proADM作为指示不良事件的标志物
阅读：908发布：2021-02-06
专利汇可以提供proADM作为指示不良事件的标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及受试者的不良事件，特别是死亡的诊断、 预后 、 风 险评估和/或风险分层。本发明涉及一种方法，该方法包括测定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proADM) 水 平，并且其中所述proADM水平指示所述受试者的所述不良事件，其中将所述proADM水平与proADM参考水平进行比较；并且其中基于该比较鉴定所述受试者的所述不良事件。本发明还涉及用于实施本发明方法的 试剂 盒 。，下面是proADM作为指示不良事件的标志物专利的具体信息内容。
1.用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的方法，其中所述方法包括
测定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proADM)水平，并且其中所述proADM水平指示所述受试者的所述不良事件，其中
将所述proADM水平与proADM的参考水平进行比较；和
其中基于所述比较鉴定所述受试者的所述不良事件
(a)其中proADM的参考水平为约0.7nmol/L至约2.0nmol/L，或
(b)其中
(i)对于症状相当于序贯器官衰竭评估(SOFA)评分≤6的受试者，proADM的参考水平为约1.8nmol/L；
(ii)对于症状相当于SOFA评分为7-12的受试者，proADM的参考水平为约3.2nmol/L；或(iii)对于症状相当于SOFA评分≥13的受试者，proADM的参考水平为约5.5nmol/L。
2.根据权利要求1(a)所述的方法，
其中与所述proADM的所述参考水平相比，所述受试者的所述proADM的水平降低或水平较低或水平相同表明未发生不良事件，优选在约28天内未发生；或
其中与proADM的参考水平相比，proADM水平的增加或proADM水平较高指示所述受试者的所述不良事件，其中优选地所述不良事件在约28天内发生。
3.根据权利要求1(a)或2中任一项所述的方法，其中proADM的参考水平为约0.8nmol/L至约1.9nmol/L。
4.根据权利要求1(a)、2或3中任一项所述的方法，其中所述不良事件是死亡。
5.根据权利要求4所述的方法，其中高于约0.9nmol/L、优选高于约1.9nmol/L、更优选高于约2.0nmol/L的proADM水平指示受试者在约28天内不存活。
6.根据权利要求1(a)或2中任一项所述的方法，其中低于约1.0nmol/L、优选低于约
0.9nmol/L、最优选低于约0.88nmol/L的proADM水平指示受试者在约28天内存活。
7.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中进一步确定所述受试者的序贯器官衰竭评估评分(SOFA评分)。
8.根据权利要求1(b)所述的方法，其中
与proADM的参考水平约1.8nmol/L相比，所述受试者的proADM水平的降低或相同水平和所述受试者的SOFA评分≤6表明所述不良事件未发生；
与proADM的参考水平约3.2nmol/L相比，所述受试者的proADM水平的降低或相同水平和所述受试者的SOFA评分7至12表明所述不良事件未发生；或者
与proADM的参考水平约5.6nmol/L相比，所述受试者的proADM水平的降低或相同水平和所述受试者的SOFA评分≥13表明所述不良事件未发生；和
其中优选地所述不良事件在约28天内未发生。
9.根据权利要求1(b)所述的方法，其中
所述受试者的proADM水平与约1.8nmol/L的proADM的参考水平相比的提高并且所述受试者的SOFA评分≤6表示所述受试者的所述不良事件；
所述受试者的proADM水平与约3.2nmol/L的proADM的参考水平相比的提高并且所述受试者的SOFA评分为7-12表示所述受试者的所述不良事件；或
所述受试者的proADM水平与约5.6nmol/L的proADM的参考水平相比的提高并且所述受试者的SOFA评分≥13表示所述受试者的所述不良事件，
其中优选地所述不良事件在约28天内发生。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中基于所述受试者的proADM水平增加所述受试者的SOFA评分，并且其中所述改变的SOFA评分指示所述不良事件。
11.根据权利要求10所述的方法，其中如果受试者具有高于约1.8nmol/L的proADM水平，则受试者的改变的SOFA评分增加1。
12.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述proADM的水平的增加为所述proADM的参考水平的约两倍高。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述proADM是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)或成熟ADM。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述proADM水平指示所述受试者在28天内发生的所述不良事件，优选地死亡。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定所述受试者的至少一种标志物和/或参数，所述标志物和/或参数选自至少一种组蛋白的水平、所述样品中降钙素原(PCT)的水平、简化急性生理学评分(SAPSII评分)、快速SOFA(qSOFA)评分、所述受试者的急性生理学和慢性健康评估II(APACHE II)评分、所述受试者的肺炎严重程度指数(PSI)评分和所述受试者的CURB-65评分。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在所述受试者入院约12小时期间确定所述标志物或参数的水平。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在所述受试者入院约12小时期间确定proADM的水平。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的所述proADM水平和SOFA评分。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或医学病症。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述受试者是重症患者，优选地其中所述受试者被送入重症监护室或急诊室，优选地所述受试者被送入重症监护室。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或医学病症，并且其中所述疾病或医学病症选自呼吸系统疾病、尿路感染、与感染性和非感染性病因相关的炎症反应、全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症、严重脓毒症、脓毒症性休克、器官衰竭、心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、肝病、肾病、免疫减弱、病毒感染、真菌感染、细菌感染、革兰氏阴性细菌感染、革兰氏阳性细菌感染和免疫抑制。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述受试者患有脓毒症。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫抑制的受试者，例如患有人免疫缺陷病毒(HIV)的受试者、接受放射疗法的受试者和/或接受免疫抑制药物的受试者。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述样品是体液、血液、血浆、血清或尿液。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中使用选自以下的方法确定所述proADM的水平：质谱(MS)、发光免疫测定(LIA)、放射免疫测定(RIA)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫测定(ELISA)、基于发光的珠阵列、基于磁珠的阵列、蛋白质微阵列测定、快速测试形式或稀有穴合物测定。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法是免疫测定，且其中在均相或多相中进行测定。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法是免疫测定，包括以下步骤：
a)将样品与以下接触
(i)对proADM的第一表位特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，和
(ii)对所述proADM的第二表位特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物；和b)检测所述第一和第二抗体或其抗原结合片段或衍生物与所述proADM的结合。
28.根据权利要求27所述的方法，其中第一或第二抗体之一被标记，而另一抗体与固相结合或能够选择性地结合固相。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中第一抗体和第二抗体分散在液体反应混合物中存在，并且其中作为基于荧光或化学发光消光或扩增的标记系统的一部分的第一标记组分与第一抗体结合，和所述标记系统的第二标记组分与第二抗体结合，使得在两种抗体与待检测的所述proADM结合后，产生了允许在测量溶液中检测所得夹心复合物的可测量信号。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述标记系统包含与荧光或化学发光染料，特别是花青类型组合的稀土穴合物或螯合物。
31.一种用于执行根据权利要求1至30中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于确定所述受试者的所述样品中所述proADM水平的检测试剂，和包括所述proADM参考水平的参考数据，并且其中与所述proADM参考水平相比，所述受试者的所述样品中proADM水平的增加指示所述受试者的不良事件。
32.一种用于执行根据权利要求1至30中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于测定所述受试者的所述样品中所述proADM水平的检测试剂，和包括所述proADM参考水平的参考数据，并且其中与所述proADM参考水平相比，所述受试者的所述样品中proADM水平的降低或类似的proADM水平表明所述受试者的不良事件在约28天内未发生。
33.根据权利要求31或32所述的试剂盒在权利要求1至27中任一项所述的方法中的用途。
34.根据权利要求31或32所述的试剂盒用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或危险分层的用途，
其中在所述受试者的所述样品中测定所述proADM水平，
其中将所述proADM水平与所述proADM参考水平进行比较，和
其中基于所述样品中测定的所述proADM水平与所述proADM参考水平的比较来鉴定所述受试者的所述不良事件。
35.试剂盒用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或危险分层的用途，其中所述试剂盒包含用于测定受试者样品中proADM水平的检测试剂，和
其中所述proADM水平指示所述受试者的所述不良事件。
36.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述比较在计算机系统中进行。
37.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中确定的proADM值用于计算指示受试者中不良事件的所述诊断、预后、风险评估和/或风险分层的评分。
38.根据权利要求37所述的方法，其中另外地，所述受试者的至少一种另外的标志物和/或参数用于计算所述评分。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者的至少一种另外的标志物和/或参数选自至少一种组蛋白的水平、所述样品中降钙素原(PCT)的水平、简化急性生理学评分(SAPSII评分)、快速SOFA(qSOFA)评分、所述受试者的急性生理学和慢性健康评估II(APACHEII)评分、所述受试者的肺炎严重程度指数(PSI)评分和所述受试者的CURB-65评分。
proADM作为指示不良事件的标志物
[0001] 本发明涉及受试者的不良事件，特别是死亡的诊断、预后、风险评估和/或风险分层。本发明涉及一种方法，该方法包括测定受试者的样品中的肾上腺髓质素原(proADM)的水平，并且其中proADM的水平指示所述受试者的不良事件；和/或测定受试者的样品中至少一种组蛋白，特别是组蛋白H2B、H4、H2A和/或H3的水平，并且其中至少一种组蛋白的水平指示所述受试者的不良事件。本发明还涉及用于实施本发明方法的试剂盒。
背景技术
[0002] 在医院的重症监护病房(ICU)通常是最危重患者和死亡率最高的病房(Kaneko-Wada Fde,Dominguez-Cherit等人2015)。它是任何医疗体系非常昂贵的组成部分，主要是由于在ICU长住、现代和昂贵的技术和重症监护的总体复杂性(Halpern和Pastores 2010)。尽管重症监护医学巨大的努力，在ICU的死亡率范围从6.4％到40％，这取决于所分析的患者群体及其严重性的状态(Mayr,Dunser等2006)。在ICU的不良后果和死亡的主要原因涉及衰竭器官，像多器官功能障碍综合征(MODS)和脓毒症(Vincent 2008；Ferreira和Sakr
2011)。对于脓毒症患者子组，死亡率在欧洲甚至更高，从27％至54％(Vincent 2008)。
2011)。对于脓毒症患者子组，死亡率在欧洲甚至更高，从27％至54％(Vincent 2008)。
[0003] 为了识别具有不良或致命事件/结果的高风险患者(i)、帮助临床医生在ICU入院后做出早期决定(ii)、优化临床治疗和资源(iii)和最终降低ICU死亡率(iv)，如短期和长期结果的决定参数的知晓具有高的价值(Mayr,Dunser等人2006)。到目前为止，严重程度评分主要用于危重患者的风险和严重程度评估以及结果预测。主要ICU评分系统是急性生理学和慢性健康评估(APACHE)评分、简化急性生理评分(SAPS)和序贯器官衰竭评估(SOFA)评分，它们分别基于17、14或6个生理学或器官特异性参数(Bouch和Thompson 2008)。尽管它们能够预测患者的结果，但这些评分也有各种缺点。例如，必须评估和评价评分的每个单个参数。因此，评分结果的确定是耗时的(≥1天)，这在高度重视快速测试的ICU护理中特别不利。此外，这些评分取决于每个评估临床医生的主观性，需要经常重新校准并依赖于单独确定的若干参数。
[0004] 因此，需要简单、快速和客观的标准用于受试者特别是重症患者中的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层。
[0005] 因此，本发明的技术问题是提供手段和方法以提供快速且可靠的方式来预测受试者的不良事件，特别是致命事件，例如死亡率/死亡。
[0007] 发明描述
[0008] 本发明涉及一种受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的样品中肾上腺髓质素原(proADM)的水平，并且其中所述proADM的水平指示所述受试者的所述不良事件。
[0009] 进一步，本发明涉及一种受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的样品中至少一种组蛋白或其片段的水平，并且其中所述至少一种组蛋白或其片段的水平指示所述受试者的所述不良事件。
[0010] 此外，本发明涉及一种受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的样品中至少一种组蛋白的水平以及肾上腺髓质素原(proADM)和/或其片段的水平，并且其中所述至少一种组蛋白以及proADM和/或所述其片段的所述水平指示所述受试者的所述不良事件。如本文所用，除非另有说明，否则“proADM”还包括片段诸如MR-proADM和成熟ADM。
[0011] 本发明解决了上述技术问题。如下文和所附实施例中所记载，在临床研究中出乎意料地发现，至少一种组蛋白，特别是组蛋白H2B、H4、H2A和H3的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平表明与受试者的不良事件例如死亡率的强统计学关系；参见说明性实施例1。因此，本文记载了所述至少一种组蛋白和/或所述proADM例如MR-proADM可用作预测不良事件的标志物。特别地，实施例记载了这些标志物可用于预测幸存者或非幸存者，即受试者的死亡率。
[0012] 在所附实施例中，令人惊讶地证明受试者的proADM(特别是MR-proADM)的水平小于或等于约参考水平，例如约0.9nmol/L，表明在大约28天内未发生不利。proADM的参考水平约0.9nmol/L在鉴定非存活者时提供了100％的灵敏度，即低于该阈值的水平可靠地鉴定将在28天期间存活的患者。在所附实施例中，proADM的参考水平约1.8nmol/L也可靠地预测不良事件，例如死亡率。因此，proADM的水平指示受试者是否存活，例如在约28天内。
[0013] 进一步证明，如果受试者根据疾病和/或病症的严重程度(例如器官衰竭)分层，则proADM(特别是MR-proADM)对于区分非幸存者或幸存者是可靠的。预测方法原则上可用于具有任何数量的器官衰竭的受试者，即对于任何SOFA评分。检测proADM(特别是MR-proADM)水平可以识别所有严重性组中的非幸存者，即对于任何SOFA评分。这对于病情较轻的患者(SOFA评分<6)尤其重要，因为该组代表脓毒症在临床过程中最早出现和/或在临床(特别是ICU或ED)环境中该疾病的不太严重的形式。因此，proADM(特别是MR-proADM)是早期脓毒症管理的可靠标记，因为它提供了快速的预后价值并有助于指导诊断干预和治疗决策。
[0014] 在所附实施例中显示，受试者可分类为重症较轻的受试者(例如SOFA评分≤6)、中度重症受试者(例如SOFA评分为7至12)或重症受试者(例如SOFA评分≥13)。因此，可以基于SOFA评分对受试者进行分类。proADM(特别是MR-proADM)的预测值可以通过将其与受试者的SOFA评分的确定相结合来改善。然而，该标记的预测值使得不需要确定SOFA分数；换句话说，在本发明方法的一些方面，确定受试者的proADM(优选MR-proADM)水平，但不确定SOFA评分。在所附实施例中，显示proADM(特别是MR-proADM)的水平在疾病严重程度低的受试者(不太严重的受试者)的情况下显示出测试标志物中的最佳表现。这些受试者的SOFA评分可能≤6。特别是，已证实较轻重症患者的proADM(特别是MR-proADM)水平低于约1.8nmol/L的参考水平，表明在约28内不会发生不良事件，特别是死亡率；见实施例2表9。此外，在中度严重患病受试者的情况下，与其他标志物(例如乳酸盐)相比，proADM在预测不良事件方面也是有利的。这些受试者的SOFA评分可能为7至12。特别是，已证实中度重度疾病患者的proADM水平低于约3.2nmol/L的参考水平表明在约28天内不会发生不良事件，特别是死亡率；见实施例2表9。最后，proADM的水平还可靠地预测严重疾病受试者的不良事件。特别是，证明了严重疾病患者的proADM水平低于5.6nmol/L的参考水平表明在28天内未发生不良事件，特别是死亡率；见实施例2表9。
[0015] 因此，proADM(特别是MR-proADM)的水平预测受试者的风险，从而帮助临床医生决定哪种治疗最合适。因此，proADM的水平改善了临床患者的治疗。因此，proADM的水平也可用于重症监护室管理，特别是用于识别不需要进一步重症监护的受试者，例如ICU或急诊科(ED)的治疗。特别地，低于约0.9nmol/L(优选0.88nmol/L)的proADM参考值允许在入住ICU或ED后28天内“排除”死亡率。因此，当明显器官衰竭的临床症状尚不明显时，这种临界值可用于指导早期临床决策。因此，本发明的方法可用于此目的。识别不需要(进一步)重症监护(例如在ICU或ED中)但可以例如转移到普通病房的受试者可以降低成本承担者的成本并释放ICU或ED中的病床。
[0016] 在一个具体方面，本发明的方法用于预测尚未表现出器官衰竭的临床症状的受试者的死亡率或分层受试者(例如，患者对应于具有低SOFA评分的受试者，例如≤6，优选≤4，更优选≤3)。
[0017] 另外，在所附实施例中显示，proADM(特别是MR-proADM)的水平也可用于改变所述受试者的SOFA评分。例如，可以基于所述受试者的proADM水平调整(例如增加)SOFA，并且其中所述改变的SOFA评分指示所述不良事件。
[0018] 特别地，如果受试者具有高于约1.8nmol/L的proADM水平，则受试者的SOFA评分可以增加1。这种改变的SOFA评分进一步改善了预测；参见例如实施例2。
[0019] 作为SOFA评分的替代或补充，也可以确定快速SOFA(qSOFA)评分。
[0020] 在所附实施例中，还令人惊讶地证明，至少一种组蛋白，特别是H2B、H4、H2A和H3的水平与受试者的不良事件(例如死亡率)强烈相关。特别地，所附实施例证明组蛋白的水平在统计学上与发生在约28天内、约7天内或约3天内的不良事件例如死亡率相关。所附实施例揭示了标志物水平的增加表明在受试者中发生不良事件，例如死亡；参见所附实施例1，例如表1至6。此外，组蛋白的水平证明与短的不良事件特别相关，例如在7天或3天内发生的。此外，发现患有呼吸系统疾病的受试者样品中至少一种组蛋白的水平与7天内发生的不良事件(例如死亡)相关；参见例如表4。此外，发现患有尿路感染的受试者样品中至少一种组蛋白的水平与28天内发生的不良事件(例如死亡)相关；见表5。此外，发现患有恶性肿瘤的受试者样品中至少一种组蛋白的水平与28天内发生的不良事件(例如死亡)相关；见表6。
[0021] 此外，还在所附实施例中令人惊讶地证明，proADM的水平，例如片段MR-proADM的水平，与受试者的不良事件(例如死亡率)强烈相关。特别地，所附实施例证明proADM的水平在统计学上与不良事件例如发生在约28天内、约7天内或约3天内死亡相关；参见例如表2和3。特别地，所附实施例证明proADM的水平指示在28天内发生或在7天内发生的不良事件，例如死亡；参见例如表2和3。
[0022] 另外，在所附实施例中记载，如果确定标志物水平的组合，则进一步改善预测。特别地，除了proADM水平之外，确定至少一种组蛋白的水平进一步改善了不良事件例如死亡率的预后；见表1至表3。在所附实施例中记载，除了至少一种组蛋白或proADM的水平之外，确定另外的标志物和/或参数的水平进一步改善了不良事件例如死亡率的预测；见说明表1至3。例如，在所附实施例中证明，确定临床评分还改善了基于proADM或组蛋白水平的预测。此外，确定生物标志物(例如醛缩酶B)的水平可改善基于proADM或组蛋白水平的预测。因此，本发明还涉及一种方法，包括确定另外的标志物和/或参数的水平，即标志物组的使用。
[0023] 本发明具有优于常规方法的以下优点：本发明方法和试剂盒快速、客观、易于使用且精确用于预测不良事件：本发明的方法和试剂盒涉及标志物，因为组蛋白和proADM的水平可以在常规获得的血液样品或从受试者获得的其他生物液体中确定，因此在医院常规中可以容易地测量标志物。此外，确定组蛋白或proADM的水平非常快。因此，本发明的方法和试剂盒适用于不良事件例如死亡率的快速评估、诊断和预后。因此，快速确定也适用于避免或降低不良事件发生风险的快速治疗决策。此外，由于生物标志物测量的简单结果作为一个特定值，当使用该方法或本发明的试剂盒时，医务人员没有主观偏见。因此，与例如在SOFA评分中使用的生理参数的主观评分相比，再现性改善。组蛋白或proADM的水平还可以与其他标志物和/或参数(例如临床评分，例如SOFA评分)组合，以进一步改善预测并使分析适应特定的灵敏度和特异性，以便评估重症患者的总体状况。
[0024] 因此，本文提供的方法和试剂盒在受试者的发生的不良事件(例如死亡率/死亡)的诊断、预后、风险评估和/或风险分层方面是有利的。
[0025] 如上文和所附实施例中所记载的，令人惊讶地发现组蛋白水平和proADM水平与受试者中的不良事件(例如死亡率)相关。因此，本发明涉及用于受试者的不良事件(特别是死亡)的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的方法和试剂盒。
[0026] 此外，本发明涉及用于受试者的监测、治疗指导和/或治疗控制的方法和试剂盒，其中至少一种组蛋白和/或proADM的水平指示不良事件，特别是死亡率。本文上下文中提供的定义也适用于这些方面。
[0027] 特别地，本发明涉及用于受试者的不良事件(特别是死亡)的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的方法，其中所述方法包括：
[0028] (i)测定所述受试者样品中至少一种组蛋白的水平，并且其中所述至少一种组蛋白的水平指示所述受试者的所述不良事件，特别是死亡率；和/或
[0029] (ii)测定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proADM)水平，并且其中所述proADM水平指示所述受试者的所述不良事件，特别是死亡率。
[0030] 如本文所用，术语“确定至少一种组蛋白的水平”等是指确定受试者样品中组蛋白或其片段的水平或确定受试者样品中多于一种组蛋白或其片段的水平。特别地，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中组蛋白的水平，其中优选地组蛋白选自组蛋白H2B、H4、H2A和H3。特别地，确定组蛋白H2B的水平。此外，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中组蛋白的水平，其中特别地确定组蛋白H4的水平。此外，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中两种组蛋白的水平，其中优选地确定组蛋白H2B和H4的水平。此外，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中三种组蛋白的水平，其中优选地确定组蛋白H2B、H4和H2A的水平。此外，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定受试者样品中四种组蛋白的水平，其中优选地确定组蛋白H2B、H4、H2A和H3的水平。
[0031] 因此，在本发明的上下文中，“确定至少一种组蛋白的水平”可以指确定组蛋白H2B的水平、组蛋白H4的水平、组蛋白H2A的水平和/或组蛋白H3的水平。
[0032] 特别地，术语“确定至少一种组蛋白的水平”等可以指确定受试者样品中组蛋白的水平。因此，本发明还涉及一种受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估、风险分层和/或监测的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的样品中组蛋白或其片段的水平，并且其中所述组蛋白或所述其片段的水平指示所述不良事件例如死亡率。
[0033] 如本文所用，“组蛋白”或“组蛋白蛋白质”或“组蛋白(一种或多种)”或“组蛋白(一种或多种)”是指经典组蛋白，例如H1、H2A、H2B、H3或H4，以及组蛋白变体，例如H3.3、H2A.Z等或其片段。组蛋白形成八聚体颗粒，DNA围绕其包裹，以组装染色质结构(Luger,Nature.1997 Sep 18；389(6648)：251-60)。例如，组蛋白蛋白质H2A、H2B、H3和H4(每个中的两者)形成八聚体，其被165个碱基对的DNA包裹以形成染色质的基本亚基，即核小体。还在多个病理生理过程中在细胞核外检测到组蛋白(WO2009/061918)。已经描述了在患有涉及炎症过程的不同病因的患者的血液中细胞外组蛋白的存在。活化的免疫细胞释放的组蛋白可以通过细胞外陷阱介导。活化的中性粒细胞作为控制和清除感染的最终机制，可释放细胞外纤维，即所谓的中性粒细胞胞外陷阱(NETs)(Brinkmann V.等人Science 2004；303(5663)：p.1532-5)。组蛋白可以释放到患者血流中的其他机制包括细胞的凋亡、坏死、细胞焦亡或坏死性凋亡。
[0034] 特别地，至少一种组蛋白选自H2B、H4、H2A和H3。因此，在本发明的方法和试剂盒中测定的组蛋白水平具体地是组蛋白H2B、H4、H2A和/或H3的水平。组蛋白的序列是技术人员已知的。组蛋白的示例性序列在SEQ ID NO：1至4中给出。组蛋白H4的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO：1中给出。组蛋白H2A的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO：2中给出。组蛋白H3的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO：3中给出。组蛋白H2B的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO：4中给出。特别地，至少一种组蛋白选自H2B、H4、H2A和H3。更特别地，至少一种组蛋白选自H2B、H4和H2A。更特别地，至少一种组蛋白是H2B和H4。更特别地，至少一种组蛋白是H2B或H4。
[0035] 应理解，“确定至少一种组蛋白的水平”等是指确定样品中至少一种组蛋白或至少一种组蛋白的片段的水平。特别地，在样品中测定组蛋白H2B、H4、H2A和/或H4的水平。因此，在样品中测定的至少一种组蛋白可以是游离组蛋白，或者样品中确定的至少一种组蛋白可以发生并且可以组装在大分子复合物中，例如在八聚体、核小体和/或NET中。因此，样品中至少一种组蛋白的水平可包括在大分子复合物中组装的游离组蛋白蛋白质和/或组蛋白蛋白质的水平。
[0036] 在本发明的特定方面，组蛋白或其片段的水平可以在未组装在大分子复合物中的样品中测定，复合物例如核小体、八聚体或嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)。这种组蛋白在本文中称为“游离组蛋白”。因此，至少一种组蛋白的水平可以具体是至少一种游离组蛋白的水平。
[0037] 这种游离组蛋白的水平可以通过检测不可在组装的化学计量大分子复合物(如单核小体或八聚体)中接近的组蛋白的氨基酸序列或结构表位来确定。在这样的结构中，组蛋白的特定区域被覆盖，因此如中性粒细胞胞外陷阱(“NETs”)所示在空间上不可接近(Brinkmann V.等人Science 303(5663)：p.1532-5,2004)。此外，在八聚体或核小体中，组蛋白的区域也参与分子内相互作用，例如在各个组蛋白之间。因此，在本发明的上下文中确定的组蛋白的区域/肽/表位可以确定组蛋白是游离组蛋白还是组装在大分子复合物中的组蛋白。例如，在基于免疫测定的方法中，当它们是核小体的八聚体核心的一部分时，所利用的抗体可能不检测组蛋白，例如H4，因为表位在结构上是不可接近的。在下文中，举例说明了组蛋白的区域/肽/表位，其可用于确定游离组蛋白。例如，组蛋白的N-末端或C-末端尾部的区域/肽/表位可用于确定组蛋白，而不管它们是否在大分子复合物中组装或是根据本发明的游离组蛋白。
[0039] 在该上下文中，“化学计量”涉及完整的复合物，例如单核小体或八聚体。“游离组蛋白”也可以包含非染色质结合的组蛋白。例如，“游离组蛋白”也可包含单个组蛋白蛋白质或非八聚体组蛋白复合物。游离组蛋白可以(例如瞬时)与个体组蛋白结合，例如，组蛋白可以形成同源或异源二聚体。游离组蛋白也可以形成同四聚体或异四聚体。同或异四聚体可以由四个组蛋白分子组成，例如H2A、H2B、H3和/或H4。典型的异四聚体由两个异二聚体形成，其中每个异二聚体由H3和H4组成。本文中还应理解，异四聚体可由H2A和H2B形成。本文还设想异四聚体可以由一种由H3和H4组成的异二聚体和一种由H2A和H2B组成的异二聚体形成。因此，游离组蛋白在本文中称为并且可以是单体、异二聚体或四聚体组蛋白蛋白质，其不组装在(“化学计量的”)大分子复合物中，所述大分子复合物由与核酸结合的组蛋白八聚体组成，例如核小体。此外，游离组蛋白也可以与核酸结合，并且其中所述游离组蛋白不在(“化学计量”的)大分子复合物中组装，例如完整的核小体。优选地，游离组蛋白基本上不含核酸。
[0040] 至少一种组蛋白的片段可具有任何长度，例如至少约5、10、20、30、40、50或100个氨基酸，只要该片段允许明确确定特定组蛋白的水平即可。至少一种组蛋白的片段是指组蛋白的独立片段，例如组蛋白H2B、H4、H2A和H3。下文公开了组蛋白的各种示例性片段，其适于测定受试者样品中组蛋白的水平。在本文中还应理解，组蛋白的水平可通过确定跨越组蛋白的N-末端或C-末端尾部的片段来确定。另外，还可以修饰在本发明的上下文中确定的组蛋白或其片段，例如通过翻译后修饰。示例性的翻译后修饰可以是乙酰化、瓜氨酸化、脱乙酰化、甲基化、去甲基化，去亚胺化，异构化、磷酸化和泛素化。
[0041] 如本文所用，术语“肾上腺髓质素原”或“proADM”是指肾上腺髓质素原或其片段，特别是MR-proADM。应理解，“确定proADM”等是指确定proADM或其片段。片段可具有任何长度，例如至少约5、10、20、30、40、50或100个氨基酸，只要该片段允许明确确定proADM的水平即可。在本发明的特别优选的方面，“确定proADM的水平”是指确定中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的水平。MR-proADM是proADM的片段。发现肽肾上腺髓质素(ADM)是包含52个氨基酸的降血压肽，其已经从人类染色体细胞中分离出来(Kitamura等人，1993)。肾上腺髓质素(ADM)被编码为包含185个氨基酸的前体肽(“肾上腺髓质素原前体(preproadrenomedullin)”或“pre-proADM”)。ADM的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO：5中给出。ADM构成pre-proADM氨基酸序列的95-146位，并且是其剪接产物。“肾上腺髓质素原”(“proADM”)是指没有信号序列(氨基酸1至21)的pre-proADM，即pre-proADM的氨基酸残基
22至285。“中区肾上腺髓质素原”(“MR-proADM”)是指pre-proADM的氨基酸42-95。MR-proADM的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO：6中给出。本文还设想pre-proADM或MR-proADM的肽及其片段可用于本文所述的方法。例如，肽或其片段可包含pre-proADM的氨基酸22-41(PAMP肽)或pre-proADM的氨基酸95-146(成熟的肾上腺髓质素)。proADM的C末端片段(preproADM的氨基酸153-185)称为肾上腺素。proADM肽的片段或MR-proADM的片段可包含例如至少约5、10、20、30或更多个氨基酸。因此，proADM的片段可以例如选自MR-proADM、PAMP、肾上腺素和成熟肾上腺髓质素，优选地，本文中该片段是MR-proADM。
22至285。“中区肾上腺髓质素原”(“MR-proADM”)是指pre-proADM的氨基酸42-95。MR-proADM的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO：6中给出。本文还设想pre-proADM或MR-proADM的肽及其片段可用于本文所述的方法。例如，肽或其片段可包含pre-proADM的氨基酸22-41(PAMP肽)或pre-proADM的氨基酸95-146(成熟的肾上腺髓质素)。proADM的C末端片段(preproADM的氨基酸153-185)称为肾上腺素。proADM肽的片段或MR-proADM的片段可包含例如至少约5、10、20、30或更多个氨基酸。因此，proADM的片段可以例如选自MR-proADM、PAMP、肾上腺素和成熟肾上腺髓质素，优选地，本文中该片段是MR-proADM。
[0042] 本文还设想可以确定多肽，其与proADM或至少一种组蛋白具有序列同一性。例如，可以在本发明的方法和试剂盒中测定多肽，其与SEQ ID NO：5或6，或分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，其中较高的序列同一性值是优选的。
根据本发明，在两个或更多个氨基酸序列的上下文中，术语“序列同一性”、“同源性”或“同源性百分比”或“同一”或“同一性百分比”或“百分比同一性”是指，当使用本领域已知的序列比较算法，或通过手动比对和目视检查，比较并对齐以在比较窗口(优选在整个长度上)或在测量的指定区域上进行最大对应时，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者具有指定百分比的相同氨基酸。具有例如70％至90％或更高(优选95％或更高)序列同一性的序列可以被认为是基本相同的。这样的定义也适用于测试序列的互补序列。优选地，所描述的同一性存在于长度为至少约10至约15个氨基酸的区域上，更优选地，长度至少约20至约35个氨基酸的区域上，最优选地在整个长度上。本领域技术人员将知道如何使用例如算法确定序列之间/之中的百分比同一性，所述算法例如基于CLUSTALW计算机程序的算法(Thompson Nucl.Acids Res.2(1994),4673-4680)或FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)，如本领域所知。
根据本发明，在两个或更多个氨基酸序列的上下文中，术语“序列同一性”、“同源性”或“同源性百分比”或“同一”或“同一性百分比”或“百分比同一性”是指，当使用本领域已知的序列比较算法，或通过手动比对和目视检查，比较并对齐以在比较窗口(优选在整个长度上)或在测量的指定区域上进行最大对应时，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者具有指定百分比的相同氨基酸。具有例如70％至90％或更高(优选95％或更高)序列同一性的序列可以被认为是基本相同的。这样的定义也适用于测试序列的互补序列。优选地，所描述的同一性存在于长度为至少约10至约15个氨基酸的区域上，更优选地，长度至少约20至约35个氨基酸的区域上，最优选地在整个长度上。本领域技术人员将知道如何使用例如算法确定序列之间/之中的百分比同一性，所述算法例如基于CLUSTALW计算机程序的算法(Thompson Nucl.Acids Res.2(1994),4673-4680)或FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)，如本领域所知。
[0043] 如本文所用，标志物的“水平”是指样品中标志物的分子实体的量。换句话说，在样品中测定标志物的浓度。例如，proADM或其片段，优选地MR-proADM的浓度和/或组蛋白H2B、H4、H3和/或H2A或其片段的浓度在受试者样品中测定。
[0044] 如本文所用，术语“至少一种组蛋白的水平”是指从受试者获得的样品中至少组蛋白的分子实体的量，例如H2B、H4、H2A和/或H3或其片段的量。换句话说，在样品中测定至少一种组蛋白蛋白质或其片段的浓度。
[0045] 如本文所用，术语“标志物肾上腺髓质素原(proADM)的水平”或“标志物肾上腺髓质素原(proADM)或其片段的水平”是指在从受试者获得的样品中标志物肾上腺髓质素原或其片段的分子实体的量。换句话说，在样品中测定标志物的浓度。因此，术语“标志物中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)的水平”是指从受试者获得的样品中标志物中区肾上腺髓质素(MR-proADM)的分子实体的量。如上所述，本文还设想可以检测和定量肾上腺髓质素原(proADM)的片段，优选地MR-proADM。此外，可以检测和量化MR-proADM的片段。确定proADM或其片段(优选地MR-proADM)的水平或确定至少一种组蛋白或其片段的水平的合适方法在下文中描述。
[0046] 如本文所用，“不良事件”是指危及生命或将要危及生命的受试者的健康状况/状态。因此，不良事件是指与同一受试者的早期健康状况相比，受试者的健康状况/状态的严重恶化，例如，在恶化前例如约28天、14天、7天、3天、1天、12小时、5小时、1小时或更短时间被诊断和确认；或者与患有类似疾病或医学病症的受试者的健康状况相比较，即疾病或疾病的进展在测试的受试者中危及生命或者变得危及生命。与健康受试者的健康状况相比，不良事件还可以指受试者的健康状况/状态的严重恶化。在此应理解，健康状况/状态的严重恶化，受试者的危及生命的状况/状态或危及生命的进展可意味着受试者有死亡的风险，即受试者的致命结果是可能的。严重恶化、严重健康状况/状态或危及生命的健康状况/状态也可以通过临床评分(例如SOFA评分)来评估/诊断。例如，SOFA排放高于14表示非常严重的健康状态，表明受试者的严重健康状况。SOFA评分在0到6之间表示健康状况不太严重，SOFA评分为7到14表示健康状况严重。例如，受试者的健康状况可能由于器官功能障碍、多器官功能障碍、疾病或医学病症(例如感染)而严重恶化。因此，术语“不良事件”可以指器官功能障碍、多器官功能障碍、疾病或医学病症，例如感染，其危及生命或将危及生命。例如，器官功能障碍或多器官功能障碍可导致这种严重恶化，因此术语“不良事件”也可指器官功能障碍或多器官功能障碍，特别是器官衰竭或多器官衰竭。例如，疾病或医学病症可导致这种严重恶化，因此术语“不良事件”也可指疾病或医学病症，其中所述疾病或医学疾病可能意味着危及生命的疾病或医学疾病。受试者还可能患有疾病和/或医学病症，并且在这种情况下的不良事件是疾病或医学病症的进展变为危及生命的状况，即不良事件也可能指危及生命的疾病或病症的进展。疾病或病症可选自呼吸系统疾病、尿路感染、与感染性和非感染性病因相关的炎症反应、全身性炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症、严重脓毒症、败血性休克、器官衰竭、心血管疾病、血液病、播散性凝血、糖尿病、恶性肿瘤、肝病、肾病和/或免疫减弱(immunodepression)、病毒感染、真菌感染、细菌感染、革兰氏阴性细菌感染、革兰氏阳性细菌感染、腹部感染和免疫抑制(immunosuppresion)。疾病也可以是感染。在特定方面，受试者患有病毒感染、真菌感染、细菌感染、革兰氏阴性细菌感染和/或革兰氏阳性细菌感染。呼吸道疾病还可以指呼吸道感染(例如社区获得性肺炎(CAP)或下呼吸道感染(LRTI))。在一个非常特别的方面，受试者患有真菌感染。
[0047] 如本文所用，术语“免疫抑制的受试者”是指与至少一个健康受试者相比具有受抑制的免疫系统的受试者。这种免疫抑制可能患有人免疫缺陷病毒(HIV)，或者可能是接受放射疗法和/或接受免疫抑制药物的受试者。
[0048] 本文优选地，受试者患有严重脓毒症或脓毒症性休克，其优选基于美国胸科医师学会/重症监护医学共识会议的SEPSIS-2定义。
[0049] 在本发明的特定方面，不良事件是死亡率。换句话说，不良事件是在本发明的特定方面中受试者的死亡。因此，术语“不良事件”特别是指“死亡率”或“死亡”。如本文所用，“死亡率”意指受试者死亡，即致命结果。因此，本发明的方法和试剂盒确定/预测受试者是否会死亡和/或受试者是否有死亡风险。
[0050] 如本文所用，通用术语“器官功能障碍”还可以表示不止一个器官具有功能障碍，即除非另有说明，否则它也可以涉及器官功能障碍。术语“器官功能障碍”或“器官功能障碍(一种或多种)”涉及受试者中的病症，其中器官或一个以上器官与未受影响的器官(例如至少一个健康受试者的器官)相比不能发挥其正常功能。例如，与至少一个健康受试者的器官相比，器官可具有降低的活性或器官可能在具有器官功能障碍的受试者中异常活跃。优选地，具有器官功能障碍的器官与未受影响的器官(例如至少一个健康受试者的)相比，可具有至少约10％、20％、30％、50％、70％、90％、100％或200％的活性减少或增加。特别是，器官功能障碍可导致器官衰竭。因此，“器官功能障碍”优选地也可以指器官衰竭。“器官衰竭”是指一种器官功能障碍，其程度使得例如在没有外部临床干预的情况下不能维持正常的稳态。“器官衰竭”也可以指一种器官功能障碍，其程度使得例如在没有外部临床干预的情况下不能维持器官的正常的稳态。“器官衰竭”也可以指一种器官功能障碍，其程度使得例如在没有外部临床干预的情况下不能维持受试者的正常的稳态。在本发明的特定方面，器官功能障碍是器官衰竭或至少一种器官衰竭。一般术语“器官衰竭”还可以表示不止一个器官发生衰竭，即除非另有说明，否则它也可能与器官衰竭有关。在此应理解，器官功能障碍也可称为多器官功能障碍。在此应理解，器官衰竭也可称为多器官衰竭。示例性器官功能障碍或器官衰竭是循环休克、血液衰竭、肝衰竭、神经功能衰竭、肾衰竭、呼吸衰竭和代谢性酸中毒。因此，在本发明的上下文中，器官功能障碍或至少一种功能障碍可以优选地选自循环休克、血液衰竭、肝衰竭、神经功能衰竭、肾衰竭、呼吸衰竭和代谢性酸中毒。在本文中应理解，受试者还可具有一种以上器官功能障碍或衰竭，其是例如选自循环休克、血液衰竭、肝衰竭、神经功能衰竭、肾衰竭、呼吸衰竭和代谢性酸中毒的两种、三种、四种器官功能障碍的组合。
[0051] 在本发明的特定方面，至少一种组蛋白的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平，表示在约28天内发生的所述不良事件。如本文所用，术语“在……内发生的不良事件”是指受试者将在该特定时间段内可能、将要或正在经历/患有/遭受不良事件。
[0052] 如本文所用，术语“不发生不良事件”意指事件不发生，例如在约28天内不发生。例如，在该时间范围内不发生受试者的死亡。因此，这表明受试者存活，例如在约28天内存活。
[0053] 至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平，特别是MR-proADM的水平也表示在约28天、约25天、约20天、约15天、约14天内、约13天、约12天、约11天、约10天、约9天、约8天、约
7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天或约1天内发生的所述不良事件。至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在14天内发生的所述不良事件。特别地，至少一种组蛋白的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在7天内发生的所述不良事件。特别地，至少一种组蛋白的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在3天内发生的所述不良事件。
7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天或约1天内发生的所述不良事件。至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在14天内发生的所述不良事件。特别地，至少一种组蛋白的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在7天内发生的所述不良事件。特别地，至少一种组蛋白的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在3天内发生的所述不良事件。
[0054] 在本发明特别优选的方面，至少一种组蛋白的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平，表示在约28天内发生的受试者的死亡率。至少一种组蛋白的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在约28天、约25天、约20天、约15天、约14天、约13天、约12天、约11天、约10天、约9天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天或约1天内发生的死亡率。至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在14天内发生的死亡率。特别地，至少一种组蛋白的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在7天内发生的死亡率。特别地，至少一种组蛋白的水平和/或proADM，特别是MR-proADM的水平，也可以指示在3天内发生的死亡率。
[0055] 在本发明的优选方面，所述受试者的所述MR-proADM水平指示所述受试者在约28天内发生或在约7天内发生的不良事件，特别是死亡。
[0056] 在本发明的具体方面，至少一种组蛋白的水平指示在约7天内或优选在约3天内发生的不良事件，特别是死亡。特别地，H2B的水平表示甚至在约7天内或优选在约3天内发生的不利。
[0057] 在本发明的具体方面，至少一种组蛋白的水平指示在约7天内或优选在约3天内发生的不良事件，特别是死亡。特别地，H4的水平表示甚至在约7天内或优选在约3天内发生的不利。
[0058] 在本发明的具体方面，至少一种组蛋白的水平和proADM水平指示所述受试者在28天内发生的不良事件，特别是死亡率。
[0059] 术语“指示所述不良事件”意指受试者已经或将可能经历/患有/遭受所述不良事件，例如死亡。因此，受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proADM水平表示受试者的不良事件，例如死亡率。
[0060] 本发明的方法还涉及一种方法，其中在受试者的样品中测定至少一种组蛋白的水平，其中将所述至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平进行比较，并且其中所述至少一种组蛋白的水平指示所述不良事件。
[0061] 优选地，本发明还涉及一种方法，其中在受试者的样品中测定肾上腺髓质素原(proADM)，特别是MR-proADM的水平，其中将所述proADM，特别是MR-proADM的水平与proADM的参考水平进行比较，并且其中所述proADM，特别是MR-proADM的水平表明所述不良事件。
[0062] 该方法还涉及一种方法，其中确定至少一种组蛋白的水平，并且其中在受试者的样品中测定肾上腺髓质素原(proADM)，特别是MR-proADM的水平，其中将所述至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平进行比较，并且其中将所述proADM水平与proADM的参考水平进行比较，并且其中基于比较步骤鉴定所述受试者中的所述不良事件。
[0063] 如本文所用，术语“与至少一种组蛋白的参考水平进行比较”或其语法变体意指将受试者的至少一种组蛋白的水平与所述至少一种组蛋白的参考水平进行比较。因此，将受试者的组蛋白水平与相同组蛋白的相应参考水平进行比较。例如，将受试者样品中测定的组蛋白H2B的水平与组蛋白H2B的参考水平进行比较。加以修正，这适用于其他组蛋白。至少一种组蛋白的参考水平具体是组蛋白H2B的水平、组蛋白H4的水平、组蛋白H2A的水平和/或组蛋白H3的水平。
[0064] 如本文所用，术语“与proADM的参考水平进行比较”或其语法变体意指将受试者的proADM水平与proADM的参考水平进行比较。如果确定至少一种组蛋白和/或proADM的片段的水平，则参考水平也可以是相应片段的水平。
[0065] 如本文所用，“参考水平”可以反映相应标志物的正常水平，在本发明优选方面中其指示没有不良事件。因此，这样的参考水平反映了相应标志物的正常水平，其不表示危及生命的病症或特别是受试者的死亡/死亡率。因此，参考水平可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proADM水平，并且其中所述参考受试者在约28天内、优选在约14天内、更优选约7天内或特别优选约3天内没有不良事件。
[0066] 参考水平可以代表一组健康受试者(例如群组)的至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平。因此，参考水平优选是健康受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proADM、特别是MR-proADM的水平。健康受试者是没有诊断(和确认)疾病和/或病症的受试者。健康受试者可以优选地具有正常功能的器官，即没有器官功能障碍或没有器官衰竭，和/或没有诊断的疾病或医学病症，例如如上所述的那些。因此，参考水平可以是在健康受试者的样品中确定的至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平。参考受试者或健康受试者在本文中优选定义为一组受试者或一组健康受试者，例如一群组受试者。健康参考受试者没有器官功能障碍或器官衰竭。因此，参考水平可以是没有器官功能障碍或没有器官衰竭的受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平。因此，参考水平可以是指示没有器官功能障碍或没有器官衰竭的水平。
[0067] 在优选的实施方案中，proADM(本文优选MR-proADM)的参考水平为约0.7nmol/L至约2.0nmol/L。在更优选的实施方案中，proADM的参考水平为约0.8nmol/L至约1.9nmol/L。在更优选的实施方案中，proADM的参考水平为约0.9nmol/L至约1.8nmol/L。在更优选的实施方案中，proADM的参考水平为约0.88nmol/L至约1.79nmol/L。在更优选的实施方案中，proADM的参考水平为约0.9nmol/L或约1.8nmol/L。在最优选的实施方案中，proADM的参考水平为约0.88nmol/L或约1.79nmol/L。应用的参考水平取决于用于预测的所需特异性和灵敏度，即较低的阈值，例如约0.9nmol/L(优选0.88nmol/L)proADM(优选MR-proADM)将可靠地鉴定未经历不良事件的受试者(特别是死亡率，即特别鉴定在28天时间内的幸存者)。
[0068] 在特定实施方案中，受试者的proADM水平(i)小于或等于proADM的参考水平(例如约0.9nmol/L至1.8nmol/L)表明不良事件特别是死亡率不会在28天内发生；或(ii)高于proADM的参考水平(例如约0.9nmol/L至1.8nmol/L)表明不良事件特别是死亡发生或将在28天内发生。
[0069] 所提供方法的灵敏度和特异性不仅取决于测试的分析质量。灵敏性和特异性还取决于构成异常(例如死亡)或正常结果的定义。对于具有和不具有不良事件的受试者，至少一种组蛋白和/或proADM的水平，优选MR-proADM的水平的分布可以重叠。在这样的条件下，测试并不准确度为100％地完全区分正常和功能障碍状态。技术人员知道这样的事实：受试者的病症本身或受试者的至少一个另外的标志物和/或参数可以帮助解释数据，并且该进一步的信息允许在重叠区域中更可靠的预后。病情本身可以指受试者的一般健康状况。受试者的一般健康状况可以影响决定选择哪个参考水平。所附实施例记载了哪些参考水平被证明最适合于特定条件。有了这种知识，可以进一步调整参考水平。
[0070] 例如，适当的参考水平可以取决于受试者的一般健康状态。可以基于SOFA评分确定一般健康状态。例如，约1.8nmol/L的proADM参考水平可用于不太严重的受试者，例如SOFA评分≤6的受试者。proADM的参考水平约3.2nmol/L可用于中度重病患者，例如SOFA评分为7-12的受试者。proADM的参考水平为约5.5nmol/L可用于重症患者，例如SOFA评分≥13的受试者。
[0071] 在优选的实施方案中，如果受试者的SOFA评分≤6，则proADM的参考水平可以是约1.8nmol/L，如果受试者的SOFA评分是7至12，则proADM的参考水平可以是约3.2nmol/L；或者，如果受试者的SOFA评分≥13，则proADM的参考水平可以是约5.6nmol/L。在最优选的方面，如果受试者的SOFA评分≤6，则proADM的参考水平可以是约1.8nmol/L，或者如果受试者的SOFA评分是7到12，则proADM的参考水平可以是约3.2nmol/L。
[0072] 因此，通过确定至少一个另外的标志物和/或参数(例如性别、组和年龄)的水平，可以选择合适的参考水平。还可以将至少一种另外的标志物和/或参数的水平与参考水平进行比较，其中受试者的所述至少一种另外的标志物和/或参数与所述参考水平的所述至少一种另外的标志物和/或参数的相应水平相比较相似或相同的值/水平指示受试者经历/具有/遭受不良事件的风险降低，和/或其中与所述参考水平的所述至少一种另外的标志物和/或参数的相应水平相比，所述至少一种另外的标志物和/或参数的更高或更低的水平/值指示经历/具有/遭受不良事件的风险增加。
[0073] 另外，可以采用如下所述和所附实施例中的ROC测试来选择提供最合适预测的适当参考水平。
[0074] 适当的参考水平也可受受试者患有的疾病/病症的影响。例如，所附实施例表明患有真菌感染的受试者显示出最高的proADM水平。因此，如果受试者患有真菌感染，则proADM的参考水平可以是5.6nmol/L。
[0075] 此外，参考水平还可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proADM水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症，并且其中疾病或病症的进展不会危及生命。换句话说，参考水平还可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proADM水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症，并且其中不良事件，特别是死亡率，不会在28天、7天或3天内发生。
[0076] 此外，参考水平还可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proADM水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学疾病和感染(例如脓毒症或败血性病症)，并且其中不良事件，特别是死亡，不会在28天、7天或3天内发生。换句话说，参考受试者的不良事件不会在28天、7天或3天内发生。特别地，参考受试者患有与待测受试者相同的疾病或医学状况/病症。
[0077] 此外，参考水平还可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proADM水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学疾病并且没有感染，并且其中不良事件，特别是死亡，不会在28天、7天或3天内发生。
[0078] 此外，参考水平还可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proADM水平，并且其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症，包括SIRS，其中所述受试者没有受到感染，并且其中不良事件，特别是死亡，不在28天、7天或3天内发生。
[0079] 如本文所用，至少一个参考受试者是指一个以上的参考受试者。特别地，所述至少一个参考受试者是参考受试者的组或群组。如下文所述，描述了用于确定标志物水平的手段和方法，例如参考文献中。
[0080] 这里使用的参考水平通常是预定水平，即它已被预先确定为以后在护理点例如ICU或ED使用的参考。
[0081] 在本发明的优选方面，不良事件是死亡率。在这些方面，参考水平还可以是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proADM水平，其中参考受试者在约28天内、约14天内、约7天内或约3天内不会死亡。此外，在这些方面，参考水平还可以是至少一种参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proADM水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症，其中参考受试者在约28天内、约14天内、约7天内或约3天内不会死亡。此外，在这些方面，参考水平还可以是至少一种参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proADM水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症以及感染，其中参考受试者在约28天内、约14天内、约7天内或约3天内不会死亡。此外，在这些方面，参考水平还可以是至少一种参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proADM水平，其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症且没有感染，其中参考受试者在约28天内、约14天内、约7天内或约3天内不会死亡。此外，在这些方面，参考水平还可以是至少一种参考受试者的至少一种组蛋白水平和/或proADM水平，并且其中所述参考受试者患有疾病和/或医学病症，包括SIRS，其中所述受试者不患有感染，并且其中所述参考受试者在约28天内、在约14天内、在约7天内或在约3天内未死亡。
[0082] 如本文所述，与参考水平相比，至少一种组蛋白的增加的水平(或至少一种组蛋白水平的增加)和/或proADM的增加的水平(或proADM水平的增加)，特别是MR-proADM，指示不良事件，特别是死亡率。特别地，如上所述，不良事件发生在28天、7天或3天内。因此，与参考水平相比，指示所述不良事件的所述至少一种组蛋白的水平和/或所述proADM水平可以是增加的水平。
[0083] 因此，本发明的方法包括一种方法，该方法包括确定所述受试者的样品中至少一种组蛋白的水平，并且其中所述受试者的所述至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平相比增加指示所述受试者中的所述不良事件，特别是死亡率。
[0084] 此外，本发明包括一种方法，该方法包括确定所述受试者样品中proADM，特别是MR-proADM的水平，并且其中与所述proADM、特别是MR-proADM的参考水平相比，所述受试者的所述proADM、特别是MR-proADM的水平增加指示所述受试者中的所述不良事件，特别是死亡率。
[0085] 此外，本发明包括一种方法，该方法包括确定所述受试者样品中proADM，特别是MR-proADM的水平，并且其中与proADM特别是MR-proADM的参考水平相比，proADM，MR-proADM特别是MR-proADM的水平增加指示所述受试者的所述不良事件，其中优选地，所述不良事件发生在约28天内；或者其中与proADM特别是MR-proADM的参考水平相比，proADM特别是MR-proADM的水平降低或等同水平表明所述受试者的所述不良事件未发生，优选在约28天内未发生。
[0086] 此外，本发明包括一种方法，该方法包括确定所述受试者样品中至少一种组蛋白的水平，并确定所述受试者样品中proADM，特别是MR-proADM的水平，并且与至少一种组蛋白的参考水平和所述proADM、特别是MR-proADM的参考水平相比，其中所述受试者的所述至少一种组蛋白的水平增加和所述受试者的所述proADM、特别是MR-proADM的水平增加指示所述受试者的所述不良事件，特别是死亡率。
[0087] 本发明还涉及一种方法，其包括
[0088] (i)确定所述受试者样品中至少一种组蛋白的水平，
[0089] 其中将所述至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平进行比较，[0090] 并且其中与所述至少一种组蛋白的参考水平相比，所述受试者的所述至少一种组蛋白的增加的水平指示所述受试者的所述不良事件；和/或
[0091] (ii)确定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proADM)的水平，
[0092] 其中将所述proADM水平与proADM的参考水平进行比较
[0093] 并且其中与所述proADM参考水平相比，所述受试者的所述proADM水平的增加指示所述受试者中的所述不良事件。
[0094] 换句话说，本发明还涉及一种方法，包括
[0095] (i)确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平，
[0096] 其中将所述至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平进行比较，[0097] 并且其中与至少一种组蛋白的参考水平相比，至少一种组蛋白水平的增加表明所述受试者的所述不良事件；和/或
[0098] (ii)确定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proADM)的水平，
[0099] 其中将所述proADM水平与proADM的参考水平进行比较
[0100] 并且其中与proADM的参考水平相比，proADM水平的增加指示所述受试者的所述不良事件。
[0101] 本发明还可以涉及一种方法，其包括
[0102] (i)确定所述受试者样品中至少一种组蛋白的水平，
[0103] 其中将所述至少一种组蛋白的水平与从先前分析获得的相同受试者的至少一种组蛋白的参考水平进行比较，
[0104] 并且其中与至少一种组蛋白的所述参考水平相比，至少一种组蛋白水平的增加表明所述受试者的所述不良事件；和/或
[0105] (ii)确定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proADM)的水平，
[0106] 其中将所述proADM水平与从先前分析获得的相同受试者的proADM的参考水平进行比较，
[0107] 并且其中与所述proADM的所述参考水平相比，proADM水平的增加指示所述受试者中的所述不良事件。
[0108] 如本文所用，“从先前分析获得”是指在过去时间，例如在下一次分析之前28天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天，确定相同受试者的样品中的标志物水平，并且其中在这些方面，所述先前确定的标志物水平被认为是参考水平。
[0109] 如本文所用，术语“标志物水平的增加”意指标志物的水平增加，即它指标志物的增加的水平。因此，术语“标志物水平的增加”在本文中可与术语“标志物的增加的水平”互换使用。受试者标志物的增加的水平或标志物水平的增加意味着标志物的水平比标志物的参考水平高至少约15％，优选至少约20％，更优选至少约25％，或甚至更优选至少约30％。
[0110] 在本发明的上下文中，术语“与参考水平相比至少一种组蛋白水平的增加”等与术语“与所述参考水平相比所述受试者的至少一种组蛋白的增加的水平”或术语“所述参考水平相比至少一种组蛋白的增加的水平”在本文可互换使用。这些术语意指受试者的至少一种组蛋白的水平，例如H2B的水平、H4的水平、H2A的水平和/或H3的水平高于至少一种组蛋白的参考水平至少约15％，优选至少约20％，更优选至少约25％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约100％。换句话说，在最优选的方面，所述至少一种组蛋白的增加的水平(或水平的增加)可以是所述至少一种组蛋白的参考水平的约两倍高。
水平增加约两倍进一步增加不良事件例如死亡的风险。例如，如表1所示，H4的危险比为
1.45意味着不良事件的风险进一步增加45％。因此，这些值也表示强相关性和用于诊断的最佳标志物。
水平增加约两倍进一步增加不良事件例如死亡的风险。例如，如表1所示，H4的危险比为
1.45意味着不良事件的风险进一步增加45％。因此，这些值也表示强相关性和用于诊断的最佳标志物。
[0111] 如本文所用，术语“与参考水平相比proADM水平的增加”等在本文中与术语“与所述参考水平相比，所述受试者的proADM的增加的水平”或术语“与所述参考水平相比，proADM的增加的水平”可互换地使用。这些术语意指受试者的proADM水平(特别是MR-proADM)水平高于proADM(特别是MR-proADM)的参考水平至少约10％，优选至少约15％，更优选至少约20％，更优选至少约25％，或甚至更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约100％。换句话说，在最优选的方面，所述proADM的增加的水平可以是所述proADM参考水平的约两倍高。
[0112] 如本文所用，术语“与参考水平相比proADM水平的降低”等在本文中与术语“与所述参考水平相比，所述受试者的proADM的增加的降低”或术语“与所述参考水平相比，proADM的降低的水平”可互换地使用。这些术语意指受试者的proADM水平(特别是MR-proADM)水平低于proADM(特别是MR-proADM)的参考水平至少约10％，优选地至少约15％，更优选至少约20％，更优选至少约25％，或甚至更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约100％。换句话说，在最优选的方面，所述proADM的降低的水平可以是所述proADM参考水平的约两倍低。
[0113] 术语“相等”还包括水平可能与参考水平相似的水平。因此，术语“相等”是指与proADM的参考水平相比，受试者的proADM水平为+/-10％，优选+/-5％，更优选+/-2％或最优选相同或相等。
[0114] 如本文使用，术语“与参考水平相比，proADM水平的降低或相同”意指受试者的proADM水平(特别是MR-proADM)水平与参考水平相比，是+/-10％,+/-5％,+/-2％或相同或相等，或者低于proADM(特别是MR-proADM)的参考水平至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约25％，或甚至更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约100％。
[0115] 在此应理解，参考水平和确定的标志物水平(即在护理点例如ICU或ED为个体受试者确定的水平)可以根据确定水平的测定/方法而变化。例如，通过基于质谱法的方法确定的参考水平和确定的标志物水平可以不同于通过免疫测定法确定的各自水平。所附实施例证明标志物的水平可通过几种方法确定，例如基于免疫测定和质谱的方法。可以通过所附实施例中举例说明的统计方法优化参考水平，例如Cox回归分析。也可以计算危险比。例如并且如所附实施例中所示，危险比高于0(HR>0)表明预后较差，即可能发生不良事件，并且危险等级小于0表明预后良好，即不良事件可能不会发生。因此，技术人员知道如何确定参考水平。例如，水平(包括参考水平)可以通过免疫测定来确定，例如通过测定受试者(或参考受试者)样品中至少一种组蛋白的水平和/或proADM例如MR-proADM的水平。
[0116] 在本发明的某些方面，至少一种组蛋白的参考水平可以是约100ng/ml，更优选约90ng/ml，更优选约80ng/ml，更优选约70ng/ml，更优选约60ng/ml，更优选约50ng/ml，更优选约45ng/ml，更优选约40ng/ml，或最优选约35ng/ml。在本发明的某些方面，至少一种组蛋白的参考水平可以是约10ng/ml，更优选约15ng/ml，更优选约20ng/ml，更优选约25ng/ml，更优选约30ng/ml，或最优选约35ng/ml。
[0117] 在本发明的某些方面，至少一种组蛋白的参考水平可以是约10ng/ml至约100ng/ml，约10ng/ml至约90ng/ml，更优选约10ng/ml至约60ng/ml，更优选约10ng/ml至约40ng/ml，更优选约15ng/ml至约40ng/ml，或最优选约20ng/ml至约40ng/ml。
[0118] 在本发明的某些方面，proADM的参考水平可以是约4nmol/L，更优选约5nmol/L，更优选约7nmol/L，更优选约8nmol/L，更优选约9nmol/L或特别优选约6nmol/L。
[0119] 此外，水平(包括参考水平)可以通过基于质谱的方法确定，例如确定相对定量或确定感兴趣的蛋白质或其片段的绝对定量的方法。
[0120] 相对定量“rSRM”可以通过以下实现：
[0121] 1.通过比较样品中检测到的给定靶片段肽的SRM(选择的反应监测)特征峰面积与在至少两个、三个、四个或更多生物样品中所述靶片段肽的相同SRM特征峰面积来确定靶蛋白的存在的增加或减少。
[0122] 2.通过比较样品中检测到的给定靶肽的SRM特征峰面积与在来自不同和单独生物来源的其他样品中来自其他蛋白质的片段肽产生的SRM特征峰面积，确定靶蛋白的存在的增加或减少，其中两个样品之间的肽片段的SRM标记峰面积比较例如对于每个样品中分析的蛋白质的量归一化。
[0123] 3.通过比较给定靶肽的SRM特征峰面积与来源于同一生物样品中不同蛋白质的其他片段肽的SRM特征峰面积来确定靶蛋白的存在的增加或减少，以便将组蛋白的变化水平对于在各种细胞条件下不改变其表达水平的其他蛋白质的水平归一化。
[0124] 4.这些测定可应用于靶蛋白的未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙酰化、甲基化(单、二、三)、瓜氨酸化、泛素化并且其中以与确定未修饰肽的相对量相同的方式确定修饰肽的相对水平。
[0125] 可以通过以下方式实现给定肽的绝对定量：
[0126] 1.将来自单个生物样品中的靶蛋白的给定片段肽的SRM/MRM特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白质裂解物的内部片段肽标准的SRM/MRM特征峰面积进行比较。所述内标可以是来自被询问的靶蛋白的片段肽的标记合成形式或标记的重组蛋白。将该标准品在消化之前(重组蛋白必需)或消化后加入已知量的样品中，并且可分别测定生物样品中内部片段肽标准品和天然片段肽二者的SRM/MRM特征峰面积，然后比较两个峰面积。这可应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙酰化、甲基化(例如单、二、三甲基化)、瓜氨酸化、泛素化并且其中可以以与确定未修饰肽的绝对量相同的方式确定修饰肽的绝对水平。
[0127] 2.肽也可以使用外部校准曲线进行定量。正常曲线方法使用恒定量的重肽作为内标，并将不同量的轻合成肽掺入样品中。需要使用类似于测试样品的代表性基质来构建标准曲线以考虑基质效应。此外，反向曲线方法避免了基质中内源性分析物的问题，其中将恒定量的轻肽掺入内源性分析物上面以产生内标，并且加入不同量的重肽以产生一组浓度标准。将要与正常曲线或反向曲线进行比较的测试样品中掺入与掺入用于产生校准曲线的基质中的内标物相同量的标准肽。
[0128] 因此，技术人员知道如何确定标志物水平，特别是适当的参考水平，这也在所附实施例中举例说明。
[0129] 除了至少一种组蛋白和/或proADM之外，本发明的方法和试剂盒还可以包括确定至少一种另外的标志物和/或参数。
[0130] 如这里所使用的，参数是可以帮助限定特定系统的特性、特征或可测量因素。参数是健康和生理学相关评估的重要因素，例如疾病/病症/临床病症风险，优选地不良事件。此外，参数被定义为客观测量和评估的特征，作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示。示例性参数可选自急性生理学和慢性健康评估评分(APACHE评分I-IV)、简化急性生理学评分(SAPS I-III评分)、序贯器官衰竭评估评分(SOFA评分)、快速SOFA(qSOFA)评分、简化急性生理学评分II(SAPSII评分)、死亡概率模型(MPM I-III)、多器官功能障碍评分(MODS)、治疗干预评分系统(TISS)、护理人力使用评分的九个等价物(NEMS)、世界神经外科学会联合会(WFNS)评分、格拉斯哥昏迷量表(GCS)、CURB-65肺炎严重性评分、肺炎严重性指数(PSI)、年龄、性别、家族史、种族、体重、体重指数(BMI)、膀胱镜检查报告、白细胞计数、CT扫描、血压、心率、抗高血压治疗、液体摄入、喘息、体温、糖尿病的存在和目前的吸烟习惯。
[0131] 如本文所用，诸如“标志物”、“替代物”、“预后标志物”、“因子”或“生物标志物”或“生物学标志物”的术语可互换使用并且涉及可测量和可量化的生物学标志物(例如，特定蛋白质或酶浓度或其片段、特定激素浓度或其片段、或生物物质或其片段的存在)，其作为健康和生理学相关评估的指标，例如疾病/病症/临床病症风险，优选地不良事件。标志物被定义为可以客观测量和评估的特征，作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示。可以在样品中测量生物标志物(作为血液、血浆、尿液或组织测试)。所述受试者的至少一种另外的标志物可选自降钙素原、降钙素、内皮素-1(ET-1)、精氨酸加压素(AVP)、心房利钠肽(ANP)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肌钙蛋白、脑利钠肽(BNP)、C反应蛋白(CRP)、胰腺结石蛋白(PSP)、在骨髓细胞1上表达的触发受体(TREM1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1、白细胞介素-24(IL-24)其他ILs、前列腺素(sCD14-ST)、脂多糖结合蛋白(LBP)、α-1-抗胰蛋白酶、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶7(MMP7)、嗜铬粒蛋白A、S100A蛋白、S100B蛋白和肿瘤坏死因子α(TNFα)或其片段。
[0132] 在本发明的特定方面，所述受试者的至少一种其他标志物和/或参数可选自所述样品中的醛缩酶B水平、所述样品中的和肽素水平、所述样品中的前内皮素-1水平、所述样品中的乳酸盐水平、所述样品中的降钙素原(PCT)水平、所述受试者的序贯器官衰竭评估评分(SOFA评分)、简化的急性生理学评分(SAPSII评分)、所述受试者的急性生理学和慢性健康评估II(APACHE II)评分和所述样品中可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)的水平。
[0133] 在本发明的某些方面，所述受试者的至少一种另外的标志物和/或参数可以选自降钙素原、降钙素、内皮素-1(ET-1)、精氨酸加压素(AVP)、心房利钠肽(ANP)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肌钙蛋白、脑利钠肽(BNP)、C反应蛋白(CRP)、胰腺结石蛋白(PSP)、骨髓细胞1上表达的触发受体(TREM1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1，白细胞介素-24(IL-24)其他ILs、前列腺素(sCD14-ST)、脂多糖结合蛋白(LBP)、α-1-抗胰蛋白酶、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶7(MMP7)、嗜铬粒蛋白A、S100A蛋白、S100B蛋白、肿瘤坏死因子α(TNFα)、年龄、性别、家族史、种族、体重、体重指数(BMI)、膀胱镜检查报告、白细胞计数、CT扫描、血压、心率、降压治疗、液体摄入、喘息、体温、糖尿病的存在、目前的吸烟习惯、急性生理学和慢性健康评估评分(APACHE评分I-IV)、简化的急性生理学评分(SAPS I-III评分)、序贯器官衰竭评估评分(SOFA评分)、死亡概率模型(MPM I-III)、多器官功能障碍评分(MODS)、治疗干预评分系统(TISS)、护理人力使用评分的九个等价物(NEMS)、世界神经外科学会联合会(WFNS)评分和格拉斯哥昏迷量表(GCS)。
[0134] 如本文所用，“醛缩酶B”是指果糖-二磷酸醛缩酶B或肝型醛缩酶，其是I类果糖1,6-二磷酸醛缩酶的三种同工酶(A、B和C)之一。可以通过基于质谱的方法确定受试者样品中的醛缩酶B水平。
[0135] “和肽素”也称为“CT-proAVP”或“加压素的C-末端部分”。血管加压素是一种强大的血管收缩剂。可以通过如下所述的免疫测定在受试者的血浆或血清中测量CT-proAVP的水平。
[0137] 如本文所用，“降钙素原”或“PCT”涉及跨越氨基酸残基1-116、2-116、3-116或其片段的肽。因此，降钙素原片段的长度为至少12个氨基酸，优选多于50个氨基酸，更优选多于110个氨基酸。PCT可包括翻译后修饰，例如糖基化、脂质化或衍生化。降钙素原是降钙素和卡他卡林的前体。因此，在正常条件下，循环中的PCT水平非常低(<约0.05ng/ml)。受试者样品中的PCT水平可以通过如下所述的免疫测定来确定。
[0138] 如本文所用，“序贯器官衰竭评估评分”或“SOFA评分”是用于在重症监护病房(ICU)或急诊室(ED)中停留期间跟踪患者状态的一个评分。SOFA评分是一种评分系统，用于确定一个人的器官功能或衰竭率。该评分基于六个不同的评分，每个各自用于呼吸、心血管、肝脏、凝血、肾脏和神经系统。平均和最高的SOFA评分都是结果的预测因子。在ICU或ED的最初24至48小时内SOFA评分的增加预示死亡率至少为50％至95％。评分低于9的预测死亡率为33％，而14岁以上的评分可接近或高于95％。
[0139] 如本文所用，“SAPS II”或“简化急性生理学评分II”涉及用于对疾病或病症的严重性进行分类的系统(参见Le Gall JR等人，A new Simplified Acute Physiology Score(SAPS II)based on a European/North American multicenter study.JAMA.1993；270(24)：2957-63)。SAPS II评分由12个生理变量和3个与疾病相关的变量组成。点评分由12个常规生理测量值、关于先前健康状态的信息和在入住ICU或ED时获得的一些信息计算。SAPS II评分可以在任何时间确定，优选在第2天确定。“最差”测量被定义为与最高点数相关的度量。SAPS II评分范围为0到163分。分类系统包括以下参数：年龄、心率、收缩压、温度、格拉斯哥昏迷量表、机械通气或CPAP、PaO2、FiO2、尿量、血尿素氮、钠、钾、碳酸氢盐、胆红素、白细胞、慢性病和入院类型。死亡率与总SAPS II评分之间存在S形关系。SAPSII评分为29分时，受试者的死亡率为10％，SAPSII评分为40分时死亡率为25％，SAPSII评分为52分时死亡率为50％，SAPSII评分为64分时死亡率为75％，SAPSII评分为77分时死亡率为90％(Le Gall loc.cit.)。
[0140] 如本文所用，“APACHE II”或“急性生理学和慢性健康评估II”是疾病严重程度分类评分系统(Knaus等，1985)。它可以在患者入住重症监护病房(ICU)或急诊室(ED)后24小时内应用，并且可以基于12种不同的生理参数确定。
[0141] 如本文所用，“快速SOFA评分”或“qSOFA评分”是指示患者器官功能障碍或死亡风险的评分系统。该评分基于三个标准：1)精神状态改变，2)收缩压降低小于100mm Hg，3)呼吸率大于22次/分钟。患有这些病症中的两种或更多种的患者具有更大的器官功能障碍或死亡的风险。
[0142] 如本文所用，“可溶性fms样酪氨酸激酶-1”或“sFlt-1”是酪氨酸激酶蛋白，其使得导致血管生长的蛋白质失活。可溶性Flt-1(sFlt-1)是VEGF受体1(Flt-1)的剪接变体，其由多种组织产生。受试者样品中sFLT1的水平可以通过基于质谱的测定和免疫测定来确定。
[0143] 如本文所用，“CURB-65”评分(Lim等人2003)涉及受试者的以下风险因素：
[0144] -新发病的混淆(定义为8或更低的缩略性心理测试分数(AMTS)(Hodkinson，1972))，
[0145] -血尿素氮大于7mmol/l(19mg/dL)，
[0146] -呼吸频率为每分钟30次或更高，
[0147] -血压低于90mmHg收缩压或舒张压60mmHg或更低，
[0148] -年龄65岁或以上。
[0149] 每个风险因子评分为1分，最高评分为5分。
[0150] 如本文所用，“肺炎严重性指数”(PSI)涉及用于计算患有社区获得性肺炎的患者的发病率和死亡率的概率的临床预测规则(Fine等人，1997)。
[0151] 如上所述，本发明的方法或试剂盒可包括确定至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平和另外的标志物和/或参数的水平。
[0152] 在优选的方面，本发明的所述方法或试剂盒可包括确定所述proADM水平和所述SOFA评分。此外，本发明的所述方法或试剂盒可包括确定所述受试者的所述proADM水平、所述SOFA评分和所述乳酸水平。
[0153] 本发明的方法和使用的试剂盒还可以包括确定至少一个其他参数，例如SAPS II评分、SOFA评分和/或APACHE II评分。例如，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平以及受试者的SAPS II评分。优选地，该方法包括确定所述受试者的所述样品中的至少一种组蛋白的水平和所述受试者的所述SAPSII评分。至少一种组蛋白的水平和SAPSII评分可以指示所述受试者在28天内发生的不良事件，特别是死亡率。
[0154] 优选地，该方法包括确定所述受试者的所述样品中的proADM水平和所述受试者的所述SAPSII评分。proADM的水平和SAPSII评分可以指示所述受试者在28天或7天内发生的不良事件，特别是死亡率。
[0155] 此外，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平以及受试者的SOFA评分。
[0156] 此外，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平以及受试者样品中的PCT水平。此外，该方法可以包括确定受试者样品中至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平以及受试者样品中醛缩酶B的水平。
[0157] 如本文所用，“受试者”(或“患者”)可以是脊椎动物。在本发明的上下文中，术语“受试者”包括人和动物，特别是哺乳动物和其他生物。因此，本文提供的方法适用于人和动物受试者。因此，所述受试者可以是动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、雪貂、猫、狗、鸡、绵羊、牛物种、马、骆驼或灵长类动物。优选地，受试者是哺乳动物。最优选地，受试者是人。
[0158] 本文提供的方法可用于任何健康受试者或患有任何疾病或病症的受试者。在优选的方面，所述受试者患有疾病、病症或医疗状况。待测受试者可以是重症患者，优选地，其中所述受试者进入重症监护病房。如本文所用，危重病是指受试者或患者处于危及生命的情况。
[0159] 受试者或参考受试者可能患有疾病或医学状况/病症，并且其中所述疾病或医学状况/病症可选自呼吸系统疾病、尿路感染、与感染性和非感染性病因相关的炎症反应、全身性炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症、严重脓毒症、败血性休克、器官衰竭、心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、肝病、肾病、免疫减弱、病毒感染、真菌感染、细菌感染、革兰氏阴性细菌感染、革兰氏阳性细菌感染和免疫抑制。本文中，基于proADM水平(特别是MR-proADM水平)的检测的本发明方法对于预测患有真菌感染的受试者中的不良事件特别有用。它对于患有呼吸道感染，特别是下呼吸道感染的受试者也特别有用。
[0160] 受试者还可能患有骨和/或组织缺陷后例如骨折的感染。
[0161] 此外，还可以选择受试者进行手术。这意味着受试者将接受手术。该手术可能与作为入院的原因或症状的疾病和/或病症有关。
[0162] 特别地，受试者患有呼吸道疾病、尿路感染和/或恶性肿瘤。
[0163] 在本发明的上下文中，“系统性炎症”优选涉及特征在于释放促炎细胞因子和活化的先天免疫系统的病症，其可以由生物因子、化学因子或遗传因素引起。严重的“全身性炎症”可导致器官衰竭和死亡。
[0164] 在本发明的上下文中，“SIRS”是全身性炎症反应综合征，没有感染迹象。它包括但不限于以下临床表现中的一种以上：(1)体温大于38℃或小于36℃；(2)心率大于每分钟90次；(3)呼吸急促，表现为呼吸频率大于每分钟呼吸20次，或过度通气，如PaCO2小于32mm Hg所示；和(4)白细胞计数的变化，如计数大于12,000/mm3、计数小于4,000/mm3，或存在超过10％的未成熟中性粒细胞(Bone等，CHEST 101(6):1644-55,1992)。
[0165] 在本发明的上下文中，“脓毒症”是指对感染的全身反应。或者，脓毒症可被视为SIRS与确认的感染过程或感染的组合。脓毒症可以表征为临床综合征，由感染和全身炎症反应的存在定义(Levy MM等人2001SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference.Crit Care Med.2003 Apr；31(4)：1250-6)。本文使用的术语“脓毒症”包括但不限于脓毒症、严重脓毒症、脓毒症性休克。在这种情况下，严重脓毒症是指与器官功能障碍、灌注不足异常或脓毒症引起的低血压相关的脓毒症。灌注不足异常包括乳酸性酸中毒、少尿和精神状态的急性改变。脓毒症引起的低血压的定义是，在没有其它低血压原因(如心源性休克)的情况下，收缩压低于约90mm Hg或从基线降低约40mm Hg或更高。败血性休克定义为严重脓毒症，尽管有足够的液体复苏，但脓毒症诱导的低血压持续存在，伴有灌注不足异常或器官功能障碍(Bone等，CHEST 101(6)：1644-55,1992)。
[0166] 术语“脓毒症”还包括基于SEPSIS-2定义的严重脓毒症或脓毒症性休克(Bone等，2009)。术语“脓毒症”还包括属于SEPSIS-3定义的受试者(Singer等，2016)。
[0167] 本文使用的术语“脓毒症”涉及脓毒症发展的所有可能阶段。
[0168] 如本文所用，本发明范围内的“感染”是指由致病性或潜在致病性微生物侵入正常无菌组织或流体引起的病理过程，并且涉及细菌、病毒、真菌和/或寄生虫引起的感染。因此，感染可以是细菌感染、病毒感染和/或真菌感染。感染可以是局部或全身感染。此外，患有感染的受试者可同时患有一种以上的感染源。例如，患有感染的受试者可能患有细菌感染和病毒感染；病毒感染和真菌感染；细菌和真菌感染，以及细菌感染、真菌感染和病毒感染。
[0169] 特别是，受试者患有脓毒症。此外，受试者可优选患有呼吸道疾病，优选患有下呼吸道感染。如本文所用，呼吸系统疾病包括影响在高等生物中可能进行气体交换的器官和组织的病理状况，并且还包括上呼吸道、气管、支气管、细支气管、肺泡、胸膜和胸膜腔以及呼吸的神经和肌肉的病症。
[0170] 特别地，在本发明的方法和试剂盒中，患有所述呼吸道疾病的所述受试者的所述样品中的至少一种组蛋白的水平指示不良事件，特别是在7天内发生的死亡。
[0171] 特别地，在本发明的方法和试剂盒中，受试者患有尿路感染，并且其中所述患有所述尿路感染的所述受试者的样品中的至少一种组蛋白的水平指示不良事件，特别是在28天内发生的死亡。
[0172] 特别地，在本发明的方法和试剂盒中，受试者患有恶性肿瘤，并且其中所述患有所述恶性肿瘤的受试者的样品中的至少一种组蛋白的水平指示在7天内发生的不良事件，特别是死亡。
[0173] 如本文所用，术语“样品”是从受试者获得的生物样品。如本文所用的“样品”可以例如是指为了诊断、预后或评估感兴趣的受试者(例如患者)而获得的体液或组织样品。在此优选地，样品是体液样品，例如血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、唾液、痰液和胸腔积液。特别地，样品是血液、血浆、血清或尿液。可以处理(预处理)样品，例如通过分级或纯化程序，例如，将全血分离成血清或血浆组分。此类预处理还可包括但不限于稀释、过滤、离心、浓缩、沉降、沉淀或透析。预处理还可包括向溶液中添加化学或生物化学物质，例如酸、碱、缓冲剂、盐、溶剂、活性染料、洗涤剂、乳化剂、螯合剂。优选地，样品是血液样品，更优选血清样品或血浆样品。
[0174] 在本发明的上下文中，“血浆”是离心后获得的含有抗凝血剂的血液的几乎无细胞的上清液。示例性抗凝血剂包括钙离子结合化合物如EDTA或柠檬酸盐和凝血酶抑制剂如肝素盐或水蛭素。通过离心抗凝血(例如柠檬酸盐、EDTA或肝素化血液)，例如在2000至3000g下离心至少15分钟，可以获得无细胞血浆。
[0176] 如本文所用，“尿液”是由肾脏通过称为撒尿(或排尿)的过程分泌并通过尿道排泄的身体的液体产品。
[0177] 如上所述，在受试者的样品中测定至少一种组蛋白和/或proADM的水平。技术人员知道可用于确定样品中生物标志物水平的方法/测定。
[0178] 如上所述，确定至少一种组蛋白的水平，特别地，确定组蛋白H2B、H4、H2A和/或H3的水平。特别地，可以确定组蛋白或组蛋白片段。这些片段在下文中举例说明。
[0179] 这种组蛋白或其片段也可以代表游离组蛋白。例如，本发明的方法、试剂盒和抗体可以特别检测游离组蛋白的肽或表位。这种氨基酸段在本文中也称为组蛋白的中心区域或部分。在下文中，描述了肽或表位，其也可用于使用本文提供的方法检测游离组蛋白。
[0180] 特别地，至少一种组蛋白可以是组蛋白H4，并且其中至少确定了跨越根据SEQ ID NO：1的组蛋白H4的氨基酸残基22至102的序列的肽。特别地，至少一种组蛋白是组蛋白H4，并且其中至少确定的序列的肽选自跨越以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1的残基60至67，SEQ ID NO：1的残基46至56，SEQ ID NO：1的残基67至78，SEQ ID NO：1的残基22至30，SEQ ID NO：1的残基67至78，SEQ ID NO：1的残基92至102，SEQ ID NO：1的残基22至34，SEQ ID NO：1的残基46至102，SEQ ID NO：1的残基46至55，SEQ ID NO：1的残基80至91，SEQ ID NO：1的残基24至35，和SEQ ID NO：1的残基68至77。例如，可以确定两种肽。
[0181] 特别地，至少一种组蛋白是组蛋白H4，并且其中肽由跨越SEQ ID NO：1的残基46至56和SEQ ID NO：1的残基67至78的氨基酸序列确定。
[0182] 此外，至少一种组蛋白是组蛋白H2A，并且其中至少确定了跨越根据SEQ ID NO：2的组蛋白H2A的氨基酸残基20至118的序列的肽。特别地，至少一种组蛋白是组蛋白H2A，并且其中至少确定的序列的肽选自跨越以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的残基21至53，SEQ ID NO：2的残基21至29，SEQ ID NO：2的残基30至53，SEQ ID NO：2的残基120至129，SEQ ID NO：2的残基21至29，SEQ ID NO：2的残基82至88，SEQ ID NO：2的残基89至95，以及SEQ ID NO：2的残基100至118。
[0183] 此外，至少一种组蛋白是组蛋白H3，并且其中至少测定了跨越根据SEQ ID NO：3的组蛋白H3的氨基酸残基27至62的序列的肽。此外，至少一种组蛋白是组蛋白H3，并且其中至少测定跨越SEQ ID NO：3的氨基酸残基27至37和/或跨越SEQ ID NO：3的氨基酸残基52至62的序列的肽。
[0184] 此外，至少一种组蛋白是组蛋白H2B，并且其中至少测定了跨越根据SEQ ID NO：4的组蛋白H2B的氨基酸残基41至69的序列的肽。
[0185] 此外，至少一种组蛋白是组蛋白H2A，并且其中至少测定选自SEQ ID NO：7、8、9和10的肽或其片段。
[0186] 此外，至少一种组蛋白是组蛋白H4，并且其中至少测定选自SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16的肽或其片段。
[0187] 在此应理解，可以测定一种、两种、三种、四种或更多种肽。
[0188] 标志物的水平，例如至少一种组蛋白或其片段和/或proADM或其片段，可以通过可靠地确定标志物浓度的任何测定来确定。特别地，可以使用质谱(MS)和/或免疫测定，如所附实施例中举例说明的。如本文所用，免疫测定是通过使用抗体或抗体结合片段或免疫球蛋白测量溶液中大分子/多肽的存在或浓度的生物化学测试。
[0189] 或者，代替抗体，特异性和/或选择性识别组蛋白序列、组蛋白表位和组蛋白结构构象的其他捕获分子或分子支架可包括在本发明的范围内。本文中，术语“捕获分子”或“分子支架”包括可用于结合靶分子或目标分子的分子，即来自样品的分析物(例如组蛋白和/或proADM)。因此，捕获分子必须在空间上和表面特征方面充分成形，例如表面电荷、疏水性、亲水性、存在或不存在路易斯供体和/或受体，以特异性结合靶分子或目标分子。因此，结合可以例如通过在捕获分子或分子支架和靶分子或目标分子之间的离子、范德华、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或两种或更多种上述相互作用或共价相互作用来介导。在本发明的上下文中，捕获分子或分子支架可以例如选自核酸分子、碳水化合物分子、PNA分子、蛋白质、肽和糖蛋白。捕获分子或分子支架包括例如适体、DARpins(设计的锚蛋白重复蛋白)、Affimers等。
[0190] 如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(免疫反应)的抗原结合位点的分子。根据本发明，抗体可以是单克隆抗体以及多克隆抗体。特别地，使用特异性结合至少一种组蛋白和/或特异性结合proADM的抗体。如果抗体对目标分子(例如至少一种组蛋白和/或proADM或其片段)比对含有目标分子的样品中包含的其他分子的亲和力至少高50倍、优选高100倍、最优选至少高1000倍，则认为抗体是特异性的。本领域众所周知如何开发和选择具有给定特异性的抗体。
在本发明的上下文中，优选单克隆抗体。抗体或抗体结合片段与本文定义的标志物或其片段特异性结合。特别地，抗体或抗体结合片段与本文定义的至少一种组蛋白蛋白质的肽结合。因此，本文定义的肽也可以是抗体特异性结合的表位。此外，抗体或抗体结合片段用于本发明的方法和试剂盒中，其特异性结合proADM，特别是MR-proADM。示例性免疫测定可以是发光免疫测定(LIA)、放射免疫测定(RIA)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于发光的珠阵列、基于磁珠的阵列、蛋白质微阵列测定、快速测试形式(rapid test formats)、稀有穴合物测定(rare cryptate assay)。此外，可以使用适用于即时测试和快速测试形式的测定，例如免疫层析带测试。
在本发明的上下文中，优选单克隆抗体。抗体或抗体结合片段与本文定义的标志物或其片段特异性结合。特别地，抗体或抗体结合片段与本文定义的至少一种组蛋白蛋白质的肽结合。因此，本文定义的肽也可以是抗体特异性结合的表位。此外，抗体或抗体结合片段用于本发明的方法和试剂盒中，其特异性结合proADM，特别是MR-proADM。示例性免疫测定可以是发光免疫测定(LIA)、放射免疫测定(RIA)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于发光的珠阵列、基于磁珠的阵列、蛋白质微阵列测定、快速测试形式(rapid test formats)、稀有穴合物测定(rare cryptate assay)。此外，可以使用适用于即时测试和快速测试形式的测定，例如免疫层析带测试。
[0191] 在本发明的某些方面，方法是用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的方法，其中所述方法包括
[0192] (i)获得受试者的样品；
[0193] (ii)通过将样品与特异于至少一种组蛋白和/或proADM的表位的抗体或其抗原结合片段或衍生物接触，并检测抗体或其抗原结合片段或衍生物与所述至少一种组蛋白和/或所述proADM之间的结合，检测所述受试者的样品中所述至少一种组蛋白的水平和/或所述肾上腺髓质素原(proADM)的水平；和
[0194] (iii)其中所述至少一种组蛋白的水平和/或所述肾上腺髓质素原(proADM)的水平指示所述受试者的所述不良事件。
[0195] 在本发明的某些方面，该方法是免疫测定，包括以下步骤：
[0196] a)将样品与以下接触
[0197] (i)对组蛋白的或proADM的第一表位特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，和
[0198] (ii)对所述组蛋白或所述proADM的第二表位特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物；和
[0199] b)检测所述第一和第二抗体或其抗原结合片段或衍生物与所述组蛋白或proADM的结合。
[0200] 优选地，可以标记一种抗体，并且可以将另一种抗体结合至固相，或者可以选择性地结合至固相。在测定的一个特别优选的方面，一种抗体被标记，而另一种抗体与固相结合或者可以选择性地结合到固相上。第一抗体和第二抗体可以分散在液体反应混合物中存在，并且其中作为基于荧光或化学发光消光或扩增的标记系统的一部分的第一标记组分与第一抗体结合，和所述标记系统的第二标记组分与第二抗体结合，使得在两种抗体与所述至少一种组蛋白和/或与所述proADM的待检测的结合后，产生了允许在测量溶液中检测所得夹心复合物的可测量信号。标记系统可包含与荧光或化学发光染料，特别是花青类型组合的稀土穴合物或螯合物。
[0201] 在一个优选的实施方案中，该方法作为多相夹心免疫测定法进行，其中一种抗体固定在任意选择的固相上，例如，涂覆的试管壁(例如聚苯乙烯试管；涂层管；CT)或微量滴定板，例如由聚苯乙烯构成的，或者固定至颗粒，例如磁性颗粒，其中另一种抗体具有类似于可检测标记的基团或能够选择性地附着到标记上，并且用于检测形成的夹层结构。使用合适的固相暂时延迟或随后固定也是可能的。
[0202] 此外，根据本发明的方法可以体现为均相方法，其中由抗体/多个抗体和待检测的标志物(例如组蛋白或proADM或其片段)形成的夹心复合物保持悬浮于液相。在这种情况下，优选的是，当使用两种抗体时，两种抗体都用检测系统的部分标记，如果两种抗体整合到单个夹心物中，则导致产生信号或触发信号。这些技术尤其体现为荧光增强或荧光猝灭检测方法。特别优选的方面涉及成对使用的检测试剂的用途，例如US 4 882 733 A、EP-B1 0 180 492或EP-B1 0 539 477和其中引用的现有技术中描述的检测试剂。以这种方式，仅检测在反应混合物中直接在单一免疫复合物中包含两种标记组分的反应产物的测量变得可能。例如，这种技术以商标名 (时间分辨扩增穴合物排放)或 提
供，其实施上述引用申请的教导。因此，在特别优选的方面，使用诊断装置来实施本文提供的方法。例如，确定组蛋白或proADM或其片段的水平，和/或本文提供的方法的任何其他标志物的水平。在特别优选的方面中，所述诊断装置是
供，其实施上述引用申请的教导。因此，在特别优选的方面，使用诊断装置来实施本文提供的方法。例如，确定组蛋白或proADM或其片段的水平，和/或本文提供的方法的任何其他标志物的水平。在特别优选的方面中，所述诊断装置是
[0203] 此外，本发明的免疫测定方法可以优选利用对至少一种组蛋白和/或proADM的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。本文下文和上文描述了示例性肽，其可适用于测定proADM和/或至少一种组蛋白的水平。
[0204] 例如，本发明的免疫测定方法可以优选利用对组蛋白H4的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越SEQ ID NO：1的氨基酸残基22至102的序列中的组蛋白H4的表位。
[0205] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越SEQ ID NO：1的氨基酸残基46至56的序列中存在的组蛋白H4的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对跨越SEQ ID NO：1的氨基酸残基67-78的序列中存在的组蛋白H4的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
[0206] 例如，本发明的免疫测定方法可以优选利用对组蛋白H2B的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越SEQ ID NO：4的氨基酸残基41至69的序列中的组蛋白H2B的表位。
[0207] 此外，本发明的免疫测定方法可以优选利用对组蛋白H2A的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越SEQ ID NO：2的氨基酸残基20至118的序列中的组蛋白H2A的表位。
[0208] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对组蛋白H2A的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至53、20至118或120至129的序列中的组蛋白H2A的表位。
[0209] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对组蛋白H3的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中第一表位和/或第二表位是存在于跨越SEQ ID NO：3的氨基酸残基27至62的序列中的组蛋白H3的表位。
[0210] 更优选地，本发明的免疫测定方法可以利用对组蛋白H4的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中表位选自跨越以下的的氨基酸序列：SEQ ID NO：1的残基22至30，SEQ ID NO：1的残基46至56，SEQ ID NO：1的残基67至78，SEQ ID NO：1的残基92至102，SEQ ID NO：1的残基22至34，和SEQ ID NO：1的残基46至102。
[0211] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对组蛋白H2A的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中表位选自跨越以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的残基21至53，SEQ ID NO：2的残基21至29，SEQ ID NO：2的残基30至53，和SEQ ID NO：2的残基120至129。
[0212] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越SEQ ID NO:4的残基41-69的组蛋白H2B的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。
[0213] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越SEQ ID NO:3的残基27-37和/或跨越SEQ ID NO:3的残基52-62的组蛋白H3的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。
[0214] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越由SEQ ID NO：2表示的组蛋白H2A序列的氨基酸残基21至53/或120至129的序列中存在的组蛋白H2A的表位具有特异性的第一抗体和/或第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。
[0215] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越SEQ ID NO：1的氨基酸残基22至102的序列中存在的组蛋白H4的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白H2A、H2B或优选H3的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
[0216] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越SEQ ID NO：4的氨基酸残基41至69的序列中存在的组蛋白H2B的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白H2A、H4或H3的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
[0217] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越SEQ ID NO：2的氨基酸残基20至118的序列中存在的组蛋白H2B的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白H2B、H4或H3的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
[0218] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越SEQ ID NO：3的氨基酸残基27至62的序列中存在的组蛋白H2B的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白H2B、H4或H2A的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
[0219] 此外，本发明的免疫测定方法可以利用对跨越SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至53、120至129或20至118的序列中存在的组蛋白H2A的表位具有特异性的第一抗体、其抗原结合片段或衍生物，和对游离组蛋白H3、H4或优选地H2B的表位具有特异性的第二抗体、其抗原结合片段或衍生物。
[0220] 本发明还涉及对如上详述的组蛋白蛋白质或其片段的表位具有特异性的抗体或其抗原结合片段或衍生物。成功用于检测组蛋白或proADM、优选MR-proADM的示例性抗体显示在所附实施例中。因此，本发明涉及对组蛋白H2B、H4、H2A、H3和/或proADM(优选MR-proADM)的表位具有特异性的抗体、其抗原结合片段或衍生物。抗体特异性结合的示例性表位或肽在本文中和下文中记载。
[0221] 标志物例如至少一种组蛋白和/或proADM的水平也可以通过如所附实施例中所述的基于质谱(MS)的分析来确定。这种方法可以包括检测在所述生物样品中或来自所述样品的蛋白质消化物(例如胰蛋白酶消化物)中所述一种或多种修饰的或未修饰的片段肽(例如proADM和/或组蛋白的)的存在、量或浓度，并任选地用色谱方法分离样品，并将制备的和任选分离的样品进行MS分析。例如，选择的反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)或平行反应监测(PRM)质谱可以用于MS分析，特别是用于确定至少一种组蛋白肽的量。本文中，术语“质谱法”或“MS”是指通过其质量鉴定化合物的分析技术。为了增强质谱的质量分辨和质量确定能力，可以在MS分析之前处理样品。因此，本发明涉及可以与免疫富集技术、与样品制备和/或色谱方法有关的方法，优选与液相色谱(LC)、更优选高效液相色谱(HPLC)或超级高效液相色谱(UHPLC)组合的MS检测方法。样品制备方法包括用于裂解、分级分离、将样品消化成肽、消耗、富集、透析、脱盐、烷基化和/或肽还原的技术。但是，这些步骤是可选的。分析物离子的选择性检测可以用串联质谱(MS/MS)进行。串联质谱的特征在于质量选择步骤(如本文所用，术语“质量选择”表示分离具有指定m/z或窄范围m/z的离子)，随后是所选离子的碎裂和所得产物(碎裂)离子的质量分析。
[0222] 技术人员知道如何通过质谱法量化样品中标志物的水平。例如，如上所述，可以采用相对定量“rSRM”或绝对定量。
[0223] 如本文所用，在本发明的上下文中的“诊断”涉及受试者中不良事件，特别是死亡率的识别和(早期)检测，并且还可以包括差别诊断。此外，不良事件严重程度的评估可以包括在术语“诊断”中。例如，评估病情的严重程度以及不良事件发生的可能性。另外，诊断意味着当受试者中的不良事件发生时，例如在约至少28天、7天或3天内，可以预测时间。
[0224] “预后”涉及预测受试者经历/具有/患有不良事件(特别是死亡)的结果或特定风险。这还可以包括估计所述受试者的恢复机会或不良结果的可能性。
[0225] 本发明还涉及用于受试者的监测、治疗指导和/或治疗控制的方法和试剂盒，该方法包括
[0226] (i)确定所述受试者样品中至少一种组蛋白的水平，并且其中所述至少一种组蛋白的水平指示所述受试者的所述不良事件；和/或
[0227] (ii)测定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proADM)水平，并且其中所述proADM水平指示所述受试者的所述不良事件。
[0228] 本发明的方法和试剂盒也可用于监测。“监测”涉及跟踪已经诊断的疾病或医学病症，例如分析疾病或医学病症的进展或特定治疗对进展的影响，并预测不良结果，例如威胁生命的健康条件或甚至死亡。
[0229] 在本发明的上下文中，术语“治疗性控制”是指对受试者的治疗性处理的监测和/或调整。治疗性处理的调整还可以包括决定是否如前所述进一步治疗受试者或是否适应治疗。例如，治疗性处理的调整可以是受试者是否保持在ICU或ED上或是否被释放。
[0230] 在本发明中，术语“风险评估”和“风险分层”涉及根据受试者的进一步预后将受试者分组到不同的风险组中。风险评估还涉及应用预防和/或治疗措施的分层。
[0231] 如本文所用，术语“治疗指导”是指基于一种或多种生物标志物的值和/或临床参数和/或临床评分应用某些疗法或医学干预。
[0232] 本发明的方法可以部分地是计算机实现的。例如，将检测到的标志物水平(例如proADM水平和/或组蛋白水平)与参考水平进行比较的步骤可以在计算机系统中进行。在计算机系统中，确定的标志物水平可以与受试者的其他标志物水平和/或参数组合，以便计算指示诊断、预后、风险评估和/或风险分层的评分。例如，可以将确定的值输入(由健康专业人员手动或者从已经确定了相应标志物水平的设备自动输入)到计算机系统中。计算机系统可以直接在护理点(例如ICU或ED)，或者它可以在通过计算机网络(例如，通过互联网)连接的远程位置。通常，计算机系统将在计算机可读介质上存储所述值(例如标记水平或诸如年龄、血压、体重、性别等的参数)并基于预定义和/或预先存储的参考水平或参考值计算评分。将为用户(通常是诸如医生的健康专业人员)显示和/或打印得到的分数。替代地或另外地，将为用户(通常是诸如医生的健康专业人员)显示和/或打印相关的预后、诊断、评估或分层。
[0233] 因此，本发明在另一方面涉及用于受试者中不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的系统，其包括
[0234] (i)用于确定受试者样品中proADM和/或组蛋白水平(以及任选的其他标志物水平)的样品分析仪；和
[0235] (ii)计算机子系统，其被编程用于计算受试者中不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层，通常基于确定的水平与(a)参考水平的比较。
[0236] 计算机子系统可以将检测到的标志物水平与如本文所述的其他水平和/或参数组合。装置的输出可以是评分或直接是对受试者中的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层。
[0237] 在相关方面，本发明涉及一种体现在计算机可读介质中的计算机程序产品，当在计算机上执行时，其执行包括基于所确定的在受试者样品中proADM和/或组蛋白的水平，确定受试者中不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的步骤。通常，该步骤基于所确定的水平与(a)如本文所述的参考水平的比较。
[0238] 本发明还涉及试剂盒、试剂盒的用途和使用这种试剂盒的方法。本发明涉及用于实施本文上文和下文提供的方法的试剂盒。本文提供的定义，例如关于方法提供的定义，也适用于本发明的试剂盒。特别地，本发明涉及用于诊断、预后、风险评估和/或风险分层的试剂盒，其中所述试剂盒包括
[0239] (i)用于测定所述受试者的所述样品中至少一种组蛋白的所述水平的检测试剂，和
[0240] 参考数据，其包括至少一种组蛋白的所述参考水平，并且其中与所述至少一种组蛋白的参考水平相比，所述受试者的所述样品中所述至少一种组蛋白的水平增加指示所述受试者的不良事件；和/或
[0241] (ii)用于确定所述受试者的所述样品中所述proADM水平的检测试剂，和
[0242] 包括所述proADM的参考水平的参考数据，并且
[0243] 其中与所述proADM的参考水平相比，所述受试者的所述样品中所述proADM的水平增加指示所述受试者的不良事件。
[0244] 此外，本发明优选涉及试剂盒及其用于实施本发明方法的用途，其中所述试剂盒包含用于确定所述受试者的所述样品中所述proADM水平的检测试剂，和包括所述proADM参考水平的参考数据，并且其中与所述proADM的参考水平相比，所述受试者的所述样品中proADM水平的增加指示所述受试者的不良事件。
[0245] 此外，本发明优选涉及试剂盒及其用于实施本发明方法的用途，其中所述试剂盒包含用于测定所述受试者的所述样品中所述proADM水平的检测试剂，和包括所述proADM参考水平的参考数据，并且其中与所述proADM的参考水平相比，所述受试者的所述样品中proADM水平的降低或类似的proADM水平表明所述受试者的不良事件在约28天内未发生。
[0246] 本发明还涉及用于受试者不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的试剂盒及试剂盒在其中的用途，
[0247] (i)其中在受试者的样品中确定至少一种组蛋白的水平，
[0248] 其中将至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平进行比较，和[0249] 其中基于样品中测定的至少一种组蛋白的水平与至少一种组蛋白的参考水平的比较，鉴定所述受试者的不良事件；和/或
[0250] (ii)其中在受试者的样品中确定proADM的水平，
[0251] 其中将proADM的水平与proADM的参考水平进行比较，和
[0252] 其中基于样品中测定的proADM水平与proADM的参考水平的比较，鉴定受试者的不良事件。
[0253] 本发明还涉及该试剂盒及其用于受试者不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的用途，
[0254] (i)其中所述试剂盒包括用于测定受试者的样品中至少一种组蛋白的水平的检测试剂，和
[0255] 其中至少一种组蛋白的水平指示所述受试者的不良事件；和/或
[0256] (ii)其中试剂盒包含用于测定受试者样品中proADM水平的检测试剂，和
[0257] 其中所述proADM的水平指示所述受试者的所述不良事件。
[0258] 如本文所用，“参考数据”包括至少一种组蛋白和/或proADM，特别是MR-proADM的参考水平。可以将受试者样品中至少一种组蛋白和/或proADM的水平与试剂盒的参考数据中包含的参考水平进行比较。所确定的标志物水平的增加指示不良事件，特别是死亡率。确定的标志物水平降低或水平相等表明未发生不良事件，特别是死亡率。这里参考水平如上所述。参考数据还可以包括参考样品，至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平与之比较。参考数据还可以包括如何使用本发明的试剂盒的说明书。
[0259] 如本文所用，“检测试剂”等是适合于确定本文所述标志物例如至少一种组蛋白和/或proADM的试剂。此类示例性检测试剂是例如配体，例如抗体或其片段，其特异性结合本文所述标志物的肽或表位。这些配体可用于如上所述的免疫测定。用于免疫测定以确定标志物水平的其他试剂也可以包含在试剂盒中，并且在本文中被认为是检测试剂。检测试剂还可以涉及用于通过基于MS的方法检测标志物或其片段的试剂。因此，这种检测试剂也可以是用于制备用于MS分析的样品的试剂，例如酶、化学品、缓冲液等。质谱仪也可以被认为是检测试剂。根据本发明的检测试剂也可以是校准溶液，例如可以用于确定和比较标志物水平的校准溶液。
[0260] 给出的定义和解释也比照适用于以下项目。本发明还涉及以下项目。
[0261] 1.用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的方法，其中所述方法包括
[0262] (i)确定所述受试者样品中至少一种组蛋白的水平，并且其中所述至少一种组蛋白的水平指示所述受试者的所述不良事件；和/或
[0263] (ii)测定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proADM)水平，并且其中所述proADM水平指示所述受试者的所述不良事件。
[0264] 2.根据项目1所述的方法，其中所述不良事件在28天内发生或其中所述不良事件在28天内未发生。
[0265] 3.根据项目1或2所述的方法，其中
[0266] (i1)将至少一种组蛋白的所述水平与所述至少一种组蛋白的参考水平进行比较；和/或
[0267] (ii1)将proADM的所述水平与proADM的参考水平进行比较；和
[0268] (iii)其中分别基于在步骤(i1)和/或(ii1)中的比较鉴定所述受试者中的说不良事件。
[0269] 4.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中
[0270] (i)与至少一种组蛋白的所述参考水平相比至少一种组蛋白水平的增加指示所述受试者的所述不良事件；和/或
[0271] (ii)与proADM的参考水平相比，proADM水平的增加指示所述受试者的所述不良事件，其中优选地所述不良事件在28天内发生，或
[0272] 与所述proADM的所述参考水平相比，所述受试者的所述proADM的水平降低或水平相同表明未发生不良事件，优选在约28天内未发生。
[0273] 5.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中所述不良事件选自死亡、器官功能障碍、多器官功能障碍和疾病或医学病症，例如感染。
[0274] 6.根据项目1至5中任一项所述的方法，其中所述不良事件是死亡。
[0275] 7.根据项目3至6中任一项所述的方法，其中proADM的参考水平为约0.9nmol/L至约1.8nmol/L.
[0276] 8.根据项目1至7中任一项所述的方法，其中
[0277] (i)所述至少一种组蛋白的增加的水平为至少一种组蛋白的所述参考水平的约两倍高；和/或
[0278] (ii)所述proADM的增加的水平为所述proADM的参考水平的约两倍高。
[0279] 9.根据项目3至8中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白的参考水平和/或proADM的参考水平是至少一个参考受试者的至少一种组蛋白的水平和/或proADM的水平。
[0280] 10.根据项目3至9中任一项所述的方法，其中所述参考受试者是健康受试者和/或没有不良事件的受试者。
[0281] 11.根据项目3至10中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白的参考水平和/或proADM的参考水平是从所述受试者的先前分析获得的至少一种组蛋白和/或proADM的水平。
[0282] 12.根据项目1至11中任一项所述的方法，其中所述proADM是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)。
[0283] 13.根据项目1至12中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述proADM水平指示所述受试者在28天内发生的所述不良事件，优选地死亡。
[0284] 14.根据项目1至13中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述proADM水平指示所述受试者在7天内发生的所述不良事件，优选地死亡。
[0285] 15.根据项目1至14中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H2B、组蛋白H2A、组蛋白H3和/或组蛋白H4。
[0286] 16.根据项目1至15中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H2B。
[0287] 17.根据项目1至16中任一项所述的方法，其中所述受试者的至少一种组蛋白的所述水平指示所述受试者在7天内或3天内发生的所述不良事件，优选地死亡。
[0288] 18.根据项目1至17中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定所述受试者的至少一个标志物和/或参数，其选自所述样品中乳酸的水平、至少一种组氨酸的水平、所述样品中醛缩酶B的水平、所述样品中和肽素的水平、所述样品中乳酸盐的水平、所述样品中降钙素原(PCT)的水平、所述受试者的序贯器官衰竭评估评分(SOFA评分)、简化急性生理学评分(SAPSII评分)、所述受试者的急性生理学慢性健康评估II(APACHE II)评分和所述样品中可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)的水平。
[0289] 19.根据项目1至18中任一项所述的方法，其中进一步确定所述受试者的序贯器官衰竭评估评分(SOFA评分)。
[0290] 20.根据项目3至19中任一项所述的方法，其中
[0291] 如果受试者的SOFA评分≤6，则proADM的参考水平为约1.8nmol/L；
[0292] 如果受试者的SOFA评分为7至12，则proADM的参考水平为约3.2nmol/L；或者[0293] 如果受试者的SOFA评分≥13，则proADM的参考水平为约5.5nmol/L。
[0294] 21.根据项目1至20中任一项所述的方法，其中
[0295] 与proADM的参考水平约1.8nmol/L和所述受试者的SOFA评分≤6相比，所述受试者的proADM水平的降低或相同水平表明所述不良事件未发生；
[0296] 与proADM的参考水平约3.2nmol/L和所述受试者的SOFA评分7至12相比，所述受试者的proADM水平的降低或相同水平表明所述不良事件未发生；或者
[0297] 与proADM的参考水平约5.6nmol/L和所述受试者的SOFA评分≥13相比，所述受试者的proADM水平的降低或相同水平表明所述不良事件未发生；和
[0298] 其中优选地所述不良事件在约28天内未发生。
[0299] 22.根据项目1至20中任一项所述的方法，其中
[0300] 所述受试者的proADM水平与约1.8nmol/L的proADM的参考水平相比的提高并且所述受试者的SOFA评分≤6表示所述受试者的所述不良事件；
[0301] 所述受试者的proADM水平与约3.2nmol/L的proADM的参考水平相比的提高并且所述受试者的SOFA评分为7-12表示所述受试者的所述不良事件；或
[0302] 所述受试者的proADM水平与约5.6nmol/L的proADM的参考水平相比的提高并且所述受试者的SOFA评分≥13表示所述受试者的所述不良事件，
[0303] 其中优选地所述不良事件在约28天内发生。
[0304] 23.根据项目19至23中任一项所述的方法，其中基于所述受试者的proADM水平增加SOFA评分，并且其中所述改变的SOFA评分指示所述不良事件。
[0305] 24.根据项目23所述的方法，其中如果受试者具有高于约1.8nmol/L的proADM水平，则受试者的SOFA评分增加1。
[0306] 25.根据项目1至24中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定在所述受试者的所述样品中至少一种组蛋白的所述水平和所述proADM的水平。
[0307] 26.根据项目25所述的方法，其中所述至少一种组蛋白的水平和所述proADM水平指示所述受试者在28天内出现的所述不良事件，优选地死亡。
[0308] 27.根据项目1至26中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的所述样品中的至少一种组蛋白的水平和所述受试者的所述SAPSII评分。
[0309] 28.根据项目27所述的方法，其中所述至少一种组蛋白的水平和所述SAPSII评分指示所述受试者在28天内出现的所述不良事件，优选地死亡。
[0310] 29.根据项目1至28中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的所述样品中的所述proADM水平和所述受试者的所述SAPSII评分。
[0311] 30.根据项目29所述的方法，其中所述proADM的水平和所述SAPSII评分指示所述受试者在28天内或在7天内出现的所述不良事件，优选地死亡。
[0312] 31.根据项目1至30中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的所述proADM水平、所述SOFA评分和所述乳酸水平。
[0313] 32.根据项目1至31中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或医学病症。
[0314] 33.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中所述受试者是重症患者，优选地，其中所述受试者进入重症监护病房。
[0315] 34.根据项目1至33中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或医学病症，并且其中所述疾病或医学病症选自呼吸系统疾病、尿路感染、与感染性和非感染性病因相关的炎症反应、全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症、严重脓毒症、脓毒症性休克、器官衰竭、心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、肝病、肾病、免疫减弱、病毒感染、真菌感染、细菌感染、革兰氏阴性细菌感染、革兰氏阳性细菌感染和免疫抑制。
[0316] 35.根据项目1至34中任一项所述的方法，其中所述受试者患有脓毒症。
[0317] 36.根据项目1至35中任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫抑制的受试者，例如患有人免疫缺陷病毒(HIV)的受试者、接受放射疗法的受试者和/或接受免疫抑制药物的受试者。
[0318] 37.根据项目1至36中任一项所述的方法，其中所述受试者患有呼吸道疾病，优选地患有下呼吸道感染。
[0319] 38.根据项目37所述的方法，其中患有所述呼吸道疾病的所述受试者的所述样品中的所述至少一种组蛋白的水平指示在7天内发生的死亡。
[0320] 39.根据项目1至38中任一项所述的方法，其中所述受试者患有尿路感染。
[0321] 40.根据项目39所述的方法，其中患有所述尿路感染的所述受试者的所述样品中的所述至少一种组蛋白的水平指示在28天内发生的死亡。
[0322] 41.根据项目1至40中任一项所述的方法，其中所述受试者患有恶性肿瘤。
[0323] 42.根据项目41所述的方法，其中患有所述恶性肿瘤的所述受试者的所述样品中的所述至少一种组蛋白的水平指示在7天内发生的死亡。
[0324] 43.根据项目1至42中任一项所述的方法，其中在所述受试者入院约12小时期间确定标志物或参数的水平。
[0325] 44.根据项目1至43中任一项所述的方法，其中所述样品是体液、血液、血浆、血清或尿液。
[0326] 45.根据项目1至44中任一项所述的方法，其中使用选自以下的方法确定所述至少一种组蛋白和/或proADM的水平：质谱(MS)、发光免疫测定(LIA)、放射免疫测定(RIA)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫测定(ELISA)、基于发光的珠阵列、基于磁珠的阵列、蛋白质微阵列测定、快速测试形式或稀有穴合物测定。
[0327] 46.根据项目45所述的方法，其中所述方法是免疫测定，且其中在均相或多相中进行测定。
[0328] 47.根据项目45或46所述的方法，其中所述方法是免疫测定，包括以下步骤：
[0329] a)将样品与以下接触
[0330] (i)对组蛋白或proADM的第一表位特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，和
[0331] (ii)对所述组蛋白或proADM的第二表位特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物；和
[0332] b)检测所述第一和第二抗体或其抗原结合片段或衍生物与所述第一组蛋白或proADM的结合。
[0333] 48.根据项目47所述的方法，其中第一或第二抗体之一被标记，而另一抗体与固相结合或能够选择性地结合固相。
[0334] 49.根据项目47或48所述的方法，其中第一抗体和第二抗体分散在液体反应混合物中存在，并且其中作为基于荧光或化学发光消光或扩增的标记系统的一部分的第一标记组分与第一抗体结合，和所述标记系统的第二标记组分与第二抗体结合，使得在两种抗体与所述至少一种组蛋白或与所述proADM的待检测的结合后，产生了允许在测量溶液中检测所得夹心复合物的可测量信号。
[0335] 50.根据项目49所述的方法，其中所述标记系统包含与荧光或化学发光染料，特别是花青类型组合的稀土穴合物或螯合物。
[0336] 51.根据项目45所述的方法，其中所述MS分析方法是反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)或平行反应监测(PRM)。
[0337] 52.根据项目1至51中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H4，并且其中至少确定了跨越根据SEQ ID NO：1的组蛋白H4的氨基酸残基22至102的序列的肽。
[0338] 53.根据项目1至52中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H4，并且其中至少确定的序列的肽选自跨越以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1的残基47至59，SEQ ID NO：1的残基68至79，SEQ ID NO：1的残基60至67，SEQ ID NO：1的残基22至30，SEQ ID NO：1的残基67至78，SEQ ID NO：1的残基92至102，SEQ ID NO：1的残基22至34，SEQ ID NO：1的残基46至102，SEQ ID NO：1的残基46至55，SEQ ID NO：1的残基80至91，SEQ ID NO：1的残基24至35，和SEQ ID NO：1的残基68至77。
[0339] 54.根据项目1至53中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H2A，并且其中至少确定了跨越根据SEQ ID NO：2的组蛋白H2A的氨基酸残基20至118的序列的肽。
[0340] 55.根据项目1至54中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H2A，并且其中至少确定的序列的肽选自跨越以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的残基21至53，SEQ ID NO：2的残基21至29，SEQ ID NO：2的残基30至53，SEQ ID NO：2的残基120至129，SEQ ID NO：2的残基21至29，SEQ ID NO：2的残基82至88，SEQ ID NO：2的残基89至95，以及SEQ ID NO：2的残基100至118。
[0341] 56.根据项目1至55中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H3，并且其中至少测定了跨越根据SEQ ID NO：3的组蛋白H3的氨基酸残基27至62的序列的肽。
[0342] 57.根据项目1至56中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H3，并且其中至少测定跨越SEQ ID NO：3的氨基酸残基27至37和/或跨越SEQ ID NO：3的氨基酸残基52至62的序列的肽。
[0343] 58.根据项目1至57中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H2B，并且其中至少测定了跨越根据SEQ ID NO：4的组蛋白H2B的氨基酸残基41至69的序列的肽。
[0344] 59.根据项目1至59中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H2A，并且其中至少测定选自SEQ ID NO：7、8、9和10的肽或其片段。
[0345] 60.根据项目1至59中任一项所述的方法，其中所述至少一种组蛋白是组蛋白H4，并且其中至少测定选自SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16的肽或其片段。
[0346] 61.一种用于执行根据项目1至60中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括
[0347] (i)用于测定所述受试者的所述样品中至少一种组蛋白的所述水平的检测试剂，和
[0348] 参考数据，其包括至少一种组蛋白的所述参考水平，并且其中与所述至少一种组蛋白的参考水平相比，所述受试者的所述样品中所述至少一种组蛋白的水平增加指示所述受试者的不良事件；和/或
[0349] (ii)用于确定所述受试者的所述样品中所述proADM水平的检测试剂，和
[0350] 包括所述proADM的参考水平的参考数据，并且
[0351] 其中与所述proADM的参考水平相比，所述受试者的所述样品中proADM的水平增加指示所述受试者的不良事件。
[0352] 62.一种用于执行根据项目1至29中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于测定所述受试者的所述样品中所述proADM水平的检测试剂，和包括所述proADM参考水平的参考数据，并且其中与所述proADM的参考水平相比，所述受试者的所述样品中proADM水平的降低或类似的proADM水平表明所述受试者的不良事件未发生，优选地在约28天内未发生。
[0353] 63.根据项目61或62所述的试剂盒在项目1至60中任一项的方法中的用途。
[0354] 64.根据项目63的试剂盒用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或危险分层的用途，
[0355] (i)其中在所述受试者的所述样品中确定至少一种组蛋白的所述水平，
[0356] 其中将所述至少一种组蛋白的所述水平与至少一种组蛋白的所述参考水平进行比较，和
[0357] 其中，基于所述样品中测定的至少一种组蛋白的所述水平与至少一种组蛋白的所述参考水平的比较，鉴定所述受试者的所述不良事件；和/或
[0358] (ii)其中在所述受试者的所述样品中测定proADM的所述水平，
[0359] 其中将所述proADM的水平与proADM的所述参考水平进行比较，和
[0360] 其中基于所述样品中测定的所述proADM的水平与所述proADM的参考水平的比较来鉴定所述受试者的所述不良事件。
[0361] 65.试剂盒用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或危险分层的用途，[0362] (i)其中所述试剂盒包括用于测定受试者的样品中至少一种组蛋白的水平的检测试剂，和
[0363] 其中所述至少一种组蛋白的水平指示所述受试者的所述不良事件；和/或
[0364] (ii)其中所述试剂盒包含用于测定受试者样品中proADM水平的检测试剂，和[0365] 其中所述proADM的水平指示所述受试者的所述不良事件。
[0366] 在优选的实施方案中，本发明还涉及以下项目。
[0367] 1.用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或风险分层的方法，其中所述方法包括
[0368] 测定所述受试者样品中的肾上腺髓质素原(proADM)水平，并且其中所述proADM水平指示所述受试者的所述不良事件。
[0369] 2.根据项目1所述的方法，其中
[0370] 将proADM的所述水平与proADM的参考水平进行比较；和
[0371] 其中基于所述比较鉴定所述受试者中的所述不良事件。
[0372] 3.根据项目1或2所述的方法，
[0373] 其中与所述proADM的所述参考水平相比，所述受试者的所述proADM的水平降低或水平较低或水平相同表明未发生不良事件，优选在约28天内未发生；或
[0374] 其中与proADM的参考水平相比，proADM水平的增加或proADM水平较高指示所述受试者的所述不良事件，其中优选地所述不良事件在28天内发生。
[0375] 4.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中proADM的参考水平为约0.7nmol/L至约2.0nmol/L，优选约0.8nmol/L至约1.9nmol/L。
[0376] 5.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中所述不良事件是死亡。
[0377] 6.根据权利项目5所述的方法，其中高于约0.9nmol/L、优选高于约1.9nmol/L、更优选高于约2.0nmol/L的proADM水平指示受试者在约28天内不存活。
[0378] 7.根据项目1或2任一项所述的方法，其中低于约1.0nmol/L、优选低于约0.9nmol/L、最优选低于约0.88nmol/L的proADM水平指示受试者在约28天内存活。
[0379] 8.根据项目1至7中任一项所述的方法，其中进一步确定所述受试者的序贯器官衰竭评估评分(SOFA评分)。
[0380] 9.根据项目2至5中任一项所述的方法，其中
[0381] 对于症状相当于SOFA评分≤6的受试者，proADM的参考水平为约1.8nmol/L；
[0382] 对于症状相当于SOFA评分为7-12的受试者，proADM的参考水平为约3.2nmol/L；或[0383] 对于症状相当于SOFA评分≥13的受试者，proADM的参考水平为约5.5nmol/L。
[0384] 10.根据项目1至5或9中任一项所述的方法，其中
[0385] 与proADM的参考水平约1.8nmol/L和所述受试者的SOFA评分≤6相比，所述受试者的proADM水平的降低或相同水平表明所述不良事件未发生；
[0386] 与proADM的参考水平约3.2nmol/L和所述受试者的SOFA评分7至12相比，所述受试者的proADM水平的降低或相同水平表明所述不良事件未发生；或者
[0387] 与proADM的参考水平约5.6nmol/L和所述受试者的SOFA评分≥13相比，所述受试者的proADM水平的降低或相同水平表明所述不良事件未发生；和
[0388] 其中优选地所述不良事件在约28天内未发生。
[0389] 11.根据项目1至5或9中任一项所述的方法，其中
[0390] 所述受试者的proADM水平与约1.8nmol/L的proADM的参考水平相比的提高并且所述受试者的SOFA评分≤6表示所述受试者的所述不良事件；
[0391] 所述受试者的proADM水平与约3.2nmol/L的proADM的参考水平相比的提高并且所述受试者的SOFA评分为7-12表示所述受试者的所述不良事件；或
[0392] 所述受试者的proADM水平与约5.6nmol/L的proADM的参考水平相比的提高并且所述受试者的SOFA评分≥13表示所述受试者的所述不良事件，
[0393] 其中优选地所述不良事件在约28天内发生。
[0394] 12.根据项目8至11中任一项所述的方法，其中基于所述受试者的proADM水平增加SOFA评分，并且其中所述改变的SOFA评分指示所述不良事件。
[0395] 13.根据项目12所述的方法，其中如果受试者具有高于约1.8nmol/L的proADM水平，则受试者的SOFA评分增加1。
[0396] 14.根据项目3至5和9至13中任一项所述的方法，其中所述proADM的水平的增加为所述proADM的参考水平的约两倍高。
[0397] 15.根据项目1至14中任一项所述的方法，其中所述proADM是中区肾上腺髓质素原(MR-proADM)或成熟ADM。
[0398] 16.根据项目1至15中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述proADM水平指示所述受试者在28天内发生的所述不良事件，优选地死亡。
[0399] 17.根据项目1至16中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定所述受试者的至少一种标志物和/或参数，所述标志物和/或参数选自至少一种组蛋白的水平、所述样品中降钙素原(PCT)的水平、简化急性生理学评分(SAPSII评分)、所述受试者的急性生理学和慢性健康评估II(APACHE II)评分、所述受试者的肺炎严重程度指数(PSI)评分和所述受试者的CURB-65评分。
[0400] 18.根据项目17所述的方法，其中在所述受试者入院约12小时期间确定标志物或参数的水平。
[0401] 19.根据项目1至18中任一项所述的方法，其中在所述受试者入院约12小时期间确定proADM的水平。
[0402] 20.根据项目1至19中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定所述受试者的所述proADM水平和SOFA评分。
[0403] 21.根据项目1至20中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或医学病症。
[0404] 22.根据项目1至21中任一项所述的方法，其中所述受试者是重症患者，优选地其中所述受试者被送入重症监护室或急诊室，优选地所述受试者被送入重症监护室。
[0405] 23.根据项目1至22中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或医学病症，并且其中所述疾病或医学病症选自呼吸系统疾病、尿路感染、与感染性和非感染性病因相关的炎症反应、全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症、严重脓毒症、脓毒症性休克、器官衰竭、心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、肝病、肾病、免疫减弱、病毒感染、真菌感染、细菌感染、革兰氏阴性细菌感染、革兰氏阳性细菌感染和免疫抑制。
[0406] 24.根据项目1至23中任一项所述的方法，其中所述受试者患有脓毒症。
[0407] 25.根据项目1至24中任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫抑制的受试者，例如患有人免疫缺陷病毒(HIV)的受试者、接受放射疗法的受试者和/或接受免疫抑制药物的受试者。
[0408] 26.根据项目1至25中任一项所述的方法，其中所述样品是体液、血液、血浆、血清或尿液。
[0409] 27.根据项目1至26中任一项所述的方法，其中使用选自以下的方法确定所述proADM的水平：质谱(MS)、发光免疫测定(LIA)、放射免疫测定(RIA)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫测定(ELISA)、基于发光的珠阵列、基于磁珠的阵列、蛋白质微阵列测定、快速测试形式或稀有穴合物测定。
[0410] 28.根据项目27所述的方法，其中所述方法是免疫测定，且其中在均相或多相中进行测定。
[0411] 29.根据项目28所述的方法，其中所述方法是免疫测定，包括以下步骤：
[0412] a)将样品与以下接触
[0413] (i)对proADM的第一表位特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，和[0414] (ii)对所述proADM的第二表位特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物；和[0415] b)检测所述第一和第二抗体或其抗原结合片段或衍生物与所述proADM的结合。
[0416] 30.根据项目29所述的方法，其中第一或第二抗体之一被标记，而另一抗体与固相结合或能够选择性地结合固相。
[0417] 31.根据项目29或30所述的方法，其中第一抗体和第二抗体分散在液体反应混合物中存在，并且其中作为基于荧光或化学发光消光或扩增的标记系统的一部分的第一标记组分与第一抗体结合，和所述标记系统的第二标记组分与第二抗体结合，使得在两种抗体与所述proADM的待检测的结合后，产生了允许在测量溶液中检测所得夹心复合物的可测量信号。
[0418] 32.根据项目31所述的方法，其中所述标记系统包含与荧光或化学发光染料，特别是花青类型组合的稀土穴合物或螯合物。
[0419] 33.一种用于执行根据项目1至32中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于确定所述受试者的所述样品中所述proADM水平的检测试剂，和包括所述proADM参考水平的参考数据，并且其中与所述proADM的参考水平相比，所述受试者的所述样品中proADM水平的增加指示所述受试者的不良事件。
[0420] 34.一种用于执行根据项目1至32中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于测定所述受试者的所述样品中所述proADM水平的检测试剂，和包括所述proADM参考水平的参考数据，并且其中与所述proADM的参考水平相比，所述受试者的所述样品中proADM水平的降低或类似的proADM水平表明所述受试者的不良事件在约28天内未发生。
[0421] 35.根据项目33或34所述的试剂盒在项目1至29中任一项的方法中的用途。
[0422] 36.根据项目33或34所述的试剂盒用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或危险分层的用途，
[0423] 其中在所述受试者的所述样品中测定proADM的所述水平，
[0424] 其中将所述proADM的水平与proADM的所述参考水平进行比较，和
[0425] 其中基于所述样品中测定的所述proADM的水平与所述proADM的参考水平的比较来鉴定所述受试者的所述不良事件。
[0426] 37.试剂盒用于受试者的不良事件的诊断、预后、风险评估和/或危险分层的用途，[0427] 其中所述试剂盒包含用于测定受试者样品中proADM水平的检测试剂，和
[0428] 其中所述proADM的水平指示所述受试者的所述不良事件。
[0429] 38.根据项目2至32中任一项所述的方法，其中所述比较在计算机系统中进行。
[0430] 39.根据项目1至32所述的方法，其中确定的proADM值用于计算指示受试者中不良事件的所述诊断、预后、风险评估和/或风险分层的评分。
[0431] 40.根据项目40所述的方法，其中另外，所述受试者的至少一种另外的标志物和/或参数用于计算所述评分。
[0432] 41.根据项目40所述的方法，其中所述受试者的至少一种另外的标志物和/或参数选自至少一种组蛋白的水平、所述样品中降钙素原(PCT)的水平、简化急性生理学评分(SAPSII评分)、所述受试者的急性生理学和慢性健康评估II(APACHE II)评分、所述受试者的肺炎严重程度指数(PSI)评分和所述受试者的CURB-65评分。
[0433] 如这里所使用的，术语“包括”和“包含”或其语法变体应被视为至少指定所述的特征、整数、步骤或组件，但不排除添加一个或多个附加特征、整数、步骤、组件或其组。该术语涵盖术语“由...组成”和“基本上由......组成”，二者被理解为仅指定所述的特征、整数、步骤或组件以排除任何附加特征。
[0434] 因此，术语“包含”/“包括”/“具有”意味着可能/可以存在任何其他组分(或同样地特征、整数、步骤等)。
[0435] 术语“由......组成”是指不存在其他组分(或同样地特征、整数、步骤等)。
[0436] 当在本文中使用时，术语“基本上由......组成”或其语法变体应被视为指定所述的特征、整数、步骤或组件，但不排除添加一个或多个附加的特征、整数、步骤、组件或其组，但仅当附加的特征、整数、步骤、组件或其组不会实质上改变所要求保护的组合物、装置或方法的基本和新颖特征时。
[0437] 因此，术语“基本上由......组成”是指可以存在那些特定的其他组分(或同样地特征、整数、步骤等)，即那些实质上不影响组合物、装置或方法的基本特征的组分。换句话说，术语“基本上由......组成”(其在本文中可与术语“基本上包含”互换使用)允许除了强制性组分(或同样地特征、整数、步骤等)之外在组合物、装置或方法中存在其他组分，只要该装置或方法的基本特征不受其他组分的存在的实质性影响。
[0438] 术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、生物和生物物理领域的从业者已知的方式、手段、技术和程序，或者通过化学、生物和生物物理领域的从业者从已知方式、手段、技术和程序容易地开发的方式、手段、技术和程序。
[0439] 术语“约”优选地表示指示数值的±10％，更优选指示数值的±5％，特别是指示的精确数值。
[0440] 如本文所用，术语“约”是指指示数值的±10％，特别是指示数值的±5％。每当使用术语“约”时，还包括对指示的精确数值的特定参考。如果术语“约”与以整数量化的参数结合使用，例如给定核酸中的核苷酸数，则对应于指示数值的±10％或±5％的数字应为四舍五入到最接近的整数。例如，表述“约25个氨基酸”是指23至28个氨基酸的范围，特别是24至26个氨基酸的范围，并且优选地是指25个氨基酸的特定值。
[0441] 诊断和/或预后测试的灵敏度和特异性不仅取决于测试的分析“质量”，它们还取决于构成异常结果的定义。在实践中，接收者操作特征曲线(ROC曲线)通常通过绘制变量的值与其在“正常”(即显然健康的没有产前病症或病症的个体)和“疾病”群体中的相对频率的关系来计算，“疾病”群体例如经历/具有/患有不良事件例如死亡的受试者。对于任何特定标志物(如MR-proADM)，具有和不具有疾病/病症的受试者的标志物水平的分布可能重叠。在这样的条件下，测试并不以准确度为100％完全区分正常与疾病，并且重叠区域可能表明测试无法区分正常与疾病。选择阈值，低于该阈值，测试被认为是异常的，高于该阈值，测试被认为是正常的，或低于或高于该阈值，测试表明特定病症，例如异常事件。ROC曲线下面积是感知测量值允许正确识别条件的概率的度量。即使测试结果不一定能给出准确数字，也可以使用ROC曲线。只要可以对结果进行排名，就可以创建ROC曲线。例如，可以根据程度对“疾病”样品(不良事件)的测试结果进行排名(例如，1＝低，2＝正常，和3＝高)。该排名可以与“正常”群体中的结果相关联，并且创建ROC曲线。这些方法在本领域中是众所周知的；参见，例如，Hanley等1982.Radiology 143:29-36。优选地，选择阈值以提供大于约0.5、更优选大于约0.7、还更优选大于约0.8、甚至更优选大于约0.85、最优选大于约0.9的ROC曲线面积。在该上下文中，术语“约”是指给定测量的+/-5％。
[0442] ROC曲线的横轴表示(1-特异性)，其随着假阳性的比率而增加。曲线的垂直轴表示灵敏度，其随着真阳性的比率而增加。因此，对于所选择的特定截止值，可以确定(1-特异性)的值，并且可以获得相应的灵敏度。ROC曲线下面积是测量的标志物水平允许正确识别不良事件，特别是死亡的概率的量度。因此，ROC曲线下面积可用于确定测试的有效性。
[0443] 在其他实施方案中，阳性似然比、阴性似然比、优势比或风险比用作测试预测风险或诊断病症或病症(不良结果)即“患病组”的能力的量度。在阳性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组中受试者中阳性结果同样可能；大于1的值表示在患病组中阳性结果更可能；并且小于1的值表示阳性结果在对照组中更可能。在阴性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组中受试者中的阴性结果同样可能；大于1的值表示测试组中阴性结果更可能；并且小于1的值表示阴性结果在对照组中更可能。
[0444] 在优势比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组中受试者中阳性结果同样可能；大于1的值表示在患病组中阳性结果更可能；并且小于1的值表示阳性结果在对照组中更可能。
[0445] 在风险比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组中终点(例如死亡)的相对风险相等；大于1的值表示患病组的风险更大；并且小于1的值表示对照组中的风险更大。
[0446] 技术人员将理解，将诊断或预后指标与诊断或未来临床结果的预后风险相关联是统计分析。例如，低于X的标志物水平可以表示患者比具有大于或等于X的水平的患者更可能患有不良事件/结果，如通过统计学显著性水平所确定的。另外，标志物浓度从基线水平的变化可以反映患者的预后，并且标志物水平的变化程度可以与不良事件的严重性相关。通常通过比较两个或更多个群体并确定置信区间和/或p值来确定统计显著性；参见，例如，Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York，1983。本发明优选的置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值为
0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
[0447] 除非另有说明，否则使用已建立的重组基因技术方法，例如，在Sambrook，Russell“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)中所述，其以全文通过引用并入本文中。
[0448] 通过参考以下非限制性图进一步描述本发明。
[0449] 图1：28天死亡率预测的Kaplan Meier分析
[0450] 图2：28天时识别非幸存者的AUROC分析(整个组)
[0451] 图3：根据三个严重程度组中的生物标志物水平，在28天时识别非幸存者的AUROC分析。
[0452] 图4：根据SOFA评分在28天时识别非幸存者的AUROC分析。
[0453] 通过参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
[0454] 实施例1
[0455] 方法
[0456] 研究群体
[0457] 从2013年6月1日至2014年6月14日收治到‘centre hospitalier universitaire(CHU)de Dijon Bourgogne’的内科重症监护病房的237位危重患者连续纳入临床研究中。年龄小于18岁的患者被排除在外。该研究得到了当地机构审查委员会的批准。在纳入之前，从患者本人或患者的近亲获得书面知情同意书。所有患者均表现出广泛的疾病，包括心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、呼吸系统疾病、肝病、肾病和免疫减弱，并出院或在医院死亡前进行监测。根据医疗记录、成像和微生物学结果的回顾性研究，两名独立医生根据国际标准化标准将入院当天的患者分类为非脓毒症(全身炎症反应综合征(SIRS))或无SIRS、严重脓毒症或脓毒症性休克(Bone,Balk等人1992)。在入院当天，即在最初的24小时内采集血样。
记录基线人口统计学和临床数据，包括病史、体检结果、常规血液分析(如血培养)、非实验室诊断检查(如SIRS标准、器官衰竭标准)、治疗干预(如机械通气(MV)、血管加压剂和肾脏替代疗法(RRT))以及结果参数(例如停留时间、所有原因死亡率)。入院时计算序贯器官衰竭评估(SOFA)评分(根据6个器官参数)以及简化急性生理评分(SAPS II)(根据17个主要生理变量)(Le Gall,Lemeshow等人1993；Vincent,Moreno等人1996)。
记录基线人口统计学和临床数据，包括病史、体检结果、常规血液分析(如血培养)、非实验室诊断检查(如SIRS标准、器官衰竭标准)、治疗干预(如机械通气(MV)、血管加压剂和肾脏替代疗法(RRT))以及结果参数(例如停留时间、所有原因死亡率)。入院时计算序贯器官衰竭评估(SOFA)评分(根据6个器官参数)以及简化急性生理评分(SAPS II)(根据17个主要生理变量)(Le Gall,Lemeshow等人1993；Vincent,Moreno等人1996)。
[0458] 生物标志物
[0459] 使用来自Roche Diagnostics(法国Meylan)的e501模块分析仪通过比色测定法测量血清乳酸盐水平。乳酸盐的参考限为0.5-2.2mmol/L。
[0460] 使用超敏感测定法例如KRYPTOR随机存取分析仪，测定血浆样品中的MR-proADM(中区肾上腺髓质素原)、和肽素和PCT(降钙素原)水平(Thermo Scientific B·R·A·H·M·S)。通过例如如下所述的选择反应监测或多反应监测(SRM/MRM)测定，在血浆样品中测定组蛋白H2A、H2B、H3和H4的水平以及醛缩酶B的水平。通过LC-MS/MS技术(TSQ Quantiva质谱仪(MS)；ThermoFisher Scientific)测量衍生自标志物的特定肽。发现每种肽的鉴定的肽序列及其碎片化离子(所谓的跃迁)是监测血液样品中标志物蛋白质水平的有用替代物。对可以同位素重标记的合成肽进行优化。关于信噪比选择最佳肽。对于每种肽，分别设置最佳保留时间和至少4个最好的跃迁。
[0461] 肽和跃迁的示例性MS定量和选择
[0462] 将5μL每种临床血浆样品加入到20μL的8M尿素/2.5％正丙醇/300mM Tris/10mM DTT pH 8.5中，并在37℃下温育1小时。将在1M碳酸氢铵中制备的500mM碘乙酸加入到每个样品孔中，并在黑暗中在室温下温育1小时。向每个孔中加入113uL的50mM Tris/5mM CaCl2 pH 8.0。将胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific)用150μL的25mM乙酸再水化，以1:10(总蛋白质含量：蛋白酶)的比例加入并在37℃下温育20小时。最后用另外的2uL甲酸淬灭消化。然后在注射前加入胰高血糖素(1ng/uL)和标准重肽。
[0463] SRM测定在连接HPLC Ultimate 3000的三重四极杆质谱仪TSQ Quantiva(Thermo Fisher Scientific)上开发。反相分离在从5至40％B的20min线性梯度中进行，总运行时间为40分钟(溶剂A：水0.2％FA，溶剂B：ACN 0.2％FA)。线性梯度期间的流速设定为240μL/min。对于所有样品和曲线上的点，总注射体积为160μL。在50℃的温度下运行150mm×2.1mm Accucore aQ柱(ThermoFisher Scientific)。
[0464] 对重标记的合成肽进行优化，掺入13C-和15N-标记的精氨酸或赖氨酸(ThermoFisher Scientific或New England Peptide)。对于每个跃迁都自动测试各个仪器参数，如碰撞能量、镜筒透镜和停留时间。在多次迭代之后，优化的肽和跃迁的列表(即最高强度信号和与其他跃迁的最小重叠)和相应的保留时间最终为每个选择的肽至少四个碎片跃迁。
[0465] 通过在色谱分离中共洗脱轻和重标记的跃迁来鉴定肽。Pinpoint(Thermo Fisher Scientific)和Skyline(MacCoss Lab)软件用于时间比对、跃迁的相对定量和靶向蛋白定量。
[0466] 通过采用如下所述的示例性方法进行标志物的相对和绝对定量。
[0467] 相对定量：
[0468] 1.通过比较生物样品中检测到的给定肽的SRM特征峰面积与在至少两个、三个、四个或更多生物样品中相同片段肽的相同SRM特征峰面积来确定标志物的存在的增加或减少。
[0469] 2.通过比较生物样品中检测到的给定肽的SRM特征峰面积与在来自不同和单独生物来源的其他样品中来自其他蛋白质的片段肽产生的SRM特征峰面积，确定标志物的存在的增加或减少，其中2个样品之间的肽片段的SRM标记峰面积比较对于每个样品中分析的蛋白质的量归一化。
[0470] 3.通过比较给定肽的SRM特征峰面积与来源于同一生物样品中不同蛋白质的其他片段肽的SRM特征峰面积来确定标志物的存在的增加或减少，以便将标志物的变化水平对于在各种细胞条件下不改变其表达水平的其他蛋白质的水平归一化。
[0471] 4.将这些测定应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，例如组蛋白蛋白质，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙酰化、甲基化(单、二、三)、瓜氨酸化、泛素化并且其中以与确定未修饰肽的相对量相同的方式确定修饰肽的相对水平。
[0472] 给定肽的绝对定量：
[0473] 将来自单个生物样品中的标志物的给定片段肽的SRM/MRM特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白质裂解物的内部片段肽标准的SRM/MRM特征峰面积进行比较。
[0474] 所述内标是来自被询问的标志物蛋白的片段肽的标记合成形式或标记的重组蛋白。将该标准品在消化之前或消化后加入已知量的样品中，并且分别测定生物样品中内部片段肽标准品和天然片段肽二者的SRM/MRM特征峰面积，然后比较两个峰面积。
[0475] 这种测定应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙酰化、甲基化(单、二、三甲基化)、瓜氨酸化、泛素化并且其中以与确定未修饰肽的绝对量相同的方式确定修饰肽的绝对水平。
[0476] 还通过免疫测定法测量组蛋白H4。组蛋白H4免疫测定(H4 IA)由以下组成：与MagPlex-C Micropheres(Luminex，Austin Texas)偶联的针对合成肽(SEQ ID NO：1的氨基酸46-56)的小鼠单克隆抗体和针对合成肽(SEQ ID NO 1的氨基酸67-78)的生物素化的绵羊多克隆抗体(pAb)。合成肽(SEQ ID NO：1的氨基酸46-102)用作标准物质。在具有xPonent 4.2 System(Luminex，Austin Texas)的MAgPix上测量样品。使用来自JMP-12(SAS统计软件，UK)的5参数逻辑回归分析数据。
[0477] 统计分析
[0478] 所有分析均使用软件R 3.0.2进行。
[0479] 数据表示为括号中的中位数和四分位数范围[IQR]。
[0480] 由于所有分析的生物标志物显示高度右倾的分布，因此在包含到回归模型之前对值进行log10变换，以减少极值对模型拟合的影响。
[0481] 低于定量限(LoQ)的值被低于LoQ的小值替换。丢失的值没有被替换。每个模型包括所有患者，其具有模型中所有变量的完整数据。
[0482] P值<0.05被认为是显著的。
[0483] 对于生存分析，在ICU入院后3、7或28天(最大随访期(FUP))酌情进行随访。在评估的FUP之前失去随访的患者(即由于早期出院或重新安置到不同的病房)在他们最后一次就诊ICU时被检查。在最大FUP存活的患者在这一天被检查。对于时间依赖性结果变量，使用Cox回归模型。显示的结果是似然比-χ2测试(L.R.χ2和p值)、C指数(Harrel)和标准化风险比(HR)。本文中的危害比是指生物标志物水平的两倍变化(生物标志物的上四分位数与下四分位数)。在调整后的模型中，调整变量包含在模型中，以确定生物标志物对模型性能的额外影响。
[0484] 结果
[0485] 研究人群包括237名患者。由于死亡率数据的记录相互矛盾，必须将两名患者(一名没有SIRS的患者，一名脓毒症患者)排除在分析之外。172名患者(73％)出现严重脓毒症或败血性休克，15名患者(6％)患有SIRS，49名患者(21％)患有SIRS。中位年龄为67[59-77岁]岁。大多数患者为男性(60％)。最常见的潜在病症是心血管疾病(35％)、糖尿病(31％)和恶性肿瘤(27％)，其次是呼吸系统疾病(16％)、肝脏疾病(12％)、肾脏疾病(12％)和免疫减弱(7％)。最常见的感染部位是下呼吸道(46％)和泌尿道(45％)。入院时SAPS II评分(56[40-69分])和SOFA评分(9[6-12分]分)增加。器官衰竭最常见于呼吸衰竭(61％)、循环休克(56％)和肾衰竭(41％)。因此，许多患者在ICU住院期间需要MV(78％)、血管加压药(68％)和RRT(37％)。所有原因ICU死亡率为32％，ICU住院时间中位数为5.4[2.5-10.6]天。
[0486] 我们使用针对年龄和性别进行调整的单变量和双变量Cox回归模型分析了所有235名重症患者的短期(例如在第3天和第7天即3天和7天)和长期(在第28天即28天)死亡率。入住ICU后截至第3天有23名患者(10％)死亡，第7天有49名患者(21％)死亡，第28天有
74名患者(32％)死亡。此外，使用针对年龄和性别调整的单变量Cox回归模型，在下呼吸道感染、尿路感染(UTI)和恶性肿瘤患者的亚群中分析死亡率。ICU入院后109名下呼吸道感染患者中有27名患者(25％)在第7天死亡，94名UTI患者中34名患者(36％)在第28天死亡，64名恶性肿瘤患者中有16名患者(25％)在第7天死亡。每个Cox回归模型区分幸存者和非幸存者的能力反映在C指数范围从0到1，最佳预测Cox回归模型导致C指数接近1。另外，HR计算为HR>0表示预后较差，HR<0表示变量的保护作用。
74名患者(32％)死亡。此外，使用针对年龄和性别调整的单变量Cox回归模型，在下呼吸道感染、尿路感染(UTI)和恶性肿瘤患者的亚群中分析死亡率。ICU入院后109名下呼吸道感染患者中有27名患者(25％)在第7天死亡，94名UTI患者中34名患者(36％)在第28天死亡，64名恶性肿瘤患者中有16名患者(25％)在第7天死亡。每个Cox回归模型区分幸存者和非幸存者的能力反映在C指数范围从0到1，最佳预测Cox回归模型导致C指数接近1。另外，HR计算为HR>0表示预后较差，HR<0表示变量的保护作用。
[0487] 在所有分析变量中，在所有235名重症患者中，ICU入院时的SAPS II评分显示在3天(C指数0.876，HR/IQR 8.42)、7天(C指数0.809，HR/IQR 5.15)和28天(C指数0.776，HR/IQR 4.19)死亡率的最佳预测，然后是ICU入院时的SOFA评分预测3天(C指数0.866，HR/IQR 6.68)和7天死亡率(C指数0.778，HR/IQR 3.82)(表1-表3)。在脓毒症患者亚组中获得了类似的结果，并且对于SAPS II评分预测下呼吸道感染的危重患者的7天死亡率(C指数0.773，HR/IQR 3.47)(表4)。
[0488] 相比之下，MR-proADM在所有重症患者ICU入院后第7天(C指数0.769，HR/IQR 4.53)和第28天(C指数0.765，HR/IQR 4.86)在所有生物标志物中最佳区分幸存者和非幸存者(表2、表3)。在预测所有重症患者的28d死亡率方面，它优于SOFA评分(表3)。在脓毒症患者亚组中获得了类似的结果。在双变量分析中，在所有重症患者中，MR-proADM改善了用于预测7天死亡率的SAPS II或SOFA的性能(SAPS II和MR-proADM联合模型的C指数0.832相比单独SAPS II的C指数0.809)和用于预测28天死亡率的SAPS II的性能(SAPS II和MR-proADM联合模型的C指数0.810相比单独SAPS II的C指数0.776)(表2,表3)。在SAPS II或SOFA和MR-proADM的联合模型中，预测这些患者的3天死亡率没有改善的预后价值(表1)。
[0489] 与其他生物标志物和评分相比，PCT(例如C指数0.689，HR/IQR 1.90，用于预测所有重症患者28天死亡率)和醛缩酶B(例如C指数0.667，HR/IQR 1.47，用于预测所有重症患者28天死亡率)在ICU入院时表现出与所有重症患者或其亚组的死亡率中度关联(例如表1)。然而，在双变量Cox回归模型中，PCT改善了SAPS II或SOFA的预后价值，用于预测所有重症患者的28天死亡率(例如SAPS II和PCT的组合模型导致C指数为0.786，相比在单变量分析中SAPS II为0.776)(例如表3)。此外，包含醛缩酶B的双变量Cox回归模型改善了MR-proADM与所有重症患者的7天死亡率的关联(MR-proADM和醛缩酶B的组合模型C指数为
0.780，相比MR-proADM的单变量模型C指数为0.769)(表2)。在其他死亡率分析中，PCT或醛缩酶B对SAPS II、MR-proADM或组蛋白，预测没有进一步改善(表1-表3)。
0.780，相比MR-proADM的单变量模型C指数为0.769)(表2)。在其他死亡率分析中，PCT或醛缩酶B对SAPS II、MR-proADM或组蛋白，预测没有进一步改善(表1-表3)。
[0490] 在所有危重患者中，ICU入院时组蛋白H2A、H2B、H3和H4的水平强关联于3天(例如H2B C指数0.793，HR/IQR 2.76)、7天(例如H2B C指数0.768，HR/IQR 2.40)和28天(例如H2B C指数0.752，HR/IQR 2.40)死亡率(表1-表3)。在脓毒症患者亚组中获得了类似的结果。在所有组蛋白中，H2B表现最佳，其次是H4、H2A和H3(表1-表6)。比较组蛋白H2A、H2B、H3和H4与其他生物标志物的性能，组蛋白对短期(3和7天)死亡率有显著的预后价值，即虽然H2B可能在预测28天死亡率时不如MR-proADM(MR-proADM C指数0.765对H2B C指数0.752)。H2B和MR-proADM与7天死亡率比较地相关联(H2B C指数0.793对MR-proADM C指数0.786)，在所有重症患者中H2B优于MR-proADM预测3天死亡率(H2B C指数0.768对MR-proADM C指数0.769)(表1-表3)。
[0491] 在双变量Cox回归模型中，组蛋白H2A、H2B、H3和H4改善了SAPS II或SOFA(例如，对于预测28天死亡率，与SAPS II的单变量模型C指数0.776相比，H2B和SAPS II的组合模型C指数为0.811)和MR-proADM(对于预测28天死亡率，H2B和MR-proADM的组合模型C指数0.795与MR-proADM的单变量模型C指数0.765相比)的性能(表1-表3)。在患有下呼吸道感染的重症患者中，ICU入院时的组蛋白H2A、H2B、H3和H4是生物标志物中7天死亡率的最佳预测因子(例如H2B C指数0.785，HR/IQR 2.56)(表4)。在患有UTI的重症患者中，组蛋白H2A、H2B、H3和H4与ICU入院时所有变量中的28天死亡率最强相关(例如H2B C指数0.764，HR/IQR 2.52)(表5)。ICU入院时的组蛋白H2A、H2B、H3和H4与入住ICU的恶性肿瘤重症患者的所有变量中7天死亡率最显著相关(例如H2B C指数0.815，HR/IQR 4.79)(表6)。
[0492] 表1：所有重症患者3天死亡率的单和双变量Cox回归分析
[0493] ICU入院后第3天，235名重症患者的总数(n)的24名患者死亡(事件)。在ICU入院时测量的评分或生物标志物包括在模型中。所有单变量或双变量模型都根据年龄和性别进行调整。自由度(df)反映了包含的变量和调整的数量。显示的结果是似然比-χ2测试(L.R.χ2和p值)、C指数(Harrel)和标准化风险比(HR)加上95％置信区间(CI)，每个四分位距(IQR)或2倍变化。(SAPS II：简化急性生理学评分II；SOFA：序贯器官衰竭评估；MR-proADM：中区肾上腺髓质素；PCT：降钙素原；组蛋白由组蛋白H2A、H2B、H3和H4代表；H4也通过免疫测定法测定(IA))。
[0494] 表1
[0495]
[0496]
[0497]
[0498] 表2：所有重症患者7天死亡率的单和双变量Cox回归分析
[0499] ICU入院后第7天，235名重症患者的总数(n)的49名患者死亡(事件)。在ICU入院时测量的评分或生物标志物包括在模型中。所有单变量或双变量模型都根据年龄和性别进行2 2
调整。自由度(df)反映了包含的变量和调整的数量。显示的结果是似然比-χ测试(L.R.χ和p值)、C指数(Harrel)和标准化风险比(HR)加上95％置信区间(CI)，每个四分位距(IQR)或2倍变化。(SAPS II：简化急性生理学评分II；SOFA：序贯器官衰竭评估；MR-proADM：中区肾上腺髓质素；PCT：降钙素原；组蛋白由组蛋白H2A、H2B、H3和H4代表；H4也通过免疫测定法测定(IA))。
调整。自由度(df)反映了包含的变量和调整的数量。显示的结果是似然比-χ测试(L.R.χ和p值)、C指数(Harrel)和标准化风险比(HR)加上95％置信区间(CI)，每个四分位距(IQR)或2倍变化。(SAPS II：简化急性生理学评分II；SOFA：序贯器官衰竭评估；MR-proADM：中区肾上腺髓质素；PCT：降钙素原；组蛋白由组蛋白H2A、H2B、H3和H4代表；H4也通过免疫测定法测定(IA))。
[0500] 表2
[0501]
[0502]
[0503] 表3：所有重症患者28天死亡率的单和双变量Cox回归分析
[0504] ICU入院后第3天，235名重症患者的总数(n)的74名患者死亡(事件)。在ICU入院时测量的评分或生物标志物包括在模型中。所有单变量或双变量模型都根据年龄和性别进行调整。自由度(df)反映了包含的变量和调整的数量。显示的结果是似然比-χ2测试(L.R.χ2和p值)、C指数(Harrel)和标准化风险比(HR)加上95％置信区间(CI)，每个四分位距(IQR)或2倍变化。(SAPS II：简化急性生理学评分II；SOFA：序贯器官衰竭评估；MR-proADM：中区肾上腺髓质素；PCT：降钙素原；组蛋白由组蛋白H2A、H2B、H3和H4代表；H4也通过免疫测定法测定(IA))。
[0505] 表3
[0506]
[0507]
[0508] 表4：在下呼吸道感染重症患者中7天死亡率的单因素Cox回归分析
[0509] ICU入院后第7天，109名下呼吸道感染重症患者的总数(n)的27名患者死亡(事件)。在ICU入院时测量的评分或生物标志物包括在模型中。所有单变量或双变量模型都根据年龄和性别进行调整。自由度(df)反映了包含的变量和调整的数量。显示的结果是似然比-χ2测试(L.R.χ2和p值)、C指数(Harrel)和标准化风险比(HR)加上95％置信区间(CI)，每个四分位距(IQR)或2倍变化。(SAPS II：简化急性生理学评分II；SOFA：序贯器官衰竭评估；MR-proADM：中区肾上腺髓质素；PCT：降钙素原；组蛋白由组蛋白H2A、H2B、H3和H4代表；也通过免疫测定法测定(IA))。
[0510] 表4
[0511]
[0512]
[0513] 表5：在尿路感染重症患者中28天死亡率的单因素Cox回归分析
[0514] ICU入院后第28天，94名尿路感染重症患者的总数(n)的34名患者死亡(事件)。在ICU入院时测量的评分或生物标志物包括在模型中。所有单变量或双变量模型都根据年龄和性别进行调整。自由度(df)反映了包含的变量和调整的数量。显示的结果是似然比-χ2测2
试(L.R.χ和p值)、C指数(Harrel)和标准化风险比(HR)加上95％置信区间(CI)，每个四分位距(IQR)或2倍变化。(SAPS II：简化急性生理学评分II；SOFA：序贯器官衰竭评估；MR-proADM：中区肾上腺髓质素；PCT：降钙素原；组蛋白由组蛋白H2A、H2B、H3和H4代表；H4也通过免疫测定法测定(IA))。
试(L.R.χ和p值)、C指数(Harrel)和标准化风险比(HR)加上95％置信区间(CI)，每个四分位距(IQR)或2倍变化。(SAPS II：简化急性生理学评分II；SOFA：序贯器官衰竭评估；MR-proADM：中区肾上腺髓质素；PCT：降钙素原；组蛋白由组蛋白H2A、H2B、H3和H4代表；H4也通过免疫测定法测定(IA))。
[0515] 表5
[0516]
[0517]
[0518] 表6：在恶性肿瘤重症患者中7天死亡率的单因素Cox回归分析
[0519] ICU入院后第7天，64名恶性肿瘤重症患者的总数(n)的16名患者死亡(事件)。在ICU入院时测量的评分或生物标志物包括在模型中。所有单变量或双变量模型都根据年龄和性别进行调整。自由度(df)反映了包含的变量和调整的数量。显示的结果是似然比-χ2测试(L.R.χ2和p值)、C指数(Harrel)和标准化风险比(HR)加上95％置信区间(CI)，每个四分位距(IQR)或2倍变化。(SAPS II：简化急性生理学评分II；SOFA：序贯器官衰竭评估；MR-proADM：中区肾上腺髓质素；PCT：降钙素原；组蛋白由组蛋白H2A、H2B、H3和H4代表。还通过免疫测定(IA)测量H4)
[0520] 表6
[0521]
[0522]
[0523] 实施例2：肾上腺髓质素的高精确度用于具有不同疾病严重程度脓毒症的死亡率预测
[0524] 背景：近年来，新型脓毒症生物标志物的使用有所增加。然而，尚未探索其对疾病严重程度的预后价值。在这项工作中，我们检查了中间区域肾上腺髓质素(MR-proADM)预测不同程度器官衰竭的脓毒症患者死亡率与降钙素原C-反应蛋白和乳酸盐相比的能力。
[0525] 方法：这是一个双中心前瞻性观察群组，招募入住ICU的严重脓毒症或脓毒性休克患者。在入院的前12小时期间测量血浆生物标志物。通过Cox回归分析和Kaplan-Meier曲线评估生物标志物与28天死亡率之间的关联。通过序贯器官衰竭评估(SOFA)评分评估，将患者分为三组。死亡率生物标志物的准确性由接受者操作特征曲线(AUROC)下的面积分析确定。
[0526] 结果：接纳326例严重脓毒症(21.7％)或脓毒性休克(79.3％)患者，28天死亡率为31.0％。只有MR-proADM和乳酸与多变量分析中的死亡率相关：风险比(HR)：8.5vs.3.4(p<
0.001)。MR-proADM在整个群组的分析中显示了28天死亡率预测的最佳AUROC(AUROC[95％CI]:0.79[0.74-0.84])(p<0.001)。当患者按器官衰竭程度分层时，MR-proADM是唯一预测所有严重程度组死亡率的生物标志物(SOFA≤6、SOFA＝7-12和SOFA≥13),分别地AUROC[95％CI]为0.75[0.61-0.88]、0.74[0.66-0.83]和0.73[0.59-0.86](p<0.05)。所有MR-proADM浓度≤0.88nmol/L的患者存活至28天。在SOFA≤6的患者中，将MR-proADM添加到SOFA评分中增加了SOFA识别非存活者的能力，AUROC[95％CI]分别为0.70[0.58-0.82]和
0.77[0.66-0.88](两者的p<0.05)。
0.001)。MR-proADM在整个群组的分析中显示了28天死亡率预测的最佳AUROC(AUROC[95％CI]:0.79[0.74-0.84])(p<0.001)。当患者按器官衰竭程度分层时，MR-proADM是唯一预测所有严重程度组死亡率的生物标志物(SOFA≤6、SOFA＝7-12和SOFA≥13),分别地AUROC[95％CI]为0.75[0.61-0.88]、0.74[0.66-0.83]和0.73[0.59-0.86](p<0.05)。所有MR-proADM浓度≤0.88nmol/L的患者存活至28天。在SOFA≤6的患者中，将MR-proADM添加到SOFA评分中增加了SOFA识别非存活者的能力，AUROC[95％CI]分别为0.70[0.58-0.82]和
0.77[0.66-0.88](两者的p<0.05)。
[0527] 结论：脓毒症中预后生物标志物的表现受疾病严重程度的高度影响。MR-proADM预测死亡率的准确性不受器官衰竭程度的影响。因此，它是早期鉴定具有中度疾病严重程度但具有死亡风险的脓毒症患者的良好候选者。
[0528] 背景
[0529] 尽管抗生素和早期血液动力学管理有所改善，但脓毒症仍然是重症监护病房(ICU)患者的主要死亡原因。在欧洲，脓毒症发生在重病患者中取决于严重性导致在27％和54％之间的ICU死亡率[1]。在美国，疾病预防中心估计，有50万人发展脓毒症和每年20万死亡[2][3]。因此，非常需要快速诊断和评估高风险脓毒症患者，增加了开始早期和特定治疗的可能性。因此，临床严重程度评分如序贯器官衰竭评估(SOFA)评分可以发挥关键作用[4]。然而，孤立使用这些评分系统来指导决策脓毒症备受诟病[5]。用于在入院时以一系列严重程度水平早期识别脓毒症患者的标准化评估工具在帮助临床决策和优化医疗保健资源的使用方面具有显著价值。因此，在过去几十年中已经在脓毒症领域提出了许多预后生物标志物-比其他疾病多得多。大多数这些分子是激素、细胞因子或涉及炎症或凝血系统中循环的蛋白质并且可能需要大量的时间、精力和费用进行测量[6]。
[0530] 肾上腺髓质素(ADM)是一种可以作为激素的肽，在生理和感染性应激过程中由多种组织产生，具有不同的生理功能，包括血管扩张、抗炎和抗菌活性，并通过其补体活性的调节和调制进一步增强[7]。因此，ADM被认为是“激素因子(hormokine)”，其特征在于当其仅由内分泌细胞产生时在非炎性条件下的激素样行为，以及当其普遍存在超表达时在脓毒症中的细胞因子样行为。此外，外源性ADM已被证明可减少脓毒症动物模型中的急性肺损伤、血管通透性和死亡；而内源性过表达类似地改善了脓毒症结果[8][9]。循环ADM的测量由于快速降解和从循环中清除而变得复杂，并且被结合蛋白(补体因子H)进一步掩盖，妨碍其通过标准免疫测定进行检测。包含氨基酸45-92的肾上腺髓质素原(MR-proADM)的中间区域片段更稳定，直接反映了迅速降解活性ADM肽的水平[10]。MR-proADM的浓度增加已经在社区获得性肺炎(CAP)患者的血浆中被识别并且被广泛使用在病症的风险和严重程度的评估中[11][12][13]。然而，很少有数据可用于严重脓毒症和脓毒性休克患者。此外，疾病严重程度对脓毒症预后生物标志物表现的影响尚未得到适当研究。
[0531] 在本研究中，我们旨在在三种不同通过SOFA评分测量的疾病严重程度中与其他标准生物标志物(降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)和乳酸)相比评估MR-proADM水平预测脓毒症患者28天死亡率的能力。
[0532] 方法
[0533] 患者、纳入和排除标准：本研究是一项前瞻性观察由西班牙和法国的两个重症监护病房(ICU)连续招募的患者群组。年龄≥18岁并且在2013年4月至2016年1月入住ICU的成年患者在符合严重脓毒症或感染性休克标准后12小时内入组，该标准基于美国胸科医师学会/危重病急救医学共识会议协会的SEPSIS-2定义[14]。入组患者的SOFA评分也≥2，因此符合脓毒症新的SEPSIS-3定义[15]。在入住ICU之前的最后3个月，患有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者和接受放射疗法或接受免疫抑制药物(包括化学疗法或全身性类固醇)的患者被认为是免疫抑制的。排除标准是年龄<18岁、怀孕的存在、ICU入院后最初12小时内没有可用于生物标志物分析的血液样本、或缺乏知情同意。从医疗记录中记录的临床数据包括人口统计学、合并症、实验室、微生物学和生物标志物水平。通过计算序贯器官衰竭评估(SOFA)评分，在入院时评估疾病的严重程度。
[0534] 生物标志物评估
[0535] 用于生物标志物分析的血浆样品尽可能接近ICU入院时刻并且始终在最初的12小时内收集。使用新的夹心免疫测定法(Kryptor Compact Plus Analyzer，BRAHMS，Hennigsdorf，德国)，通过TRACE技术(时间分辨扩大的穴状发射技术(Time Resolved Amplified Cryptate Emission))进行血浆MR-proADM测量；检出限0.05nmol/L。PCT测量通过电化学发光免疫测定(ECLIA)在化学分析仪(Cobas 6000，Roche Diagnostics，Meylan，法国)上进行；检出限0.02ng/ml。分别通过颗粒增强免疫比浊法和比色法测定血清CRP和乳酸(e501 Module Analyzer，Roche Diagnostics，Meylan，法国)；检出限分别为0.15mg/dL和0.2mmol/L。
[0536] 统计分析
[0537] 使用分类变量的χ2检验，评估幸存者和非幸存者之间的人口统计学和临床特征的差异。学生t检验或Mann-Whitney U检验分别用于比较基于正态分布存在与否的连续变量。通过Cox回归分析评估生物标志物与死亡风险之间的关联，通过混杂变量进行调整。入住ICU后28天审查时间。ICU入院的前24小时被视为分析的第1天。在多变量分析中进一步包括在单变量回归分析中产生p<0.05的变量。对生物标志物进行对数转换以达到正态分布。通过使用Kaplan-Meier曲线和Mantel-Haenszel对数秩检验评估生物标志物对平均存活时间的影响。与Cox回归分析相似，在入住ICU后28天对时间进行审查。通过计算接受者操作特征(AUROC)曲线下的面积来评估生物标志物的死亡率的准确性和预测值。根据疾病严重程度将患者分为三组，如通过SOFA评分使用两个预定截止值评估的，一个敏感性接近90％，另一个显示特异性接近90％，用于在28天检测非存活者(图4)。使用IBM SPSS 20.0软件(SPSS，Chicago，Ill)分析数据。
[0538] 结果
[0539] 患者特征和生物标志物浓度：共有三百二十六(326)名患有严重脓毒症(21.7％)或脓毒性休克(79.3％)的患者入组，在Valladolid和Dijon的28天死亡率分别为25.5％和34.9％，两个地点的总死亡率为31.0％(表7)。中位年龄为65岁，54.3％的患者为男性。与幸存者相比，非幸存者年龄更大和SOFA评分更高就，并且脓毒性休克、机械通气、肾脏替代治疗、瘤形成、心血管疾病、慢性肾功能衰竭、免疫抑制和呼吸系统疾病的发病率增加(均p<
0.05)。无论结果如何，最常见的感染源是呼吸道和泌尿系统。取决于感染源的死亡率如下：
患有呼吸道感染的患者为37.2％，泌尿系感染患者为32.4％，腹部感染患者为28.6％，原发性或继发性菌血症患者为35.5％，其他来源感染的患者为25.6％。关于微生物鉴定，幸存者和非幸存者均表现出平衡存在的革兰氏阴性、革兰氏阳性和病毒病原体。非幸存者的真菌感染更为常见。最常见的死亡原因是多器官功能障碍综合征(n＝58；57.4％)，其次是难治性休克(n＝9，8.9％)和难治性低氧血症(n＝8，7.9％)。对21名患者应用了治疗努力限制。
与存活者相比，非存活患者的MR-proADM、PCT和乳酸浓度均显著升高(均p<0.01)，而两组的CRP水平保持相似。取决于感染源的MR-proADM的水平如下[中位数(四分位数间距)]：呼吸道感染[3.6nmol/L(5.6)]，泌尿系感染[4.6nmol/L(5.4)]，腹腔感染[4.9nmol/L(6.5)]，细菌血症[3.8nmol/L(5.1)]和其他来源的感染[3.5nmol/L(5.8)]。取决于感染微生物的MR-proADM的水平[中位数(四分位数间距)]：真菌感染[6.1nmol/L(5.6)]，革兰氏阴性细菌[4.9nmol/L(5.9)]，革兰氏阳性细菌[4.1nmol]/L(6.2)]或病毒[1.2nmol/L(3.4)]。
0.05)。无论结果如何，最常见的感染源是呼吸道和泌尿系统。取决于感染源的死亡率如下：
患有呼吸道感染的患者为37.2％，泌尿系感染患者为32.4％，腹部感染患者为28.6％，原发性或继发性菌血症患者为35.5％，其他来源感染的患者为25.6％。关于微生物鉴定，幸存者和非幸存者均表现出平衡存在的革兰氏阴性、革兰氏阳性和病毒病原体。非幸存者的真菌感染更为常见。最常见的死亡原因是多器官功能障碍综合征(n＝58；57.4％)，其次是难治性休克(n＝9，8.9％)和难治性低氧血症(n＝8，7.9％)。对21名患者应用了治疗努力限制。
与存活者相比，非存活患者的MR-proADM、PCT和乳酸浓度均显著升高(均p<0.01)，而两组的CRP水平保持相似。取决于感染源的MR-proADM的水平如下[中位数(四分位数间距)]：呼吸道感染[3.6nmol/L(5.6)]，泌尿系感染[4.6nmol/L(5.4)]，腹腔感染[4.9nmol/L(6.5)]，细菌血症[3.8nmol/L(5.1)]和其他来源的感染[3.5nmol/L(5.8)]。取决于感染微生物的MR-proADM的水平[中位数(四分位数间距)]：真菌感染[6.1nmol/L(5.6)]，革兰氏阴性细菌[4.9nmol/L(5.9)]，革兰氏阳性细菌[4.1nmol]/L(6.2)]或病毒[1.2nmol/L(3.4)]。
[0540] 表7.患者的临床特征：合适的情况下数据以平均值(S.D.)或中位数(IQR)表示。以百分比(％)表示的值表示特定变量在28天时幸存者和非幸存者的比例。
[0541]
[0542]
[0543] 存活分析
[0544] MR-proADM、PCT和乳酸在单变量Cox回归分析中显示与死亡率显著相关(表8)。在调整混杂因素并与PCT、CRP和乳酸进行比较后，MR-proADM显示出与死亡风险最强的独立关联(风险比：8.5；95％置信区间：4.2-17.4；p<0.001)(表8)。此外，Kaplan Meier分析显示，在ICU入院后的前28天内，没有MR-proADM值≤0.88nmol/L的患者死亡(图1)。选择该截止值是因为它在AUROC中识别非幸存者时提供了100％的灵敏度(图2)。
[0545] 表8.ICU入院后28天的死亡率预测的单变量和多变量Cox回归分析。
[0546]
[0547] 调整变量是：年龄，脓毒性休克，心血管疾病，免疫抑制，慢性肾功能衰竭，瘤形成，呼吸道感染，肾脏替代疗法，医院(Valladolid/Dijon)，真菌感染的存在，治疗努力的限制[0548] 疾病严重程度对生物标志物表现的影响
[0549] MR-proADM在整个群组的分析中显示了28天死亡率预测的最佳AUROC，甚至优于SOFA评分(图2)。当患者根据器官衰竭程度进行分层时，MR-proADM是唯一能够在疾病严重程度最低(SOFA评分≤6)的患者中在28天时区分非幸存者和幸存者的生物标志物(AUROC[95]％置信区间(95％CI)：]：0.75[0.61-0.88])，(p＝0.006)(图3)。在中度重度患者(SOFA评分7-12)中，MR-proADM显示出比用乳酸盐观察到的更高的AUROC(分别为0.74[0.66-0.83]vs.0.61[0.52-0.71])(图3)。在最严重的患者(SOFA评分≥13)中，MR-proADM和乳酸有类似的AUROC(分别为0.73[0.59-0.86]vs.0.72[0.59-0.86])(图3)。根据SOFA评分，CRP和PCT均未预测任何严重组的28天死亡率。
[0550] 用于鉴定非存活者的MR-proADM的阈值(截止值)是显示与具有至少0.80的预固定灵敏度的那些的最高特异性的那些。对于SOFA评分≤6、7-12和≥13的患者，MR-proADM截止值分别为1.79、3.25和5.58nmol/L(表9)。
[0551] 表9.用于根据SOFA评分预测28天死亡率的具有最高准确度的MR-proADM截止值(nmol/L)。PPV–阳性预测值，NPV–阴性预测值，+LR–阳性似然比，-LR–阴性似然比。
[0552] 截止值 灵敏度 特异性 PPV NPV +LR -LR
SOFA≤6 1.79 83.0 61.0 23.8 96.2 2.14 0.27
SOFA 7-12 3.25 83.0 52.0 43.4 87.0 1.74 0.33
SOFA≥13 5.58 83.8 60.0 75.6 71.4 2.09 0.27
SOFA≤6 1.79 83.0 61.0 23.8 96.2 2.14 0.27
SOFA 7-12 3.25 83.0 52.0 43.4 87.0 1.74 0.33
SOFA≥13 5.58 83.8 60.0 75.6 71.4 2.09 0.27
[0553] 每个严重程度组的ICU停留时间为[平均值，(SD)]：SOFA≤6：11.0天(18.3)；SOFA 7-12：12.4天(16.0)；SOFA≥13：8.4天(7.6)。每个严重程度组的死亡率分别为12.8％、
30.6％和59.7％。
30.6％和59.7％。
[0554] MR-proADM改善了患有严重疾病的患者的死亡率预测
[0555] 我们评估了MR-proADM和SOFA评分在预测死亡率方面的组合，因此MR-proADM浓度>1.79nmol/L的患者被认为SOFA评分增加1个点。在SOFA≤6的患者中，与单独使用SOFA相比，MR-proAD改变的SOFA评分(ADM-SOFA)显示出识别非存活者的能力增加，AUROC[95％CI]：SOFA 0.70[0.58-0.82]和ADM-SOFA 0.77[0.66-0.88]。
[0556] 讨论
[0557] 脓毒病严重性取决于器官衰竭的程度，如由SOFA评分评估的，这又直接与死亡风险相关[15]。尽管如此，越来越多的生物标志物的出现可以提供一种新的途径，用于以简单和快速的方式提高预后准确性。在这方面，我们的研究表明MR-proADM可能是一种有前景的生物标志物。然而，先前评估MR-proADM在脓毒症中的预后作用的研究提供了相互矛盾的结果。Christ-Crain等人发现，对于一组53名脓毒症患者检测ICU死亡率，MR-proADM产生0.81的AUROC[16]。与此相反，Suberviola等发现在137名脓毒症患者中预测住院死亡率的MR-proADM有限值，AUROC为0.62[17]。然而Marino等人发现，在101名脓毒症、重症脓毒症或感染性休克患者中，血浆肾上腺髓质素与疾病、血管加压需求和28天死亡率的严重性强相关[18]。这些关于MR-proADM预后作用的不同结果可以通过各种研究中患者特征、疾病严重程度、感染源、手术与医疗和小样本量的差异来解释。
[0558] 在本研究中，我们首次证明了生物标志物预测脓毒症死亡率的表现在很大程度上取决于ICU入院时器官衰竭的程度。根据他们的SOFA评分对患者进行分层使我们能够证明MR-proADM是唯一能够识别所有严重程度组中非存活者的生物标志物。这对于病情较轻的患者(SOFA评分<6)尤其重要，因为该组代表脓毒症在临床过程中最早出现和/或在ICU环境中该疾病的不太严重的形式。因此，MR-proADM可能是纳入早期脓毒症管理方案的良好候选者，因为它可以提供快速预后价值并有助于指导诊断干预和治疗决策，因此类似于肌钙蛋白在心肌梗塞或d-二聚体在肺栓塞中的作用。对于这组患者(1.79nmol/L)鉴定的MR-proADM的截止值对于这方面可能是非常有用的。该截止值能够以良好的灵敏度和高的阴性预测值检测死亡率。最后，MR-proADM可帮助对检查脓毒症的新疗法的临床试验中的患者进行分层。
[0559] 对于中度器官衰竭(SOFA评分为7-12)的患者，MR-proADM显示出比其他更常用的生物标志物(包括乳酸盐)更高的死亡风险预测值。相反，MR-proADM和乳酸盐在最严重的患者(SOFA≥13)中表现相似。因此，我们的结果支持在设计用于在脓毒症中发现预后生物标志物的研究时考虑器官衰竭程度的重要性。
[0560] 使用SOFA评分评估器官功能衰竭最近被SEPSIS-3共识建议，以确定怀疑感染的高风险患者[15]。我们的研究结果表明，“阳性”MR-proADM值可以提高SOFA预测脓毒症死亡率的能力。有趣的是，MR-proADM与临床评分诸如PSI或CURB-65的组合在社区获得性肺炎(CAP)或下呼吸道感染(LRTI)患者中也比单独临床评分表现更好[12][19][20][21]。因此，MR-proADM可用作可靠的风险分层工具，能够预测死亡率或不良事件并指导临床决策。因此保证了将MR-proADM与其他经典严重性评分和/或生物标志物组合以便改善脓毒症的识别和预测的进一步的临床研究评价策略[22][23]。
[0561] 最后，我们观察到MR-proADM值低于0.88nmol/L可能允许在入住ICU后28天内“排除”死亡率。当明显器官衰竭的临床症状尚不明显时，这种截止可能对指导早期临床决策特别有用。
[0562] MR-proADM的随着时间的监测可能会进一步说明时间趋势，这可以指示特定的治疗和疗法的成功，并因此提高它的结果预测值[25]。最后，在我们的群组中，MR-proADM水平根据感染源略有不同。真菌感染诱导最高水平的MR-proADM，而病毒感染诱导最低水平。这可能与真菌感染导致疾病严重程度较高的事实有关(中位数SOFA评分为12分vs.没有真菌感染的患者中的9分)，而病毒感染导致疾病严重程度较轻(中位SOFA评分为6.5分vs.没有病毒感染的患者中的9分)。
[0563] 结论
[0564] 我们的研究结果表明，生物标志物在确定脓毒症死亡风险方面的表现受疾病严重程度的影响。在中度严重程度的患者中，MR-proADM优于其他标准生物标志物。因此，MR-proADM可以帮助早期鉴定需要紧急ICU入院的脓毒症患者以及促进这些患者的后续临床管理。
[0565] 缩略语表
[0566] ADM：肾上腺髓质素
[0567] MR-proADM：中区肾上腺髓质素原
[0568] CRP：C-反应蛋白
[0569] PCT：降钙素原
[0570] SOFA：序贯器官衰竭评估分数
[0571] CI：置信区间
[0572] AUROC：接收者操作特性曲线下的面积
[0573] PPV：阳性预测价值
[0574] NPV：阴性预测价值
[0575] LR：似然比
[0576] HR：危险比
[0577] PSI：肺炎严重程度指数
[0578] RRT：肾脏替代疗法
[0579] 本文引用的所有参考文献都通过引用完全并入。
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