皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器及其制作方法技术领域

本发明涉及一种皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器及其制作方法，尤其涉及一种以针状式参考电极、工作电极中固定有葡萄糖氧化酶为基础的皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器及其制作方法。背景技术

第一类传统血糖监测仪是有创测量仪器，其方法是指尖取血测量检验。第二类是无创血糖检测仪，包括皮下组织间液葡萄糖检测仪和光谱分析血糖仪。

第三类是连续式血糖监测仪，由MiniMed公司制造的便携式CGMS已获FDA的批准用于连续的血糖测量。该仪器在细针头的前端加上- -个葡萄糖传感器，植入皮下组织，利用所含的葡萄糖氧化酶每10s测定皮下组织问液中氧的消耗量或氢氧离子的产生量，借此转换成葡萄糖值。该仪器每5min记录一次平均值，每天共计有288笔数据，每台记录器可连续存贮2周的数据。每隔3天需到医院将数据通过红外接口或RS232串口下载到普通电脑中，便可做出完整的血糖图和统计值，其可测定的范围为40〜400mg/dl。 CGMS的好处是不会影响生活起居，可将3天的血糖值做成一条连续变化的曲线，并在注射胰岛素、饮食、运动或其它突发事件时按钮做记录，以弥补1天4次血糖监测所无法检测到的高/低血糖，尤其是半夜或运动期问的低血糖及餐后的高血糖，并可一目了然的观察到黎明效应或是低血糖反弹，医生便可根据此制定相应的治疗方案。CGMS的缺点是不能向病人提供实时的血糖测量值，而只能提供医师事后下载的数据资料。

如有人申请了名称为"血液接触传感器"的PCT申请，国际申请日为2005年09月08日，国际公开日为2006年03月16日，国际申请号为PCT/US2005/032102，国际公布号为WO/2006/029293。该装置特别适用于传感器直接接触到在体内的血液。该装置包括一个传感器可以检测到样品的存在及其的装配工具。装配工具有一个传感器终端，固定在传感器上，以及装配工具是适合与静脉流装置联合使用。通过与静脉流装置联合使用，装配工具把传感器直接与静脉流中的血液接触。静脉流装置使传感器直接接触包含一些物质的血液，但不仅限于用于静脉导管和外部血液循环，如用于额外的氧化膜或血液透析。

在连续血糖测量系统中，葡萄糖传感器是至关重要的，也是现在尚未解决

的难题，许多研究都表明：通过植入式葡萄糖传感器进行在体葡萄糖连续监测

是可行的。考虑到外科手术的便利、安全性和需要更换传感器的实际情况，传感器的植入应选择在皮下用于植入生物体可连续测量化学成分的传感器，并且必须满足其相应的生物体特性。这些特性都与传感器的生物兼容性相关。在有植入体植入的情况下，活体组织或器官都会有组织反应和受体反应，这就意味着传感器不但要有对需检测的化合物有特异的选择性，而且在植入组织后相对长的期间内有良好的稳定性和对被测物浓度快速变化的检测能力即良好的响应时间特性。发明内容

本发明针对现有技术中葡萄糖传感器生物兼容性差、不能实时向使用者提供其当时的血糖值的不足，提供了一种生物兼容性好的皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器及其制作方法。为了解决上述技术问题，本发明通

过下述技术方案得以解决：

皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器，包括一个针状式参考电极和至少一个针状式工作电极，工作电极包括导电层和酶膜层，所述工作电 极还包括高分子材料内膜层和高分子材料控制扩散层，导电层、高分子材料内 膜层、酶膜层及高分子材料控制扩散层由里至外依次覆盖而成。

酶膜层内含有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，是一层酶胶层。酶膜层可以氧 化葡萄糖和过氧化氢。

本发明的皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器采用多个工 作电极时，多个工作电极并联。其中一个作为主工作电极，主工作电极采用优 化方式进行选取，其余工作电极为辅助工作电极。工作电极和参考电极构成回 路组成电化学传感器。

工作电极和参考电极可以通过塑料底座固定，塑料底座为圆弧设计，电极 垂直底座圆弧，无线发射装置嵌入底座内并与电极相连。塑料底座的材料可以 是聚丙烯、聚亚胺、聚氯乙烯、聚醚、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚酰胺、聚 氨酯、聚氯乙烯、聚对苯二甲酸亚丁烯基酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氧化 苯或是丙烯丁二烯树脂中的任意一种材料，优选聚乙烯。

作为优选，工作电极的导电层由金属基体、金属过渡层、贵金属层由内而 外依次组成。

作为优选，所述的工作电极的导电层的金属基体的材料可以是不锈钢、 铜或钛的任意一种，优选不锈钢；

金属过渡层的材料可以是钛、镍、金、白金、钯、铑、铱或铬中的的任

意一种，优选钯；

贵金属层的材料可以是钯、铑、铱、铬或铂中的任意一种，优选钯和铂。 导电层需有足够的刚性，能够很容易地刺入皮肤。 作为优选，高分子材料内膜层的材料可以是聚对苯二甲酸亚丁烯基酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氧化苯、丙烯丁二烯树脂、硅烷树脂、环氧树脂或 醋酸纤维中的任意一种，根据材料在导电层上的成膜特性，优选环氧树脂和醋 酸纤维，考虑到葡萄糖氧化酶采用交联方法交联到高分子材料内膜层上，特别 优选醋酸纤维；

高分子材料控制扩散层的材料可以是醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚乙烯醇、 聚亚胺酯、聚氨酯、聚四氟乙烯或聚氯乙烯中的任意一种，聚氨酯生物相容性 好，有良好的成膜性能，因此优选聚氨酯；

高分子材料控制扩散层表面包裹一层多空间网格的亲水性水合层，材料可 以是多孔性的聚乙烯醇、聚乙二醇、羧化的壳聚糖，羧甲基纤维素、羟乙基纤 维素、低寡聚糖或双氧淀粉中的任意一种，优选材料为多孔性聚乙烯醇，特选 60pm的多孔性聚乙烯醇。

高分子材料内膜层作用是绝缘和隔除小分子干扰物包括抗坏血酸和少量 的氨基尿酸、胆红素、儿茶酚胺、药物及其他各种代谢物，只允许过氧化氢进 入针形金属微电极表面，可以减少工作电极的电化学干扰。

葡萄糖氧化酶对葡萄糖的响应动力学，只有在较低的葡萄糖浓度范围内， 葡萄糖氧化酶对葡萄糖浓度的响应才是线性响应。因而本发明在酶膜层表面覆 盖一层高分子材料控制扩散膜。工作电极的高分子材料控制扩散层具有选择透 过性，使血液中的葡萄糖分子扩散透过这层高分子薄膜到达葡萄糖氧化酶膜表 面，降低葡萄糖分子的扩散速度，使葡萄糖分子的扩散过程作为整个反应的控 制过程，酶膜中的葡萄糖浓度始终保持在较低的浓度范围内，达到扩大线性范 围的目的。

高分子材料控制扩散层可以阻止酶的流失，选择浸透性可以减缓较大分子 如蛋白等的扩散，可以减少电极干扰，还可以通过限制葡萄糖扩散到工作电极的量来增加传感器的检测线性范围。如果这层膜氧的浸透性大于葡萄糖的浸透 性，还可以改善电极对氧的依赖。高分子材料控制扩散层可以过滤大分子和细 胞，对整个反应起到扩散控制作用。

如果在葡萄糖传感器表面存在丰富血管分布的纤维组织，血液就能较容易 扩散到葡萄糖传感器的表面，则葡萄糖传感器就可以较好的测量血液葡萄糖的 变化。这就縮短了葡萄糖传感器的响应时间，从而达到实时监测。并且如果在 葡萄糖传感器表面存在丰富的血管组织，可以使葡萄糖传感器能在不校正的情 况下长期稳定的工作。在葡萄糖传感器的表面固定一层多空间网格的亲水性高 分子材料层，可以促进在传感器周围新血管的形成，从而縮短了葡萄糖传感器 的响应时间，同时还能有效增加葡萄糖传感器周围组织的葡萄糖和氧浓度。

作为优选，参考电极为银/氯化银电极，由内而外依次包括导电层、银/氯 化银层和高分子材料外膜层三层。

作为优选，所述的参考电极的导电层由金属基体和银层由内而外依次组 成，金属基体的材料可以是不锈钢、铜或钛中的任意一种，优选不锈钢；参考 电极的高分子材料外膜层的材料可以是醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚乙烯醇、聚 亚胺酯、聚氨酯、聚四氟乙烯或聚氯乙烯中的任意一种，优选聚乙烯醇。

作为优选，所述的工作电极的导电层的金属基体直径R7为0.15~0.25mm， 优选0.2mm，金属基体表面颗粒大小为30nm;

金属过渡层厚度R6为0.05pm〜lnm，颗粒大小为100nm;

贵金属层厚度R5为1,〜3pm，颗粒大小为30nm;

酶膜层厚度R3为0.05pm~l|im;

高分子材料控制扩散层厚度R2为5pm〜10^im。

高分子材料控制扩散层表面包裹的一层空间网格的亲水性水合层，其厚度Rl为3(am〜6|am。

参考电极的银层厚度R10为0.05pm〜lpm，银颗粒大小在lOOnm左右。 本发明还公开了一种皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器 的制作方法：

高分子材料内膜层通过涂布或浸渍的一种方式结合在导电层的表面，优选 涂布方法；

酶膜层以戊二醛为交联剂，以牛血清蛋白或环糊精或明胶为载体，通过交 联法和共价键合法固定在高分子材料内膜层表面上；

高分子材料控制扩散层采用涂布或浸渍的方式固定在酶膜层表面，优选涂 布方法；

工作电极的导电层表面用氧离子蚀刻法进行表面活化预处理。在导电层的 金属基体表面沉积一层金层作为金属过渡层，金电极表面电沉积一层疏松状的 铂黑颗粒，介体和酶直接吸附在铂黑电极表面，以满足在pH二7.4的生理环境

下电化学氧化过氧化氢的电极要求。铂黑多孔微颗粒具有比表面积大、电催化 能力、强等优良特性，经铂黑修饰的金电极在酶固定化过程中，利用铂黑颗粒 的多孔特性，酶分子能牢固地吸附在铂黑电极表面上，通过改变电沉积电压， 可以控制铀黑电极比表面积的大小和疏松度。铂黑提供足够大的面积从而使电 极过程为葡萄糖扩散过程控制，这样制备的葡萄糖传感器具有体积小、灵敏度 高和一致性好的特点。高疏松状的铂黑电极表面能有效增大传感器电流信号输 出的信躁比，提高电极表面的亲水性，从而减少酶损失。

在沉积铂黑前用物理或化学的方法对电极表面进行预处理，可有效提高电 极的抗腐蚀能力，降低电极阻抗，增强铂黑颗粒与金电极的交联度。本发明采 用氧离子刻蚀的方法对金电极表面进行预处理，可以去除电极表面的污染物，同时还能起到活化电极表面的作用。刻蚀的条件可根据电极表面的情况做适当

的调整，电镀电压、沉积时间以及不同电解液配比都将影响膜的厚度和致密度。 本发明的酶膜层结合法的优点是酶结合的牢固性、稳定性好，灵敏度、选

择性和重现性高。

高分子材料控制扩散层表面包裹一层多空间网格的亲水性水合层。 作为优选，工作电极的导电层由金属基体、金属过渡层、贵金属层由内而

外依次组成；

导电层的金属过渡层可以通过化学沉积法、磁控溅射或电镀方法中的任意 一种方法附着在金属基体表面，优选磁控溅射方法；

导电层的贵金属层可以通过化学沉积法、磁控溅射或电镀方法中的任意一 种方法附着在金属过渡层表面。

作为优选，参考电极为银/氯化银电极，由内而外依次包括导电层、银/ 氯化银层和高分子材料外膜层三层；参考电极的导电层由金属基体和银层由内 而外依次组成，金属基体的材料可以是不锈钢、铜或钛中的任意一种；

参考电极的金属基体表面通过电镀方法、化学沉积法或磁控溅射法中的任 意一种方法渡一层银，优选电镀方法，进行氯化形成银/氯化银层，颗粒大小 为100nm;

参考电极的高分子材料外膜层的材料可以是醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚乙 烯醇、聚亚胺酯、聚氨酯、聚四氟乙烯或聚氯乙烯中的任意一种；

参考电极的高分子材料外膜层通过涂布或浸渍中的任意一种方法固定在 银/氯化银层表面。

根据葡萄糖氧化酶对葡萄糖的响应动力学，只有在较低的葡萄糖浓度范围 内，葡萄糖氧化酶对葡萄糖浓度的响应才是线性响应。因而本发明在葡萄糖氧

11化酶层覆盖一层高分子材料控制扩散层。高分子材料控制扩散层使血液中的葡 萄糖分子扩散透过这层具有选择透过性的高分子薄膜到达葡萄糖氧化酶层表 面，从而降低葡萄糖分子的扩散速度，使葡萄糖分子的扩散过程作为整个反应 的控制过程，葡萄糖氧化酶层中的葡萄糖浓度始终保持在较低的浓度范围内， 达到扩大线性范围的目的。

根据临床的要求，葡萄糖传感器线性区域上限必须达到30mmo1。在此上 限下，传感器的分析特性如灵敏度、线性区等，稳定性由高分子材料控制扩散 膜的厚度及制备方式决定。本发明的葡萄糖传感器线性区域上限达到30mmo1 以上。

本发明可以用于人体或动物皮下组织液葡萄糖的检测，植入部位为皮下组 织可以是手臂或腹部部位，优选植入部位为腹部皮下组织。本发明的葡萄糖传 感器连续工作不少于72小时。

本发明的探测头被植入测试者皮下，测试者皮下细胞间液中的葡萄糖通过 半透膜透析到传感器工作电极表面，透析到传感器工作电极表面葡萄糖与酶发 生反应，产生的电信号反映人体组织液葡萄糖水平。

植入后传感器灵敏度的衰减与传感器的结构有关，主要问题是在氧不足时 酶的催化反应受到抑制和一些小内源性分子的电化学干扰。氧不足的问题可通 过相对增加氧的渗入面积减少酶反应的面积，使用高溶解氧的膜或使用疏水性 外层膜选择性地减少葡萄糖扩散到酶膜层内来解决。电化学干扰可以通过使用 具有选择性的膜和非导电聚合膜来解决。

按照本发明的制作方法，葡萄糖传感器稳定性好、灵敏性高、输出电流与 葡萄糖浓度的线性范围广泛、响应时间短可连续实时监测，酶结合的牢固性、 稳定性好，灵敏度、选择性和重现性高。附图说明

图1为葡萄糖传感器结构示意图。

图2为图1的俯视图。

图3为工作电级的放大剖视图。

图4为参考电级的放大剖视图。

图5为葡萄糖传感器在体外磷酸盐缓冲试剂的葡萄糖溶液测试结果图。 图6为使用本发明葡萄糖传感器连续实时测量的电流值。 具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

实施例l，皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器，如图l、 2、 3所示，包括一个针状式参考电极2和至少一个针状式工作电极1，工作电极l 包括导电层8和酶膜层6，其特征在于：所述工作电极l还包括高分子材料内膜 层7和高分子材料控制扩散层5，导电层8、高分子材料内膜层7、酶膜层6及 高分子材料控制扩散层5由里至外依次覆盖而成。

工作电极1和参考电极2可以通过塑料底座3，固定无线发射装置嵌入塑料 底座3内并与工作电极1和参考电极2相连。 在本实施例中：

导电层8的金属基体83材料选用不锈钢；

导电层8的金属过渡层82材料选用钯；

导电层8的贵金属层81材料选用钯；

高分子材料内膜层7的材料选用醋酸纤维；

酶膜层6内含有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶；

高分子材料控制扩散层5的材料选用聚氨酯；高分子材料控制扩散层5表面包裹的一层空间网格的亲水性水合层4，亲

水性水合层4材料选用60nrn的多孔性聚乙烯醇；

塑料底座3的材料为聚乙烯； 其中9为传感器的中心线。

按照下列厚度R参数制备8个相同的葡萄糖传感器。

参数 金属基体83 金属过渡 层82 贵金属层 81 高分子材料 内膜层7 酶膜层6

厚度（R) R7=200pm R6=0.05|xm R5=l(xm R4=3|im R3=0.05|im

参数 高分子材料 控制扩散层5 亲水性水 合层4 金属基体 122 银层121 高分子材料 外膜层10

厚度（R) R2=5(im Rl=3|im Rll=200|im Rl 0=0.05 R8=5,

表l:8个葡萄糖传感器尺寸参数表

这8个葡萄糖传感器在体外磷酸盐缓冲试剂的葡萄糖溶液测试，测试电压

正负极电压差为0.55V，测试结果如下:

葡萄糖 浓度 (mmol/L) 传感器 1 传感器 2 传感器 3 传感器 4 传感器 传感器 6 传感器 7 传感器 8

0 37 30 30 33 30 35 31 31

150 145 147 143 143 149 141 141

10 263 260 267 255 255 276 256 257

15 373 378 388 364 373 404 373 378

20 490 497 508 475 488 529 493 498

25 603 611 626 585 602 653 605 610

30 708 715 744 697 709 771 710 713

线性(％) 99.996 99.997 99.998 99.999 99.996 99.979 99.987 99.982

表2: 8个传感器在体外磷酸盐缓冲试剂的葡萄糖溶液测试结果表（单位：nA)

在保证临床使用条件下，本发明葡萄糖传感器葡萄糖线性测试大于

30mmol/L，线性达到99.9%，灵敏度大于25nA/ (mmol/L)，灵敏度较好；各传 感器的性能一致、稳定。实施例2，皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器，大致的构造 和实验条件相同，所不同的地方仅为如下。 导电层8的贵金属层81材料选用铂； 高分子材料内膜层7的材料选用环氧树脂;

按照下列厚度R也制备8个相同的葡萄糖传感器（即传感器9至传感器

16)。

表3 :传感器9至传感器16的尺寸参数表

这7个葡萄糖传感器在体外磷酸盐缓冲试剂的葡萄糖溶液测试，测试电压

正负极电压差为0.55V，测试结果如下:

在保证临床使用条件下，本发明葡萄糖传感器葡萄糖线性测试大于

27mmol/L，线性检测上线高，线性达到99.9%;灵敏度为28nA/ (mmol/L)，灵敏度较好；各传感器的性能一致、稳定。

实施例3，制作实施例1的皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传 感器的方法：葡萄糖传感器有两个工作电极1和一个参考电极2，工作电极l 和参考电极2可固定在一个塑料底座3上，工作电极1和参考电极2通过导线 构成回路。

工作电极1的导电层8由金属基体83、金属过渡层82、贵金属层81由

内而外依次组成。

金属过渡层82通过磁控溅射方法附着在金属基体83表面；

贵金属层81通过电镀方法附着在金属过渡层82表面；

导电层8表面采用氧离子刻蚀法使表面活化。

高分子材料内膜层7通过涂布的方式结合在导电层8的表面；

酶膜层6以戊二醛为交联剂，以牛血清蛋白为载体，通过交联法和共价

键合法固定在高分子材料内膜层7表面上；

高分子材料控制扩散层5采用涂布的方式固定在酶膜层6表面；

参考电极2的金属基体122表面通过电镀方法方法渡一层银，进行氯化形 成银/氯化银层11，颗粒大小为100nm;

高分子材料外膜层10通过涂布方法固定在银/氯化银层11表面。 用该方法制备的传感器可以达到实施例1所述的效果。 实施例4，制作实施例2的皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖

传感器的方法：与实施例3不同的是：酶膜层6以戊二醛为交联剂，以明胶为 载体，通过交联法和共价键合法固定在高分子材料内膜层7表面上； 高分子材料控制扩散层5采用浸渍的方式固定在酶膜层6表面；

其它步骤与实施例3相同，用该方法制备的传感器可以达到实施例2所述的效果。

实施例5，将实施例2的皮下组织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感 器1植入手臂部位连续工作不少于72小时，图6为使用本实施例2的皮下组 织实时监测用针状电流测定式葡萄糖传感器连续实时测量的电流值。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作 的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。