내분비교란물질 검출 바이오마커 시약 {Biomarker Reagent for the detection of Endocrine Disruptors}

본 발명은 환경오염 내분비교란물질 검출을 목적으로 넙치의 혈장, 혈청 및 간세포배양액 (hepatocytes culture supernatant) 내의 비텔로제닌을 검출하는 면역크로마토그래피(immunochromatography)법 검출시약에 관한 것이다.

비텔로제닌은 어류를 비롯한 척추동물의 간에서 합성되는 난황전구물질이며, 여성호르몬인 에스트로젠의 분비에 따라 간에서 합성되어 혈류를 따라 여포로 이동하여 흡수된 후 난황을 구성하는 리포비테린, 포스비틴 및 베타프라임-콤포넌트로 분리된 후 난에 축적된다.

정상적인 수컷에서는 비텔로제닌이 합성되지 않으나, 에스트로젠에 노출되거나, 에스트로젠 유사 내분비교란물질에 노출되면 수컷의 간에서도 합성되어 혈중에서 검출된다. 그러므로 이러한 내분비교란물질의 오염이 의심되는 물에서 자랐거나 인공적으로 사육한 후 혈 중의 비텔로제니 합성 유무를 검사하여 내분비교란물질의 존재를 확인할 수 있다. 또한, 배양 간세포에 시험물질을 가하고 배양한 후 배양상청 중의 비텔로제닌을 조사하여 대상물질이 내분비교란성이 있는가 여부를 확인할 수 있다.

비텔로제닌을 혈청에서 측정하는 진단시약은, 효소를 이용한 EIA법이 일본에 소개되어 있으나, 이러한 검사법은 특별히 고안된 검사용 장비가 필요하고 검사 시간이 오래 걸리며, 특히 오염현장에서의 즉각적인 적용이 불가능하므로, 현장에서 적용이 가능한 간편한 검사법이 절실히 요구되어 왔다. 특히 현재 일본에서 소개된 비텔로제닌 검사용 시약은 잉어와 송어를 대상으로 고안된 방법이므로 연안 바다의 오염을 검사할 수는 없다는 한계점이 있었다.

본 발명은 검사결과를 짧게는 약 3분 내에 볼 수 있는 초고속 진단 방법인 면역크로마토그래피법을 응용하여 넙치의 비텔로제닌을 검출하는 진단시약의 개발에 대한 것이다. 면역크로마토그래피법으로 비텔로제닌을 검출하기 위해서는 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 비텔로제닌에 대한 항체를 정해진 위치에 흡착시키고 골드입자에 각각에 대한 항체를 접합시켜 패드에 건조시킨다. 건조된 골드패드와 검체를 적용하는 패드를 중첩하여 나이트로셀룰로우즈 멤브레인 위에 덮고 반대편 위치에 흡습용 패드를 부착시켜 테스트용 스트립을 제조한다(도 2).

환경호르몬의 바이오마커(biomarker)인 비텔로제닌에 대한 항체를 얻기 위해서는 정제된 비텔로제닌이 있어야 한다. 비텔로제닌을 얻기 위하여 넙치의 복강 내에 에스트로젠을 접종하여 간으로부터 비텔로제닌을 합성유도 시킨 후 채혈하여, 혈청을 분리한 후 냉각증류수법(ice-cold water precipitation법), 이온교환크로마토그래피법(ion-exchange chromatography법) 및 겔크로마토그래피법으로 순수한 비텔로제닌을 얻어내었다.

비텔로제닌에 대한 항체는 정제된 각각의 항원을 blab/c 마우스에 면역시키고 비장세포를 분리하여 골수암세포(myeloma cell)와 세포융합시켜 비텔로제닌에 대한 단클론항체를 분비하는 잡종세포주를 개발한다. 이 세포주를 이용하여 단클론항체를 제조하였다. 또한 골드입자에 부착하는 항체는 정제된 각각의 항원을 토끼에 면역하고 특이항체만을 친화성크로마토그래피법으로 정제하여 제조하였다.

상기의 방법으로 제조된 테스트 스트립을 검체 적용홀과 표시창이 표시된 플라스틱 디바이스에 넣는다. 검체 적용홀에 넙치의 혈액 혹은 간세포배양상청 약 100ul(2방울) 넣으면 검체 중에 존재하는 비텔로제닌이 골드입자에 부착된 각각의 항체와 반응을 하면서 나이트로셀룰로우즈 멤브레인 위를 모세관 현상에 의해서 전개된다. 멤브레인에는 비텔로제닌에 대한 단클론항체를 일정한 위치에 흡착시켜 놓아 비텔로제닌이 혈청 중에 존재하는 경우는 골드입자에 접합된 항체에 반응한 비텔로제닌이 멤브레인에 흡착된 항체와 다시 반응하여 해당 위치에 골드입자 색에 의한 보라색 밴드를 형성한다. 대조선 위치에는 항토끼(anti-rabbit) IgG를 흡착시켜 토끼 IgG가 흡착된 골드입자가 혈청 중에 비텔로제닌 마커의 존재여부에 관계없이 항상 반응하여 보라색 밴드를 나타내게 하였다. 반응하지 않은 내용물은 흡습패드에 스며들어 검사창의 멤브레인은 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있도록 하였다. 즉 혈청 중에 비텔로제닌이 존재하면 비텔로제닌에 대한 단클론항체가 흡착된 위치와 대조선 위치에 보라색 밴드를 나타난다.

비텔로제닌은 극히 불안정하여 하급의 단백으로 빠른 단백변성·분해를 가지는 성질이 있으므로, 본 발명품의 경우는 변성·분해된 상태의 항원 결정기에 대한 항체를 쌍으로 시스템을 구성함으로써 냉장 및 냉동 보관되어 다소의 변성·분해된 시료를 사용하여도 검출이 가능하다.

또한, 본 발명품은 기본적으로 내분비교란성 여부의 판별에 적합하게 이용될 수 있으나, 비텔로제닌이 자성(암컷)특이 물질이라는 점과 치어기의 암수판별이 어려운 특성을 감안할 때, 현장에서의 암수판별에 용이하게 이용될 수 있다. 어류의 실험에 있어 살아있는 상태에서 암수의 구별이 필요한 경우 (암수성비의 판정, 성전환 실험 등)에 손쉽게 판별이 가능하다. 암수의 판별은 특히 치어기의 어류에 있어서는 거의 불가능하다고 할 수 있으며, 이제까지의 감별 방법은 해부한 후 생식소의 감별을 통해서만 가능하였다. 본 발명품은 어류의 분비 점액물질을 채취하여 반응시킴으로써 암수의 감별이 가능한 특징을 가진다. 단, 대상어류는 성성숙 시기의 내분비 호르몬 (성호르몬)이 분비되어 혈중 비텔로제닌의 합성이 이루어지는 시기의 것으로 한정한다.

본 발명은 속칭 `환경호르몬'이라 불리는 환경오염 내분비교란물질 검출을 보다 신속하고 정확하게 판단할 수 있는 신속진단시약을 개발함으로써, 내분비교란성 화학물질에의 노출을 방지하고 인류의 건강증진에 도움을 주고자 하는 것을 목적으로 한다. 본 발명자는 상기와 같은 문제점에 비추어 예의 연구를 거듭한 결과, 비텔로제닌 신속 진단 면역크로마토그래피법을 이용하여 내분비교란성 환경호르몬의 검출을 보다 신속하고 간편하게 할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명품을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 비텔로제닌의 단클론항체를 생산하여 혈청, 혈장 및 간세포배양액내의 비텔로제닌의 신속한 정성분석을 통하여 내분비교란성 여부를 판단하는신속진단시약을 제조하는 것을 목적으로 한다.

도 1a는 본 발명의 실시예에 따른 바이오마커 시약의 제조공정 중 비텔로제닌의 순수분리과정을 나타낸 제조공정도.

도 1b는 본 발명의 실시예에 따른 바이오마커 시약의 제조공정 중 토끼 다크론 특이항체를 제작하는 과정을 나타낸 제조공정도.

도 1c는 본 발명의 실시예에 따른 바이오마커 시약의 제조공정 중 마우스 단클론특이항체를 제작하는 과정을 나타낸 제조공정도.

도 1d는 본 발명의 실시예에 따른 바이오마커 시약의 제조공정 중 제품의 제제화 과정을 나타낸 제조공정도.

도 2는 발명품에 사용될 테스트용 스트립의 기본 구성도.

도 3은 에스트로젠에 유도된 단백질의 전기영동 사진.

(HMM: 분자량마커, 1,3: 수컷혈청, 2,4: 에스트로젠이 처리된 수컷혈청)

도 4는 Ice-Cold 법에 의해 정제되기 전의 혈청단백질의 전기영동사진.

도 5는 Ice-Cold법에 의해 정제된 비텔로제닌의 전기영동사진.

도 6은 혈청을 세파로스6비컬럼 크로마토그래피에 의해 분리시킨 단백질의 흡광도상.

도 7은 도 7에 의해 분리정제된 비텔로제닌의 전기영동사진.

도 8은 Colloid의 전자현미경 사진 (좌:20nm, 우; 40nm 구경).

도 9는 완충액 및 흡착농도별로 구분하여 전개한 면역크로마토그래피의 결과 사진.

도 10은 다양한 농도의 비텔로제닌 혈청에 대한 시험결과 도해.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본, 발명에 따른 비텔로제닌 신속진단시약제조의 방법을 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 사용한 비텔로제닌은 넙치 수컷(500 - 600g)을 마취 후 체중 Kg당 1㎎의 에스트로젠을 복강 내에 주사하고 5일 후에 에스트로젠을 각각의 어류에 대하여 상기 동량을 재 주사하고, 초회접종 10일 후에 미단 꼬리 부분을 절단하여 혈액을 채취하고, 0.01% sodium azide와 1mM Phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF) 첨가하여 냉장실에서 충분한 응고가 되도록 한 후에 원심 분리하여 혈청을 얻고,

상기 혈청을 상기 혈청을 8㎖ 당 증류수 80㎖를 첨가하여 12시간 냉장 보관한 후 15,000 rpm/min으로 15분간 원심분리를 한 후 침전물에 50㎖의 증류수를 첨가하여 세척하고, 세척한 침전물은 다시 15,000 rpm/min으로 15분간 원심분리를 하여, 침전물을 2㎖ 0.02M Tris-HCl, 0.1% NaN3, 2% NaCl pH 8.0의 용액에 용해하고, 용해된 용액은 다시 10,000 rpm/min으로 15분간 원심분리를 하여 상등액에 20㎖, 영상 4도의 증류수와 희석하고, 희석액은 15,000 rpm/min으로 15분간 원심분리를 한 후 희석액에 0.02M Tris-HCl 1㎖를 첨가하여 5,000 rpm/min으로 5분간 원심분리하여 최종 비텔로제닌의 침전물을 얻는다(도 4,5).

또 다른 방법으로는, 세파로스겔(Sephalose CL4B gel, 30cm, 5ml/cm)을 이용한 여과를 통해 순수하게 정제하여 얻어진다(도 6,7).

정제된 비텔로제닌을 이용하여, 면역을 위한 동물 즉, 토끼(2수)와 마우스(Balb/c 2수)를 준비하여 토끼는 complete Adjuvant solution과 1:1(단백량=100㎍)로 emulsion한 후 매 2주씩 접종하고, 마우스는 1차 100㎍의 단백량으로 complete Adjuvant와 emulsion을 거친 후 복강 내 투여로 접종하고, 2차 면역은 2주 후 100㎍의 단백량으로 incomplete Adjuvant와 emulsion을 거친 후 복강 내 투여하고, 일주일의 간격을 둔 후 3회 연속 비텔로제닌만을 100㎍의 단백량으로 1일 간격으로 3회 접종하고 다음 날 Fusion을 실시한다.

비텔로제닌으로 면역된 마우스(Balb/c; 2수)의 혈액을 50100㎕정도 채취하여 ELISA를 통해 항체 역가를 측정 후 항체의 형성이 확인되면 세포융합을 실시한다. 안락사 시킨 마우스의 비장을 무균적으로 적출해 낸 후 멸균된 철망에 갈아 세포를 얻어내고 미리 준비한 SP2 골수암세포와 융합시키고, 융합에는 PEG 1500을 사용한다.

ELISA값을 통해 얻어진 데이터를 근거로 비텔로제닌에 대한 높은 항체가를 가진 클론들을 분리 배양하여 well당 1개의 세포가 들어가도록 분리 배양시킨다. 클론이 2/3정도 바닥에 배양되면 ELISA를 실시하여 역가가 가장 높은 well의 클론을 따로 분리하여 배양시키고, 동결 보관한다.

마우스의 복강 내 pristane을 처리한 후 1주일 후 배양된 단클론 세포를 채취하여 복강내 투여하여, 1주일 후 마우스의 복강에서 항체가 증폭되어진 복수를 채취하고 복수는 냉동보관한다(-70도).

20nm gold 100ml를 제조하여 nucleation을 통하여 40nm plain gold를 제조한다(도 8). 초자류는 철저히 세척한 후 사용하였다. 모든 물은 18.2 MOhm의 순수를 사용하였다. 1 % gold chloride는 0.1 g tetrachloroauric(III) acid trihydrate를 용해시켜 만들었으며, 1% tri-Sodium citrate는 0.5g tri-sod. citrate를 50ml에 용해시켜 준비하였다.

물 89ml을 100도로 가열하고, 1% gc, 1ml을 가하여 0.01%되게 한 후, 1% sc 4ml에 물 6ml을 섞고 추가로 15분간 더 끓였다. 이후 20nm gold에 물을 추가로 가한 다음 끓여서 40nm의 plain gold를 제조하였다. 1% sc 2ml을 가하여 0.01%가 되게 하고, 1% gc 2ml을 물 18ml과 섞은 후 점적하며 20분간 끓인 다음 실온에 방치하여 감온시켰다. 보존제로는 0.01%되게 NaN ₃ 를 가하였다.

[실시예 1]

* 비텔로제닌 진단 면역크로마토그래피법 시약 제조

1. 넙치의 비텔로제닌 순수분리

넙치 수컷(500 - 600g)을 마취 후 에스트로젠을 체중 Kg당 1㎎ 씩 복강 내에 주사하고 5일 후에 에스트로젠을 각각의 어류에 대하여 상기 동량을 재 주사하고, 10일 후 미부를 절단하여 채취하였다. 0.01% (sodium azide)와 1mM Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)를 첨가하여 냉장실에서 충분한 응고가 되도록 한 후에 1,500g로 10분간 4도에서 원심 분리하여 크로마토그래피법으로 정제하였다.

먼저 세파로스 6비 컬럼(Spharose 6B column, 850 x 16mm)에서 1mM PMSF가 포함된 100mM 트리스완충액(Tris-buffer, pH7.8)으로 시간당 60㎖가 용출되도록 한 후에 준비된 샘플을 공급한 후 비텔로제닌이 포함된 분획을 회수하여 디이에이이-세파로스컬럼(DEAE-Sepharose column, 350 x 16mm)에 가하고 1mM PMSF가 포함된 150mM 트리스완충액(pH7.8)으로 시간당 36㎖씩 용출시켜 6㎖씩의 분획을 얻고 비텔로제닌이 용출된 분획을 회수하여 토끼 항비텔로제닌 항체와 단클론항비텔로제닌개발용 면역원으로 사용하였다.

2. 특이항체의 제작과 정제

토끼 항비텔로제닌 항체는 정제된 비텔로제닌을 1회에 20ug씩 freund's adjuvant와 함께 1개월 간격으로 토끼의 피하에 4회 접종하여 항혈청을 얻었다. 항혈청은 다시 비텔로제닌이 부착된 세파로스겔을 이용하여 동일한 방법으로 순수한 토끼 항비텔로제닌만을 정제했다. 이 정제된 항체는 골드입자에 흡착용으로 사용하였다. 즉 골드 크로라이드(gold chloride)를 소디움시트레이트(sod. citrate)용액으로 환원시켜 40nm 크기의 골드입자를 532nm에서 흡광도가 10+/-1이 되게 제조하였다. 여기에 정제된 토끼 항비텔로제닌을 10ug/ml되게 부착시키고 PEG용액으로 골드입자를 안정화 시켰다. 제조된 골드접합체는 다른 골드접합체와 함께 폴리에스테르(polyester) 또는 유리섬유(glass fiber)와 같은 기질(matrix)에 적셔 건조시켰다. 정제된 비텔로제닌 항원을 blab/c 마우스에 면역시키고 비장세포를 분리하여 골수암세포와 접합시켜 비텔로제닌 대한 단일클론 항체를 분비하는 잡종세포주를 ELISA방법으로 선별하고 한계희석 방법으로 단세포군을 확립하였다. 이 세포주를 대량 배양하여 balb/c 마우스에 복강에 접종하여 항체가 다량 함유된 복수를 얻고 protein A gel을 이용하여 IgG항체를 정제하였다. 정제된 항체를 1mg/ml 농도로 PBS로 희석하여 멤브레인에 흡착시켰다.

* 진단 시약의 제제화

단백과의 접합체를 제조하기 위한 plain gold는 20nm 혹은 40nm 구경의 것을 일반적으로 많이 사용한다. gold의 성능은 구형에 가깝고 크기가 균일한 것이 우수하다. 본 과제에서 개발한 colloidal gold 20nm 및 40nm의 전자현미경 사진을 그림 8에 나타내었다. 각 크기별로 고른 모양의 구형을 띄고 있으므로 만족할 만한 품질의 gold 가 개발된 것으로 판단된다.

마우스의 비장세포와 골수암세포를 융합하여 얻은 단클론 항체와 40nm 구경의 Colloidal gold를 접합시켜 gold conjugate를 제작하였다(도 8). NC paper에 흡착시키는 조건과 conjugation 조건 및 각 단계별 완충액의 조건을 조사하여 비텔로제닌을 검출하는 면역크로미토그래피 kit의 format을 완성하였다. 도 9는 Goldconjugate 희석액, NC paper coating 농도, 혈청희석액의 차이에 따라 민감도와 특이도에 차이가 난다. 구성된 strip은 상용화된 device에 결합시켰다.

[시험예 1]

* 검사 방법 및 판정 방법

검사하고자 하는 어류의 혈청, 혈장 혹은 전혈이나, 간세포 배양상청액을 타원형의 검체 홀에 넣고 약 20분 후에 1및 C의 위치에 보라색 밴드가 나타났는지를 관찰한다. 즉 모든 경우에 C위치에 보라색선이 나타나야 하고 C위치에만 보라색 선이 있는 경우는 비텔로제닌에 대하여 음성으로 판정하며 1, 위치에 보라색 선이 나타나면 비텔로제닌이 양성인 것으로 판정한다.

판정예)

* 본 발명품과 기존 제품의 비교 자료

가. 넙치 비텔로제닌 검출 시약의 비교 시험 결과

제주대학교 수의학과에서 개발한 샌드위치 ELISA법과 비교한 결과로서 아래와 같다.

* 양성 기준 : 시료 중에 비텔로제닌 20ng/ml이상

상기의 결과에 의하면 본 발명품은 내분비교란성 환경호르몬에 의하여 해산어류 넙치(광어, Olive Flounder, Paralichthys olivaceus )의 혈장, 혈청 및 각 어류의 간세포 배양상청 중에 합성된 비텔로제닌의 존재를 확인할 수 있는 신속 검출법으로서 특이성과 민감성을 동시에 갖춘 진단시약임을 확인하였다.

이상에서 설명한 바와같이 본발명에 따른 넙치 비텔로제닌 검출시약을 이용하여 얻을 수 있는 효과는 다음과 같다.

① 내분비교란 화학 물질의 검출을 위한 시간, 비용 및 인력을 감소시킬 수 있고,

②내분비교란 화학 물질의 신속 진단으로 신 합성화학 물질의 독성학점 검증에 이용 가능하고,

③ 치어 조기 성감별을 가능하게 하여 양식 산업의 단성 양성을 가능하게 할 수 있다.