技术领域
[0001] 本
发明属于
生物制药领域，具体涉及一种天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法和制备工艺。
背景技术
[0002] 血液是为组织输送营养并从组织中移去排泄废物的工具。血液由红细胞(RBC或红血球)、白细胞(WBC)、血小板和
血浆组成。红细胞约占血液中细胞的99％，其主要功能是为组织输送氧气并从中移去二氧化
碳。红细胞可逆的氧合功能(即输送氧气)是通过血红蛋白实现的。
哺乳动物血红蛋白的分子量约64000道尔顿，由约6％血红素和94070珠蛋白组成。其天然形式包含两对亚基(即其为四聚体)，各自包含血红素基团扣珠蛋白多肽链。血红蛋白在
水溶液中处于四聚体和二聚体形式之间的平衡；红细胞外的二聚体由肾脏排出。
[0003] 由于医院及其它环境下的血液制品需求越来越大，近年来，医药领域已经针对血液代用品(blood substitute)进行了广泛而深入的研究。血液代用品是能够携带并为组织供应氧气的血液制品。血液代用品具有多种用途，包括替代手术过程中和急性出血后的失血，以及创伤性损伤后的复苏过程。
[0004] 血红蛋白(hemoglobin,Hb)类的血液代用品Hemoglobin-Based Oxygen Carriers,简称(HBOCs)与纳米血红蛋白氧载体，是当前国内外人造血液组织工程与纳米载氧创新药物研发的重点。而以天然血红蛋白(包括成人外周血、人脐带血和动物血)为原料的研发最受关注。目前已有5个厂家的HBOCs产品(含人源性的4种)完成或接近完成了III期临床研究，取得了令人振奋的进展。然而，这些产品在临床试用中都不同程度地出现了诸如血管收缩、血压升高，心脏、肾脏、肝脏等器官受损等毒
副作用，特别对心肌损伤的不良反应较对照组高3倍以上。为此，美国FDA未准予上市。机理研究表明，产生这些毒副作用的主要原因与制品中高
铁血红蛋白(MetHb)含量水平有关，2010年以前临床试用品中的MetHb含量曾允许到5-10％，这不仅与临床试用品所发生的上述不良反应有关，而且也相应的降低了制品给组织器官供氧的疗效。近几年国内外对HBOCs制品的MetHb的含量要求标准均已提高，要求低于3％，甚至1％以下。但要达到这个高标准要求，关键在于要使Hb溶液与HBOCs制品的制备过程，包括分离纯化、交联修饰Hb等过程，和存储过程，脱氧足够彻底。
[0005] 然而，以天然血红蛋白为原料的血液代用品因Hb的特性，在纯化阶段要彻底脱氧需要克服多重困难。天然血红蛋白
接触空气或氧气后迅速被氧
化成氧合血红蛋白(HbO2)，其氧
饱和度(SO2)可达90％以上，而且使Hb溶液中氧分压(PO2)升高，这就很容易使Hb中Fe2+3+
迅速氧化成Fe 而使MetHb含量水平随即相应增加，因此脱氧速度要求快。此外，常规的脱氧方法，如充氮，会对天然血红蛋白造成损害，破坏蛋白的结构，影响其活性。为了控制血液代用品中MetHb的含量，最大限度的减小甚至消除其毒副作用，
现有技术已经研究了一些方法。
[0006]
专利US2002/0137221采用将血红蛋白制备成
一氧化碳血红蛋白(HbCO)来稳定Hb，再将HbCO转换回HbO2，并向溶液中充入氮气以脱氧。但是其中制备一氧化碳血红蛋白使用的CO对操作人员的人身安全是潜在的威胁，而且在使用中将HbCO转换回HbO2十分繁琐，并且也没有提供在天然血红蛋白纯化阶段快速有效且不破坏蛋白结构的脱氧方法。
[0007] 专利CN200810096698.6同样将血红蛋白制备成一氧化碳血红蛋白，并进一步制备成脂质体，再通过氮气鼓泡去氧，该方法依然存在HbCO转换的
缺陷，而且其脱氧方法不能直接用于天然血红蛋白纯化。
[0008] 专利CN200980117711.4提供了一种将血红蛋白制备成聚合戊二
醛血红蛋白的血液代用品，并添加
葡萄糖和/或
抗坏血酸，将其制备成
冻干制剂，以保证高铁血红蛋白的含量低于5％。该方法只能保证高铁血红蛋白的含量低于5％，无法避免MetHb造成的毒副作用，且仍没有提供在天然血红蛋白纯化阶段快速有效且不破坏蛋白结构的脱氧方法。
[0009] 经交联和修饰后的血红蛋白，具有类似红细胞的特性，常规脱氧方法不易将其破坏，然而天然血红蛋白的结构在常规处理方式下容易被破坏，因此用天然来源的血红蛋白制备脱氧彻底迅速、MetHb含量低的血液代用品具有很大的挑战。
[0010] 因此，本发明的
发明人致
力于天然血红蛋白类血液代用品的脱氧工艺研究，经过大量的试验，获得了脱氧迅速、最大限度降低高铁血红蛋白含量(可为0％)，不破坏天然血红蛋白结构，并且成本较低的一种脱氧工艺和使用该脱氧工艺制备血液代用品的方法。
发明内容
[0011] 针对现有技术存在的问题，本发明首先提供一种天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法，该方法操作简便、安全、环保、成本低廉、高效，能在不破坏天然血红蛋白结构的
基础上迅速降低氧分压(PO2)，最大限度降低高铁血红蛋白含量，甚至高铁血红蛋白含量可低至0％。
[0012] 本发明技术方案如下：
[0013] 一种天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法，包括以下脱氧步骤：
[0014] ①向含天然血红蛋白的等渗体系中加入小分子抗氧剂和糖类保护剂；
[0015] ②调整含天然血红蛋白的等渗体系的pH值至5.0-8.0；
[0016] ④将含天然血红蛋白的等渗体系采用抽
真空和通高纯惰性气体交替多次的方式脱氧。
[0017] 进一步地，上述天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法，所述天然血红蛋白来源于人外周血、脐带血或者动物血。
[0018] 进一步地，上述天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法，所述小分子抗氧剂为维生素C。优选步骤②采用维生素C调整pH值。根据本发明的一些具体
实施例，所述维生素C在等渗体系中的
质量浓度为0.05％～0.5％。
[0019] 进一步地，上述天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法，所述糖类保护剂为单糖或
二糖。优选所述单糖为葡萄糖，优选所述二糖为
蔗糖。根据本发明的一些具体实施例，糖类保护剂在等渗体系中的质量浓度为0.05-3％。
[0020] 进一步地，上述天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法，所述采用抽真空和通高纯惰性气体交替多次的方式脱氧具体是：真空
泵抽真空15-30分钟，通入高纯惰性气体15-30分钟，交替多次进行。
[0021] 更进一步地，所述通惰性气体是用1μm-10μm的
钛棒将高纯惰性气体通入含天然血红蛋白的等渗体系内。
[0022] 更进一步地，上述高纯惰性气体为高纯氮气或高纯氩气。
[0023] 优选步骤③将含天然血红蛋白的等渗体系采用抽真空和通高纯惰性气体交替3次以上脱氧。
[0024] 基于上述天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法，本发明还进一步提供了一种血红蛋白类血液代用品的制备工艺，该工艺包括：
[0025] A、天然血红蛋白纯化步骤：获取红细胞，加入已脱氧的蒸馏水破膜，再加入
氯化钠使溶液体系为等渗体系；加入小分子抗氧剂和糖类保护剂，调节溶液pH为5.0～8.0，等渗体系中小分子抗氧剂的终浓度为0.05％～0.5％，糖类保护剂的终浓度为0.05-3％，天然血红蛋白的终浓度为3-10％；将等渗体采用
真空泵抽真空15-30分钟、通入高纯惰性气体15-30分钟，交替多次进行脱氧，再将脱氧后的天然血红蛋白在60℃下加热10小时，1μm水系微孔滤
膜过滤后，用截留分子量为10KD的
超滤膜包超滤去除杂质和小分子，得到纯化的天然血红蛋白生理盐
水体系；
[0026] B、交联步骤：戊二醛与步骤A获得的纯化的天然血红蛋白进行交联，交联结束，加入
硼氢化钠终止反应，用1μm水系微孔滤膜过滤，并用截留分子量为100KD的超滤膜包超滤去除杂质和小分子；
[0027] C、修饰步骤：依次用植酸、双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯与步骤B得到的聚合血红蛋白反应，硼氢化钠终止反应后，降至4℃，用1μm水系微孔滤膜过滤，用截留分子量为100KD的超滤膜包超滤去除杂质和小分子；
[0028] D、终产品制备步骤：将步骤C得到的含修饰血红蛋白的血液代用品进行分装和保存。
[0029] 进一步地，上述血红蛋白类血液代用品的制备工艺，其步骤B在交联反应前，步骤C在修饰反应前，步骤D在分装前先按照前述脱氧步骤①②③进行脱氧。
[0030] 本发明提供了一种天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法，该方法通过抽真空和通气体交替多次的方式彻底脱氧，并在脱氧前添加适量小分子抗氧剂避免脱氧前后引入氧造成MetHb含量升高，相比于现有技术仅靠后续步骤通气体脱氧而言，本发明的方法脱氧更为彻底，可快速使氧分压(PO2)降低至≤1mmHg，氧饱和度(SO2)≤5％，高铁红蛋白(MetHb)含量≤1％，甚至低至0％；而且本发明的发明人在脱氧前加入适量的糖类保护剂充分保护天然血红蛋白结构在脱氧过程中不被破坏，以保证终产品的活性和疗效。本发明的发明人基于该脱氧方法进一步提供了血红蛋白类血液代用品的制备工艺，在整个工艺过程中对含血红蛋白的体系都进行严格的脱氧处理，为生产低毒副作用、更适用于临床的血红蛋白类血液代用品提供了可靠的方法，而且该方法操作简单常规，使用
试剂均安全环保，对于促进血红蛋白类血液代用品的研究发展具有重要的意义。
附图说明
[0031] 图1是实施例1纯化后天然血红蛋白变性图；
[0032] 图2是对比例1纯化后天然血红蛋白变性图；
[0033] 图3是对比例2纯化后天然血红蛋白变性图。
具体实施方式
[0034] 以下仅为本发明一些较佳的实施方式，不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，本发明的各个特征在不矛盾的情况下均可进行任意的组合，这些均属于本发明保护的范围。
[0035] 实施例1
[0036] 天然血红蛋白纯化步骤：4-20℃条件下，通过生理盐水洗涤人脐带血得到压积红细胞400ml，加入1000ml无菌、无热原且预先用孔径1μm的钛棒通高纯氮气除氧的蒸馏水开始破膜15分钟，再加入9g氯化钠使溶液体系为等渗体系；加入3％的VC调节溶液pH为6.0，且加入VC终浓度为0.5％，加入葡萄糖保护剂终浓度为3％，Hb最终浓度为5％。继续以抽真空15分钟与钛棒通高纯氮气15分钟相交替反复3次以上充分脱氧，分别在1小时、2小时、3小时取样测其PO2、SO2和MetHb。再将脱氧后的Hb 60℃加热10小时，冷却到4℃，然后1μm水系微孔滤膜过滤后，用截留分子量为10KD的超滤膜包超滤去除杂质和小分子后得到含纯化Hb的生理盐水体系。进一步检测纯化后天然血红蛋白得率和血红蛋白通过膜后变性程度(图1)，结果见表1。
[0037] 表1天然血红蛋白纯化步骤脱氧结果
[0038]
[0039] 由上表可见，本发明脱氧方法对天然血红蛋白进行纯化时，脱氧迅速，氧分压降低快，而且该方法对血红蛋白有很好的保护作用，血红蛋白变性产生的絮状物非常少。
[0040] 对比例
[0041] 天然血红蛋白纯化步骤：设计对比例1和对比例2，对比例1不抽真空，对比例2不加糖类保护剂，其他条件与实施例1完全相同。分别检测其PO2、SO2、MetHb、天然血红蛋白得率和血红蛋白通过膜后的变性程度。对比例1血红蛋白通过膜后的变性情况见图2，对比例2血红蛋白通过膜后的变性情况见图3。数据结果见表2。
[0042] 表2对比例天然血红蛋白纯化步骤脱氧结果
[0043]
[0044]
[0045] 根据以上实验可知，仅靠充入氮气和添加抗
氧化剂，在天然血红蛋白纯化阶段脱氧缓慢，氧分压PO2降低慢，不加糖类保护剂则会有大量天然血红蛋白在脱氧过程中因受物理因素破坏而变性，导致蛋白变性程度高，纯化产物得率低。
[0046] 实施例2
[0047] 交联步骤：4℃条件下，将实施例1得到的含纯化后Hb的生理盐水体系用VC调pH到7.5，加入VC终浓度为0.3％，加入蔗糖终浓度为3％，Hb最终浓度为5.5％。继续以抽真空15分钟、孔径1μm的钛棒通高纯氮气15分钟相交替的方式，反复3次以上充分脱氧，分别在1小时、2小时、3小时取样测其PO2、SO2和MetHb，结果见表3。再以3ml/min速度加入1％戊二醛于纯化Hb中，反应30分钟后，加入20倍摩尔比的硼氢化钠终止反应。最后通过1μm水系微孔滤膜过滤后，用截留分子量为100KD的超滤膜包超滤去除杂质和小分子后得到聚合Hb。
[0048] 表3天然血红蛋白交联步骤脱氧结果
[0049]
[0050] 实施例3
[0051] 修饰步骤：4℃条件下，将实施例2得到的聚合Hb加入到0.1M的Bis-tris溶液中，VC调pH到8.0，加入VC终浓度为0.3％，加入葡萄糖保护剂终浓度为3％，Hb最终浓度为6.4％，体积2000ml。继续以抽真空15分钟、孔径1μm钛棒通高纯氮气15分钟相交替的方式，反复3次以上充分脱氧，分别在1小时、2小时、3小时取样测其PO2、SO2和MetHb，结果见表4。再将溶液放于25℃水浴中，加入植酸(15mM)，反应1小时，加入血红蛋白6.0倍摩尔量的双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸酯(DBBF)，反应2小时，加入血红蛋白20倍摩尔量的硼氢化钠终止反应，
温度降至4℃。最后通过1μm水系微孔滤膜过滤后，用截留分子量为100KD的超滤膜包加入生理盐水40L超滤去除杂质和小分子后得到修饰Hb。
[0052] 表4天然血红蛋白修饰步骤脱氧结果
[0053]
[0054] 实施例4
[0055] 终产品制备步骤：将实施例3得到的修饰Hb，4℃条件下，VC调pH到8.0，加入VC终浓度为0.05％，加入葡萄糖保护剂终浓度为3％，HBOCs最终浓度为6％，体积600ml。继续以抽真空15分钟、孔径1μm钛棒通高纯氮气15分钟相交替的方式，反复3次以上充分脱氧，分别在1小时、2小时、3小时取样测其PO2、SO2和MetHb，结果见表5。再7000rpm离心1小时，0.22μm水系微孔滤膜过滤后即得脱氧的HBOCs，最后开始分装于10ml西林瓶中4℃保存。
[0056] 表5终产品制备步骤脱氧结果
[0057]
