5所组成的一群组的一核酸序列的至少21个连续碱基相同。
[0050] 根据本发明的一些实施例，所述RNA包含一核酸序列，与选自于由SEQ ID NO：59、64、77、78和79所组成的一群组的一核酸序列互补。
[0051] 根据本发明的一些实施例，所述RNA包含一序列，与选自于由SEQ ID NO：59、64、77、78和79所组成的一群组的一核酸序列的至少21个连续碱基相同。
[0052] 根据本发明的一些实施例，所述养殖的甲壳类动物的所述目标mRNA分子是一mRNA，与所述养殖的甲壳动物对于所述多种养殖的甲壳类动物中的致病病毒的感染的易感性或反应性相关。
[0053] 根据本发明的一些实施例，所述养殖的甲壳类动物的所述目标mRNA分子包含：一Rab7 mRNA序列，或所述Rab7 mRNA序列的片段。
[0054] 根据本发明的一些实施例，所述壳聚醣RNA纳米颗粒包含选自于由SEQ ID NO：47、53和54所组成的一群组的一RNA序列。
[0055] 根据本发明的一些实施例，所述的壳聚醣RNA纳米颗粒、营养药物组合物、养殖的甲壳类动物或方法包含至少一额外的RNA序列，能够指导在多种养殖的甲壳类动物中的一致病病毒的一目标mRNA分子的切割。
[0056] 根据本发明的一些实施例，所述至少一RNA序列和所述至少一额外的RNA序列针对相同病毒的一目标mRNA。
[0057] 根据本发明的一些实施例，所述至少一RNA序列和所述至少一额外的RNA序列针对不同病毒的一目标mRNA。
[0058] 根据本发明的一些实施例，通过有效z-平均直径测量，所述纳米颗粒的颗粒尺寸在50至500纳米、65至350纳米、75至300纳米、80至250纳米、100至200纳米、120至180纳米、150至250纳米和140至160纳米的范围内。
[0059] 根据本发明的一些实施例，通过有效z-平均直径测量，所述纳米颗粒的颗粒尺寸在100至200纳米的范围内。
[0060] 根据本发明的一些实施例，当在pH值4.6下测量时，所述纳米颗粒的表面电荷(z-电位)在5至100毫伏、10至90毫伏、15至85毫伏、15至25毫伏、20至75毫伏、30至60毫伏、40至50毫伏和45至50毫伏的范围内。
[0061] 根据本发明的一些实施例，当在pH值4.6下测量时，所述纳米颗粒的表面电荷(z-电位)在150至250毫伏的范围内。
[0062] 根据本发明的一些实施例，所述壳聚醣与生物素(biotin)偶联。
[0063] 根据本发明的一些实施例，所述壳聚醣与葡醣醛酸(glucuronic acid)偶联。
[0064] 根据本发明的一些实施例，所述壳聚醣与一聚合物偶联。
[0065] 根据本发明的一些实施例，所述聚合物选自于由下述所组成的一群组：聚赖氨酸(poly(lysine),PLL)、直链聚乙烯亚胺(linear polyethyleneimine,l-PEI)、支链聚乙烯亚胺(branched polyethyleneimine,b-PEI)、聚乙二醇(poly(ethylene glycol),PEG)、G3树状的聚酰胺胺(G3dendritic poly(amido amine),PAMAM)、直链的聚氨基胺(poly(amino amine),PAA)、聚(丙交酯-共-乙交酯poly(lactide-co-glycolide),PLGA)以及聚β氨基酯(poly(beta-amino ester),PBAE)。
[0066] 根据本发明的一些实施例，所述聚合物是聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)。
[0068] 根据本发明的一些实施例，所述壳聚醣RNA的聚合物/RNA比率对于壳聚醣在2：1至15：1、4：1至12:1、5：1至10：1和6：1至8：1的范围内。
[0069] 根据本发明的一些实施例，所述壳聚醣RNA的聚合物/RNA比率对于高度脱乙酰化的壳聚醣为8：1，及对于55％脱乙酰化的壳聚醣为50：1。
[0070] 根据本发明的一些实施例，通过一养殖的甲壳类动物摄取所述纳米颗粒或所述营养药物组合物，导致所述养殖的甲壳类动物中一致病病毒水平降低，所述降低是与所述相同的养殖的甲壳类动物摄入不含有以所述致病病毒的一基因产物为目标的RNA的饲料相比。
[0071] 根据本发明的一些实施例，通过一养殖的甲壳类动物摄取所述纳米颗粒或所述营养药物组合物，导致所述养殖的甲壳类动物的存活率、产量、生长速率、活力(vigor)、生物量、饲料转化率、大小、味道和气味品质或胁迫耐受性提升，所述提升是与所述相同的养殖的甲壳类动物摄入不含有以所述致病病毒的一基因产物为目标的RNA的饲料相比。
[0072] 根据本发明的一些实施例，所述养殖的甲壳类动物是虾，并且所述纳米颗粒或营养药物组合物以每生命周期1至3次的喂食频率提供。
[0073] 根据本发明的一些实施例，所述养殖的甲壳类动物是虾，并且每次所述喂食是以至少5天的一周期中至少两日喂食。
[0074] 根据本发明的一些实施例，所述养殖的甲壳类动物是虾，并且其中所述营养药物组合物是以每日喂食占虾体重的3至10％的剂量来提供。
[0075] 除非另有定义，否则所有本文使用的技术和/或科学术语与本发明所属领域的通常技术人员所理解的具有相同含义。尽管与本文所描述的类似或相同的方法或材料可以用于实践或测试本发明的实施例，但是仍将示例性的方法和/或材料描述如下。在冲突的情况下，以专利说明书所包含的定义为主。此外材料、方法和实施例仅是用于说明，而非旨在必然性地限制各自实施例。附图说明
[0076] 本发明的一些实施例，仅作为示例的方式，在本文中描述。现在详细具体地参照附图，其强调的是所述的细节是通过示例的方式、并出于本发明实施例的说明性讨论的目的而显示。在这点上，描述配合附图使本领域技术人员明了如何实施本发明的实施例施。
[0077] 在图式中：
[0078] 图1是壳聚醣(chitosan,Cs)的N-乙酰化(N-acetylation)反应中发生的化学变化的一曲线图式；
[0079] 图2是一曲线图，显示壳聚醣的乙酰化程度(表示为脱乙酰化程度降低)与乙酸酐(acetic anhydride)浓度的函数关系的图，应该注意的是，在整个乙酸酐浓度范围内的基本线性函数；
[0080] 图3A至图3C是琼脂胶体的照片，显示脱乙酰化程度对未处理的壳聚醣(图3A)、壳聚醣衍生物H42(图3B，41.6％脱乙酰化)和壳聚醣衍生物H35的双股RNA结合效率的影响(图3C，35.1％脱乙酰化)。在所有胶体中，泳道1是DNA标记物(marker)，泳道2是游离双股RNA对照组，泳道3至14是具有聚合物/Rab7质量比为1、2、4、6、8、10、15、20、25、30的纳米颗粒制剂，应该注意的是，具有较高的脱乙酰化程度的壳聚醣衍生物(图3A)比具有较低脱乙酰化程度的壳聚醣衍生物更容易与双股RNA结合(图3B和图3C)；
[0081] 图4A至图4B是一曲线图，说明物理性质的变化影响纳米颗粒的细胞相互作用(图4A：颗粒尺寸以及图4B：表面电荷[电位])，绘制为壳聚醣双股RNA的聚合物/Rab7质量比的函数。图4A显示纳米颗粒的H42/Rab7质量比对增加对纳米颗粒尺寸的影响(正相关)。图4B显示乙酰化对壳聚醣纳米颗粒的表面电荷(Z电位)的影响。应该注意的是，增加的质量比导致纳米颗粒尺寸增加(图4A)，而由部分N-乙酰化的壳聚醣(H42和H55)所制备的纳米颗粒清楚地表征为比未处理的壳聚醣具有更低的Z-电位值(图4B)；
[0082] 图5是一曲线图，说明通过口服施用壳聚醣双股RNA纳米颗粒，执行在虾类中有效的基因沉默。虾类饲食含有游离Rab7(游离RNA)、H35/Rab7(质量比50)、H42/Rab7(质量比40)、H55/Rab7(质量比30)和Cs/Rab7(质量比8)复合物或普通饲料的饮食配方，每天两次持续5天(每个喂食天口服递送1.5微克的Rab7)，最后喂食后48小时，牺牲所有虾并提取总RNA用于RT-PCR分析。应该注意的是，使用包含部分N-乙酰化的壳聚醣衍生物(H42和H35)和双股RNA的纳米颗粒进行有效的体内沉默(in-vivo silencing)；
[0083] 图6A至图6C显示聚乙二醇(PEG)偶联(conjucation)对脱乙酰化的壳多醣的双股RNA结合效率(图6A)和物理性质(图6B和图6C)的影响。胶体分析(图6A)表明所述壳聚醣颗粒的结合随着PEG化而降低，通过降低的表面电荷(Z)值(图6C)和更大的颗粒尺寸(图6B)进一步证明了这一点。
[0084] 图7A至图7B为多个曲线图，显示PEG偶联(conjucation)对壳聚醣衍生物H55的物理性质(尺寸)的影响。应该注意的是，聚乙二醇化(PEG化)的H55壳聚醣衍生物的平均颗粒尺寸的减小(图7A)，以及超声处理对PEG化的H55壳聚醣衍生物的颗粒尺寸的显着影响(图7B)；
[0085] 图8是一曲线图，说明通过口服PEG化的壳聚醣和壳聚醣衍生物双股RNA纳米颗粒执行在虾类中有效基因沉默。虾饲食多种饮食配方，其含有游离Rab7(游离RNA)、壳聚醣和PEG化壳聚醣双股RNA纳米颗粒(80/20)(PEG-Cs/Cs)、PEG化H55和H55(50/50)以及PEG化H55/H55(90/10)，其含有0.02摩尔鱼精蛋白复合物(protamine complex)或普通饲料，每天两次，共5天(每个喂食日每只虾口服递送1.5微克Rab7)。
[0086] 最后喂食后48小时，牺牲所有虾并提取总RNA用于RT-PCR分析。应该注意的是，使用包含PEG化的、部分N-乙酰化的壳聚醣衍生物(H55)和双股RNA的纳米颗粒进行有效的体内沉默(in-vivo silencing)；
[0087] 图9A至图9D是多个胶体，通过一系列pH值(图9A pH＝4.6、图9B pH＝7.0和图9C pH＝8.0)和孵育时间(图9D＝pH 7的壳聚醣衍生物H55双股RNA，0-240分钟)说明脱乙酰化程度对壳聚醣双股RNA纳米颗粒在水性环境中的稳定性的影响。使用1M NaOH，将与壳聚醣衍生物H55(DD＝55％，NP1)、H42(DD＝42％，NP2)或H35(DD＝35％，NP3)复合的双股Rab7 RNA(250bp)暴露于增加的pH值，并取样用于释放双股RNA的分析，通过胶体电泳。M＝100bp DNA标记物(marker)，“游离RNA”＝未复合的双股Rab7 RNA。应该注意的是，基于H55的纳米颗粒的绝对稳定性，以及基于H42和H32的纳米颗粒的部分稳定性；
[0088] 图10是一胶体，说明壳聚醣复合的双股RNA对RNase消化的抗性。将与壳聚醣衍生物H55(DD＝55％，NP1)或H42(DD＝42％，NP2)复合的双股Rab7 RNA(250bp)与RNase A[(II)RNase]一起孵育1小时(消化“游离RNA”在30分钟内完成)，通过添加RNase抑制剂停止降解，然后通过壳聚醣酶[(III)RNase+释放]释放RNA。M＝100bp DNA标记物(marker)，“游离RNA”＝未复合的双股Rab7 RNA。应该注意的是，基于H55的纳米颗粒(NP1)对RNase消化的完全抗性，以及基于H42的纳米颗粒(NP2)的部分抗性；
[0089] 图11是一柱状图，显示在一系列壳聚醣：RNA质量比上，与壳聚醣双股Rab7(250bp)纳米颗粒(灰色柱)相比，壳聚醣单股Rab7(250bp)纳米颗粒(黑色柱)的纳米颗粒尺寸减小。尺寸表示为相关函数的累积分析的z-平均流体动力学直径，其使用水的粘度和折射率；
[0090] 图12是一柱状图，显示与70,125和250bp双股Rab7 RNA复合的壳聚醣纳米颗粒的纳米颗粒尺寸(壳聚醣：RNA比率＝8)。尺寸表示为相关函数的累积分析的z-平均流体动力学直径，其使用水的粘度和折射率；
[0091] 图13是一胶体，说明与壳聚醣复合的单股RNA对RNase消化的抗性。将与未处理的壳聚醣(DD＝83％，壳聚醣：RNA质量比＝8)复合的单股(single strand,ss)Rab7 RNA(250b)与RNase A[(II)RNase]一起孵育1小时(消化“游离RNA”在30分钟内完成)，通过添加RNase抑制剂停止降解，然后通过壳聚醣酶释放RNA。M＝100bp DNA标记物(marker)，“游离RNA”＝未复合的双股Rab7 RNA。应该注意的是，对壳聚醣单股Rab7纳米颗粒的RNase消化的完全抗性；
[0092] 图14是一曲线图，显示通过注射单股或双股Rab7 RNA执行在虾类中有效的体内基因沉默。个别的南美白对虾中(Peneaus vanameii)注射5微升(0.5微克/克)游离的、未复合的同义或反义单股Rab7(250b)或双股Rab7(250bp)、1％NaCl(控制组)或混合的(50％/50％)同义和反义单股Rab7(250bp)。在注射后24小时，通过使用Rab7特异性引子，从萃取的鳃组织RNA进行cDNA合成以及qPCR，在鳃中测定相对Rab7的表达。定量相对于未处理的控制组设定为“1”。应该注意的是，所有注射的双股和单股Rab7 RNA组合物的有效基因沉默；
[0093] 图15是一曲线图，显示通过注射壳聚醣-单股或双股Rab7 RNA复合纳米颗粒，执行在虾中有效的体内基因沉默。个别的南美白对虾中(Peneaus vanameii)注射5微升(0.5微克/克)游离的、未复合的同义或反义单股Rab7(250b)或双股Rab7(250bp)、壳聚醣复合的有义或反义单股Rab7(250b)或双股Rab7(250bp)、1％NaCl(控组组)或RNase A处理过的壳聚醣复合的同义单股Rab7 RNA。在注射后24小时，通过使用Rab7特异性引子，从萃取的鳃组织RNA进行cDNA合成以及qPCR，在鳃中测定相对Rab7的表达。定量相对于未处理的控制组设定为“1”。应该注意的是，游离和复合的单股同义以及反义Rab7 RNA都具有高效基因沉默，以及壳聚醣-同义单股Rab7RNA纳米颗粒复合物的RNase抗性的基因沉默活性；
[0094] 图16是一曲线图，显示白斑综合征病毒感染后壳聚醣-双股RNA增加虾的存活率。五组(每组20只，每个处理重复4次)的幼虾(2g)接受注射：处理1(三角形)＝未复合的(游离)VP28 250bp RNA片段，SEQ ID NO：59；处理2(“X”)＝未复合的(游离)VP28 125bp RNA片段，SEQ ID NO：64；处理3(菱形)＝葡萄糖-壳聚醣-VP28 250bp RNA片段，SEQ ID NO：59；处理4(点状圆圈)＝包含四种基因的三种RNA序列的混合物：VP28、VP19[VP19+VP28-(SEQ ID NO：77)]、rr2(SEQ ID NO：78)和wsv477(SEQ ID NO：79)。阳性控制组(空心圆)＝2％NaCl+WSSV，以及阴性对照(正方形)＝2％NaCl。WSSV病毒(感染的剁碎的虾肉，每克约107个WSSV颗粒，剂量＝体重的5％)通过注射后48小时，给予处理组1至4和阳性对照组，并且在处理后
65小时再次给予。阴性控制组仍未受感染。
65小时再次给予。阴性控制组仍未受感染。
[0095] 感染后(感染后数天，day post infection,dpi)，每天每组两次计数虾的数量，并在18天中记录存活率。应该注意的是，盐水处理的阳性控制组(空心圆圈)中疾病的快速发作和严重性，通过注射接受病毒RNA的组别的存活率提高，以及通过施用葡萄糖-壳聚醣-双股WSSV RNA复合纳米颗粒(处理3)或病毒RNA的混合物(处理4)的优越存活率；
[0096] 图17是一胶体，说明壳聚醣-双股RNA处理的虾的存活率和对WSSV感染的抗性之间的相关性。如图16所述的5组虾受到感染(T1-T5：处理1-5，Pos：阳性对照)，并且一组未处理和未感染(Neg：阴性对照)，在来自不同组织样品中检测到WSSV序列。在感染后第4天、第7天和第14天通过巢式PCR检测(dpi)进行分组。T＝处理组(T1、T2、T3)。EF-1为PCR控制组的参考基因。M＝100bp大小的标记物(marker)。第4天和第14天的样品是来自于各组中的4个体所收集的RNA，同时个别测定第7天样品(所有T11、T12、T21、T22和T23是来自死亡的虾样品)。“N”和“P”指阳性和阴性内部PCR控制组。应该注意的是，尽管暴露于病毒，但在所有经过处理的健康的虾中都没有可检测到的WSSV序列。
具体实施方式
[0097] 在本发明的一些实施方案中，本发明涉及产生纳米结合RNA-单股RNA和双股RNA的方法，更具体地但非排他地，涉及其用于增加养殖的水生甲壳类动物对病毒的抗性的用途。特别地，本发明提供了修饰的几丁质-RNA纳米颗粒，以及增强对多种养殖的水生甲壳类动物(例如虾(shrimp)和对虾(prawn))的病毒病原体的感染抗性的方法。
[0098] 参考附图和随附的描述，可以更好地理解本发明的原理和操作。
[0099] 在说明本发明的至少一种详细实施例之前，应当理解的是，本发明不只限于应用到下面的说明中所阐述的细节或通过实施例举例说明的细节。本发明能够实施成为其它的实施例或以各种方式被实践。另外也应理解，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应被视为限制。
[0100] 基因沉默技术在商业养殖业中的应用引起了极大的兴趣，提供了补偿野生物种常见的遗传变异丧失的可能方法，遗传变异在商业物种的驯化和近亲繁殖过程中大大丧失。然而，开发有效率的和经济上有效地将有效量的RNA沉默剂递送至宿主生物的方法被证明是难以捉摸的。
[0101] 水产养殖(aquaculture,farming or culturing)水生物种，是一种古老而又快速发展的产业，最近特别重要的是，由于野生淡水和咸水存量的减少，以及西方饮食中鱼类和海鲜的重要性的增加。现在一般养殖的水生物种包括鱼类、甲壳类动物(crustaceans)、软体动物(mollusks)甚至海藻(seaweed)和棘皮动物(echinoderms，例如海参sea cucumbers)。
[0102] 随着养殖的优势，水生种群的高密度养殖以及养殖种群的有限遗传变异性，为致病性的生物创造了机会，特别是病毒病原体的繁殖，有时甚至达到流行病的程度，导致收入减少并且存量族群的显着减少。
[0103] 虽然通过RNAi进行基因沉默可能是在水产养殖环境中提供治疗的挑战的一种有吸引力的解决方案(例如，双股RNA可以在宿主生物体内扩增)，但是有效地且经济上有效地将RNAi试剂递送至养殖的水生物种的方法尚未实现。用壳聚醣纳米颗粒作为递送平台的体内基因沉默研究几乎没有成功。
[0104] 在将本发明实践的同时，本发明人开发了能够有效结合和递送RNAi物质的基于几丁质(chitin-based)的组合物。发明人通过严格的实验已经确定了壳聚醣(chitosan)主链的特定修饰，其可用于生产包含双股RNA(dsRNA)和/或单股RNA(ssRNA)的壳聚醣-RNA纳米颗粒，其在被虾类摄取或施用于虾类时，有效地将RNA递送至宿主生物的细胞(使RNA的基因表达沉默)(参见实施例I，图5、实施例II，图8)，从而提供沉默病毒基因的有效手段。具体地，本发明人已发现将壳聚醣的脱乙酰化程度降低至特定范围内显着增强了双股和单股RNA的可逆结合以及壳聚醣-RNA纳米颗粒的形成，其在水性环境中和生理pH范围下是稳定，并且通过喂食和直接给药(例如注射)，有效地将RNA递送至宿主生物体，从而影响病毒基因表达。此外，本发明人通过施用壳聚醣-RNA纳米颗粒，以递送以白斑综合症病毒(WSSV)为目标的沉默RNA，成功地减少了病毒基因表达，并提高暴露于WSSV的虾类的存活率。
[0105] 更进一步地，在纳米颗粒中添加聚合物提供了更高的RNA干扰序列在虾类摄取改性纳米颗粒中的递送效率(参见实施例II和图6A至图6C，图7A至图7B和图8)。
[0106] 因此根据本发明一方面的一些实施方案，提供了壳聚醣-RNA纳米颗粒，其包含部分脱乙酰化的壳聚醣和至少一种RNA，其中所述壳聚醣的脱乙酰度在59％至35％的范围内。
[0107] 如本文所用术语“几丁质(chitin)”是指N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine)的长链生物聚合物[即2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖]在β-1,4键[聚(N-乙酰基-1,4-β-D-吡喃葡萄糖胺)](2-(acetylamino)-2-deoxy-D-glucose]in beta-1,4linkage[poly(N-acetyl-1,4-beta-D-glucopyranosamine])中。几丁质在昆虫外骨胳和真菌和细菌细胞壁中普遍存在，并且在商业上大量可获得(例如参见，Sigma-Aldrich产品号C7170，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)。α、β和γ几丁质的区别在于它们的聚合物链的排列(以及随后的机械性质)的不同：α几丁质具有链的交替反向平行排列(最常见于甲壳类动物中)；β几丁质具有多醣链的平行排列(在鱿鱼中常见)，并且γ几丁质具有两条平行链，在统计上与一条反向平行链交替(在真菌中常见)。除非另有说明，术语“几丁质”与α、β或γ几丁质中的任何一种同义。几丁质可以是天然几丁质，来自生物体的天然几丁质，来自经遗传工程改造的生物体的重组几丁质，化学合成的几丁质通过葡糖胺(glucosamine)单体或低聚物(oligomer)的混合物的聚合来生产几丁质。不同类型的几丁质聚合物排列是可区分的，例如通过质子核磁共振(proton nuclear magnetic resonance,1H NMR)光谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)。
[0108] 甲壳素是相当不可溶的，仅溶于强的溶剂系统。
[0109] 如本文所用，术语“壳聚醣(chitosan)”是指脱乙酰化(deacetylated)的几丁质(chitin)聚合物，但与几丁质相反，其具有游离的胺基。壳聚醣可以通过几丁质的碱性脱乙酰化获得，产生具有随机的乙酰化胺基的几丁质聚合物，具有各种性质，取决于脱乙酰化程度和链的长度。壳聚醣是安全的、无毒的、易溶于弱酸性溶液中，可与聚阴离子相互作用形成复合物和凝胶。壳聚醣的特征尤其在于聚合物中乙酰化与非乙酰化(脱乙酰化)的胺基的比例，以及聚合物的平均链长。市售的壳聚醣通常以α、β或γ取向的粉末形式提供(根据几丁质的来源)，脱乙酰化程度(％DD)为介于60％至100％，分子量为约4至大约20kDa，并且具有不同的纯度。如本文所用，术语“部分脱乙酰化的壳聚醣”是指经过处理，以乙酰化一部分的脱乙酰化的游离氨基。如在市售的壳聚醣中，部分脱乙酰化的壳聚醣的特征在于脱乙酰化程度(％DD)。壳聚醣的脱乙酰化的胺基的乙酰化(或“再乙酰化”)可以在多种反应中完成，主要是基于壳多醣的游离胺基(amino groups)与乙酸酐(acetic anhydride,Ac2O)的反应，如图1所示。在一实施例中，通过将壳聚醣(例如，80％MW 40-150kDa的脱乙酰化的壳聚醣)溶于4％乙酸乙酸酐的乙醇溶液中使壳聚醣乙酰化，通过中和停止反应，并使壳聚醣沉淀、洗涤和纯化。使用所述方法，壳聚醣的脱乙酰化程度的降低取决于加入的壳聚醣与乙酸酐的摩尔数的比率(参见图2)。
[0110] 壳多醣的脱乙酰化程度可通过多种方法测定，通常分为三类：(1)光谱法(IR、(1)H NMR、(13)C NMR、(15)N NMR和UV)；(2)常规法(各种类型的滴定、电导测定、电位测定、茚三酮(ninhydrin)测定、通过苦味酸(pictric acid)吸附壳聚醣的游离氨基)和(3)破坏法(元素分析、甲壳素/壳聚醣的酸或酶水解，然后通过比色法(colorimetry)或高效液相色谱法(high performance liquid chromatography)的DA测量、热解-气相色谱法(pyrolysis-gas chromatography)和使用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry)的热分析法)。在本发明的一些实施例中，使用电位滴定测定壳聚醣的脱乙酰化程度，例如，其中将壳聚醣样品溶解在HCl(例如0.1M HCl)中，通过搅拌和加热溶解，并(使用pH计)用0.1NaOH溶液滴定)。滴定曲线的两个拐点之间消耗的酸量对应于游离氨基的量(脱乙酰化程度)。
[0111] 在一些实施例中，使用以下公式从电位滴定计算脱乙酰化程度：
[0112]
[0113] 其中m是样品的重量。V1、V2是对应于拐点的0.1M氢氧化钠溶液的体积。2.03是由几丁质单体单元的分子量获得的系数。0.0042是由几丁质和壳聚醣单体单元的分子量之差所获得的系数。
[0114] 在一些实施例中，壳聚醣中的游离胺的量，特别是高度脱乙酰化的壳聚醣的量(例如具有大于80％的DD(deacetylation degree)的市售脱乙酰化的壳聚醣)可以通过与除乙酰基之外的分子偶联来修饰，或通过与这些分子偶联，附加在用乙酰基阻挡胺基。壳聚醣与乙酰基之外的分子的偶联，类似于壳聚醣的乙酰化，导致具有较少游离胺基的改性壳聚醣，因此与偶联前的高度脱乙酰化的壳聚醣相比，其等同于较低度脱乙酰化的壳聚醣。在具体的实施例中，本发明的壳聚醣-RNA纳米颗粒包含与生物素(biotin)偶联的壳聚醣。在其他实施例中，本发明的壳聚醣-RNA纳米颗粒包含与葡醣醛酸(glucuronic acid)偶联的壳聚醣。在一些实施例中，脱乙酰壳多醣-RNA纳米颗粒包含与生物素或葡醣醛酸偶联的壳聚醣，所述壳聚醣等同于脱乙酰程度为59至35％的壳聚醣。
[0115] 简而言之，壳聚醣与葡醣醛酸(例如D-葡醣醛酸)的偶联可在N-(3-二甲基氨基丙基-)N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(N-(3-Dimethylaminopropyl-)N'-ethylcarbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide)的存在下，在室温下剧烈搅拌下进行。脱乙酰壳多醣与生物素的偶联可以在N，N-二甲基甲酰胺，N-(3-二甲基氨基丙基-)N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(N,N-dimethylformamide,N-(3-Dimethylaminopropyl-)N'-ethylcarbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide)的存在下，在室温下剧烈搅拌下进行。得到的偶联物可以通过大量透析进一步纯化并冻干用于储存。
[0116] 在将本发明实践的同时，本发明人已经发现，虽然高度脱乙酰化的壳聚醣可以比脱乙酰化程度在66％至35％范围内的部分脱乙酰化的壳聚醣更有效地结合双股RNA并形成壳聚醣-双股RNA纳米颗粒(实施例I，结果和图3A至图3C)，但是包含较低度脱乙酰化的壳聚醣的壳聚醣-双股RNA纳米颗粒(脱乙酰化在66％至35％之间)在体内更有效地使双股RNA序列所标的的基因沉默。进一步的研究表明，甚至更低程度的脱乙酰化也是有效的，并且较低程度的脱乙酰化未必会降低纳米颗粒在生理条件下(例如水环境，生理pH和RNase暴露下)使RNA有效负载(payload)稳定的能力。因此，在一些实施例中，通过电位滴定测定的部分脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰化程度在59％至35％的范围内。在一些实施例中，通过电位滴定测定的部分脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰程度在40％至59％的范围内，在一些实施例中在45％至55％的范围内，在一些实施例中在45％至55％的范围内。在一些实施例中在43％至
58％的范围内。在一些实施例中，在45％至50％的范围内。在一些实施例中，部分脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰程度为59％，或在58％至60％之间，在一些实施例中为55％，或在54％至
55％之间，在一些实施例中为42％，或在41％至42％之间。在一些实施例中，为35％，或在
35％至36％之间。应理解，每个范围代表本发明的不同实施方案。在其他实施方案中，部分脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰程度为55％，在一些实施例中为42％，在其他实施方例为35％，如以电位测量的。
58％的范围内。在一些实施例中，在45％至50％的范围内。在一些实施例中，部分脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰程度为59％，或在58％至60％之间，在一些实施例中为55％，或在54％至
55％之间，在一些实施例中为42％，或在41％至42％之间。在一些实施例中，为35％，或在
35％至36％之间。应理解，每个范围代表本发明的不同实施方案。在其他实施方案中，部分脱乙酰化的壳聚醣的脱乙酰程度为55％，在一些实施例中为42％，在其他实施方例为35％，如以电位测量的。
[0117] 根据本发明的一些实施例，壳聚醣-RNA纳米颗粒包含至少一种双股RNA。如本文所用，术语“双股RNA(dsRNA)”涉及通过碱基配对保持在一起的两股反向平行的多核糖核酸。“dsRNA”也可以描述为“dsRNA双股体(dsRNA duplex)”或“RNA双股体(RNA duplex)”或“双股体RNA(duplex RNA)”。两条股可以具有相同的长度或不同的长度，条件是在两股之间存在足够的序列同源性，形成双股结构，在整个长度上具有至少80％、90％、95％或100％的互补性。选择适合与本文所述的本发明一起使用的双股RNA之间的互补水平，以提供至少足够的互补，以影响目标RNA分子的基因沉默。
[0118] 在本发明的其他具体实施例中，壳聚醣-RNA纳米颗粒包含至少一种单股RNA。如本文所用，术语“单股RNA(ssRNA)”涉及单股多核糖核酸。当单股RNA是一沉默RNA，其针对目标生物体中特定目标序列(例如虾类序列如Rab7，或病原体序列如WSSV VP28，VP19或Rr2等)时，单股RNA可以与目标RNA序列或其一部分(“同义单股RNA”)相同，或者与目标RNA序列或其一部分(“反义单股RNA”)互补。在一些实施例中，纳米颗粒可包含有义和反义ssRNA的组合。
[0119] 应该注意的是，一些单股RNA序列可包含自身互补部分(self-complementary例如“回文(pallindromic)”或“亚序列(sub-sequences)”)，其在某些条件下可形成内部碱基配对的片段，而导致从本发明的纳米颗粒的单股RNA形成部分双股RNA。应该注意的是，单股或双股RNA可以根据对目标基因转录物(transcript)进行编码的DNA核酸序列来定义，并且应当理解，对应于一基因的编码序列的反义单股或双股RNA序列包含与所述基因编码序列的RNA互补，或所述基因转录成RNA的其他序列。
[0120] 单股或双股RNA可用于通过RNA沉默来向下调控(downregulatioon)基因的表达。如本文所用，术语“RNA沉默(RNA silencing)”是指一组调节机制例如，由RNA分子介导的[RNA干扰(RNA interference，RNAi)，转录基因沉默(transcriptional gene、TGS)，转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing、PTGS)、平息(guelling)、共抑制(co-suppression)和翻译抑制(translational repression)、其导致抑制或“沉默
(silencing)”一相应的蛋白质编码基因的表达，或在某些情况下，是抑制或“沉默”一编码功能性RNA产物的基因。在许多类型的生物中已经观察到RNA沉默，包括植物、动物(脊椎动物和无脊椎动物)和真菌。
(silencing)”一相应的蛋白质编码基因的表达，或在某些情况下，是抑制或“沉默”一编码功能性RNA产物的基因。在许多类型的生物中已经观察到RNA沉默，包括植物、动物(脊椎动物和无脊椎动物)和真菌。
[0121] 所述RNA可以是单股或双股RNA，其能够特异性地抑制或“沉默”目标基因的表达。在一些实施例中，RNA能够通过转录后沉默机制阻止mRNA分子的完整的加工程序(例如完整的转译和/或表达)。当用于基因沉默时，RNA包括非编码RNA分子，例如包含成对股的RNA双股体(RNA duplexes)，以及前体RNA(precursor RNA)，可以从其中产生这种小的非编码RNA。可用于RNA沉默的示例性RNA包括siRNA双股体、miRNAs和shRNAs。在一实施例中，RNA能够诱导RNA干扰。在另一实施方案中，RNA能够介导转译的抑制。在另一实施例中，RNA能够指导目标RNA的切割。这种目标RNA的切割可以通过RNAi途径实现，如下文详细描述。
[0122] 所述RNA的抑制性RNA序列与目标基因转录物(transcript)的部分可以大于90％相同，或甚至100％相同。在一些实施例中，所述RNA，例如双股RNA的双股体区域，可以在功能上定义为一核苷酸序列，能够通过互补碱基配对与病毒的目标mRNA分子结合，例如在严格条件下与一部分的目标基因转录物(transcript)杂合(例如400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，60℃杂合12至16小时；然后洗涤)。
[0123] 在一些实施例中，纳米颗粒的抑制性RNA序列是单同义的RNA序列，其包含至少一序列，与目标基因转录物(例如目标mRNA分子)具有至少90％序列一致性。
[0124] 与目标基因转录物互补或相同的双股或单股核苷酸序列的长度可以是至少约18、19、20、21、25、40、50、75、100、150、200、250、300、400、491、500、600或至少750或更多个碱基。在一些实施例中，与目标基因转录物互补或相同的双股或单股核苷酸序列包含至少20、至少约21、25、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400、491、500、600或至少750或更多个连续碱基。在一些实施例中，目标mRNA序列的长度可以是至少20、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少250、至少400、at至少500个、至少600个、至少750个碱基。
应当理解，每个长度代表一单独的实施例。
应当理解，每个长度代表一单独的实施例。
[0125] 在本发明一些方面的一些实施例中，对于多种养殖的水生甲壳类动物的病毒基因，单股或双股核苷酸序列的长度为约40至约450、约50至约450、约60至约350、约60至约300和约80至约250个核苷酸长度。在本发明一些方面的一些实施例中，对于其多种养殖的水生甲壳类动物的病毒基因，单股或双股核苷酸序列的长度为约50至350个核苷酸。在一具体的实施例中，单股或双股核苷酸序列的长度是125或250。应当理解，每个单独的范围代表不同且独立的实施例。
[0126] 本文所用的术语“对应于”是指多核苷酸序列对于一参考多核苷酸序列的全部或部分具有同源性(或一致性，例如100％同源性)。相反，术语“与...互补”在本文中用于表示一互补序列对于一参考多核苷酸序列的全部或部分的互补序列同源(或一致，例如100％同源)。例如，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”并且与参考序列“GTATA”互补。
[0127] 本教示涉及各种长度的单股或双股RNA，其中较短的形式(短于或等于50碱基(例如17-50))被称为siRNA或miRNA。长于51至600碱基的单股或双股RNA分子在本文中称为单股或双股RNA，其可进一步加工成siRNA分子。根据一些实施例，单股或双股RNA的核酸序列长度大于15个碱基或碱基对。根据其他实施例，单股或双股RNA的核酸序列长度为19至25个碱基或碱基对，长度为30至100个碱基或碱基对，长度为100至250个碱基或碱基对或长度为100至500个碱基或碱基对。根据其他实施例，单股或双股RNA的长度为300至600个碱基或碱基对，长度为350至500个碱基或碱基对，或长度为400至450个碱基或碱基对。在一些实施例中，单股或双股RNA的长度为400个碱基或碱基对。应理解，每个单独范围的RNA长度代表单独且不同的实施例。
[0128] 由于认为RNA的这些较长区域将导致诱导非特异性反应，长单股或双股RNA(即大于50bp的RNA)的使用非常有限。然而，使用长RNA可以提供许多优点，包括：细胞可以选择最佳的沉默序列，从而减少了测试多种siRNA的需求。长的单股或双股RNA将允许沉默资料库的复杂性低于siRNA所需的复杂性；并且或许最重要的是，当用作为治疗剂时，长的单股或双股RNA可以防止病毒逃逸突变。
[0129] 各种研究表明长的RNA可用于使基因表达沉默而不诱导压力反应(stress response)或引起显着的脱靶(off-target)效应，例如参见[Strat等人所著，核酸研究期刊Nucleic Acids Research,2006,Vol.34,No.13 3803–3810；Bhargava A等人所著，大脑研究建议期刊Brain Res.Protoc.2004；13:115–125；Diallo M.等人所著，寡核苷酸期刊Oligonucleotides.2003；13:381–392；Paddison P.J.,等人所著，美国国家科学院院刊Proc.Natl Acad.Sci.USA.2002；99:1443–1448；Tran N.等人所著，欧洲生化学会联合会期刊]。
[0130] 在一些实施例中，双股RNA可包含siRNA双股体(siRNA duplexes)。术语“siRNA”是指小抑制性RNA双股体(small inhibitory RNA duplexes，通常在17至30个碱基对之间，但也可更长例如31至50碱基对)，其诱导RNA干扰(RNAi)的途径。通常siRNAs化学合成为21聚体，具有一中心19个碱基的双股体区域，以及在末端对称的2碱基3'-突出端(2-base 3'-overhangs)，然而最近已公开了与同一位置的21聚体相比，化学合成的25至30个碱基长度的RNA双股体的效力提高了100倍。在诱发RNAi中使用较长RNA所获得的观察到的增加效力，理论上是由于向Dicer提供基质(substrate，27聚体)而导致，而非产物(21聚体)，并且这提高了siRNA双股体进入RISC的速率或效率。
[0131] 已经发现3'-突出端的位置影响siRNA的效力，在反义股上具有3'-突出端的非对称双股体，通常比同义股上具有3'-突出端的非对称双股体更有效(Rose等人所著，2005)。这可归因于非对称股加载到RISC中，因为当以反义转录物为目标时，观察到相反的效力模式。
[0132] 双股干扰RNA(例如siRNA)的股可以连接以形成发夹或茎环结构(例如，shRNA)。因此如上所述，本发明的一些实施中的双股RNA也可以是一短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)。短发夹RNA(shRNA)也可以由本发明的单股RNA的内部茎-环碱基配对(internal stem-and loop base-pairing)所产生。
[0133] 如本文所用，术语“短发夹RNA(shRNA)”是指具有茎-环结构的RNA试剂，其包含互补序列的第一和第二区域，所述区域的互补程度和取向足以使得碱基配对发生在所述区域之间。第一区域和第二区域由一环套区域(loop region)连接，所述环套(loop)由环套区域内核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对所产生。环套中核苷酸的数目是3个至23个、或5个至15个、或7个至13个、或4个至9个、或9个至11之间的数字。应当理解，这里指出的每个范围代表本发明的一单独实施例。所述环套中的一些核苷酸可以参与所述环中其他核苷酸的碱基对相互作用。可用于形成环套的寡核苷酸序列的实例包括5'-UUCAAGAGA-3'(SEQ ID NO：44)(Brummelkamp，TR等人所著(2002)科学期刊Science 296：550)和5'-UUUGUGUAG-3'(SEQ ID NO：45)(Castanotto，D等人所著(2002)RNA期刊RNA 8：1454)。本领域技术人员将认识到，所得单股寡核苷酸形成茎环或发夹结构，其包含能够与RNAi机制相互作用的双股区。
[0134] 根据本教示，单股或双股RNA分子可以是天然存在的或合成的。
[0135] 适用于本发明一些实施例的RNA的合成可以如下实现。首先，在AUG起始密码子的下游寻找AA二核苷酸序列以扫描目标mRNA序列(例如对甲壳类动物为致病的病毒的mRNA)。记录每个AA以及3'相邻的19个核苷酸的发生处作为潜在的siRNA目标位点。优选地，siRNA目标位点选自所述开放阅读框(open reading frame)，因为非转译区(untranslated regions,UTR)富含调节蛋白结合位点(regulatory protein binding sites)。UTR结合蛋白和/或转译起始复合物(translation initiation complexes)可能干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem。2：239-245]。虽然应当理解，针对非翻译区的siRNA也可能是有效的，这被GAPDH所证明，其中针对5'UTR的siRNA介导了细胞中mRNA GAPDH约
90％的下降以及完全消除蛋白浓度(参见Ambion公司网站-techlib 91/912)。
90％的下降以及完全消除蛋白浓度(参见Ambion公司网站-techlib 91/912)。
[0136] 其次，使用任何序列比对软件将潜在的目标位点与适当的基因组数据库(例如甲壳类动物)进行比较，例如可从NCBI服务器获得的BLAST软件(www.ncbi.nlm.nih.GOV/BLAST/)鉴定并过滤出与其他编码序列显示出显着同源性的推定目标位点。
[0137] 因此在一些实施例中，所述至少一RNA与目标核酸分子至少部分互补，或通过互补碱基配对与目标分子结合，或具有至少一种与目标mRNA分子的至少20个连续碱基相同的序列，并且与任何养殖的水生甲壳动物宿主基因序列没有任何显着的同源性。
[0138] 选择合格的目标序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是包括低G/C含量的序列，因为与G/C含量高于55％的序列相比，已经证明这些序列在介导基因沉默方面更为有效。优选地沿着目标基因的长度选择几个目标位点以用于评估。为了更好地评估所选择的siRNA，优选结合使用阴性对照。阴性对照siRNA可包括与所述siRNA具有相同的核苷酸组成，但与对基因组缺乏显着的同源性。因此，经常使用siRNA的乱序(scrambled)核苷酸序列，条件是它不与任何其他基因显示任何显着的同源性。
[0139] 单股或双股RNA可以使用本领域已知的任何方法合成，包括酵素合成或固相合成。如上所述，这些在具有或不具有修饰的短多核苷酸序列的情况下特别有用。用于进行固相合成的设备和试剂例如可从Applied Biosystems厂商购获得。也可以采用任何其他合成方法。实际寡核苷酸的合成完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以通过以下详述的已建立的方法来完成。，例如Sambrook,J.and Russell,D.W.所著(2001)“, 分子克隆:实验手册Molecular Cloning:A Laboratory Manual”；Ausubel,R.M.等人所著,eds.(1994,
1989),“现今分子生物学建议Current Protocols in Molecular Biology,”Volumes I-III,John Wiley&Sons,Baltimore,Maryland；Perbal,B.所著(1988)“,分子克隆实用指南A Practical Guide to Molecular Cloning,”John Wiley&Sons,New York；and Gait,M.J.,所著(1984)“,寡核苷酸合成Oligonucleotide Synthesis”；利用固相化学，例如氰乙基亚磷酰胺(cyanoethyl phosphoramidite)，然后例如通过自动三苯甲基方法(automated trityl-on method)或HPLC进行去保护、脱盐和纯化。
1989),“现今分子生物学建议Current Protocols in Molecular Biology,”Volumes I-III,John Wiley&Sons,Baltimore,Maryland；Perbal,B.所著(1988)“,分子克隆实用指南A Practical Guide to Molecular Cloning,”John Wiley&Sons,New York；and Gait,M.J.,所著(1984)“,寡核苷酸合成Oligonucleotide Synthesis”；利用固相化学，例如氰乙基亚磷酰胺(cyanoethyl phosphoramidite)，然后例如通过自动三苯甲基方法(automated trityl-on method)或HPLC进行去保护、脱盐和纯化。
[0140] 单股或双股RNA可以是长的和短的双股RNA分子的混合物，例如双股RNA、siRNA、siRNA+双股RNA、siRNA+miRNA、hpRNA或其组合。根据具体实施方案，双股RNA是siRNA(100％)。壳聚醣-RNA纳米颗粒还可以包含同义和反义单股RNA的混合物。
[0141] 应当理解，本发明的一些实施例的单股或双股RNA不必限于仅含有RNA的那些分子，还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
[0142] 在一些实施例中，本文提供的RNA可以与细胞穿透肽(cell-penetrating peptide)功能性结合。如本文所用，“细胞穿透肽(cell-penetrating peptide)”是指包含短的(约12至30个残基)氨基酸序列或功能基团的肽，其赋予与运输相关的非能量依赖性(即，非内吞作用)易位(translocation)性质，其与膜可渗透的复合物的传输相关，所述复合物穿过细胞的细胞浆和/或核膜。在本发明的一些实施例中，膜可渗透复合物中使用的细胞穿透肽优选包含至少一个非功能性半胱氨酸残基(cysteine residue)，其可以是游离的或衍生的，以与双股核糖核酸形成双硫键(disulfide link)所述双股核糖核酸被这种联系修改。赋予这些性质的代表性氨基酸基团序列于美国专号No.6,348,185中表列，其内容通过引用明确地并入本文。本发明的一些实施例的细胞穿透肽优选地包括但不限于穿透蛋白(penetratin)、转运蛋白(transportan)、pIs1、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。另一方面，在一些实施方案中，细胞穿透肽或转化剂(transformation agent)的使用是不期望的。因此，在一些实施例中，提供缺乏细胞穿透肽或任何其他形式的细胞穿透剂、转化增强剂的双股RNA。应该注意，在本发明的上下文中，细胞穿透肽、细胞渗透剂和转化增强剂不包括壳聚醣或聚合物，如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。
[0143] 根据另一个实施例，单股或双股RNA可以是microRNA前体，或“pri-miRNA”。
[0144] 术语“microRNA”、“miRNA”和“miR”是同义词，并且是指长度为约19至28个核苷酸的非编码单股RNA分子的集合，其调节基因表达。miRNA存在于广泛的生物体(病毒、人类)中，并且已被证明在发育、体内平衡和疾病病因学中发挥作用。
[0145] 以下是miRNA活性机制的简要说明。
[0146] 编码miRNA的基因被转录，导致产生miRNA前体“pri-miRNA”。pri-miRNA通常是多顺反子RNA(polycistronic RNA)的一部分，其包含多个pri-miRNA。pri-miRNA可以形成具有茎和环套的发夹。茎可包含错配(mismatched)的碱基。
[0147] pri-miRNA的发夹结构被Drosha识别，Drosha是RNase III内切核酸酶。Drosha通常识别pri-miRNA中的末端环套并将大约两个螺旋切割成茎部，以产生称为pre-miRNA的60至70的核苷酸的前体。Drosha以用典型的RNase III核酸内切酶交错切割以对pri-miRNA进行切割，产生具有5'磷酸和～2核苷酸3'突出端的pre-miRNA茎环。据估计，延伸超过Drosha切割位点的大约一螺旋转角(～10个核苷酸)对于有效加工是必不可少的。然后通过Ran-GTP和输出受体Ex-portin-5将pre-miRNA从细胞核主动转运至细胞质。
[0148] 然后通过Dicer识别pre-miRNA的双股茎部，Dicer也是一种RNase III内切核酸酶。Dicer还可以识别茎环底部的5'磷酸和3'突出端。然后Dicer切下末端环套距离茎环基部两个螺旋转角，留下额外的5'磷酸和～2个核苷酸3'突出端。所得到的siRNA双股体可能包含错配(mismatches)，并且包含成熟的miRNA以及大小类似的片段，其称为miRNA*。miRNA和miRNA*可以源自pri-miRNA和pre-miRNA的相对臂。miRNA*序列可以在克隆的miRNA的资料库中找到，但通常比miRNA的频率低。
[0149] 虽然miRNA与miRNA*最初存在为双股物质，但miRNA最终作为单股RNA并入称为RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)的核糖核蛋白复合物中。各种蛋白质可以形成RISC，这可以导致miRNA/miRNA*双股体的特异性，目标基因的结合位点，miRNA的活性(抑制或激活)的变异性，以及miRNA/miRNA*双股体的哪条链被加载到RISC。
[0150] 当miRNA：miRNA*双股体的miRNA股加载到RISC中时，miRNA*被去除并降解。加载到RISC中的miRNA：miRNA*双股体的股是其5'末端不太紧密配对的链。在miRNA：miRNA*的两端具有大致相同的5'配对的情况下，miRNA和miRNA*都可具有基因沉默活性。
[0151] RISC是根据miRNA和mRNA之间的高水平互补性来辨识目标核酸，尤其是miRNA的核苷酸2-7。
[0152] 许多研究已经探讨了miRNA及其mRNA目标之间的碱基配对要求，以实现有效的转译抑制(Bartel 2004所著，细胞期刊Cell 116-281)。在哺乳动物细胞中，miRNA的前8个核苷酸可能是重要的(Doench&Sharp所著2004基因发展期刊GenesDev 2004-504)。然而，microRNA的其他部分也可能参与mRNA结合。此外在3'处的充足碱基配对可以补偿5'处的不充足的配对(Brennecke等，2005PLoS 3-e85)。分析miRNA在整个基因组上的结合的计算研究已经表明miRNA的5'碱基2至7在目标结合中的特定作用，而第一个核苷酸的作用，通常被发现被辨识为“A”(Lewis等人所著，2005，细胞期刊Cell 120-15)。类似地，Krek等人(2005，自然基因学Nat Genet 37-495)使用核苷酸1至7或2至8来鉴定和验证目标。
[0153] mRNA中的目标位点可以在5'UTR、3'UTR或编码区中。有趣的是，多个miRNA可以通过识别相同或多个位点来调节相同的mRNA目标。在大多数遗传辨识的目标中存在多个miRNA结合位点，可以表明多个RISC的协同作用提供最有效的转译抑制。
[0154] miRNA可以引导RISC通过两种机制中的任一种向下调控基因表达：mRNA切割或转译抑制。如果mRNA与miRNA具有一定程度的互补性，则miRNA可以指定mRNA的切割。当miRNA指导切割时，切口通常在与miRNA的残基10和11配对的核苷酸之间。或者，如果miRNA不具有与miRNA的必需程度的互补性，则miRNA可以抑制转译。转译抑制可能在动物中更普遍，因为动物在miRNA和结合位点之间可能具有较低程度的互补性。
[0155] 应注意，任何一对miRNA和miRNA*的5'和3'末端可能存在差异。这种可变性可能是由于Drosha和Dicer的酵素加工相对于切割位点的可变性。miRNA和miRNA*的5'和3'末端的可变性也可能是由于pri-miRNA和pre-miRNA的茎部结构的错配。茎股的错配可能导致不同发夹结构的族群。茎部结构的可变性也可能导致Drosha和Dicer切割产物的可变性。
[0156] 因此，根据一些实施例中，壳聚醣-RNA纳米颗粒包含至少一RNA序列，能够通过互补碱基配对结合到多种养殖的甲壳类动物中致病病毒的目标mRNA分子，特别是多种养殖的水生甲壳类动物。目标mRNA可以是致病病毒的任何基因序列的转录物。来自致病病毒并且具有与这种目标mRNA序列互补的序列的基因被认为是目标基因，条件是目标序列与宿主基因没有实质同源性。
[0157] 在另一实施例中，壳聚醣-双股RNA纳米颗粒包含至少一RNA序列，至少部分地与多种养殖的甲壳类动物中致病病毒的目标mRNA互补，特别是多种养殖的水生甲壳类动物。
[0158] 在另一实施例中，壳聚醣-双股RNA纳米颗粒包含至少一RNA序列，与多种养殖的甲壳类动物中致病病毒的目标mRNA至少90％相同，特别是多种养殖的水生甲壳类动物。
[0159] 如本文所用，短语“病原体目标基因”或“病目标基因”定义为一病毒基因，所述基因的表达对病毒的毒力(virulence)、生长或致病性是必需的。术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关的病毒核酸的任何片段。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调控序列。例如，基因是指表达mRNA或功能性RNA的核酸片段，并且任选地编码特定蛋白质。
[0160] 病毒病原体目标基因包括但不限于病毒体蛋白(virion)的结构基因、功能蛋白的基因(例如与复制相关的基因)、与宿主甲壳类动物中的疾病或疾病症状相关的其他序列。
[0161] 如本文所用，短语“病毒病原体基因产物”是指病毒病原体基因表达的产物-包括但不限于病毒病原体基因的RNA转录物和由病毒病原体基因的序列所编码的肽或多肽。
[0162] 通过降低一病毒病原体基因的表达来实现治疗或预防病毒病原体的感染。因此，在一些实施例中，至少一种病毒病原体基因是一病毒基因，其表达在病毒病原体感染过程中开始或增加。例如Tsai等人所著(病毒期刊J Virol204,78：11360-370)公开了白斑综合症病毒基因，其表达可在病毒病原体感染期间改变(例如降低)。
[0163] 表I提供了与多种养殖的甲壳类动物疾病相关的病毒性疾病和病毒基因组的非限制性列表，其包含多个序列，其可以是本发明的壳聚醣-双股RNA纳米颗粒降低表达的目标。
[0164] 表1：水产中疾病与致病病毒：
[0165]
[0166]
[0167] 在一实施例中，所述至少一病毒病原体基因选自包衣(coat或衣壳capsid)蛋白、病毒复制酶(例如病毒RNA聚合酶viral RNA polymerases、解旋酶helicases)、病毒蛋白酶(viral proteases)和病毒几丁质结合蛋白(viral chitin-binding proteins)。因此，壳聚醣-双股RNA纳米颗粒可包含至少一RNA序列，通过互补碱基配对与至少一种病毒包衣或衣壳，及/或至少一种病毒复制的病毒酶，及/或至少一种病毒蛋白酶，及/或至少一种病毒几丁质结合蛋白的mRNA序列互补或者能够结合。
[0168] 表II提供了表I的致病病毒的一些基因(及其类别)的非详尽列表，其可以是用于通过本文所述的壳聚醣-双股RNA纳米颗粒降低表达的目标(例如目标基因产物)。
[0169] 表II来自甲壳动物病毒的病毒病原体基因的部分列表：
[0170]
[0171]
[0172] 应该理解，表II中公开的各个基因或序列代表本发明的单独的实施例。
[0173] 在一些实施例中，RNA包含一核酸序列，特异性减少选自以下群组所组成的基因产物：病毒衣壳蛋白28(VP28)基因、病毒衣壳蛋白19(VP19)基因，核糖核苷酸还原酶2(rr2)基因和白斑病毒WSV477基因。在一些实施例中，WSSV病毒衣壳蛋白28基因产物由SEQ ID NO：1或其部分所编码。WSSV病毒衣壳蛋白19基因产物由SEQ ID NO：2或其部分所编码。WSSV核糖核苷酸还原酶2(rr2)蛋白质基因产物由SEQ ID NO：3或其部分所编码。WSV477基因产物由SEQ ID NO：5或其部分所编码。例如，以养殖甲壳类动物的病毒病原体为目标的单股或双股RNA可以是WSSV特异性的单股或双股RNA，对应于WSSV序列的SEQ ID NO：1和2。可以根据来自在养殖的甲壳类动物中致病的任何病毒(或病毒)的序列，设计以病毒病原体为目标的其他合适的单股或双股RNA，例如，表II中详述的序列。
[0174] 本发明的壳聚醣-单股或双股RNA纳米颗粒也可用于使多种养殖的甲壳类动物的内源宿主基因的表达沉默。因此，在一些实施例中，所述至少一种RNA包括至少一种序列，与养殖的甲壳类动物或养殖的水生甲壳类动物的目标mRNA分子结合，或至少部分互补，或具有至少90％一致性。养殖的水生甲壳类动物的内源mRNA，其为使用双股RNA的目标，并且可包括但不限于在多种养殖甲壳类动物中致病病毒的任一者中，其表达与不被想要的表型性状相关的mRNA，或其表达与对任何感染的易感性、反应或抗性相关的mRNA。可以作为目标的示例性mRNA是编码病毒辨识基团的mRNA，其沉默对宿主甲壳类动物不是有害的。在其他实施方案中，双股RNA针对养殖的水生甲壳类动物的目标mRNA，其构成所需过程或途径的调节步骤，其沉默增加了所述途径的活性。
[0175] 此类目标可以包括负调节因子的mRNA，例如转录因子和信号传导途径，负责向下调节所需途径的受体的mRNA等。用于抑制表达的其他期望的内源目标可以包括但不限于负责提高增强生长、提高生长速度、改善饲料转化率、针对发育过程中的性别决定、影响风味、压力(温度、盐度、毒性、低氧张力、疾病、寄生虫等)抗性或耐受性、繁殖行为、甚至是使还没有驯化物种易于培养的基因和途径。在一具体实施例中，内源宿主基因目标是虾类Rab7基因，Rab7基因编码一Ras相关病毒蛋白VP-28结合蛋白，与白斑综合症病毒(WSSV)有关。在一些实施例中，壳聚醣-RNA纳米颗粒包含至少一序列，与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Ras相关蛋白(Rab7，登录号#JQ581679，SEQ ID NO：25)的mRNA序列互补或结合。在进一步的实施例中，壳聚醣-双股RNA纳米颗粒包含一双股RNA，所述双股RNA包含一序列，与Rab7的mRNA的SEQ ID NO：47结合、至少部分互补或具有至少90％的一致性。
[0176] 还考虑了包含多种RNA的壳聚醣-RNA纳米颗粒。因此在一些实施例中，壳聚醣-双股RNA纳米颗粒的双股RNA可以是同源的(homogeneous)，即全部皆与病毒病原体的mRNA目标分子的相同序列互补、结合或至少90％相同。此外，壳聚醣-RNA纳米颗粒的单股或双股RNA可以是异质的(heterogeneous)，例如与病毒病原体的相同mRNA目标分子的两个或更多个序列互补、结合或至少90％相同。在其他实施例中，单股或双股RNA可包含多种序列，与相同病毒病原体的不同mRNA目标分子互补、结合或至少90％相同。例如在一具体实施例中，本文所述的壳聚醣-RNA纳米颗粒的RNA包含多种序列与WSSV的任何一个、两个、三个或更多个序列互补、结合或至少90％一致。在一些实施例中，RNA包含多种序列，与SEQ ID No.1、2、3和5中的任何一者或多者互补、结合或至少90％一致。因此，额外的序列也可以与相同的目标mRNA互补、结合或至少90％一致，但来自其不同的区段，或者额外的序列可以与来自相同病毒病原体的显着不同的目标mRNA互补或结合。
[0177] 还考量了壳聚醣-RNA纳米颗粒，其中壳聚醣-RNA纳米颗粒的双股RNA包含单股或双股RNA，与两种或更多种不同病毒病原体的多种mRNA目标分子的各种核苷酸序列中的一或多者互补、结合或至少90％一致。例如，在一具体实施方案中，本文所述的壳聚醣-双股RNA纳米颗粒的RNA包括多种序列，与来自养殖的甲壳类动物中WSSV、GAV、INPV或任何其他致病病毒的各种序列中的至少一者互补、结合或至少90％一致。应当理解，如本文所述的纳米颗粒的单股或双股RNA可以包括多种序列，与目标mRNA的多种组合的所有物质互补、结合或至少90％一致，例如来自相同目标mRNA的一或多个序列，以及来自一或多个不同目标mRNA的一或多个序列。还考量了包含针对多个目标RNA序列的壳聚醣-RNA纳米颗粒。这种针对多个目标的双股RNA包括连续的双股RNA序列，设计成与多于一个目标序列互补、结合或至少90％一致，例如WSSV的所有SEQ ID No.1,2,3，其被包含在相同的单股或双股RNA多核苷酸上，当加工时，其可以产生与WSSV的多个目标互补、结合或至少90％一致的siRNA。本文所述的这种组合的优点尤其在于使用单一单股或双股RNA的壳聚醣-RNA配方的生产经济性和简单性。
[0178] 此外，还考量壳聚醣-RNA纳米颗粒包含单股或双股RNA，与一种以上的养殖的甲壳类动物的一或多种病毒病原体的目标mRNA互补、结合或至少90％一致。因此，壳聚醣-dsRNA纳米颗粒可例如包含双股RNA，与中南美白对虾(Litopanaeus vannamei)、草虾(Panaeus monodon)、日本对虾(Penaeus japonicas)以及/或淡水长臂大虾(Macrobrachium rosenbergii)所组成的一群组中的任何一或多种病理学病毒的目标mRNA互补、结合或至少90％一致。更进一步地，双股RNA可以与不同类型的养殖的甲壳类动物的病毒病原体互补、结合或至少90％一致，例如以蟹类病毒以及龙虾病毒为目标的的单股或双股RNA。这种多目标壳聚醣-RNA纳米颗粒在一整合的多营养水产养殖系统中特别有效，其中一种以上的甲壳类动物被养殖在一起。
[0179] 因此，在一些实施例中，RNA包含一核酸序列，与白斑综合症病毒的病毒衣壳蛋白28(VP28)基因、病毒衣壳蛋白19(VP 19)基因、核糖核苷酸还原酶2(rr2)基因和白斑病毒WSV477基因互补、结合或至少90％一致。在具体的实施例中，以WSSV为目标的RNA包含单股或双股RNA，与选自VP28序列SEQ ID NO：59、VP28序列SEQ ID NO：64或65、Rr2序列SEQ ID NO：78和Wsv477序列SEQ ID NO：79所组成的一群组的一WSSV RNA序列互补、结合或至少
90％一致。
90％一致。
[0180] 在一些实施例中，以WSSV为目标的RNA包含单股或双股RNA，与多于一种WSSV RNA序列互补或至少90％一致，例如两种或更多种WSSV序列(例如VP28、VP19、Rr2、Wsv477)。在具体的一实施例中，以WSSV为目标的RNA包含一单股或双股RNA(例如SEQ ID NO：66)，与多种WSSV序列的混合物的一部分互补或至少90％一致。在具体实施例中，以WSSV为目标的RNA包含单股或双股RNA，与VP28-VP19融合序列SEQ ID NO：77互补或至少90％一致。
[0181] 在更进一步的实施例中，壳聚醣-RNA纳米颗粒包含至少一额外的单股或双股RNA，其包含至少一额外序列，能够通过互补碱基配对，与多种养殖的甲壳类动物的一目标mRNA分子结合或至少90％相同的。在其他实施例中，壳聚醣-RNA纳米颗粒包含至少一额外的单股或双股RNA，包含至少一额外的序列，与多种养殖的甲壳类动物的一目标mRNA分子至少部分互补或至少90％相同。
[0182] 根据本发明的另一实施例，可以根据已知整合到宿主基因组中的病毒病原体目标序列、怀疑与病毒病原体感染抗性相关的目标序列、代表病毒病原体基因组的基因间区域的目标序列、以及显示对病原体生长和/或复制而言是关键的病原体特异性序列，来实现适合用于本发明的单股或双股RNA的合成。应当理解，在本发明的另一实施例中，单股或双股RNA以在病毒病原体的不同菌株之间或甚至在不同病毒病原体之间具有保守同源性的序列为目标，一旦鉴定出这样的序列，就可以有效对抗不止一种的病毒病原体菌株，甚至是不同病毒。
[0183] 从上文提供的描述中可以理解，使水生甲壳类细胞与miRNA接触可能以多种方式实现：
[0184] 1.用成熟的双股miRNA瞬时转染(transiently transfecting)宿主细胞；
[0185] 2.用编码成熟miRNA的表达载体(expression vector)稳定地或瞬时地转染宿主细胞；
[0186] 3.用编码pre-miRNA的表达载体(expression vector)稳定地或瞬时地转染宿主细胞。pre-miRNA序列可包含45至90、60至80或60至70个核苷酸。pre-miRNA的序列可包含如本文所述的miRNA和miRNA*。pre-miRNA的序列也可以是pri-miRNA的序列，所述序列排除了pri-miRNA的5'和3'末端的0-160个核苷酸。pre-miRNA的序列可包含SEQ ID NO：5至10的序列或其变体；
[0187] 4.用编码pri-miRNA的表达载体(expression vector)稳定地或瞬时地转染宿主细胞pri-miRNA序列可包含45-30,000、50-25,000、100-20,000、1,000-1,500或80-100个核苷酸。pri-miRNA的序列可包含如本文所述的pre-miRNA、miRNA和miRNA*及其变体。
[0188] 本发明提供了多种制备如本文所公开的壳聚醣-RNA纳米颗粒的方法。根据一些实施例，部分脱乙酰化的壳聚醣可以通过将壳聚醣(例如壳聚醣80/20分子量40-150kDa)溶解在乙酸中，加入乙酸酐(acetic anhydride)，根据需要搅拌(在室温或更高温度，例如40℃)(例如12小时)来制备，并通过使用强碱(例如NaOH)中和来终止反应。壳聚醣沉淀，现在所述部分脱乙酰化的壳聚醣可通过离心和反复洗涤以及对水透析(dialysis)以除去杂质来回收。然后可以将部分脱乙酰化的壳聚醣冻干(lyphilized)用于储存。
[0189] 由于壳聚醣的脱乙酰化程度取决于乙酸酐和壳聚醣的摩尔比，可加入更大量的乙酸酐以产生更部分地脱乙酰化的壳聚醣。在一些实施例中，将乙酸酐/壳聚醣的摩尔比(Ac2O)调节在0至500的范围内，以将脱乙酰度从约82％(Ac2O为0，无Ac2O)降低至约35％(摩尔比约为375)，两个值之间具有线性斜率。
[0190] 在一些实施例中，具有不同聚合物/RNA质量比的制剂可通过自组装(self-assembly)方法制备，同时保持单股或双股RNA的量恒定(20微克/毫升)。简而言之，将壳聚醣或其衍生物在温和酸性(例如0.2M乙酸钠缓冲(pH＝4.6))缓冲溶液中溶解至所需浓度(例如4％)。通过从原料液用相同缓冲液稀释，制备具有不同浓度(例如0.01％至0.1％)的工作溶液，然后可以与等体积的单股或双股RNA溶液(例如100微克/毫升在0.2摩尔浓度(M)醋酸钠缓冲液中)剧烈涡旋混合。在温育约1小时后，可以实现RNA与部分脱乙酰化的壳聚醣的结合。然后可以使用所述被组装的纳米颗粒而无需进一步纯化。
[0191] 根据一些实施例的一些方面，所述至少一RNA包含至少一序列，能够通过互补碱基配对，与在多种养殖的甲壳类动物中致病病毒的目标mRNA分子结合，或至少90％一致。在其他实施例中，所述至少一双股RNA包含至少一序列，与多种养殖的甲壳类动物的致病病毒的目标mRNA分子至少部分互补或至少90％一致。
[0192] 如本文所用，术语“在多种养殖的甲壳类动物中病毒病原体”或“致病病毒”是指一含有核酸的病毒剂，通过破坏甲壳类动物的正常功能和/或生长，能够在养殖的甲壳类动物内增殖，通常是通过侵入细胞或生物体的细胞，并利用甲壳类动物的细胞、营养物、代谢物和/或能量代谢来进行病毒繁殖。如本文所用，术语“病毒”是指亚微观感染因子(submicroscopic infective agent)的一大群体中的任何一种，其被视为极其简单的微生物或极其复杂的分子，其通常包含围绕遗传物质的RNA或DNA核心的蛋白质外壳。但没有半透膜，只能在活细胞中生长和繁殖，并且在人类、低等动物或植物中引起各种重要疾病。因此“在多种养殖的甲壳类动物中病毒病原体”可以是破坏甲壳类动物正常功能或生长的任何一种或多种病毒。水产养殖病毒及其宿主生物和相关疾病的详细列表可在“鱼类网站(Fish Site)”和美国农业部的网站上获得(也见本文表I)。
[0193] 本文所用的术语“养殖的甲壳动物(farmed crustacean)”是指甲壳类动物，其严格地或部分地是水生的(即在水中生活至少一部分生物体的生命周期)，并且在水产养殖环境中由人类培育(即生长)。水产养殖环境可包括人造水池、人造池塘、网笼、围栏和其他类型的封闭。这里使用的术语“水产养殖环境”与术语“水产养殖系统”同义。以下描述了适用于本文公开的组合物和方法的多个方案和不同类型的水产养殖环境。
[0194] 一种水产养殖环境是海水养殖，这是一种水产养殖的一种分支，在开放性的海域或充满海水的水池或池塘的一封闭性的部分中养殖海洋生物。海鱼(例如比目鱼flounder和白鲑whiting)，海洋甲壳类动物(例如对虾prawns、虾shrimps、龙虾lobsters和螃蟹crabs)和海洋软体动物(例如牡蛎oyster和鲍鱼abalone)可以在海水中培养。淡水水产养殖适用于淡水物种，包括鱼类(例如罗非鱼tilapia、鳟鱼trout)，甲壳类动物(例如小龙虾crayfish)和淡水软体动物(例如蛤蜊clams)。有些物种特别适合在咸淡水(brackish water、鲤鱼carp、鲶鱼catfish)中培养。
[0195] 一些水产养殖系统使用流动水，以提供含氧水并消除废物。其他水产养殖环境或所有封闭的水域，无法获得负担得起的流动水再循环部分，而还有其他的系统采用各种技术(喷洒、桨动)对封闭的静止水域进行通气。一些水产养殖系统使用水处理系统，例如修复(remediation，例如生物修复bio-remediation)系统，例如Bradley等人在美国专利No.8,506,881中描述的再循环系统。
[0196] 水产养殖环境可以包括开放的池塘系统，例如池塘、水池、围栏和湖泊，水面暴露在开放的空气，或封闭的池塘系统，其中池塘被覆盖，可以更好地控制阳光、温度和气体。
[0197] 一些水产养殖系统是单一养殖系统，在整个水产养殖环境中养殖单一种类的甲壳类动物。单一栽培具有许多优点(易于采获，简单的营养需求)，但也有缺点，单一物种的养殖不允许营养物的再循环。另一方面，综合多营养水产养殖(integrated multitrophic aquaculture,IMTA)在同一水产养殖环境中共同培育许多不同的物种，因此可将组成物种的营养需求结合到回收养分的单一系统中(例如鱼类和甲壳类废物当一起栽培时，为软体动物和海藻提供营养)。
[0198] 在一些实施例中，适用于本发明的方法和组合物的养殖的甲壳类动物是水生虾(shrimps)、对虾(prawns)等。在一些实施例中，适用于本文公开的发明的养殖甲壳类动物选自虾(shrimps)、对虾(prawns)、螃蟹(crabs)、龙虾(lobster)和小龙虾(crayfishes)。特别地，在一些实施例中，养殖的甲壳类动物是虾和/或对虾。具体地，在一些实施例中，虾或对虾选自中南美白对虾(Litopanaeus vannamei)、草虾(Panaeus monodon)、日本对虾(Penaeus japonicas)以及/或淡水长臂大虾(Macrobrachium rosenbergii)。
[0199] 上面的表I包括养殖甲壳类动物的示例性病毒病原体的非详尽列表，其引起或促进所指示的宿主甲壳类动物中的指定疾病，并且其对宿主生物的影响可能易于通过本发明的组合物和方法而被治疗或预防。。
[0200] 根据本发明的一实施例，病原生物是一病毒，在养殖的甲壳类动物中引起或促进病毒性疾病，例如白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV登录号AF332093)、桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus，TSV登录号NC_003005)、黄头病毒(Yellowhead Virus，YHV，登录号FJ848673.1)、鳃相关病毒(Gill-Associated Virus，GHV，登录号NC_010306.1)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(Infectious Hypodermal and
Haematopoietic Necrosis Virus，IHHNV，登录号NC_002190)、传染性肌坏死病毒(Infectious Myonecrosis Virus，IMNV，Accesion No.KR815474.1)、罗氏沼虾诺达病毒(Macrobracium rosenbergii nodavirus，MrN病毒，登录号NC_005094.1(1)和NC-005095.1(2))和传染性胰腺坏死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus，IPNV，登录号NC
001915.1(A)和NC 001916.1(B))。
Haematopoietic Necrosis Virus，IHHNV，登录号NC_002190)、传染性肌坏死病毒(Infectious Myonecrosis Virus，IMNV，Accesion No.KR815474.1)、罗氏沼虾诺达病毒(Macrobracium rosenbergii nodavirus，MrN病毒，登录号NC_005094.1(1)和NC-005095.1(2))和传染性胰腺坏死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus，IPNV，登录号NC
001915.1(A)和NC 001916.1(B))。
[0201] 本发明人揭示了多种组分和某些参数之间的关系，所述参数表征本发明的壳聚醣-双股RNA纳米颗粒，其严重影响了壳聚醣-双股RNA纳米颗粒在预期目标上结合和递送双股RNA的有效性。纳米颗粒的质量比(壳聚醣的质量相对于纳米颗粒中的双股RNA的质量)随所用壳聚醣的脱乙酰化程度而变化。质量比的增加导致纳米颗粒的平均尺寸增加(参见下文的实施例1和图4A)。纳米颗粒尺寸可以以多种方式测量，包括动态光散射、透射电子显微镜、BET(特定表面积)和有效z平均直径。
[0202] 因此在一些实施例中，纳米颗粒的粒度在50-500纳米，65-350纳米，75-300纳米、80-250纳米、100-200纳米、120-180纳米和140-160纳米的范围内。通过有效z-平均直径测量的纳米(nm)。在特定实施例中，通过有效z-平均直径测量，本发明的纳米颗粒的尺寸范围为150-250纳米。在其他实施例中，通过有效z-平均直径测量，纳米颗粒为150-200纳米。在其他实施例中，通过有效z-平均直径测量，纳米颗粒为200-250纳米。通过有效z-平均直径测量，本发明的一些纳米颗粒测量为140-180纳米，或175-250纳米。通过有效z-平均直径测量，本发明的特定壳聚醣-RNA纳米颗粒测量为100-200纳米。
[0203] 受壳聚醣的脱乙酰化程度和负载在纳米颗粒上的单股或双股RNA的量影响的另一纳米颗粒参数是RNA-壳聚醣纳米颗粒的表面电荷(z-电位)，对于正确摄取和递送RNA于目标也是很重要的。
[0204] 一纳米颗粒的表面电荷的测量可以通过多种方法实现，包括结合施加的电场(电泳)的动态光散射(dynamic light scattering，DLS)。当使用DLS电泳测定时，纳米颗粒的表面电荷的精确计算取决于测定期间的场内的pH。在纳米颗粒中，Z电位是颗粒之间静电荷排斥或吸引的指示剂，影响悬浮颗粒的稳定性(倾向聚集)，以及纳米颗粒在目标处与细胞膜相互作用的质量，在表面上吸收到目标细胞中。
[0205] 本发明人发现，当在相同的质量密度值下测量时，部分脱乙酰化的壳聚醣纳米颗粒(例如55％和42％脱乙酰化)的特征在于正电荷以及z-电位比未处理的壳聚醣低(参见实验1和图4B)。
[0206] 因此在一些实施例中，在pH 4.6下测量的纳米颗粒的表面电荷(z-电位)在5-100毫福特(mV)、10-90毫福特(mV)、15-85毫福特(mV)、15-25毫福特(mV)、20-75毫福特(mV)、30-60毫福特(mV)、40-50毫福特(mV)和45-50毫福特(mV)的范围内。在特定实施方案中，本发明的纳米颗粒的表面电荷在15-25毫福特(mV)、15-25毫福特(mV)、12-20毫福特(mV)和
12-15毫福特(mV)的范围内。
12-15毫福特(mV)的范围内。
[0207] 进行壳聚醣的化学修饰以增强其基因转染效率。最常见的是，使用反应性氨基(C2位置)和羟基(C6和C3位置)，壳聚醣可以疏水性、亲水性、两亲性CPPs和细胞特异性配体(ligand)进行结构修饰。
[0208] 因此，本发明的壳聚醣-RNA纳米颗粒还可以通过化学修饰(除了降低上述脱乙酰化程度之外)制备，例如增强单股或双股RNA在目标细胞上的结合和递送的有效性。因此，根据一些实施例，壳聚醣-RNA纳米颗粒还包含一聚合物。适用于添加到本发明的纳米颗粒中的聚合物的非限制性列表包括聚(赖氨酸)(poly(lysine)，PLL)、线性聚乙烯亚胺(linear polyethyleneimine，1-PEI)、支化聚乙烯亚胺(branched polyethyleneimine，b-PEI)、聚(乙二醇)(poly(ethylene glycol)，PEG)、G3树枝状聚(酰胺胺)(G3dendritic poly(amido amine)，PAMAM)、线性聚(氨基胺)(linear poly(amino amine)，PAA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)和聚(β-氨基酯)(poly(beta-amino ester)，PBAE)。
[0209] 在一些实施例中，本文所述的壳聚醣-RNA纳米颗粒还可包含聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。在一实施例中，PEG的分子量在选自1至10千道尔顿(kDa)、2至8kDa、1至5kDa和2至5kDa的范围内。在一具体实施例中，PEG的分子量在2至5kDa的范围内。然而也可以使用不同分子量的PEG。应理解，PEG化合物包含具有一系列分子量的PEG分子组群，并且所指示的分子量涉及化合物的平均分子量。
[0210] 虽然不希望受理论束缚，但与PEG的结合可以防止或减少体内纳米颗粒聚集并增强纳米颗粒的稳定性。
[0211] 因此，本公开的纳米颗粒的PEG化可以提供一制剂，用于通过喂食增强口服递送。
[0212] 因此，本公开中一种制备壳聚醣-RNA纳米颗粒的方法可以进一步包括将纳米颗粒与聚乙二醇(PEG)混合和温育的步骤。由于利用PEG基团进行共价修饰需要PEG化合物，在一端含有反应性或可做为目标的官能团，因此修饰的PEG化合物(例如胺反应性PEG化合物)可用于本文所述的壳聚醣-RNA的PEG化。这种合适的修饰的PEG化合物包括但不限于PEG-NHS(一端具有NHS酯的PEG)，MS(PEG)n或m-PEG-NHS(methyl-PEGn-NHS ester，甲基-PEGn-NHS酯)，支化的PEG NHS等等。适用于所公开的纳米颗粒的PEG化合物的详细列表可商购获得，例如，购自Creative PEGworks公司(Chapel Hill，NC)。
[0213] 根据一实施例，为了使壳聚醣聚乙二醇化(PEGylate)，将壳聚醣或部分脱乙酰化的壳聚醣溶解在3％乙酸中，剧烈搅拌，超声处理并调节pH(高度脱乙酰化的壳聚醣可调节至微酸性pH值，例如pH 6.5，而部分脱乙酰化的壳聚醣可以调节至稍微更碱性的pH值，例如pH 7.0)。通过加入PEG-NHS或mPEG-NHS引发PEG化，并在搅拌下孵育24小时，然后对dd H2O透析，并冻干以用于储存。PEG化反应可以产生PEG化纳米颗粒，其具有不同程度的壳聚醣分子PEG化。在一些实施例中，纳米颗粒的PEG化壳聚醣的PEG化程度为1至60％、5至50％、10至40％、15至35％、5至40％和20至30％的PEG化的壳聚醣纳米颗粒。应理解，每个单独的PEG化范围代表一单独立的实施例。
[0214] 然后可以如所述对非PEG化纳米颗粒进行PEG化的壳聚醣-RNA纳米颗粒的形成。在一具体实施例中，PEG化纳米颗粒包含PEG化的壳聚醣-RNA，其具有5至40％的范围的PEG化。
[0215] 所公开的PEG化的壳聚醣-RNA纳米颗粒还可以以聚合物(PEG化的壳聚醣)与RNA的比率来表征，即聚合物/单股或双股RNA比率。在一些实施例中，聚合物(例如PEG化的壳聚醣)/RNA比率在2：1至15：1、4：1至12：1、5：1至10：1和6：1至8：1的范围内。在一具体实施例中，由未处理的高度脱乙酰化的壳聚醣所制备的纳米颗粒的聚合物/双股RNA比率为约8：1。在一些实施例中，
[0216] 如本文所公开的部分脱乙酰化的壳聚醣-RNA纳米颗粒的聚合物/RNA比率在10：1至100：1、20：1至85：1、25：1至70：1、35：1至60：1和40：1至50：1的范围内。应理解，每个单独的聚合物/RNA比率范围代表单一独立的实施例。在一具体实施例中，由部分脱乙酰化的壳聚醣-RNA所制备的纳米颗粒的聚合物/RNA比率为约50：1。
[0217] 纳米颗粒维持其结构完整性的能力对于它们作为RNA“有效负载(payload)”递送载体的功效是至关重要的。应当理解，将RNA复合到部分脱乙酰化的壳聚醣-RNA纳米颗粒中增强了核酸的稳定性，如对于壳聚醣-双股RNA纳米颗粒(参见实施例III)和/或本发明的壳聚醣-单股RNA纳米颗粒所示(参见实施例IV)。因此，在一些实施例中，壳聚醣-RNA纳米颗粒是稳定的纳米颗粒。
[0218] 如本文所用，术语“稳定的壳聚醣-RNA纳米颗粒”定义为一纳米颗粒，即使在严厉的条件下也保持RNA“有效负载”的一显着部分。一种合适的稳定性测量是维持初始RNA“有效负载”的大部分能力。因此，在一些实施例中，壳聚醣-RNA纳米颗粒是稳定的纳米颗粒，当暴露于水性环境(海水、淡、微咸水等)时保留至少60％的复合物RNA。在其他实施例中，当暴露于水性环境或介质时，壳聚醣-RNA纳米颗粒保留复合物的RNA的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。在具体的实施例中，当暴露于pH值范围为4.2至8.0的水性环境时，壳聚醣-RNA纳米颗粒保留复合物的RNA的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。在一些实施例中，水性环境或介质的pH值在6.5至7.8的范围内，或更具体地为pH 7.5。
[0219] 所公开的脱乙酰壳多醣-双股RNA纳米颗粒可用于治疗或预防养多种殖甲壳类动物的疾病。所公开的纳米颗粒或包含纳米颗粒的组合物，可以多种施用方法被提供或被施用于多种养殖的甲壳类动物，包括喂食、与鳃组织接触、通过眼睛、通过皮肤或角质层(在蜕皮期间特别重要)并通过外部伤口(切口或擦伤)。还考量了肠胃外施用包含所公开的纳米颗粒的组合物。
[0220] 在具体的实施例中，所公开的壳聚醣-RNA纳米颗粒可以作为营养药物组合物提供(例如施用)，包含养殖的甲壳类食物和本文公开的壳聚醣-RNA纳米颗粒。在一些实施例中，营养药物组合物包含含有一单一序列的单股或双股RNA的纳米颗粒，即全部针对一单一目标RNA序列。在其他实施例中，营养物包含壳聚醣-RNA纳米颗粒，其包含针对一种以上目标mRNA序列的单股或双股RNA，如本文详述。总之，应注意，营养物可包含本文描述或提出的任何壳聚醣-RNA纳米颗粒，或其任何组合。
[0221] 如本文所用，术语“营养药物组合物”是“营养组合物”和“药物组合物”的组合，并且是指对生物体具有一或多种有益作用的可摄入物质，如一养殖甲壳类动物。术语“营养药物”还可以指存在于可摄入物质中的一种或多种化合物。可摄入物质包括但不限于膳食补充剂、食物等。术语“营养药物”和“营养补充剂”可互换使用。具有有益的生物学、营养学或药学性质的物质(例如食品、营养品或药物)是指所述物质提供如本文所述的个体一种或多种健康益处的能力(例如，对预防、减少和/或治愈本文所述的一种或多种疾病和/或病症。
[0222] 可施用营养药物组合物以治疗疾病或使基因沉默，并且本文描述了待治疗的养殖甲壳类动物的实例，以及可在治疗的甲壳类动物中预防或治愈的疾病的实例。取决于待治疗的养殖甲壳类动物，可以通过将壳聚醣-RNA纳米颗粒与甲壳类动物的饲料一起提供，或者在一些虾类或其他甲壳类动物的情况下，通过将其提供在动物生活的水中来施用制剂。应理解，壳聚醣衍生自几丁质，其构成许多海洋和淡水物种的饮食的重要部分。此外众所周知，海洋甲壳类动物是同类相食的，它们为自己族群的成员以及非相关人群提供食物。因此，本文所述的壳聚醣-RNA纳米颗粒还可以有效地将单股或双股RNA递送至养殖的甲壳类动物，而不与饲料组合，所述饲料在生物体所在的水产养殖环境的水中提供。
[0223] 应当理解，所述营养药物当作为饲料提供时，或者在养殖的甲壳类动物对象的水饲喂时，可以取决于甲壳类动物对象的摄取，但也可以通过与甲壳类动物对象的组织接触来介导，例如接触鳃、眼睛或其他表面，其可以允许将本文所述的纳米颗粒，例如整个纳米颗粒，或甚至只有纳米颗粒的单股或双股RNA组分转移到宿主甲壳类动物对象的细胞。
[0224] 可以将多个纳米颗粒与生理学上可接受的载体和/或佐剂一起引入甲壳类动物中。有用的载体在本领域中是公知的，包括例如水、缓冲水、盐水、甘氨酸(glycine)、透明质酸(hyaluronic acid)等。如上所述，所得的水溶液可以按原样包装或冻干，冻干的制剂在给药前再与水混合。组合物可含有药学上可接受的辅助物质，其接近生理条件的所需，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠(sodium acetate)、乳酸钠(sodium lactate)、氯化钠(sodium chloride)、氯化钾(potassium chloride)、氯化钙(calcium chloride)、脱水山梨糖醇单月桂酸酯(sorbitan monolaurate)、三乙醇胺油酸酯(triethanolamine oleate)等。在本发明的一实施例中，将纳米颗粒包封，使得所得的组合物具有防水性，但易于在甲壳类动物宿主的消化系统内释放。在另一实施例中，将分子与粘合剂组合，所述粘合剂有助于使分子与饲料结合，这对于口服给药特别有用。这种防水结合物质可以是具有这种性质的任何物质。实例包括但不限于琼脂糖(agarose)或其他糖化合物、白蛋白(albumin)、藻酸盐(alginate)或任何类似的组合物。
[0225] 本发明的组合物可以在饲料中提供。养殖水生物种的饲料包括鱼油和蛋白质以及植物蛋白质、矿物质和维生素，其可以满足鱼类或甲壳类动物的营养需求，并且还可以为人类提供健康益处(食用养殖物种)。传统上，鱼类的饮食含有30至50％的鱼粉和油。适合饲养养殖的水生鱼类、甲壳类动物和软体动物的饲料在配方上可以相似或不同。例如，鱼可以喂食各种食物，包括但不限于鱼粉、豌豆籽粉、麦麸、小麦粉、血粉、维生素、玉米麸质和小麦面筋。
[0226] 甲壳类动物可以喂食各种食品，包括但不限于大豆油饼(soybean oil cake)、鱼粉、鱼油、小麦粉、豆粕、鱿鱼油、啤酒酵母、虾粉、鱿鱼粉、苜蓿、小麦面筋、鱿鱼肝粉、酵母、虾头餐、虾壳粉和维生素。这些可以以多种形式提供，例如作为饲料颗粒。
[0227] 本发明的一些实施方案的组合物可进一步包含表面活性剂、惰性载体媒介物(inert carrier vehicle)、防腐剂、进食刺激剂、引诱剂(attractant)、包封剂(encapsulating agent)、粘合剂(binder)、乳化剂、染料、和紫外线保护剂、缓冲剂、流动剂或微量营养素供体(例如维生素)以及影响养殖的甲壳类动物的健康或生长或压力/疾病耐受性的药物或其他制剂中的至少一种。
[0228] 通过将纳米颗粒与养殖的甲壳类动物的饲料混合，可以将本发明的壳聚醣-RNA纳米颗粒制备成用于养殖的甲壳类的营养药物。本发明的壳聚醣-RNA纳米颗粒可以以不同的方式与养殖的甲壳类食物混合，例如可以通过将制剂与现成的饲料混合，并进行空气干燥，以将颗粒添加到虾类饲料中，然后用鱼油或明胶喷洒混合物。在一些实施例中，壳聚醣-RNA纳米颗粒可与进料混合，以作为制剂(液体)，然后用明胶(gelatin)喷洒饲料上方。饲料也可以用明胶和壳聚醣-RNA纳米颗粒的液体制剂进行上方喷洒。壳聚醣-RNA纳米颗粒的干粉制剂也可以使用，例如通过喷洒干燥壳聚醣-RNA纳米颗粒，将所喷洒的干燥的壳聚醣-RNA与饲料成分混合，并在上方喷洒明胶。
[0229] 在一些实施例中，纳米颗粒与饲料以每公克虾和/或对虾饲料约10至10,000微克的单股或双股RNA，每公克虾和/或对虾饲料约50至8,000微克的单股或双股RNA，每公克虾和/或对虾饲料约100至5,000微克的单股或双股RNA，每公克虾和/或对虾饲料约200至1,000微克的单股或双股RNA，每公克虾和/或对虾饲料约250至5,000微克的单股或双股RNA，每公克虾和/或对虾饲料约500至5,000微克的单股或双股RNA的比例混合。应当理解，每克饲料双股RNA比率的各范围代表单一独立的实施例。在一具体实施例中，以每公克虾和/或对虾饲料约50至500微克的单股或双股RNA的比例混合。在一具体实施例中，甲壳类动物是虾(shrimps)和/或对虾(prawns)，营养组合物以每日喂食的虾体重的3至10％的剂量提供。
在具体的实施例中，本发明的纳米颗粒或营养药物组合物以每次喂食虾体重的5％的剂量提供。
在具体的实施例中，本发明的纳米颗粒或营养药物组合物以每次喂食虾体重的5％的剂量提供。
[0230] 提供纳米颗粒或营养药物组合物(方案)的频率将随着养殖的水生物种而变化，并且在一些情况下，随着养殖生物的生命周期的特定阶段有所不同。因此，在一些实施例中，养殖的生物是虾和/或对虾，并且本发明的纳米颗粒或营养药物每个虾和/或对虾的生命周期提供1至10次、2至8次、3至6次或1至3次。在一个具体实施例中，养殖的甲壳类动物是虾(shrimps)和/或对虾(prawns)，并且本发明的纳米颗粒或营养药物，每个虾和/或对虾的生命周期提供1至3次。在另一实施例中，每天至少喂食一次、两次、至少三次、至少四次、五次或更多次，并且每个喂养期延长至至少两天、至少三天、至少四天、五天、或更多天。在一些特定的实施例中，每天喂食至少三次。在另一实施例中，每个喂食周期延长至至少五天。
[0231] 因此，本发明提供了通过向养殖的甲壳类动物给予本发明的制剂或营养组合物来治疗或预防疾病或使基因沉默的方法。制剂可以通过本文所述的任何方式施用。如本文所述，本发明的纳米颗粒还可用于制备用于治疗病毒性疾病或使病毒基因沉默的药物。本文提供了适用于以本发明的组合物和方法治疗的病毒性疾病或养殖甲壳类动物的病症，以及与其相关的致病病毒的非限制性列表(参见表1)。
[0232] 在一些实施例中，通过养殖的甲壳类动物摄取本发明的纳米颗粒或营养药物组合物，导致养殖的甲壳类动物中致病病毒的至少一基因产物的水平降低，所述降低是与至少一相同的养殖的甲壳类动物的所述致病病毒基因产物的水平相比，所述至少一相同的养殖的甲壳类动物摄入不含有以所述致病病毒的基因产物为目标的单股或双股RNA。在其他实施例中，通过养殖的甲壳类动物摄取本发明的纳米颗粒或营养药物组合物，导致养殖的甲壳类动物中致病病毒的水平降低，所述降低是与至少一相同的养殖的甲壳类动物的所述致病生物的水平相比，所述至少一相同的养殖的甲壳类动物摄入不含有以所述致病病毒的基因产物为目标的单股或双股RNA。
[0233] 利用本发明的纳米颗粒和组合物，可以长期实现保护养殖的甲壳类动物抵抗病毒病的。在喂食至少一次以致病病毒为目标的纳米颗粒或营养药物组合物后的保护期已经达到，并且至少两周、至少20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天或更长时间的保护可以使用本发明而实现。应当理解，每个单独的时期代表单一独立的实施例。
[0234] 在一些实施例中，甲壳类动物接触或摄取纳米颗粒或营养药物导致所述养殖甲壳类的存活率、产量、生长速率、活力(vigor)、生物量、饲料转化率、大小、味道品质和气味或胁迫耐受性增加，所述增加是与所述养殖的甲壳类动物的摄入不含有以所述致病病毒的基因产物为目标的单股或双股RNA相比。
[0235] 发明人已经表明，本发明的壳聚醣-单股RNA纳米颗粒以及壳聚醣-双股RNA纳米颗粒的施用，其包含以WSSV病毒序列为目标的RNA序列，且可有效地保护虾免受感染以极致死性的WSSV感染的病症。因此，在一些实施例中，所述养殖的甲壳类动物摄取或接触本发明的壳聚醣-RNA纳米颗粒或营养药物导致所述养殖的甲壳类动物的存活率增加，所述增加是与所述养殖的甲壳类动物摄取不具有以所述致病病毒的基因产物为目标的单股或双股RNA的饲料相比或是与所述养殖的甲壳类动物未接触所述致病病毒的基因产物为目标的单股或双股RNA相比。如本文所用，术语“存活(survival)”定义为维持生存力，死亡表明缺乏“存活(survival)”。
[0236] 如本文所用，术语“病毒病理学(viral pathology)”或“病原体病毒感染(pathogen viral infection)”定义为养殖甲壳动物的生理学、形态学、繁殖适合度、经济价值、活力(vigor)、生物量、味道品质、气味、胁迫耐受性的不期望的变化，是与养殖的甲壳类致病病毒接触直接或间接所引起。根据本发明的一实施例，不期望的变化包括但不限于生病的或病原体感染的甲壳类动物的生物量和/或产量。根据本发明的另一实施例，产量的变化包括但不限于每单位体基水产养殖的产量变化、养殖甲壳类动物的质量变化、风味质量和气味质量(例如肉质)等。在一些实施例中，宿主甲壳类动物是虾、对虾或小龙虾，并且致病性病毒是白斑综合症病毒。在一些实施例中，WSSV感染在宿主甲壳类动物中引起白斑病。
[0237] WSSV的临床症状包括食物消耗的突然减少、昏睡、角质松散和通常微红的变色，并且在甲壳的内表面上存在直径为0.5至2.0毫米的白点，附属物和角质层布满腹部。在鳃上皮、触角腺、造血组织、神经组织、结缔组织和肠上皮组织中观察到组织学变化。受感染的细胞有明显的核内闭塞(intranuclear occlusions)，最初染色为嗜酸性，但随着年龄的增长变得嗜碱性；肥大细胞核具有染色质边缘(hypertrophied nuclei with chromatin margination)；和细胞质清除(cytoplasmic clearing)。发病机制涉及广泛的组织坏死和崩解。
[0238] 在扫描电子显微镜下被感染的虾类的壳上的白点看起来像甲壳上(carapase)的大的圆顶形(dome-shaped)斑点，测量直径为0.3至3毫米。0.02至0.1毫米的较小白点表现为角质层表面上的多个连接球体。斑点的化学成分类似于甲壳，钙占总物质的80％至90％，并且暗示其来源于表皮(cuticular epidermis)的异常。
[0239] 报导已指出在用所述病毒感染后发生许多生化变化：葡萄糖消耗和血浆乳酸浓度增加，葡萄糖6磷酸脱氢酶(glucose 6phosphate dehydrogenase activity)活性增加和甘油三酯(triglyceride)浓度降低。线粒体的电位依赖性阴离子通道也被向上调节。
[0240] 如本文所用，短语“胁迫耐受性(stress tolerance)”是指对生物胁迫的耐受性和对非生物胁迫的耐受性。本文所用的短语“非生物胁迫(abiotic stress)”是指由非生物剂(abiotic agent)引起的对宿主甲壳类动物的代谢、生长、活力(vigor)和/或繁殖的任何不利影响。任何次优(suboptimal)的环境生长条件都可以诱导非生物胁迫，例如氧气不足、高浓度的毒素、水中的污染物或废物、水温低或高、重金属毒性、营养水平高或低(例如营养缺乏)、高盐或低盐水平(如盐度)、大气污染、高光或低光强度(如光线不足)或紫外线照射。非生物胁迫可以是短期效应(例如急性效应，例如持续约一周)，或者可以是持久的(例如慢性效应，例如持续例如10天或更长)。本公开考虑了存在单一非生物胁迫条件的情况或者发生两种或更多种非生物胁迫的情况。
[0241] 如本文所用，短语“非生物胁迫耐受性”是指养殖的水生甲壳类动物忍受非生物胁迫而不表现出实质的生理或物理损害(例如甲壳类动物的代谢，生长，活力(vigor)和/或生殖能力的改变)的能力。
[0242] 根据一些实施例，摄取或接触本发明的纳米颗粒或营养药物可提高生长速率和饲料转化率。生长速率可以通过生物量或产量来测量，并且可以用于进料转化率。如本文所用，短语“饲料转化率”是指提供的每单位营养素的养殖甲壳类动物生产量。饲料转化效率通常是甲壳类动物摄取、扩散、吸收、积累、重新定位(relocation，在植物内)和甲壳类动物所吸收的养分的利用中的至少一种的改变的结果。
[0243] 如本文所用，术语/短语“生物量(biobass)”，水生养殖物种的生物量或“宿主甲壳类动物的生物量”是指在生长季节中，从宿主生物体产生的组织量(例如，以空气干燥组织(air-dry tissue)的克数测量)。
[0244] 如本文所用，术语/短语“活力或茁壮vigor)”是指在给定时间内由养殖的水生甲壳类动物产生的组织量(例如，通过重量测量)。增加的活力(vigor)可以决定或影响产量或每个生长时间或生长区域的产量。
[0245] 如本文所用，术语/短语“产率(yield)”是指每个生长季节中养殖的水生甲壳类动物的一族群，或每个别的养殖的甲壳类动物，所生产的组织或器官的量(例如由重量或大小确定)或数量(例如，数目)。增加的产量可以影响在某个生长区域和/或生长时间内从水产养殖中所获得的经济效益。
[0246] 根据一实施例，通过蛋白质含量测量产率。
[0247] 根据另一实施例，通过油脂含量测量产率。
[0248] 如本文所用，“生物胁迫(biotic stress)”是指由于其他生物，如细菌、病毒、真菌、寄生虫、有益和有害昆虫对养殖的甲壳类动物造成的损害而发生的胁迫。
[0249] 在本发明的一些实施例中，摄入或接触本发明的营养药物或纳米颗粒导致：改善的非生物胁迫耐受性(例如，对水质差、热、冷、非最佳营养物或盐水平的耐受性)或生物胁迫(例如拥挤或受伤)；改性的初级代谢产物(例如，脂肪酸、油脂、ω-3油脂、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组合物；改性的次级代谢产物(例如，生物碱(alkaloids)、萜类化合物(terpenoids)、聚酮化合物(polyketides)、非核醣体肽(non-ribosomal peptides)和混合生物合成来源的次级代谢产物(secondary metabolites of mixed biosynthetic origin))组合物；改性的微量元素(例如铁，锌)或维生素(例如生育酚(tocopherols))组合物；提高产量(例如，在非胁迫条件下提高产量或在生物或非生物胁迫下提高产量)；提高使用氮或其他营养素的能力；改变生长或繁殖特征；提高收获，储存或加工质量(例如，改善收获，储存或加工质量)，改良对消费者的吸引力；或这些特征的任何组合。
[0250] 如本文所用，术语“改善(improving)”或“增加(increasing)”是指在任何上述参数中至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的增加，其是与具有相同病原体感染或具有相同疾病且不摄取或接触本公开内容的营养药物或纳米颗粒的相同或类似的养殖甲壳类动物相比(即，养殖水生甲壳类动物不与营养药物或纳米颗粒接触或摄取)。
[0251] 如本文所用，术语“降低”是指在疾病或病理学中(例如养殖的甲壳类动物的白斑症、坏死等等)至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的减少，与相同或相似的未处理的甲壳类动物相比。
[0252] 在一些实施例中，被治疗的养殖的甲壳类动物的阴性或阳性参数的变化在治疗后2至3周、治疗后3至4周、治疗后5至7周、治疗后1至2个月、治疗后2至4个月、治疗后4至6个月、治疗后5至8个月和治疗后5至12个月或更长时间的时间点进行测量。
[0253] 根据本发明的一些实施例，在摄入或接触营养药物或纳米颗粒后，在治疗过的甲壳类动物中监测健康/疾病参数。在一些实施例中，监测参数(基因表达和/或对胁迫的耐受性，生长速率等)可用于确定甲壳类动物的治疗方案，例如额外引入本发明的营养药物或纳米颗粒，用其他治疗方式增强治疗(例如杀虫剂、抗生素、多物种水产养殖中的其他物种等等)。在作物或植物田中用于监测的植物的选择可以是随机的或系统的(例如，可以在处理之前预先选择哨兵甲壳类动物)。
[0254] 本发明还提供了包含本文所述的纳米颗粒或营养药物组合物的养殖甲壳类动物。任何养殖的甲壳类动物(例如虾或对虾)可包含纳米颗粒或营养组合物，特别是虾、对虾、螃蟹、龙虾和小龙虾中的任何一种。在一些具体的实施例中，养殖的甲壳类动物是虾或对虾。
合适的虾或对虾可以选自中南美白对虾(Litopanaeus vannamei)、草虾(Panaeus monodon)、日本对虾(Penaeus japonicas)以及淡水长臂大虾(Macrobrachium
rosenbergii)。
合适的虾或对虾可以选自中南美白对虾(Litopanaeus vannamei)、草虾(Panaeus monodon)、日本对虾(Penaeus japonicas)以及淡水长臂大虾(Macrobrachium
rosenbergii)。
[0255] 此外在一些实施例中，提供了水产养殖环境，其包含含有本文所述的营养药物组合物或纳米颗粒的养殖的甲壳类动物。这种水产养殖环境可以是池塘、围栏、水池。池塘、围栏、水池还可以是开放式或封闭式系统水产养殖环境。
[0256] 如本文所用的术语“约”是指±10％，并且符号“≈”表示具有至多10％的公差的相等性。
[0257] 术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化是指“包括但不限于”。
[0258] 术语“由...组成(consisting of)”意指“包括幷且限于”。
[0259] 术语“本质上由......组成”指的是组成或方法可包括额外的成分和/或步骤，但仅当额外的成分和/或步骤不实质上改变所要求保护的组成或方法的基本和新颖特性。
[0260] 本文所使用的单数形式“一”、“一个”及“至少一”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。
[0261] 在整个本申请中，本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在。应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及所述范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。
[0262] 每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。术语，第一指示数字及第二指示数字"之间的范围”及第一指示数字"到”第二指示数字"的范围"在本文中可互换，幷指包括第一及第二指示数字，及其间的所有分数及整数。
[0263] 如本文所用的术语“方法(method)”指的是用于完成一特定任务的方式(manner)，手段(means)，技术(technique)和程序(procedures)，包括但不限于，那些方式，手段，技术和程序，其是已知的，或是从已知的方式，手段，技术或程序很容易地被化学，药理，生物，生化及医学领域从业者所开发。
[0264] 应当理解，本申请中公开的任何序列标识号(SEQ ID NO)可以指DNA序列或RNA序列，这取决于提及SEQ ID NO的上下文，即使仅以DNA序列形式或RNA序列形式表达SEQ ID NO也是如此。例如，SEQ ID NO：47(Rab7)以DNA序列形式表达(例如，T表示胸腺嘧啶)，但它可以指对应于Rab7核酸序列的DNA序列，或者RNA分子核酸序列的RNA序列。类似地，尽管一些序列以RNA序列形式表达(例如，U表示尿嘧啶)，但是取决于所描述的分子的实际类型，它可以指包含dsRNA的RNA分子的序列，或者。与所示RNA序列对应的DNA分子序列。无论如何，可设想公开的序列的DNA和RNA分子具有任何替代物。
[0265] 可以理解，本发明中的特定特征，为清楚起见，在分开的实施例的内文中描述，也可以在单一实施例的组合中提供。相反地，本发明中，为简洁起见，在单一实施例的内文中所描述的各种特征，也可以分开地、或者以任何合适的子组合、或者在适用于本发明的任何其他描述的实施例中提供。在各种实施例的内文中所描述的特定特征，幷不被认为是那些实施方案的必要特征，除非所述实施例没有那些元素就不起作用。
[0267] 现在参考以下实施例，其与上述描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施例。
[0268] 一般而言，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。例如参见，“分子克隆：实验室手册Molecular Cloning:A laboratory Manual”Sambrook等人所著,(1989)；“分子生物学中的现行方案Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I-III Ausubel,R.M.所著(1994)；Ausubel等人所著,“分子生物学中的现行方案Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal“,分子克隆的实用指南A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人所著,“重组DNA Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York；Birren等人所著““基因组分析：实验室手册系列Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；美国专利号No.4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所描述的方法；“细胞生物学：实验室手册Cell Biology:A Laboratory Handbook”,Volumes I-III Cellis,J.E.,所著(1994)；“动物细胞培养-基本技术手册Culture of Animal Cells–A Manual of Basic Technique”by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；“免疫学现行方案Current Protocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.,所著(1994)；Stites所著“基础与临床免疫学Basic and Clinical Immunology”(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi所著,“细胞免疫学中的选择方法Selected Methods in Cellular Immunology”,W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；在专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定法，例如参见美国专利号No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,
867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,
876；4,879,219；5,011,771及5,281,521；“寡核苷酸合成Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.,所著(1984)；“核酸杂合Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.,and Higgins S.J.所著(1985)；“转录和翻译Transcription and Translation”Hames,B.D.,and Higgins S.J.所著(1984)；“动物细胞培养Animal Cell Culture”Freshney,R.I.所著(1986)；“固定化细胞和酵素Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press,(1986)；“分子克隆的实用指南A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal,B.,(1984)以及“酵素学方法Methods in Enzymology”Vol.1,2,317,Academic Press；“PCR方案：方法和应用指南PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications”,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等人所著,“蛋白质纯化和表征策略Strategies for Protein Purification and Characterization–A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用并入本文，如同在此完全阐述一样。本文档中提供了其他一般参考资料，其中的程序被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的，其中包含的所有信息都通过引用并入本文。
867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,
876；4,879,219；5,011,771及5,281,521；“寡核苷酸合成Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.,所著(1984)；“核酸杂合Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.,and Higgins S.J.所著(1985)；“转录和翻译Transcription and Translation”Hames,B.D.,and Higgins S.J.所著(1984)；“动物细胞培养Animal Cell Culture”Freshney,R.I.所著(1986)；“固定化细胞和酵素Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press,(1986)；“分子克隆的实用指南A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal,B.,(1984)以及“酵素学方法Methods in Enzymology”Vol.1,2,317,Academic Press；“PCR方案：方法和应用指南PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications”,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等人所著,“蛋白质纯化和表征策略Strategies for Protein Purification and Characterization–A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用并入本文，如同在此完全阐述一样。本文档中提供了其他一般参考资料，其中的程序被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的，其中包含的所有信息都通过引用并入本文。
[0269] 实施例I：N-乙酰化壳聚醣纳米颗粒(N-ACETYLATED CHITOSAN)对双股RNA的有效口服递送
[0270] 通过乙酸酐和高度脱乙酰化的壳聚醣之间的均相N-乙酰化反应，来合成具有不同脱乙酰度的壳聚醣。使用所得到的壳聚醣衍生物，来评估壳聚醣的脱乙酰化影响壳聚醣-双股RNA颗粒形成、双股RNA释放以及通过口服递送的最终体内基因沉默的程度。
[0271] 材料和方法：
[0272] 生产双股RNA：
[0273] Rab7-双股RNA通过体内细菌系统合成。为了克隆含有茎和环的反向重复序列的重组质体(recombinant plasmid)，合成含有凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的Ras相关蛋白(Rab7，登录号JQ581679)的部分序列以及形成环部的非编码额外部分(SEQ ID NO：48，环部)的一合成片段(SEQ ID NO：46，具有环的Rab7片段)。
[0274] 所述片段作为模板，使用引子来扩增同义的250bp Rab7序列+环部区域：XbaI Rab7前向GAAACTCTAGATGGGTAACAAGATTGATCTGGAG(SEQ ID NO：26)和BamHI Rab7反向AGCCGGATCCtagcttacga(SEQ ID NO：27)。使用XbaI+BamHI限制性位点将PCR产物克隆到pET9a(Novagen)中。使用相同的模板，以以下引子对反义Rab7进行PCR扩增：BamHI正向GCATAGGATCCTGGGTAACAAGATTGATCTGGAG(SEQ ID NO：28)和PstI反向GAGTACTGCAGCATCCTGTTTAGCCTTGTTGTCA(SEQ ID NO：29)，并使用BamHI，PstI克隆以产生最终质体(plasmid)-pET9a-Rab7 250RNAi。通过热激法(heat shock)将含有茎环Rab7的反向重复的重组质体(recombinant plasmid pET9a-Rab7 250containing an inverted repeat of stem loop Rab7)转型(transformed)到核糖核酸酶III突变的大肠杆菌菌株HT115中(Rnase III mutant E.coli strain HT115)。通过向细菌培养物中加入0.4毫摩尔浓度(mM)的异丙基-β-D硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D Thiogalactoside，IPTG)诱导茎环Rab7的表达。在IPTG诱导后4小时收获培养物。用核糖核酸酶A(Rnase A)消化细菌单股RNA(ssRNA)和茎环Rab7的环部。然后根据制造商的说明，通过 RNAIsolation Reagents(ThermoFisher Scientific)提取双股RNA-GFP。通过紫外分光光度法(UV-spectrophotometry)在260纳米波长和琼脂凝胶(agarose gel)电泳下测定双股RNA-Rab7和双股RNA-GFP的浓度。
[0275] 使用相同的方法克隆125bp和70bp的Rab7-RNAi序列。引子如下表所示：
[0276] 表3:用于克隆Rab7-RNAi的引子序列：
[0277]
[0278]
[0279] 壳聚醣的N-乙酰化：
[0280] 将1.5克壳聚醣(HMC+Chitoscience Chitosan 80/20，分子量40-150kDa)溶于4％乙酸溶液(50毫升)中，并加入在50毫升的纯乙醇中的乙酸酐。由于乙酸酐的量决定了N-乙酰化反应的程度并因此决定了最终产物的脱乙酰化程度(deacetylation degree，DD)，因此使用不同量的乙酸酐。在40℃下搅拌12小时后，通过用NaOH(5M)中和pH直至pH＝9来终止反应。将所得沉淀物离心(10分钟，在15000g，4℃下)并用去离子水在pH＝9下彻底洗涤。重复所述程序3次。然后，通过在5L去离子水中透析(SpectrumLabs，12-14kDa孔径)72小时，从溶剂和杂质中洗去沉淀物。在此期间，水被更换了8次。使用离心(15分钟，15,000g，4℃下)从透析袋中回收所得的N-乙酰化壳聚醣，并使用冷冻干燥器(Labconco)冷冻干燥48小时。
[0281] 电位滴定法测定脱乙酰化程度：
[0282] 电位滴定法用于测定N-乙酰化壳聚醣的脱乙酰化程度(DD)。简言之，将0.2克合成的壳聚醣溶于30毫升的0.1摩尔浓度(M)的盐酸中。连续搅拌2小时后，加入25毫升的去离子水并继续搅拌1小时。当壳聚醣完全溶解时，用0.1摩尔浓度(M)氢氧化钠溶液滴定溶液。从所述溶液的滴定，获得具有两个拐点的曲线。认为这两点之间消耗的酸量对应于溶液中游离氨基的量(Tolaimate，2000)。用pH测量计(EUTECH仪器)进行滴定。
[0283] 壳聚醣的脱乙酰度(DD)使用下式计算：
[0284]
[0285] 其中m是样品的重量。V1，V2是对应于偏转点的0.1摩尔浓度(M)的氢氧化钠溶液的体积。2.03是由几丁质单体单元的分子量得到的系数。0.0042是由几丁质和壳聚醣单体单元的分子量之差产生的系数。
[0286] 壳聚醣-双股RNA纳米颗粒的制备：
[0287] 通过一自组装方法来制备具有不同聚合物/双股RNA质量比的制剂，同时保持双股RNA的量恒定(20微克/毫升)。将壳聚醣或其N-乙酰化衍生物在0.2摩尔浓度(M)的乙酸钠缓冲液(pH＝4.6)中溶解至4％的浓度。通过用相同缓冲液稀释，从原料液(stock solution)制备浓度为0.01％至0.1％的工作溶液。将等体积的Rab7双股RNA溶液(100微克/毫升在0.2摩尔浓度(M)的乙酸钠缓冲液中)和壳聚醣溶液在高速涡旋下快速混合30秒并在室温下温育1小时。组装的纳米颗粒的使用无需进一步纯化。由于双股RNA浓度对于所有纳米颗粒溶液保持恒定，因此操纵壳聚醣浓度改变了聚合物/双股RNA质量比。
[0288] 纳米颗粒的表征：
[0289] 使用Zetasizer Nano ZSP(Malvern Instruments，UK)测定壳聚醣/双股RNA纳米颗粒的颗粒尺寸和表面电荷(Z电位)。颗粒尺寸在173°角和25℃的温度下进行测量。所述尺寸表示为z-平均流体动力学直径，其是通过在计算中使用水的粘度和折射率的相关函数的累积分析所获得的。使用一次性折叠毛细管(Malvern Instruments，UK)测量分布在乙酸钠缓冲液中的纳米颗粒的表面电荷(pH＝4.6除非另有说明)。
[0290] 双股RNA保留(retention)和释放：
[0291] 在纳米颗粒形成后，通过胶体电泳，以在TAE(X1，Hy-Labs)中的1.5％琼脂(agarose,Sigma)以及溴化乙锭(ethidium bromide，Hy-Labs)评估RNA的保留(retention)。凝胶在100毫福特(mV)下运行30分钟并且在UV光下观察到双股RNA保留。
[0292] 虾饲料的制备：
[0293] 包含300微克双股RNA的1.5克饲料制备成为各个纳米颗粒系统(壳聚醣或壳聚醣衍生物与250bp Rab7双股RNA的复合物)。简而言之，通过将在3.75毫升的乙酸钠缓冲液(0.2M，pH＝4.6)中的300微克250bp Rab7加入3.75毫升的壳聚醣(Cs)、H35、H42或H55溶液(在0.2摩尔浓度(M)的乙酸钠缓冲液中制备，pH4.6)来制备不同的纳米颗粒处理，得到聚合物/Rab7质量比分别为50,40,30和8。然后，将所得溶液涡旋30秒并在室温下温育1小时。过夜冻干后，将冷冻干燥的复合物溶于1毫升的DEPC处理的水(Biological Industries)中，并将所得溶液与1.5克市售虾饲料丸充分混合。一旦饲料丸完全被纳米颗粒溶液浸泡，将它们在60℃下在热空气烘箱中干燥0.5小时。
[0294] 在虾类中使用基于乙酰化的壳聚醣纳米颗粒粒以口服递送250bp Rab7
[0295] 将6周龄的南美白对虾中(Peneaus vanameii)分成6组(每组12只虾)，彼此保持分离以进行基因沉默实验。在第I组中，虾以市售颗粒饲料喂食。在第II组中，虾以游离双股RNA(200微克/克饲料)所制备的沉淀喂食。在第III，IV，V和VI组中，分别将虾喂食含有H35、H42、H55和基于壳聚醣的复合物的饲料丸，所有饲料丸均包含每克饲料200微克的双股RNA。在实验开始后5天(每天2次喂食，每日饲料相当于体重的5％)，解剖虾并收集每只虾的鳃并立即置于液氮中直至使用。
[0296] 样品采集，RNA提取和cDNA合成：
[0297] 收集每只虾的鳃样品并立即置于液氮中直至使用。使用Argos研杵马达混合器，使用玻璃珠在1毫升 试剂中均化样品，并根据制造商的说明指示，通过试剂RNAIsolation Reagents(ThermoFisher Scientific)提取总RNA，然后进行
Dnase处理(TURBO DNA-freeTM Kit，Ambion)。根据制造商的说明指示，使用试剂RevertAid First Strand cDNA Synthesis合成第一股的cDNA。
Dnase处理(TURBO DNA-freeTM Kit，Ambion)。根据制造商的说明指示，使用试剂RevertAid First Strand cDNA Synthesis合成第一股的cDNA。
[0298] 实时PCR：
[0299] 如Vatanavicharn等人于2014所述，通过定量PCR定量Rab7基因(登录号#FJ811529)。用于qRT分析的引子序列选自于Rab7片段，其不是选择用于产生双股RNA的片段的一部分，以避免双股RNA递送引起的错误。将2微升的cDNA用于10微升反应中，所述反应是使用含有以下引子和探针的qPCRBIO Probe Mix Lo-ROX(PCR Biosystems)和
qPCR Assays(IDT)而制备的：Rab7前向GGGATACAGCTGGTCAAGAAA(SEQ ID
NO：38)；Rab7反向CGAGAGACTTGAAGGTATTGGG(SEQ ID NO：39)和FAM标记的探针-
CGAGGAGCTGATTGTTGTGTTCTCGT(SEQ ID NO：40)(500纳摩尔浓度(nM)的引子和250纳摩尔浓度(nM)的探针)。
qPCR Assays(IDT)而制备的：Rab7前向GGGATACAGCTGGTCAAGAAA(SEQ ID
NO：38)；Rab7反向CGAGAGACTTGAAGGTATTGGG(SEQ ID NO：39)和FAM标记的探针-
CGAGGAGCTGATTGTTGTGTTCTCGT(SEQ ID NO：40)(500纳摩尔浓度(nM)的引子和250纳摩尔浓度(nM)的探针)。
[0300] 使用默认的热循环条件在CFX96 TouchTM实时PCR检测系统中进行PCR。使用以下引子和探针针对EF1αmRNA(登录号#GU136229)获得的实时RT-PCR Ct值进行标准化：EF1α前向GTGGAGACCTTCCAACAGTATG(SEQ ID NO：41)，EF1α反向CCTTCTTGTTGACCTCCTTGAT(SEQ ID NO：42)和FAM标记的探针TGCGTGACATGAAGCAGACGG(SEQ ID NO：43)。确定每次处理的平均ΔCt值±SD(每个最少5只虾)，并且相对于未处理的控制组的定量设定为1。
[0301] 结果：
[0302] 通过乙酸酐和高度脱乙酰化的壳聚醣之间的均相N-乙酰化反应，合成具有不同脱乙酰化程度的壳聚醣。改变加入反应溶液中的100％乙酸酐的量可以容易地控制所得的壳聚醣的脱乙酰化程度，如表2和图2所示。
[0303] 表2：
[0304] 壳聚醣衍生物的脱乙酰化程度与乙酸酐浓度的关系：
[0305]
[0306] 比较不同的壳聚醣，包括市售的壳聚醣和部分脱乙酰化的壳聚醣衍生物的递送双股RNA的能力和进一步介导基因沉默的能力。首先，通过这些壳聚醣和250bp Rab7双股RNA的自组装来制备纳米颗粒。通过改变聚合物的浓度并保持双股RNA浓度恒定，来改变颗粒聚合物/Rab7质量比。双股RNA和壳聚醣的自组装取决于壳聚醣衍生物的脱乙酰化程度。因此，当脱乙酰化程度降低时(例如通过与乙酸酐反应)，双股RNA结合能力降低，即需要更多的壳聚醣来完全结合相同量的双股RNA。图3A至图3C显示脱乙酰壳多醣的脱乙酰化程度对未处理的脱乙酰壳多醣和衍生物H42和H55的双股RNA结合效力的影响。显然，脱乙酰化的壳聚醣更有效地结合双股RNA(例如，在较低的聚合物/双股RNA质量比下完全结合双股RNA)。应该注意的是，当脱乙酰化程度从82.4％(未处理的壳聚醣)降低至42％(H42)时，完整双股RNA结合的聚合物/Rab7质量比从未处理的壳聚醣的2增加(图3A泳道4)至H42的25(图3C泳道11)。
[0307] 脱乙酰化程度对壳聚醣纳米颗粒的物理性质的影响：
[0308] 测定影响细胞相互作用和纳米颗粒的细胞内摄取的物理性质(即尺寸和表面电荷)。测量的有效z-平均直径(使用累积分析确定为平均尺寸)和复合物的z电位(电荷)，其相对于纳米颗粒的聚合物/Rab7质量比绘制，并分别显示在图4A和图4B中。当质量比增加时，所有纳米颗粒制剂(即由不同的壳聚醣衍生物制备)显示出增加的粒度。例如具有不同聚合物/Rab7质量比的H42/Rab7制剂的粒度显示在图4A中。表面电荷的测量(图4B)显示所有配制的壳聚醣/双股RNA纳米颗粒的净正电荷。对于所有测试的质量比，部分N-乙酰化壳聚醣衍生物(H55和H42)，其特征在于较低程度的脱乙酰化，并且与未处理的壳聚醣相比呈现低z-电位值(图4B)。例如，基于H42的纳米颗粒的z电位在聚合物/Rab7质量比为40时约为15毫福特(mV)，而(未处理的)基于壳聚醣的纳米颗粒呈现出的z-电位值为26毫福特(mV)。
[0309] 通过喂食壳聚醣-双股RNA纳米颗粒进行体内基因沉默：
[0310] 为了确定通过摄取部分N-乙酰化的壳聚醣纳米颗粒的双股RNA递送是否可以在体内引发RNAi和基因沉默，12只年幼的南美白对虾(150毫克)喂食45毫克的壳聚醣-双股RNA复合纳米颗粒(衍生物H35、H42、H55或未处理的基于壳聚醣的复合物，其包含每克饲料200微克的双股RNA)，或Rab7-饲料(每克饲料200微克的游离Rab7双股RNA)或市售食品(普通饲料)，每天两次且每天5天，且每日总剂量为5％的生物量。最后一次喂食48小时后，牺牲所有虾并从虾组织中提取总RNA以用于定量实时PCR分析。对虾中相对Rab7 mRNA表达的影响如图5所示。与喂食游离双股RNA的控制组虾相比，在摄入H42/Rab7纳米颗粒(52％基因表达)和H55/Rab7纳米颗粒(61％基因)复合物的虾中观察到Rab7表达减少约2倍。这些结果表明，当Rab7双股RNA与具有较低脱乙酰化程度的壳聚醣衍生物复合，如H42或H55，并掺入配制的饲料中时，Rab7双股RNA成功进入宿主(例如虾)细胞并可触发RNAi，最终抑制宿主Rab7 mRNA的表达。
[0311] 实施例II：通过聚乙二醇化的(PEG)部分N-乙酰化的壳聚醣纳米颗粒对双股RNA的有效口服递送：
[0312] 为了进一步改善壳聚醣纳米载体的表面性质，它们与虾胃肠环境的相互作用和改善双股RNA透粘膜递送，将聚合物聚乙二醇(polymer polyethylene glycol,PEG)加入到纳米颗粒的壳聚醣主链中。将PEG-NHS与壳聚醣和H55胺端部基团偶连，以分别产生聚合物PEG-壳聚醣(Cs)和PEG-H55，以及评估EG偶连对壳聚醣/H55-双股RNA颗粒形成的影响、合成的纳米颗粒的稳定性的影响、以及口服递送颗粒后由此产生的基因沉默结果的影响。
[0313] 材料和方法：
[0314] PEG-H55和PEG-壳聚醣的合成：
[0315] 将PEG2000-NHS(mPEG-SG，分子量2000，Creative PEGWorks)与壳聚醣和H55胺端基偶联，分别产生聚合物壳聚醣-PEG2000和H55-PEG2000。简而言之，在剧烈搅拌下将壳聚醣(Cs)和壳聚醣衍生物H-55(各100毫克)溶解在20毫升的3％乙酸中1小时。然后，将样品以40％强度超声处理2分钟。超声处理后，使用NaOH 1M将样品的pH值调节至6.5(对于壳聚醣)和7(对于H-55)。将每个mPEG-NHS两份250毫克的样品溶解在15毫升的ddH2O中并立即加入H-55和壳聚醣样品中。将所得溶液在室温下在磁力搅拌下温育24小时。将所得混合物用透析膜(SpectrumLabs，12-14kDa孔径)对蒸馏水透析48小时，随后将溶液冷冻干燥。
[0316] 壳聚醣-双股RNA纳米颗粒的制备：
[0317] 使用250bp Rab7双股RNA的自组装方法制备具有不同组成分的壳聚醣/PEG-壳聚醣的制剂(即1/0、0.8/0.2、0.6/0.4、0.4/0.6、0.2/0.8和0/1)，总聚合物/Rab7双股RNA质量比为8(类似于上述方法)。以相同方式制备包含PEG化和非PEG化纳米颗粒(例如PEG-H55/H55和PEG-H55/Cs)的制剂，保持总聚合物/Rab7双股RNA质量比为50。
[0318] 纳米颗粒的表征：
[0319] 使用Zetasizer Nano ZSP(Malvern Instruments，UK)测定纳米颗粒的粒度和表面电荷(z电位)。粒度测量在173°角和25℃的温度下进行。所述尺寸表示为z-平均流体动力学直径，其是通过在计算中使用水的粘度和折射率的相关函数的累积分析所获得的。使用一次性折叠毛细管(Malvern Instruments，UK)测量分布在乙酸钠缓冲液中的纳米颗粒的表面电荷。
[0320] 双股RNA保留(retention)和释放：
[0321] 在纳米颗粒形成后，通过胶体电泳，以在TAE(X1，Hy-Labs)中的1.5％琼脂(agarose,Sigma)以及溴化乙锭(ethidium bromide，Hy-Labs)评估RNA的保留(retention)。凝胶在100毫福特(mV)下运行30分钟并且在UV光下观察到双股RNA保留。
[0322] 纳米颗粒的浓缩：
[0323] 在复合化步骤期间使用2,4和8倍浓度的250bp Rab7双股RNA(分别为0.04、0.08和0.16微克/微升)和壳聚醣/PEG-壳聚醣(分别为0.32、0.64和1.28微克/微升)进行壳聚醣/PEG-壳聚醣复合物的浓缩。同时保持复合化体积(complexation volume)恒定(1毫升)。对于制备的所有壳聚醣/PEG-壳聚醣复合物，保持总聚合物/Rab质量比为8。以相同的方式浓缩H55/PEG-H55复合物，只是将总聚合物/Rab7质量比维持在50。在复合化后，使用超声浴以
40千赫强度对复合物进行超声处理1小时。
40千赫强度对复合物进行超声处理1小时。
[0324] 虾饲料的制备：
[0325] 制备包含300微克的双股RNA的1.5克饲料，用于以下纳米颗粒系统-PEG-壳聚醣/壳聚醣(80/20)、PEG-H55/H55(50/50)和PEG-H55/H55(90/10)，具有0.02摩尔鱼精蛋白(protamine)，总聚合物/Rab7质量比分别为8,50和50。简而言之，通过将在3.75毫升乙酸钠缓冲液(0.2摩尔浓度(M)，pH＝4.6)中的300微克250bp Rab7双股RNA添加至3.75毫升的PEG-壳聚醣/壳聚醣(80/20)、PEG-H55/H55(50/50)或PEG-H55/H55(90/10)中来制备不同的纳米颗粒，其含有0.02摩尔的鱼精蛋白溶液(在0.2摩尔浓度(M)乙酸钠缓冲液中制备，pH＝4.6)，涡旋30秒并在室温下温育1小时，来制备不同的纳米颗粒处理。使用冷冻干燥器冷冻干燥所得复合物。过夜冻干后，将冷冻干燥的复合物溶于1毫升的DEPC处理的水
(Biological Industries)中，并将所得溶液与1.5克市售虾饲料丸充分混合。一旦饲料丸完全被纳米颗粒溶液浸泡，将它们在60℃下在热空气烘箱中干燥0.5小时。
(Biological Industries)中，并将所得溶液与1.5克市售虾饲料丸充分混合。一旦饲料丸完全被纳米颗粒溶液浸泡，将它们在60℃下在热空气烘箱中干燥0.5小时。
[0326] 在虾类中使用基于乙酰化的壳聚醣纳米颗粒粒以口服递送250bp Rab7
[0327] 将6周龄的南美白对虾中(Peneaus vanameii)分成6组(每组12只虾)，彼此保持分离以进行基因沉默实验。在第I组中，虾以市售颗粒饲料喂食。在第II组中，虾以游离双股RNA(200μg/课饲料)所制备的沉淀喂食。在第III，IV，V和VI组中，分别将虾喂食含有PEG-壳聚醣/壳聚醣(80/20)、PEG-H55/H55(50/50)或PEG-H55/H55(90/10)的饲料丸，所有饲料丸均包含每克饲料200微克的双股RNA。在实验开始后5天(每天2次喂食，每日饲料相当于体重的5％)，解剖虾并收集每只虾的鳃并立即置于液氮中直至使用。
[0328] 样品采集，RNA提取和cDNA合成：
[0329] 使用Argos研杵马达混合器，使用玻璃珠在1毫升 试剂中均化样品，并根据制造商的说明指示，通过试剂 RNAIsolation Reagents(ThermoFisher
Scientific)提取总RNA，然后进行Dnase处理(TURBO DNA-freeTM Kit，Ambion)。根据制造商的说明指示，使用试剂RevertAid First Strand cDNA Synthesis合成第一股的cDNA。
Scientific)提取总RNA，然后进行Dnase处理(TURBO DNA-freeTM Kit，Ambion)。根据制造商的说明指示，使用试剂RevertAid First Strand cDNA Synthesis合成第一股的cDNA。
[0330] 实时PCR：
[0331] 如上所述通过定量PCR对Rab7基因进行定量(实施例1)。
[0332] 结果：
[0333] 聚乙二醇化(PEGylated，PEG化)的壳聚醣纳米粒的双股RNA结合能力和物理性质：
[0334] 将PEG2000-NHS与未处理的壳聚醣和H55胺端基偶联，分别得到聚合物壳聚醣-PEG2000和H55-PEG2000。将PEG化的聚合物与Rab7混合以测定双股RNA结合亲和力和颗粒尺寸测量(图6A至图6C)。虽然未处理的壳聚醣(Cs)将Rab7双股RNA浓缩合成流体动力学直径为约170纳米的均匀颗粒，但由于可用的带正电荷的胺基团减少，单独的PEG化的壳聚醣不能浓缩合成Rab7，导致双股RNA与聚合物的不完全结合和更大的颗粒尺寸(图6A和图6B)。由Rab7双股RNA和不同PEG-壳聚醣/壳聚醣组合物所组成的纳米颗粒的Z电位测量进一步支持所述观察，表明随着PEG-壳聚醣组合物在复合物中增加，表面电荷值降低(图6C)。
[0335] 为了研究PEG偶联对纳米颗粒稳定性的影响，在复合物在2、4和8倍浓缩后测量复合物的大小。与基于PEG化的H55的颗粒(97％PEG-H55和3％壳聚醣的聚合物组合物)相比，图7A显示基于H55的纳米颗粒(非PEG化的H55)的颗粒尺寸(以纳米表示)。随着颗粒浓度增加8倍(从X1到X8)，基于H55的纳米颗粒的平均直径从300增加到1234纳米。基于PEG化的H55的纳米颗粒表现出较小的尺寸增加，颗粒尺寸从192增加至1050纳米(图7A)。
[0336] 为了减小颗粒浓缩后的颗粒尺寸，使用超声波浴将纳米颗粒超声处理1小时，然后另外测量颗粒尺寸。图7B显示在超声处理后与基于PEG化的H55基颗粒相比，基于H55的纳米颗粒的颗粒尺寸，揭示了两种类型的复合物之间的行为的显着差异。当颗粒浓度增加8倍时，基于H55的纳米颗粒的平均直径从300增加到1287nm，这表明超声波对颗粒尺寸没有影响(即与图7A中呈现的数据相比)。然而，基于PEG化的H55的纳米颗粒在最大颗粒浓度下仅表现出1.5倍的尺寸增加，表明PEG偶联与超声波处理一起通过在颗粒周围提供空间层来减轻浓缩所诱导的聚集。
[0337] PEG化对通过喂食壳聚醣-双股RNA纳米颗粒进行体内基因沉默效果的影响：
[0338] 为了确定PEG偶联是否改善Rab7口服递送和体内基因沉默，12只幼虾的南美白对虾(150毫克)喂食45毫克的以下复合的双股RNA-壳聚醣纳米颗粒：PEG-壳聚醣(80/20)、PEG-H55/H55(50/50)以及PEG-H55/H55(90/10)+鱼精蛋白(Protamine)，其包含每克饲料200微克的双股RNA，或Rab7-饲料(游离Rab7双股RNA)或市售食品(普通饲料)，每天两次且每天5天，且每日总剂量为5％的生物量。最后一次喂食48小时后，牺牲所有虾并从虾组织中提取总RNA以用于定量实时PCR分析。对虾中相对Rab7 mRNA表达的影响如图8所示。PEG-壳聚醣/Rab7复合物的口服递送不会导致任何显着的基因沉默。然而，与喂食游离双股RNA的控制组的虾相比，在摄入PEG-H55/H55(50/50)的纳米颗粒(22％基因表达)的虾中观察到Rab7表达减少约5倍。这些结果表明，与PEG化H55聚合物复合并且掺入配制饲料中的Rab7双股RNA可进入虾细胞并引发RNAi产生，抑制宿主中Rab7 mRNA的水平。此外，PEG分子与H55骨架的偶联进一步改善了PEG-H55/Rab7纳米颗粒的穿透粘膜的递送，导致宿主Rab7基因表达的更显着的沉默。
[0339] 总之，本文提供的结果表明，具有一减少数量的胺基团的化学修饰的壳聚醣可以结合双股RNA，自组装成复杂的双股RNA-壳聚醣纳米颗粒，其在摄入时有效沉默宿主生物体中的目标基因。壳聚醣主链的PEG化进一步增强了双股RNA-壳聚醣纳米颗粒的基因沉默效应。
[0340] 实施例III-RNA-壳聚醣纳米颗粒在水生环境中的稳定性：
[0341] 材料和方法：
[0342] 为了阐明脱乙酰化程度(DD)对颗粒稳定性的影响，制备具有250bp Rab7双股RNA和具有不同脱乙酰化程度的壳聚醣衍生物的复合制剂，其聚合物/双股RNA质量比为30。将N-乙酰化衍生物H55(DD55％)、H42(DD42％)和H35(DD35％)溶解至浓度为1.2毫克/毫升，于0.2摩尔浓度(M)乙酸钠缓冲液(pH＝4.6)中。通过剧烈涡旋30秒将等体积的Rab7双股RNA(40微克/毫升在0.2摩尔浓度(M)乙酸钠缓冲液中)和聚合物溶液快速混合，并在室温下温育1小时。使用所得组装的纳米颗粒而无需进一步纯化。制备复合物后，用1摩尔浓度(M)NaOH增加溶液的pH值。通过在TAE(X1，Hy-Labs，Rehovot，Israel)中于1.5％琼脂(agarsoe,Sigma)上用溴化乙锭(Hy-Labs)进行胶体电泳来分析复合物的稳定性。将凝胶在100毫福特(mV)下运行30分钟并在UV光下观察双股RNA的保留。使用100bp DNA(10微升)作为标记物。
[0343] 保护双股RNA免受酵素降解的复合能力：RNA酶A(RNase)测定：
[0344] 使用RNA酶A酶(RNase)促降解测定法检查复合物稳定性和保护双股RNA免于降解的能力。简言之，首先将游离双股RNA、和H55/双股RNA、和H42/双股RNA复合物在37℃下暴露于RNA酶A(Promega，Cat#A7970，Madison，WI)1小时(每1微克的复合RNA 20纳米的RNA酶A)。然后，通过RNA酵素抑制剂使酵素失活(每1微克复合的RNA 80单位、Ribolock RNA酶抑制剂，20U/微升，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)，并通过用壳聚醣酶在37℃温育1小时从纳米颗粒中释放双股RNA。(来自链霉菌属Streptomyces sp.物种N174的壳聚醣酶，Calbiochem，Cat#220477-10U，CA，USA)进行测定。用冷异丙醇(isopropanel)沉淀游离的双股RNA。然后将沉淀重新溶解在30微升的DEPC水中，并在100福特下施用1.5％琼脂胶体电泳
30分钟。
30分钟。
[0345] 壳聚醣脱乙酰化程度对水生环境中颗粒稳定性的影响：
[0346] 壳聚醣的特征在于pKa值为约6.5。因此，在酸性pH(低于其pKa)下，伯胺(primary amines)变为带正电荷，使壳聚醣结合带负电荷的双股RNA。较高的pH值导致聚合物的正电荷较少。因此纳米颗粒制剂在水生环境中的稳定性(以中性pH为特征)非常重要。图9A至图9D显示由250bp双股Rab7和具有一系列脱乙酰化程度(H55、H42和H35)的壳聚醣衍生物所制备的复合物在不同pH值和不同孵育持续时间下的稳定性。为了阐明脱乙酰化程度(DD)对颗粒稳定性的影响，以相同的聚合物/双股RNA质量比(30)制备所有复合物。制备复合物后，用
1摩尔浓度(M)NaOH增加溶液的pH值。然后通过胶体电泳分离所得组合物来分析复合物的稳定性。
1摩尔浓度(M)NaOH增加溶液的pH值。然后通过胶体电泳分离所得组合物来分析复合物的稳定性。
[0347] 图9A至图9C显示基于H55的壳聚醣-双股RNA纳米颗粒(NP1，DD＝55％)在水生pH条件下是稳定的。壳聚醣-双股RNA纳米颗粒具有较低的脱乙酰化水平[即H42(NP2，DD＝42％)和H35(NP3，DD＝35％)]更易于从纳米颗粒中释放双股RNA。图9D进一步证明了在pH＝7和28℃温育4小时(240分钟)后基于H55的壳聚醣-双股RNA纳米颗粒的稳定性，显示在整个持续时间内游离的双股RNA释放不超过5％。
[0348] 壳聚醣复合的双股RNA对酵素促降解具有抗性：
[0349] 载体保护其有效负载免受核酸酶降解的能力是对于有效实施RNA沉默技术的一重要特性，以便在纳米颗粒递送期间和目标细胞内抵消核酸酶消化。为了解决这个问题，在RNA酶A(RNase A)溶液存在下评估不同纳米颗粒对酶促降解的抗性程度(使用能够在30分钟内完全降解游离双股RNA的RNase A浓度)。图10显示含有壳聚醣衍生物H55(NP1，DD＝55％)或H42(NP2，DD＝42％)的壳聚醣-双股RNA纳米颗粒可以分别完全地或部分地保护双股RNA在pH＝7下的酶促降解，而游离双股RNA暴露于RNase A后完全降解。
[0350] 总之，这里提供的数据提供了强有力的证据，证明当与壳聚醣-RNA纳米颗粒中的特定壳聚醣衍生物复合时，沉默RNA序列的稳定性增强。
[0351] 实施例IV-用壳聚醣-单股RNA纳米颗粒沉默基因：
[0352] 研究了在壳聚醣-RNA纳米颗粒中用单股RNA(ssRNA)替换双股RNA(dsRNA)用于基因沉默的功效。
[0353] 材料和方法：
[0354] RNA的生产：
[0355] Rab7-单股RNA在体外合成。为了产生用于单股RNA合成的DNA模板，合成含有凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的Ras相关蛋白(Rab7，登录号#JQ581679)的部分序列(SEQ ID NO：46，具有环部的Rab7片段)的合成片段。使用以下引子将此片段用作为扩增同义和反义250bp Rab7序列的模板：
[0356] 同义片段：T7rab250前向：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTGGGTAACAAGATTGATCTGGAG(SEQ ID NO：80)；rab250后向CATCCTGTTTAGCCTTGTTGTC(SEQ ID NO：50)；
[0357] 反义片段：rab7前向：TGGGTAACAAGATTGATCTGGAG(SEQ ID NO：51)；T7rab7后向：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCATCCTGTTTAGCCTTGTTGTC(SEQ ID NO：52)。
[0358] 根据制造商的方案，使用T7 RiboMAX TM Express RNAi System(Promega)进行体外转录。将反应物在37℃温育1小时，然后进行DNA酶处理和乙醇沉淀。将RNA重新悬浮于无核酸酶的水中，并通过UV-分光光度法在260纳米波长下测定其浓度并进行琼脂凝体电泳。
[0359] 同义片段：
[0360] TGGGTAACAAGATTGATCTGGAGAATAGGGCGGTATCGACGAAGCGAGCACAACAATGGTGTCATAGTAAAAATGAAGTTCCCTACTTTGAAACTAGTGCAAAGGAAGCTATTAATGTGGAGCTAGCTTTCCAGACCATTGCTCGCAATGCTCTTGCTCAGGAGTCAGAGGTGGAGCTGTACAATGAGTTTCCAGACCAGATCAAATTGACCAATGACAACAAGGCTAAACAGGATG(SEQ ID NO.53)。
[0361] 反义片段：
[0362] CATCCTGTTTAGCCTTGTTGTCATTGGTCAATTTGATCTGGTCTGGAAACTCATTGTACAGCTCCACCTCTGACTCCTGAGCAAGAGCATTGCGAGCAATGGTCTGGAAAGCTAGCTCCACATTAATAGCTTCCTTTGCACTAGTTTCAAAGTAGGGAACTTCATTTTTACTATGACACCATTGTTGTGCTCGCTTCGTCGATACCGCCCTATTCTCCAGATCAATCTTGTTACCCA(SEQ ID NO.54)。
[0363] 壳聚醣-RNA纳米颗粒的制备：
[0364] 通过自组装方法制备具有不同壳聚醣/RNA质量比的制剂，同时保持RNA(单股RNA或双股RNA)的量恒定(20微克/毫升)。首先，在0.2摩尔浓度(M)的乙酸钠缓冲液(pH＝4.6)中制备浓度为1毫克/毫升的壳聚醣。通过用相同缓冲液稀释，从原料溶液(stock)制备浓度为0.08至0.8毫克/毫升的工作溶液。将等体积的Rab7单股RNA或双股RNA溶液(0.04毫克/毫升在0.2摩尔浓度(M)乙酸钠缓冲液中)和壳聚醣溶液在剧烈涡旋下快速混合30秒并在室温下温育1小时。使用组装的纳米颗粒而无需进一步纯化。由于RNA浓度对于所有纳米颗粒溶液保持恒定，因此操纵壳聚醣浓度改变了聚合物/RNA的质量比。
[0365] 纳米颗粒大小的表征：
[0366] 使用Zetasizer Nano ZSP(Malvern Instruments，UK)测定壳聚醣/双股RNA纳米颗粒的颗粒尺寸和表面电荷(Z电位)。颗粒尺寸在173°角和25℃的温度下进行测量。所述尺寸表示为z-平均流体动力学直径，其是通过在计算中使用水的粘度和折射率的相关函数的累积分析所获得的。
[0367] 双股RNA保留(retention)和释放：
[0368] 在纳米颗粒形成后，通过胶体电泳，以在TAE(X1，Hy-Labs)中的1.5％琼脂(agarose,Sigma)以及溴化乙锭(ethidium bromide，Hy-Labs)评估RNA的保留(retention)。凝胶在100毫福特(mV)下运行30分钟并且在UV光下观察到双股RNA保留，以及
100bp DNA标记物(100微克/毫升)。
100bp DNA标记物(100微克/毫升)。
[0369] 在RNA酶存在下单股RNA的稳定性：
[0370] 研究脱乙酰壳多醣/RNA复合物保护单股RNA免于RNase消化的能力。简言之，将含有2微克单股RNA的不同的壳聚醣/单股RNA制剂(质量比为8、15和30)与RNA酶A(0.4纳克/微克双股RNA)在37℃温育1小时。在与RNA酶A温育后，通过Ribolock RNA酶抑制剂(20U/微升、4微升/微克单股RNA)对样品进行RNA酶A灭活30分钟。通过将样品与10微升壳聚醣酶溶液(0.001U/微升)在37℃温育1小时，将单股RNA从壳聚醣载体中置换出来。在1.5％琼脂胶体电泳上分析所提取的单股RNA，在100福特下进行30分钟。在相同条件下测试含有裸露的单股RNA的阳性控制组。
[0371] 通过注射单股和双股RNA使虾中基因沉默：
[0372] 将平均体重2克的南美白对虾中(Peneaus vanameii)分成5组(每组5只虾)，并维持分离以用于基因沉默实验。在第I组(阴性控制组)中，给虾注入1％NaCl溶液。在第II组和第III组中，虾分别注射游离的250b同义Rab7RNA(SEQ ID NO：53)和反义Rab7 RNA(SEQ ID NO：54)(0.5微克RNA/每克虾)。在第IV组(阳性控制组)中，向虾注射游离的250bp双股Rab7 RNA(SEQ ID NO：53)(0.5微克RNA/每克虾)。在第V组中，虾注入250b同义和反义Rab7 RNA(0.5微克RNA/每克虾)的混合物。使用具有26g针头的10微升Hamilton玻璃注射器将来自5微升的各种处理注射到每只虾中。
[0373] 样品采集、RNA提取、以及cDNA合成：
[0374] 收集每只虾的鳃样品并立即置于液氮中直至使用。使用Argos研杵马达混合器，使用玻璃珠在1毫升 试剂中均化样品，并根据制造商的说明指示，通过试剂RNAIsolation Reagents(ThermoFisher Scientific)提取总RNA，然后进行
Dnase处理(TURBO DNA-freeTM Kit，Ambion)。根据制造商的说明指示，使用试剂RevertAid First Strand cDNA Synthesis合成第一股的cDNA。
Dnase处理(TURBO DNA-freeTM Kit，Ambion)。根据制造商的说明指示，使用试剂RevertAid First Strand cDNA Synthesis合成第一股的cDNA。
[0375] 实时PCR：
[0376] 如Vatanavicharn等人于2014所述，通过定量PCR定量Rab7基因(登录号#FJ811529)。用于qRT分析的引子序列选自于Rab7片段，其不是选择用于产生双股RNA的片段的一部分，以避免双股RNA递送引起的错误。将2微升的cDNA用于10微升反应中，所述反应是使用含有以下引子和探针的qPCRBIO Probe Mix Lo-ROX(PCR Biosystems)和
qPCR Assays(IDT)而制备的：Rab7前向GGGATACAGCTGGTCAAGAAA(SEQ ID
NO：38)；Rab7反向CGAGAGACTTGAAGGTATTGGG(SEQ ID NO：39)和FAM标记的探针-
CGAGGAGCTGATTGTTGTGTTCTCGT(SEQ ID NO：40)(500纳摩尔浓度(nM)的引子和250纳摩尔浓度(nM)的探针)。
qPCR Assays(IDT)而制备的：Rab7前向GGGATACAGCTGGTCAAGAAA(SEQ ID
NO：38)；Rab7反向CGAGAGACTTGAAGGTATTGGG(SEQ ID NO：39)和FAM标记的探针-
CGAGGAGCTGATTGTTGTGTTCTCGT(SEQ ID NO：40)(500纳摩尔浓度(nM)的引子和250纳摩尔浓度(nM)的探针)。
[0377] 使用默认的热循环条件在CFX96 TouchTM实时PCR检测系统中进行PCR。使用以下引子和探针针对EF1αmRNA(登录号#GU136229)获得的实时RT-PCR Ct值进行标准化：EF1α前向GTGGAGACCTTCCAACAGTATG(SEQ ID NO：41)，EF1α反向CCTTCTTGTTGACCTCCTTGAT(SEQ ID NO：42)和FAM标记的探针TGCGTGACATGAAGCAGACGG(SEQ ID NO：43)。确定每次处理的平均ΔCt值±SD(每个最少5只虾)，并且相对于未处理的控制组的定量设定为1。
[0378] 结果：
[0379] 使用单股同义RNA代替双股RNA以减小颗粒尺寸：
[0380] 尺寸分析(图11)显示，与壳聚醣或壳聚醣衍生物和双股Rab7片段(约170纳米)的复合物相比，壳聚醣或壳聚醣衍生物和250b同义Rab7 RNA的复合物的特征在于显着更小的复合物尺寸(约100纳米)(图12)。
[0381] 此外，将壳聚醣或壳聚醣衍生物与较短的双股RNA片段(即70,125和250bp)复合不会导致这种显着的纳米颗粒尺寸减小。
[0382] 保护单股RNA免受酶降解的复合能力：
[0383] 通过核酸酶攻击的RNA降解是RNA递送的最重要障碍之一。因此壳聚醣-RNA复合物将复合RNA对RNA酶降解的感受性最小化或甚至消除的能力是壳聚醣-RNA复合物的重要要素。根据结果(图13)，裸露的单股RNA与RNA酶A一起在37℃温育1小时后被完全消化(步骤II)。另一方面，以壳聚醣/单股RNA质量比为30掺入壳聚醣复合物中的单股RNA保持完整。注射单股Rab7 RNA和双股Rab7 RNA后，使Rab7基因沉默。
[0384] 当将Rab7 RNA片段(250b同义和反义Rab7和双股Rab7)注射到虾中时，观察到同义和反义单股以及双股Rab7 RNA序列使Rab7基因表达沉默(图14)。令人惊讶的是，同义单股Rab7 RNA的基因沉默效力等于单股互补反义RNA的基因沉默效力。
[0385] 通过注射壳聚醣/单股Rab7 RNA和壳聚醣/双股Rab7 RNA进行体内Rab7基因沉默：
[0386] 当将壳聚醣和壳聚醣衍生物和Rab7 RNA序列(250b同义和反义Rab7和250bp双股Rab7)的复合物注射到虾中时，与注射壳聚醣/双股Rab7复合物所观察到的基因沉默相比(图15)，壳聚醣复合的单股RNA序列(同义和反义Rab7 RNA)产生相似的基因沉默效果。此外在与RNA酶A(降解未受保护的单股RNA)温育后，注射壳聚醣/单股同义Rab7 RNA复合物导致显着的Rab7基因沉默，类似于注射的其他复合物，表明将RNA复合在壳聚醣-RNA纳米颗粒赋予基因沉默序列对RNA酶降解的显着抗性。
[0387] 总之，这些结果表明双股RNA和单股RNA都可以有效沉默甲壳类动物(例如虾)中的目标基因，并且令人惊讶地，有义和反义单股RNA在基因沉默中都是有效的。同样重要的是观察到将双股RNA或单股RNA复合至壳聚醣-RNA纳米颗粒中赋予了对RNA酶降解的显着抗性，并且壳聚醣-RNA复合物可以是将基因沉默序列递送至甲壳类动物的有效方法。
[0388] 实施例V：使用基于乙酰化的壳聚醣的纳米颗粒在虾中口服递送单股同义Rab7 RNA
[0389] 通过摄取基于部分N-乙酰化的壳聚醣的纳米颗粒，测试RNA递送，以确定喂食纳米颗粒是否可以在体内引发RNAi和基因沉默。
[0390] 材料和方法：
[0391] 将6周龄的南美白对虾中(Peneaus vanameii)分成6组(每组12只虾)保持分离以用于基因沉默实验。在第I组中，用市售颗粒饲料喂食虾。在组第II组中，饲喂虾游离250b Rab7同义RNA(SEQ ID NO：53)(每克饲料200微克RNA)制备的饲料丸。在第III、IV、V和VI组中，分别饲喂虾含有基于H35(DD＝35％)、H42(DD＝42％)、H55(DD＝55％)和未处理的壳聚醣(Cs，DD＝83％)复合物的饲料丸，均包括每克饲料200微克的250b Rab7同义RNA(SEQ ID NO：53)。任选地，饲料丸可以含有葡醣醛酸(glucuronic acid)或生物素(biotin)偶联的壳聚醣-RNA纳米颗粒，其为单独的或与脱乙酰化的壳聚醣-RNA纳米颗粒组合。
[0392] 每天喂食虾两次，持续5天(每日饲料相当于体重的5％)。然后，解剖虾并收集每只虾的鳃并立即置于液氮中直至使用。
[0393] 评估：然后可(例如)通过使RT-PCR(如上所述)所测量的虾组织中Rab-7表达与饲料中所提供的壳聚醣-Rab7 RN纳米颗粒的量和类型相关联，以阐明壳聚醣-RNA对沉默虾Rab7基因的任何影响。
[0394] 实施例VI-用壳聚醣-RNA纳米颗粒通过病毒基因沉默，保护虾抵抗白斑综合征病毒(WSSV)：
[0395] 通过在WSSV感染的虾中注射壳聚醣-纳米颗粒，来研究施用包含病毒基因序列的壳聚醣-RNA纳米颗粒在虾类中使病毒基因沉默的功效。
[0396] 方法：
[0397] 病毒基因目标：
[0398] 制备WSSV特异性双股RNA序列用于WSSV挑战测试，以评估RNA序列和壳聚醣-RNA纳米颗粒在保护虾类对抗WSSV病毒性疾病的功效。
[0399] RNA的生产：
[0400] 为了生产WSSV VP28 250bp双股RNA，以下合成DNA模板是商业合成的：CCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGATCCGGCAGGTATCACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCCACACAGACAATATCGAGACAAACATGGATGAAAACCTCCGCATTCCTGTGACTGCTGAGGTTGGATCAGGCTACTTCAAGATGACTGATGTGTCCTTTGACAGCGACACCTTGGGCAAAATCAAGATCCGCAATGGAAAGTCTGATGCACAGATGAAGGAAGAAGATGCGGATCTTGTCATCACTCCCGTGGAGGGCCGAGCACTCGAAGTGACTGTGGGGCAGAATCTCACCTTTGAGGGAACATTCAAGGTGTGGAACAACACATCAAGAAAGATCAACATCACTGGTATGCAGATGGTGCCAAAGATTAACCCATCAAAGGCCTTTGTCGGTAGCTCCAACACCTCCTCCTTCACCCCCGTCTCTATTGATGAGGATGAAGTTGGCACCTTTGTGTGTGGTACCACCTTTGGCGCACCAATTGCAGCTACCGCCGGTGGAAATCTTTTCGACATGTACGTGCACGTCACCTACTCTGGCACTGAGACCGAGTAAGCGGCCGCAACTCGAGAACG(SEQ ID NO：55)。
[0401] 使用引子：XbaI VP28-3前向GACTATCTAGACATTCAAGGTGTGGAACAACAC(SEQ ID NO：56)和NcoI VP28-3后向ACGTACCATGGCTCGGTCTCAGTGCCAGAGT(SEQ ID NO：57)，将所述片段作为模板用于扩增同义250bp VP28序列。使用XbaI+NcoI限制性位点，将PCR产物克隆到pET9a-Rab7 125RNAi中(先前描述的，在其PstI和NcoI位点之间含有一环部片段)中。使用相同的模板以及下列引子，以PCR扩增反义的VP28：BamHI VP28-3前向：ACATAGGATCCCATTCAAGGTGTGGAACAACAC (SEQ ID NO ：81) 和PstI VP28-3后向：
ACAGACTGCAGCTCGGTCTCAGTGCCAGAGT(SEQ ID NO：58)，并使用BamHI，PstI克隆以产生最终质体(plasmid)-pET9a-VP28 250RNAi。通过热激法(heat shock)将含有茎环VP28的反向重复的重组质体(recombinant plasmid pET9a-VP28 250containing an inverted repeat of stem loop VP28)转型(transformed)到核糖核酸酶III突变的大肠杆菌菌株HT115中(Rnase III mutant E.coli strain HT115)。通过向细菌培养物中加入0.4毫摩尔浓度(mM)的异丙基-β-D硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D Thiogalactoside，IPTG)诱导茎环VP28的表达。在IPTG诱导后4小时收获培养物。用核糖核酸酶A(Rnase A)消化细菌单股RNA(ssRNA)和茎环VP28的环部。然后根据制造商的说明，通过 RNAIsolation
Reagents(ThermoFisher Scientific)提取双股RNA-GFP。
ACAGACTGCAGCTCGGTCTCAGTGCCAGAGT(SEQ ID NO：58)，并使用BamHI，PstI克隆以产生最终质体(plasmid)-pET9a-VP28 250RNAi。通过热激法(heat shock)将含有茎环VP28的反向重复的重组质体(recombinant plasmid pET9a-VP28 250containing an inverted repeat of stem loop VP28)转型(transformed)到核糖核酸酶III突变的大肠杆菌菌株HT115中(Rnase III mutant E.coli strain HT115)。通过向细菌培养物中加入0.4毫摩尔浓度(mM)的异丙基-β-D硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D Thiogalactoside，IPTG)诱导茎环VP28的表达。在IPTG诱导后4小时收获培养物。用核糖核酸酶A(Rnase A)消化细菌单股RNA(ssRNA)和茎环VP28的环部。然后根据制造商的说明，通过 RNAIsolation
Reagents(ThermoFisher Scientific)提取双股RNA-GFP。
[0402] 转录和RNA酶处理后，产生以下250bp的VP28序列：ATTCAAGGTGTGGAACAACACATCAAGAAAGATCAACATCACTGGTATGCAGATGGTGCCAAAGATTAACCCATCAAAGGCCTTTGTCGGTAGCTCCAACACCTCCTCCTTCACCCCCGTCTCTATTGATGAGGATGAAGTTGGCACCTTTGTGTGTGGTACCACCTTTGGCGCACCAATTGCAGCTACCGCCGGTGGAAATCTTTTCGACATGTACGTGCACGTCACCTACTCTGGCACTGAGACCGAG(SEQ ID NO：59)。
[0403] 通过UV-分光光度法在260纳米和琼脂胶体电泳测定双股RNA-VP28的浓度。
[0404] 在体外进行VP28 125bp片段的产生。为了产生VP28 125bp片段，使用以下引子将合成的VP28DNA片段(SEQ ID NO：55)作为模板，用以扩增同义和反义的125bp VP28序列：
[0405] 同义片段：T7VP28 125
[0406] 前向：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGCAGAATCTCACCTTTGAGG(SEQ ID NO：60)；
[0407] 反向：VP19-VP28：GTTGGAGCTACCGACAAAGG(SEQ ID NO.61)；
[0408] 反义片段：VP28 125前向：GGCAGAATCTCACCTTTGAGG(SEQ ID NO.62)；
[0409] T7反向：VP19-VP28：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTGGAGCTACCGACAAAGG(SEQ ID NO.63)。
[0410] 根据制造商的方案，使用T7 RiboMAX TM Express RNAi System(Promega)进行体外转录。将反应物在37℃温育1小时，然后进行DNA酶处理和乙醇沉淀。将RNA重新悬浮于无核酸酶的水中，并通过UV-分光光度法在260纳米波长下测定其浓度并进行琼脂凝体电泳。
[0411] 同义片段：
[0412] GGCAGAATCTCACCTTTGAGGGAACATTCAAGGTGTGGAACAACACATCAAGAAAGATCAACATCACTGGTATGCAGATGGTGCCAAAGATTAACCCATCAAAGGCCTTTGTCGGTAGCTCCAAC(SEQ ID NO.64)。
[0413] 反义片段：
[0414] GTTGGAGCTACCGACAAAGGCCTTTGATGGGTATAATCTTTGGCACCATCTGCATACCAGTGATGTTGATCTTTCTTGATGTGTTGTTCCACACCTTGAATGTTCCCTCAAAGGTGAGATTCTGCC(SEQ ID NO.65)。
[0415] 使用相同的体外方法以产生四种WSSV基因片段的混合物-VP28、VP19、rr2和wsv477，使用合成的DNA序列：
[0416] GACAGATATGGCCACCACGACTAACACTCTTCCTTTCGGCAGGACCGGAGCCCAGGCCGCTGGTCCTTCTTACACCATGGAAGATCTTGAAGGCTCCATGTCTATGGCTCGCATGGGTCTCTTTTTGATCGTTGCTATCTCAATTGGTATCCTCGTCCTGGCCGTCATGAATGTATGGATGGGACCAAAGAAGGACAGCGATTCTGACACTGATAAGGACACCGATGATGATGACGACACTGCCAACGATAACGATGATGAGGACAAATATAAGAACAGGACCAGGGATATGATGCTTCTGGCTGGGTCCGCTCTTCTGTTCCTCGTTTCCGCCGCCACCGTTTTTATGTCTTACCCCAAGAGGAGGCAGTAAGGCAGAATCTCACCTTTGAGGGAACATTCAAGGTGTGGAACAACACATCAAGAAAGATCAACATCACTGGTATGCAGATGGTGCCAAAGATTAACCCATCAAAGGCCTTTGTCGGTAGCTCCAACACCTCCTCCTTCACCCCCGTCTCTATTGATGAGGATGAAGTTGGCACCTTTGTGTGTGGTACCACCTTTGGCGCACCAATTGCAGCTACCGCCGGTGGAAATCTTTTCGACATGTACGTGCACGTCACCTACTCTGGCACTGAGACCGAGCTAGAAAAGCACTATAATGTTACCAACCCCTTCCCATTCATGGACAATATTTCCCTCGAGAATAAGACCAACTTTTTTGAAAAGAGAGTCGCCGAGTATCAACGTGCCCAGGTCATGGCTTCTATCAATAAGATCAAGAAGGACCAACAAACCCAAGAAACTGGTTCTCCTCTCCCAATTCTGACTGCACCTCCTCCAGTCTCTTCCTCATCATCCGAACAAGAAGATGTTGAAGACGGCGTCGGGGACTACATCAGTTATGACGATTTTATCAGTT(SEQ ID NO：66)
[0417] 表5：多种引子序列，用于体外生产(in vitro production)复合多基因的以病毒为目标的RNA(composite multigene viral targeting RNA)的处理。
[0418]
[0419] 产生的三个序列是：
[0420] VP19-VP28融合(250bp片段包含125bp的VP28和125bp的VP19)：ATAACGATGATGAGGACAAATATAAGAACAGGACCAGGGATATGATGCTTCTGGCTGGGTCCGCTCTTCTGTTCCTCGTTTCCGCCGCCACCGTTTTTATGTCTTACCCCAAGAGGAGGCAGTAAGGCAGAATCTCACCTTTGAGGGAACATTCAAGGTGTGGAACAACACATCAAGAAAGATCAACATCACTGGTATGCAGATGGTGCCAAAGATTAACCCATCAAAGGCCTTTGTCGGTAGCTCCAAC(SEQ ID NO:77)
[0421] Rr2(250bp片段)：
[0422] GTTACCAACCCCTTCCCATTCATGGACAATATTTCCCTCGAGAATAAGACCAACTTTTTTGAAAAGAGAGTCGCCGAGTATCAACGTGCCCAGGTCATGGCTTCTATCAATAAGATCAAGAAGGACCAACAAACCCAAGAAACTGGTTCTCCTCTCCCAATTCTGACTGCACCTCCTCCAGTCTCTTCCTCATCATCCGAACAAGAAGATGTTGAAGACGGCGTCGGGGACTACATCAGTTATGACGATT(SEQ ID NO:78)
[0423] Wsv477(250bp片段)：
[0424] TATGGATACTGCAACCAAGTGGATGGCTGAAATTATTAGAGAGAAGAGGGGCAATATTCAAGAAATAAAAGTGACCCCTAGAGTAGTCTTCAATGGCAATGGTTGTAGTGCATGTTTCTCTAACACTAAGAGAAACTTGTATAACTTTGGAACAAACTATAACAATGTTGTACATTGTGATTTGTTGTGCCCTTTTGCAAGGCATAGGATTGTACATTTCTTATAATGGTTTAAGGAACGTGTTTTCGAG(SEQ ID NO:79)
[0425] 葡萄醣醛酸-偶联壳聚醣的合成：
[0426] 将D-葡醣醛酸(分子量194.14Da，Sigma-Aldrich)与壳聚醣胺端基偶联，得到聚合物Glu-壳聚醣。简而言之，在剧烈搅拌下将0.5克壳聚醣(HMC's壳聚醣80/20，分子量40-150kDa)溶解在100毫升3％乙酸中2小时。称量D-葡醣醛酸(0.42克，1当量/[葡糖胺])并加入到壳聚醣溶液中，并将所得溶液搅拌1小时。然后，使用5摩尔浓度(M)的NaOH，将溶液的pH值调节至6.3。称量N-(3-二甲基氨基丙基-)N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(N-(3-
Dimethylaminopropyl-)N'-ethylcarbodiimide hydrochloride，分子量191.70Da，Sigma-Aldrich)(0.412克，1当量/[Gluc.acid])并加入到壳聚醣-葡醣醛酸溶液中。进一步称量N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，分子量115.09Da，Sigma-Aldrich)(0.124g，1当量/[EDC])并加入到壳聚醣-葡醣醛酸溶液中。将所得溶液在室温下搅拌24小时。将所得混合物用透析膜(SpectrumLabs，12-14kDa孔径)对蒸馏水透析72小时，随后将溶液冷冻干燥(Labconco冻干机)。
Dimethylaminopropyl-)N'-ethylcarbodiimide hydrochloride，分子量191.70Da，Sigma-Aldrich)(0.412克，1当量/[Gluc.acid])并加入到壳聚醣-葡醣醛酸溶液中。进一步称量N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，分子量115.09Da，Sigma-Aldrich)(0.124g，1当量/[EDC])并加入到壳聚醣-葡醣醛酸溶液中。将所得溶液在室温下搅拌24小时。将所得混合物用透析膜(SpectrumLabs，12-14kDa孔径)对蒸馏水透析72小时，随后将溶液冷冻干燥(Labconco冻干机)。
[0427] 通过电位滴定表征脱乙酰化程度(DD):
[0428] 电位滴定法用于测定Glu-壳聚醣和生物素-壳聚醣的脱乙酰化程度(DD)。简而言之，将各种偶联的壳聚醣溶解0.2克在30毫升0.1M盐酸中。在连续搅拌2小时后，向各种聚合物溶液中加入25毫升的去离子水并继续搅拌1小时。当偶联的聚合物完全溶解时，用0.1摩尔浓度(M)氢氧化钠溶液滴定溶液。从所述溶液的滴定，获得具有两个拐点的曲线。认为这两点之间消耗的酸量对应于溶液中游离氨基的量(Tolaimate，2000)。用pH测量计(EUTECH仪器)进行滴定。
[0429] 壳聚醣-RNA纳米颗粒的制备：
[0430] 通过一自组装方法来制备具有不同聚合物/双股RNA质量比的制剂，同时保持RNA(单股或双股RNA)的量恒定(20微克/毫升)。将壳聚醣或其N-乙酰化衍生物在0.2摩尔浓度(M)的乙酸钠缓冲液(pH＝4.6)中溶解至4％的浓度。通过用相同缓冲液稀释，从原料液(stock)制备浓度为0.08％至0.8毫克/毫升的工作溶液。将等体积的病毒单股RNA或双股RNA溶液(0.04毫克/毫升在0.2摩尔浓度(M)的乙酸钠缓冲液中)和壳聚醣溶液在高速涡旋下快速混合30秒并在室温下温育1小时。组装的纳米颗粒的使用无需进一步纯化。由于双股RNA浓度对于所有纳米颗粒溶液保持恒定，因此操纵壳聚醣浓度改变了聚合物/RNA质量比。
[0431] 虾类的病毒感染：
[0432] 动物：
[0433] 南美白对虾(Penaeus vannamei)各约2克，由GN，Phang Nga，SyAqua Siam Co.，Ltd提供。在实验前5天，在3吨水槽中，在30ppt盐度下使总量为1000只虾适应环境。喂食虾5％体重的市售饲料。溶氧量(DO)保持在4ppm以上，并根据需要更换水。
[0434] 实验设计：
[0435] 测试了四种处理(下文)和两个控制组，一阳性：注射1％NaCl后受病毒挑战；一阴性(不用病毒挑战)。因此，将幼虾分成5组，每组在60公升水槽中的20个个体中重复4次。
[0436] 处理1：注射游离(未复合的)VP28 250bp片段
[0437] 处理2：注射游离(未复合的)VP28 125bp片段
[0438] 处理3：注射Glu-壳聚醣/VP28 250bp片段。
[0439] 处理4：注射包含4个WSSV基因的三个250bp片段的游离(未复合的)混合物(序列如下所示)。
[0440] 疾病挑战：
[0441] 在24个60公升的水槽中，通过口服感染，幼虾被WSSV病毒挑战(大小2克)。在给药处理后48小时，在注射后48小时和65小时，基于每只虾5％体重施用WSSV感染的碎肉(每1克肌肉约107个复制的WSSV)(总共约为被感染的虾的10％体重)。用与治疗剂量相同的盐水溶液(2％NaCl)注射阴性和阳性控制组。将各组与控制组分开以避免污染。
[0442] 在挑战试验期间，虾以每天5％体重连续喂食商业饲料。在早晨(早上8点)和下午(下午4点)记录了虾的数目，同时记录了垂死的虾。对一些垂死的和健康的虾进行取样以用于qPCR，并固定用于组织病理学分析。
[0443] 溶解氧(DO)保持在4ppm以上，温度始终低于28℃，并根据需要更换水。
[0444] 生存分析分析了4种不同治疗方法在相当长的一段时间内的死亡时间点。通过ANOVA比较来自不同组的存活方法。两种统计方法都使用R程序进行处理。
[0445] WSSV检侧：使用FavorPrep TM Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit(Favorgen Biotech，Taiwan)按照制造商的方案从虾样品中分离DNA。白斑综合症病毒(WSSV)巢式PCR基于Lo C.F.的方法进行。(Lo等人于1996所著)。基于Sambrook，2001(Sambrook和Russell于2001所著)的方法进行胶体电泳。
[0446] 结果：
[0447] 病毒目标序列的选择：
[0448] WSSV基因沉默的目标选自先前描述的文献中的WSSV目标(Kumar等人于2015所著)。这些目标包括衣壳蛋白(caspid proteins)，如VP28、核糖核苷酸还原酶和RNA聚合酶。
[0449] 注射候选病毒沉默RNA序列和监测虾中病毒表达和/或病毒载量的后续变化，表明了病毒基因可能易受病毒RNA沉默的影响。处理过的虾中的病毒载量、症状或对病毒感染的易感性的间的变化的相关性，也可以为选择与甲壳类病毒病的感染和病理学高度相关的目标基因提供重要标准。
[0450] 使用注射VP28序列和H55-VP28复合物，保护虾类对抗WSSV
[0451] 在先前的实验中显示，注射基于部分N-乙酰化的壳聚醣的纳米颗粒中复合的单股和双股RNA，可以有效地使虾中的基因表达沉默。
[0452] 为了测试双股RNA序列和双股RNA复合物在保护虾类免受WSSV病毒侵害方面的功效，制备了四种类型的处理方法：
[0453] 1.VP28 250bp双股RNA(SEQ ID NO：59)
[0454] 2.VP28 125bp双股RNA(SEQ ID NO：64)
[0455] 3.葡萄醣醛酸-壳聚醣(Glu-壳聚醣)/VP28 250bp复合物。
[0456] 4.包含四种WSSV基因的三种序列的混合物：VP28、VP19、(VP19+VP28-SEQ ID NO：77)、rr2(SEQ ID NO：78)和Wsv477(SEQ ID NO：79)。
[0457] 如上文方法中所述，在虾类接受病毒挑战之前48小时，通过注射每个处理中4个重复的20只虾，来施用各个处理。分别计数来自不同组(处理)的虾，并每天记录。
[0458] 感染后14天(dpi)记录虾存活者数，如表6所示。在WSSV阳性控制组中，感染后第2天动物开始死亡，并以每天4至6只动物的平均速度继续死亡。在所述治疗的所有重复中死亡率模式非常相似。在感染后第7天观察到百分之百的死亡率。在阴性对照组中未观察到死亡率(表6，图16)。所有三种处理均与阳性对照显着不同，处理3(Glu-壳聚醣-VP28双股RNA 250bp)和处理4(包含四种WSSV基因的三种序列的混合物：VP28、VP19、rr2和wsv477)与阴性对照无显着差异，表现出最佳疗效。
[0459] 表6：WSSV感染中壳聚醣-以病毒为目标的RNA和虾的存活率：
[0460]
[0461] WSSV检测：
[0462] 使用巢式PCR检测方法在选定的处理中评估来自垂死的和健康的虾的腹足和鳃的WSSV感染水平(图17和表7)。发现在感染后4天(day post infection，dpi)，在任何双股RNA处理的动物或阴性控制组中未检测到WSSV，但在阳性控制组中检测到大量的WSSV(没有壳聚醣-RNA纳米颗粒，被WSSV感染)。在感染后第7天，通过PCR分别在处理1和处理2的两个样品之一者和三个样品之两者检测到WSSV。虽然不希望提出单一假设，但有一种可能性是，在一些垂死的虾中，WSSV的水平低于检测阈值，或者死亡原因不是WSSV。
[0463] 在所有双股RNA处理的健康动物的所有样品中，以及阴性控制组(14dpi)中，在测试结束时检测不到WSSV。由于潜伏感染不太可能在最初暴露于病毒后很长时间内未被发现，这表明施用壳聚醣-RNA纳米颗粒的保护作用在治疗后至少持续17天，并且病毒感染被阻止或成功地从处理过的虾类组织中消除。
[0464] WSSV巢式PCR：
[0465] 表7WSSV-巢式PCR检测的总结：
[0466]
[0467] 实施例VII：用壳聚醣-RNA纳米颗粒使病毒基因沉默：
[0468] 研究了包含口服递送的病毒基因序列的壳聚醣-RNA纳米颗粒在虾类中使病毒基因沉默的功效。
[0469] 方法：
[0470] 病毒基因目标：
[0471] 为WSSV挑战测试而准备WSSV特异性单股和双股RNA序列，以测试RNA序列和壳聚醣-RNA纳米颗粒在保护虾类对抗WSSV病毒性疾病中的功效。
[0472] RNA的生产：
[0473] 如上所述合成VP28 250bp双股RNA(SEQ ID NO：59)和VP125碱基同义(SEQ ID NO：64)和反义(SEQ ID NO：65)的单股RNA片段，Rr2和Wsv477片段。
[0474] 壳聚醣-RNA纳米颗粒的制备：
[0475] 通过一自组装方法来制备具有不同聚合物/RNA质量比的制剂，同时保持RNA(单股RNA或双股RNA)的量恒定(20微克/毫升)。首先将壳聚醣在0.2摩尔浓度(M)的乙酸钠缓冲液(pH＝4.6)中制备。通过用相同缓冲液稀释，从原料液(stock)制备浓度为0.08毫克/毫升至0.8毫克/毫升的工作溶液。将等体积的病毒单股RNA或双股RNA溶液(0.04微克/毫升在0.2摩尔浓度(M)的乙酸钠缓冲液中)和壳聚醣溶液在高速涡旋下快速混合30秒并在室温下温育1小时。组装的纳米颗粒的使用无需进一步纯化。由于RNA浓度对于所有纳米颗粒溶液保持恒定，因此操纵壳聚醣浓度改变了聚合物/RNA质量比。
[0476] 虾类病毒感染：
[0477] 动物：
[0478] 南美白对虾(Penaeus vannamei)各约2克，由GN，Phang Nga，SyAqua Siam Co.，Ltd提供。在实验前5天，在3吨水槽中，在30ppt盐度下使总量为1000只虾适应环境。喂食虾5％体重的市售饲料。溶氧量(DO)保持在4ppm以上，并根据需要更换水。
[0479] 实验设计：
[0480] 测试四种处理，并使用两个控制组，一阳性和一阴性。因此将幼虾分成6组，每组在60公升水槽中的20个个体中重复4次(总共＝28个水槽)。
[0481] 纳米颗粒尺寸的特征：
[0482] 壳聚醣/病毒RNA纳米颗粒的尺寸如实施例V中所述测定。
[0483] RNA保留(retention)和释放：
[0484] 在纳米颗粒形成后，如实施例V中所述通过胶体电泳评估RNA保留。
[0485] 样品采集、RNA提取和cDNA合成
[0486] 使用每个基因的特异性引子，如实施例V进行样品采集、RNA提取、cDNA合成和RT-PCR。使用RealTime qPCR Assay(IDT)，以设计用于病毒基因表达的PCR的引子序列的选择。对于各种处理，决定平均ΔCt值±SD，并且相对于未处理的控制组的定量设定为1。
[0487] 虾饲料的制备：
[0488] 如实施例V中所述制备包含使病毒基因沉默的RNA或壳聚醣-RNA纳米颗粒的虾饲料，包括制备不同的纳米颗粒处理、通过涡旋的混合、冷冻干燥和使冻干的壳聚醣-RNA复合物与虾饲料混合，最后干燥混合物。
[0489] 使用基于脱乙酰化的壳聚醣纳米颗粒，以口服递送以病毒为目标的RNA于虾类中：
[0490] 将幼虾(例如六周龄的南美白对虾(Peneaus vanameii))分成多个组别，其在基因沉默实验期间保持分离。为了评估被感染的虾中的病毒基因沉默，将虾暴露于病毒，确认虾的感染，并使其进行至细胞预定水平的病毒感染，然后喂食实验饲料。为了评估虾类病毒基因沉默对于病毒感染的预防方面，虾在接触病毒之前或同时接种实验饲料。并且病毒感染水平以及受感染的虾中的目标基因的表达，以及两者之间的相关性可以阐明，喂食使病毒基因沉默的RNA，对预防或减轻甲壳类动物病毒感染的效果。
[0491] 以市售颗粒饲料喂食虾，在一些组中包括以游离的使病毒基因沉默的序列(双股、同义和反义、混合同义和反义、和无义的对照组)所制备的饲料丸，并且在其他组中虾接受混合有壳聚醣或壳聚醣衍生物/RNA复合纳米颗粒的饲料丸。壳聚醣复合的病毒RNA序列以在含有H35(DD＝35％)、H42(DD＝42％)、H55(DD＝55％)或未处理的壳聚醣(DD＝83％)复合物的饲料丸中提供。任选地，壳聚醣-复合的RNA包含葡醣醛酸偶联的壳聚醣-RNA纳米颗粒。喂食方案例如为喂食相当于体重的5％的饲料，每天两次，持续5天。病毒基因表达的测量在解剖的鳃上进行，并且通过立即浸没在液氮中保存到使用时。
[0492] 结果：
[0493] 病毒目标序列的选择：
[0494] 可以在喂食实验之前，筛选候选使病毒沉默的RNA序列(例如VP28、VP19、Rr2、Wsv477)序列、外壳蛋白(coat protein)和外壳蛋白相关序列、RNA聚合酶序列、包膜蛋白序列(envelope protein sequences)、病毒繁殖所需的序列，例如通过注射壳聚醣-RNA纳米颗粒并监测虾类中病毒表达，并且/或者病毒载量的后续变化表明病毒基因可能易于被病毒RNA沉默。与处理过的虾中病毒载量、症状或对病毒感染的易感性的变化的相关性，也可以为选择与甲壳类病毒病的感染和病理学高度相关的目标基因提供重要标准。此WSS病毒实验，如上所述(实施例VI)。
[0495] 保护病毒RNA免受酵素降解的复合能力(complex ability)：
[0496] 当RNA在与壳聚醣或壳聚醣衍生物-RNA纳米颗粒中复合时，以壳聚醣：RNA质量比与壳聚醣衍生物的脱乙酰化程度的不同组合，通过监测“裸露的”(游离的)候选病毒基因沉默序列的RNA酶降解，与相同序列相比，可以表明壳聚醣-RNA复合物最小化或甚至消除复合RNA对RNA酶降解的感受性的能力。
[0497] 通过喂食壳聚醣-病毒RNA纳米颗粒进行体内基因沉默：
[0498] 在先前的实验中，显示摄入在基于部分N-乙酰化的壳聚醣的纳米颗粒中复合的单股和双股RNA可以有效地沉默虾类中的基因表达。为了测试通过摄入这种壳聚醣-病毒RNA复合的纳米颗粒来递送使病毒基因沉默的RNA序列是否能够有效地触发体内RNAi和病毒基因沉默，喂食虾(例如幼年的南美白对虾Penaeus vannamei)壳聚醣-病毒RNA复合纳米颗粒(基于衍生物H35(DD＝35％)、H42(DD＝42％)、H55(DD＝55％)或未处理的壳聚醣(DD＝83％)的复合物，其在饲料中混合，以及含有游离的病毒RNA的饲料丸，和市售食品(普通饲料，没有添加RNA)，其为根据预定的方案和剂量(例如每天2次，持续5天，每日总剂量为虾生物质量的5％)。虾类样品族群包括纯洁的虾(未被病毒感染的)和感染的虾(在开始喂食之前通过取样病毒滴度(viral titers)来验证病毒感染)。
[0499] 可以增加额外的组，包括在施用纳米颗粒的过程中暴露于病毒的虾，以监测喂食纳米颗粒对病毒感染的易感性的影响。
[0500] 在最后一次喂食后的预定时间(例如48小时)，牺牲虾并从虾组织中提取总RNA用于定量实时PCR分析，以及分析不同组中的病毒滴度(viral titers)。对虾中相对病毒mRNA表达的影响(例如减少)因此表明了不同壳聚醣-病毒RNA纳米颗粒制剂的功效(例如质量比，壳聚醣的脱乙酰化程度)，特定病毒序列的功效、剂量和治疗方案的功效、通过饲食壳聚醣-病毒RNA纳米颗粒使体内病毒基因沉默的功效。
[0501] 通过喂食壳聚醣-病毒RNA纳米颗粒提高虾的存活率：
[0502] 除了通过摄入在部分N-乙酰化的壳聚醣纳米颗粒或是生物素或葡醣醛酸-壳聚醣-RNA纳米颗粒中复合的单股和双股RNA而进行基因沉默，了解此基因沉默是否最终会提高抗性或者是虾对疾病的耐受性是非常重要，特别是对病毒性疾病的耐受性。为了测试通过摄入这种壳聚醣-病毒RNA复合纳米颗粒来递送病毒基因沉默RNA序列是否可以有效地降低感染水平或改善虾暴露于病原性病毒后的存活率，喂食虾(例如幼年的南美白对虾Penaeus vannamei)壳聚醣-病毒RNA复合纳米颗粒(基于衍生物H35(DD＝35％)、H42(DD＝42％)、H55(DD＝55％)或未处理的壳聚醣(DD＝83％)的复合物，以及含有游离的病毒RNA的饲料丸，和市售食品(普通饲料，没有添加RNA)，其为根据预定的方案和剂量(例如每天2次，持续5天，每日总剂量为虾生物质量的5％)。虾类样品族群包括纯洁的虾(未被病毒感染的)和感染的虾(在开始喂食之前通过取样病毒滴度(viral titers)来验证病毒感染)。
[0503] 可以增加额外的组，包括在施用纳米颗粒的过程中暴露于病毒的虾，以监测喂食纳米颗粒对病毒感染的易感性的影响。
[0504] 在开始喂食后的一预定时间内(或多个时间内)(例如48小时、4天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月)，对虾进行计数并检查对生长、体重(生物量)的影响，检查健康的外观和病理，牺牲虾，确定的病毒滴度(viral titers)，以及从虾组织提取的总RNA用于定量实时PCR分析。对受感染的虾的病毒感染率和病毒滴度以及不同的健康参数(体重、生长、外观、饲料转化率、存活率等)的影响(例如减少)进行监测，然后可以使其与喂食纳米颗粒对于相关的病毒mRNA表达的效果相关联，提供对喂食纳米颗粒的虾水产养殖的实际优势的测量，特别是不同的壳聚醣-病毒RNA纳米颗粒制剂(例如质量比、壳聚醣的脱乙酰化程度)、特定病毒序列、剂量和治疗方案，以用于使体内病毒基因沉默，通过饲喂壳聚醣-病毒RNA纳米颗粒。
[0505] 总之，这些结果可为选择有效的病毒基因目标和使病毒基因沉默的RNA序列提供重要指导，并指示制备以及通过虾摄入饲料递送病毒基因沉默RNA序列的有效方法，如壳聚醣-病毒RNA纳米颗粒，及其对病毒性疾病的抗性和耐受性的影响，以及在面对致病病毒时提高虾的存活率的能力。
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