肺炎克雷伯氏菌的杀菌性单克隆抗体
阅读：420发布：2021-02-05
专利汇可以提供肺炎克雷伯氏菌的杀菌性单克隆抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种特异性识别 肺 炎克雷伯氏菌O1的D-半乳聚糖-II 抗原 的人或人源化单克隆IgG 抗体 (mAb)(其特征在于杀菌性CDC活性)、其生产方法、医学和诊断用途。，下面是肺炎克雷伯氏菌的杀菌性单克隆抗体专利的具体信息内容。
1.一种特异性识别肺炎克雷伯氏菌血清型O1的D-半乳聚糖-II的人或人源化单克隆IgG抗体(mAb)，其特征在于杀菌性CDC活性。
2.如权利要求1所述的抗体，其为人或人源化的mAb。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其包含：
A
抗原结合位点，其特征在于以下CDR序列：
a)由SEQ ID 1的氨基酸序列组成的CDR1；和
b)由SEQ ID 2的氨基酸序列组成的CDR2；和
c)由SEQ ID 3的氨基酸序列组成的CDR3；和
d)由SEQ ID 4的氨基酸序列组成的CDR4；和
e)由SEQ ID 5的氨基酸序列组成的CDR5；和
f)由SEQ ID 6的氨基酸序列组成的CDR6；
或
B
如A中所定义的抗原结合位点的功能变体，其中所述功能变体在任何一个或多个CDR序列中包含至少一个点突变，并且进一步其中
i.所述功能变体具有结合gal-II表位的特异性；和/或
ii.所述功能变体是抗原结合位点的人、人源化或亲和力成熟的变体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其为全长单克隆抗体，其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包含至少一个含有抗原结合位点的抗体结构域构造和Fc区，所述融合蛋白至少包含与异源肽或多肽融合的所述抗体片段。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体，其包含人IgG1或IgG3的Fc，优选任何人IgG1或IgG3同种异型，优选由氨基酸序列SEQ ID 7识别的人IgG1同种异型G1m1,17的恒定区，或其Fc部分，或其功能变体，其包含C1q结合位点。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其具有结合所述O1抗原的亲和力，具有小于10-6M，优选小于10-7M或小于10-8M的Kd。
7.一种人造单克隆抗体组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体。
8.一种药物制剂，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体，优选包含肠胃外或粘膜制剂，任选含有药学上可接受的载体或赋形剂。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体，其用于治疗有风险患有或患有肺炎克雷伯氏菌感染或定植的主体，包括向主体施用有效量的抗体以限制主体的感染或改善由所述感染引起的病情，优选用于治疗或预防任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
10.根据权利要求9使用的抗体，其中所述主体是免疫功能低下或免疫抑制的患者或其接触者。
11.根据权利要求9或10使用的抗体，其中所述主体是以吞噬细胞数量和/或功能受损为特征的宿主组，所述宿主组是以下任一：
a)患有遗传性或获得性原发性或继发性免疫缺陷的患者；
b)选自以下组成的组的患者：小于x月龄的新生儿，年龄大于65岁的老年患者，患有糖尿病、肾衰竭、肝硬化、21三体综合征、外伤或HIV的患者，或经历过外科手术或用皮质类固醇系统性治疗的患者；或
c)入院患者或医院人员，尤其是急症室或重症监护室的入院患者或医院人员，暴露于患有肺炎克雷伯氏菌病的患者时有感染风险。
12.根据权利要求9-11中任一项使用的抗体，用于预防肺炎克雷伯氏菌病的医院内或医源性暴发。
13.根据权利要求9-12中任一项使用的抗体，其中所述抗体与抗生素药组合施用。
14.治疗有风险患有或患有肺炎克雷伯氏菌感染或定植的主体的方法，包括向主体施用有效量的抗体以限制主体中的感染或改善由所述感染导致的病情，优选用于治疗或预防任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
15.一种如权利要求1-6中任一项所述的抗体的诊断制剂，其在组合物或成套试剂盒中包含所述抗体和另外的诊断试剂，其包含以下组分：
a)所述抗体；和
b)所述另外的诊断试剂；
c)和任选的固相，以固定抗体和诊断试剂中的至少一种；
优选其中所述另外的诊断试剂是诊断标记，或与所述抗体和/或所述抗体与其抗原结合的反应产物特异性反应的试剂。
16.一种诊断由肺炎克雷伯氏菌O1菌株引起的主体中肺炎克雷伯氏菌O1感染或定植的方法，包括：
a)提供根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，和
b)检测所述抗体是否与待测主体的生物样品中的半乳聚糖-II表位特异性免疫反应，由此诊断肺炎克雷伯氏菌O1感染或定植。
17.一种编码权利要求1-6中任一项的抗体的核酸。
18.一种重组宿主细胞，其包含权利要求17所述的核酸。
19.一种生产权利要求1-6中任一项所述的抗体的方法，其中能够表达抗体的重组宿主细胞在产生所述抗体的条件下培养或维持。
肺炎克雷伯氏菌的杀菌性单克隆抗体
技术领域
[0001] 本发明涉及杀菌性单克隆抗体(mAb)，其为特异性识别肺炎克雷伯氏菌血清型O1的LPS侧链内的D-半乳聚糖-II(半乳聚糖II、D-gal II、gal-II)的人IgG1抗体，及其医疗用途。
[0002] 发明背景
[0003] 肺炎克雷伯氏菌是导致泌尿道感染、肺炎和败血症的医院内机会致病菌，其导致显著的发病率和死亡率。易感患者的免疫功能往往受损，而无法应对由该共生肠细菌引起的侵袭性感染。
[0004] 更令人惊恐的是，最近出现了多重耐药(MDR)菌株并在全球蔓延，而对此的治疗方法有限。单克隆抗体可能代表新的治疗方法。尽管如此，考虑到屏蔽大多数表面抗原的体积庞大的荚膜多糖，肺炎克雷伯氏菌表面上可接近的分子靶标非常有限。另一方面，容易接近的荚膜多糖显示出高度的结构变异性和因此显示出高度的抗原变异性，使其对广谱抗菌方法不具有吸引力。
[0005] 另一种主要的非蛋白质表面抗原是比荚膜抗原表现出更少变异性的LPS。在肺炎克雷伯氏菌中，根据LPS O-侧链的结构，存在少于10个O-血清组区别。最常见的血清型是O1，据报道其由三分之一以上的全部肺炎克雷伯氏菌分离株表达(1；2)。Held等人描述了鼠半乳聚糖-II-特异性鼠IgG2b(Mab Ru.O1)，其能够诱导补体依赖性调理吞噬杀伤但缺乏补体介导杀伤能力，因此在不存在吞噬细胞时不是杀菌性的(1)。
[0006] 包括最近在不同地理位置分离的MDR菌株的内部研究证实O1分离株的患病率最高(图1)。
[0007] 天然存在的抗体由两条重链和两条轻链组成。在IgG中，抗原结合片段(Fab)区含有互补位，并且可以通过与抗原的结合作用发挥直接效应。此外，Fc区与各种辅助分子相互作用以介导间接效应子功能，比如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)(也称为调理吞噬作用(OPK))和补体依赖性细胞毒性(CDC)。后两种Fc介导的效应子功能对传染性疾病尤其重要，其中细胞和补体介导的应答对高效病原体清除是重要的。
[0008] 在补体依赖性细胞毒性(CDC)中，C1q与抗体结合，并且该结合触发补体级联，由于经典途径补体激活，其导致在靶细胞表面形成膜攻击复合物(C5b至C9)。对于人IgG1和IgG3，CDC效应子功能的水平通常较高，对于IgG2则较低，对于IgG4则无效，但主要取决于靶细胞和抗原的类型。
[0009] 在大多数临床流行的肺炎克雷伯氏菌血清型中，D-半乳聚糖II提供了定义O1抗原的表位，其特征在于D-gal II重复单元结构：[-3)-α-D-Galp-(1–3)-β-D-Galp-(1-]。
[0010] 它的存在负责细菌在宿主中抵抗补体介导杀伤。仅产生D-半乳聚糖I的肺炎克雷伯氏菌突变体因此对血清敏感(13)。
[0012] 肺炎克雷伯氏菌O1抗原的详细生物化学结构早先由两个独立的小组描述(11；12)。如上所述(1-3)，Trautmann小组提出并表征了针对肺炎克雷伯氏菌O1抗原的多克隆和鼠单克隆IgG2a抗体。基于他们的实验数据，提出了抗-O1mAb的治疗用途。
[0013] 抗LPS O-抗原的抗体，特别是抗O1抗原(半乳聚糖-II)的抗体是以前由其它人开发和测试的。表明这些抗体诱导调理吞噬细胞杀伤(OPK)(1)并且在克雷伯氏菌感染的鼠模型中提供保护(2)。基于调理潜力，意味着使用针对半乳聚糖-II的mAb是有希望的抗菌策略(2；3)。
[0014] Hsieh等人描述了D-半乳聚糖II作为O1LPS中的免疫显性抗原及其在疫苗设计中的意义(14)。
[0015] 存在用于O1抗原的详细结构分析以及针对该结构的单克隆抗体的现有技术。选择此类现有技术的抗体是基于其调理功能，即功效将依赖于受感染宿主的吞噬细胞功能。但是，肺炎克雷伯氏菌作为机会致病菌倾向于感染免疫功能低下的个体，其吞噬活性可能严重不足(参见上文)。
[0016] Kubota等人描述了具有改进的效应子功能的工程改造的治疗性抗体，比如抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性(15)。
[0017] 免疫功能低下的患者不能产生正常的免疫应答，导致免疫系统较弱/受损(免疫缺陷)。免疫缺陷可以是原发性的(当遗传缺陷影响免疫细胞时)或继发性的(当因素影响具有本质上正常的免疫系统的宿主导致获得性免疫缺陷时)并且它们可以由抗体、淋巴细胞、吞噬细胞、补体系统的紊乱或这些因素的组合导致。
发明内容
[0019] 本发明的目的是提供改良抗体，所述改良抗体可用于治疗人主体，用于免疫预防和免疫疗法，特别是用于治疗免疫功能低下的患者。
[0020] 所述目的通过本发明的主题来解决。
[0021] 根据本发明，提供了特异性识别肺炎克雷伯氏菌血清型O1的D-半乳聚糖-II，特别是LPS内的D-半乳聚糖-II表位，或D-半乳聚糖-II抗原的人源化或人单克隆IgG抗体(mAb)，该抗体的特征在于杀菌性CDC活性。特别是，抗体包括含有C1q结合位点的Fc区，其特征在于杀菌性CDC活性。特别是，如本文所述的抗体是特异性识别肺炎克雷伯氏菌O1的D-半乳聚糖-II抗原的mAb，其包括含有C1q结合位点的人恒定区，其特征在于杀细菌CDC活性。特别是，抗体包含IgG1或IgG3抗体的结构，优选包括人IgG1或IgG3的Fc。特别是，抗体是IgG1或IgG3抗体。
[0022] 如本文所用，抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)是其中一种或多种补体蛋白组分识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞裂解的反应。
[0023] 特别是，抗体的特征在于对循环中含有抗原的细菌的补体介导的直接杀死的CDC活性，例如通过标准CDC测定法在血清中测定。特别地，与对照相比，如果细胞溶解的百分比显著增加，则抗体具有杀菌性CDC活性。与CDC有关的细胞毒性活性优选以绝对百分比增加来测量，其优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％。
[0024] 令人惊讶的是，尽管肺炎克雷伯氏菌血清型O1对血清杀死有天然抗性，但是多种IgG1型单克隆人抗体(每种具有不同抗原结合位点和不同CDR序列)能够通过CDC活性直接杀死细菌。治疗吞噬缺陷患者或免疫功能低下患者时，杀菌活性尤其重要。
[0026] 根据具体实施方案，抗体包括：
[0027] A
[0028] 特征为以下CDR序列的抗原结合位点：
[0029] a)由SEQ ID 1的氨基酸序列组成的CDR1；和
[0030] b)由SEQ ID 2的氨基酸序列组成的CDR2；和
[0031] c)由SEQ ID 3的氨基酸序列组成的CDR3；和
[0032] d)由SEQ ID 4的氨基酸序列组成的CDR4；和
[0033] e)由SEQ ID 5的氨基酸序列组成的CDR5；和
[0034] f)由SEQ ID 6的氨基酸序列组成的CDR6；
[0035] 或
[0036] B
[0037] 如A中所定义的抗原结合位点的功能变体，其中所述功能变体包括任何一个或多个CDR序列中的至少一个点突变，并且另外其中
[0038] i.所述功能变体具有结合gal-II表位的特异性；和/或
[0039] ii.所述功能变体是人的，人源化的，包括例如人/小鼠嵌合的或亲和力成熟的变体抗原结合位点。
[0040] 特别是，将CDR1-3序列并入抗体重链的可变结构域(VH结构域)，并将CDR4-6序列并入抗体轻链的可变结构域(VL结构域)，采用人VH和VL框架序列或与人框架序列至少60％(优选至少70％、80％或90％)相同的框架序列。根据具体实施例，抗体是包含VH和VL的人源化抗体，该VH在VH框架序列内并入了CDR1、CDR2和CDR3序列，且该VL在VL框架序列内并入了CDR4、CDR5和CDR6序列，其中框架序列源自人IgG，特别是人IgG1，或者其中使用框架序列的至少一个功能变体，其不改变可变结构域的抗原结合特异性，并且与相应的VH或VL框架序列具有至少60％的同一性，优选具有至少70％、80％或90％的同一性。
[0041] 特别是，如A中所定义的抗原结合位点是指定为8E9、G2-27或G2-33和如本文所述的任何示例性抗体的抗原结合位点。这些抗体中的每一个的特征在于由CDR1-6序列所定义的相同的抗原结合位点，但抗体的框架或恒定区不同。人-小鼠嵌合的mAb 8E9包含人IgG1恒定重链区和κ恒定轻链区，因此属于人IgG1类型，以及通过进一步人源化mAb 8E9获得的人源化G2-27和G2-33。
[0042] 本发明还涉及这些抗体的变体。为了提供变体，8E9、G2-27或G2-33抗体中的任一种在本文中称为亲本抗体，并且它们的CDR序列在本文中称为亲本CDR序列。包含亲本抗体的抗原结合位点或其任何各CDR序列的功能变体的抗体特别地理解为功能变体抗体，并且它们的变体CDR序列在本文中称为功能活性CDR变体序列。
[0043] 除非另有说明，否则参考根据Kabat编号的CDR序列，即根据Kabat命名法(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，U.S.Department of Health and Human Services(美国卫生和公众服务部)，(1991))确定。应该理解的是，本发明和权利要求的范围还应涵盖相同的抗体和CDR，但是具有不同的编号和指定的CDR区，其中CDR区根据IMGT系统来定义(The international ImMunoGeneTics，Lefrancet al.，1999，Nucleic Acids Res.27:209-212)。
[0044] 特别地，认为结合于靶抗原并具有以CDC活性为特征的细胞毒性的变体抗体是有功能活性的。亲本抗体的变体VH或VL结构域也是可行的，例如可以使用在各自FR或CDR序列中的修饰，其具有功能活性，例如结合到相同的表位(即gal-II表位)或包含相同的结合位点或具有与亲本抗体相同的结合特征。本文所述抗体的一些FR或CDR序列可以被其它抗体的那些FR或CDR序列交换，也是可行的。具体的变体可以包含：
[0045] ·通过改组亲本抗体的结构域获得的VH和VL结构域的组合，或
[0046] ·通过改组亲本抗体的重链和轻链获得的HC和LC的组合。
[0047] 例如，功能抗体变体可以包含第一亲本抗体的VH结构域和另一亲本抗体的VL结构域。根据另一个实施例，功能抗体变体可以包含第一亲本抗体的HC结构域和另一亲本抗体的LC。
[0048] 功能变体，也称为“功能活性”变体，可以是功能活性CDR变体，其在亲本CDR序列中包含至少一个点突变，并且包括或组成为与亲本CDR序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，优选至少70％、至少80％、至少90％序列同一性。
[0049] 具体的变体是例如亲本抗体的人源化变体，其中将亲本CDR序列并入到人或人源化框架序列中，其中每个亲本CDR序列中任选1、2、3或4个氨基酸残基可以通过引入点突变进一步突变以提高亲本或人源化抗体的稳定性、特异性和亲和力。
[0050] 特别地，抗体包含亲本抗体的任何CDR序列的功能活性CDR变体，其中功能活性CDR变体包括以下至少一个：
[0051] a)亲本CDR序列中的1、2或3个点突变；和/或
[0052] b)亲本CDR序列的四个C端或四个N端或四个中心氨基酸位置中的任一个位置中的1或2个点突变；和/或
[0053] c)与亲本CDR序列具有至少60％的序列同一性；
[0054] 优选地其中所述功能活性CDR变体在由少于4或5个氨基酸组成的任何CDR序列中包含1或2个点突变。
[0055] 特别是，功能活性变体抗体包含至少一种如本文所述的功能活性CDR变体。特别是，包含一个或多个功能活性CDR变体的功能活性变体抗体具有与亲本抗体结合相同表位的特异性。
[0056] 根据具体的方面，点突变是一个或多个氨基酸的任意氨基酸取代、缺失和/或插入。
[0057] 特别是，抗体来源于任何此类亲本抗体：通过诱变，使用各自的CDR序列或CDR突变体，包含功能活性CDR变体，例如在一个CDR环内具有1、2或3个点突变，例如在5-18个氨基酸的CDR长度内，例如在5-15个氨基酸或5-10个氨基酸的CDR区内。或者，在一个CDR环内可以存在1至2个点突变，例如，在小于5个氨基酸的CDR长度内，提供包含功能活性CDR变体的抗体。特定的CDR序列可以很短，例如CDR2或CDR5序列。根据具体实施方案，功能活性CDR变体在由少于4或5个氨基酸组成的任何CDR序列中包含1或2个点突变。
[0058] 在此具体的理解是，编号为CDR1、2和3的CDR代表VH结构域的结合区，并且CDR4、5和6代表VL结构域的结合区。
[0059] 提供了其它特异性抗体作为CDR突变抗体，例如，以改善抗体的亲和力和/或靶向亲本抗体所靶向表位附近的相同的一个或多个表位(表位替换(epitope shift))，但是仍然特异性识别gal-II表位。
[0060] 特别是，这些变体的VH或重链(HC)序列可以分别由另一变体的VH和HC序列取代，特别是其中另一变体是相同亲本抗体的任何其它变体。
[0061] 特别是，这些变体的VL或轻链(LC)序列可以分别由另一变体的VL和LC序列取代，特别是其中另一变体是相同亲本抗体的任何其它变体。
[0062] 根据具体的方面，抗体包含重组CDR和框架序列，例如不同起源，其中CDR和框架序列中的至少一个包括人、人源化、嵌合、鼠或亲和力成熟的序列，然而其中框架和特别是Fc区是人IgG1或IgG3的，或人IgG1或IgG3恒定区变体(同种异型)的Fc区，或包含随机化或人工氨基酸序列(例如非天然存在的)序列的重组IgG1或IgG3抗体的Fc区，但是不改变IgG1或IgG3亚型结构。
[0063] 具体优选的抗体包含任何亲本抗体的结合位点，特别是通过各自VH和VL结构域的组合形成的结合位点。
[0064] 特别是，抗体是包含一个或多个(几个)点突变的工程改造的mAb，以改善抗体的C1q结合(和可选的CDC活性)，即通过一个或多个(几个)点突变或糖结构工程改造Fc区的C1q结合位点。特别是，可以通过改善C1q活化来工程改造抗体以改善CDC活性。
[0065] 本发明进一步提供了产生亲本抗体的功能活性抗体变体的方法，所述亲本抗体是8E9、G2-27或G2-33抗体中的任一种，或者包含8E9、G2-27或G2-33抗体中的任一种的结合位点，所述方法包括在任何恒定区或互补决定区(CDR1至CDR6)中制造至少一个点突变以获得变体抗体，并且确定变体抗体的功能活性，特别地通过结合O1表位的亲和力来确定，Kd小于
10-6M，优选小于10-7M，或小于10-8M，或小于10-9M，甚至小于10-10M，或小于10-11M，例如亲和力在皮摩尔范围，和通过CDC活性来确定。在确定功能活性后，选择功能活性变体用于进一步使用并任选地通过重组生产方法进行生产。通过诱变源自亲本抗体的变体抗体可以通过本领域公知的方法产生。
10-6M，优选小于10-7M，或小于10-8M，或小于10-9M，甚至小于10-10M，或小于10-11M，例如亲和力在皮摩尔范围，和通过CDC活性来确定。在确定功能活性后，选择功能活性变体用于进一步使用并任选地通过重组生产方法进行生产。通过诱变源自亲本抗体的变体抗体可以通过本领域公知的方法产生。
[0066] 根据具体的方面，变体抗体与亲本抗体结合相同的表位。
[0067] 根据进一步具体的方面，变体抗体包含与亲本抗体相同的结合位点。
[0068] 特别是，抗体具有结合O1抗原的亲和力，具有小于10-6M，优选小于10-7M或小于10-8M的Kd。
[0069] 如本文所述的抗体具体的进一步特征在于，它不与任何其它肺炎克雷伯氏菌抗原交叉反应，和/或抗体以较低亲和力结合至任何其它肺炎克雷伯氏菌抗原，例如其中优先结合O1抗原而不是其它肺炎克雷伯氏菌抗原(不是O1抗原)的Kd差异至少是2log，优选至少3log。
[0070] 通过亲和力成熟产生的亲本抗体变体，本文称为亲和力成熟变体，可以具有增加的结合亲和力，与亲本抗体相比，具有至少1log，或2log，或3log的Kd差异。亲和力成熟的变-8 -9 -8体通常具有结合O1抗原的亲和力，Kd小于10 M，或小于10 M。如果亲本抗体具有小于10 M，或小于10-9M的Kd的亲和力，并且亲本抗体经历亲和力成熟，则亲和力成熟变体可以具有甚至更高的亲和力，Kd分别小于10-9M和小于10-10M。
[0071] 特别是，抗体是全长单克隆抗体，其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包含至少一个含抗原结合位点的抗体结构域构造和Fc区，所述融合蛋白至少包含与异源肽或多肽融合的所述抗体片段。
[0072] 特别是，抗体包含人IgG的Fc，比如IgG1或IgG3的Fc，优选任何人IgG1或IgG3同种异型的Fc，优选人IgG1的Fc区或Fc部分，比如抗体包含人IgG1同种异型G1ml,17恒定区(由氨基酸序列SEQ ID 7确定)，或其Fc部分或Fc区，例如由SEQ ID 8确定的人IgG1Fc，或其功能变体，包含C1q结合位点。SEQ ID 7确定人IgG1的G1m1,17同种异型，SEQ ID 8确定包含在SEQ ID 7中的Fc部分。
[0073] 或者，可以使用任何其它人IgG1或IgG3的Fc或Fc区，或任何人IgG1或IgG3的Fc变体或恒定区变体，或人IgG1或IgG3的同种异型，只要其包含C1q结合位点。
[0074] 本发明进一步提供了编码如本文所述的抗体的分离的核酸。
[0075] 本发明进一步提供了表达盒或质粒，其包含编码序列以表达本文所述的抗体或包含所述抗体的VH和/或VL和Fc区的蛋白质。
[0076] 本发明进一步提供了包含如本文所述的核酸或表达盒或质粒的宿主细胞。
[0077] 本发明进一步提供了生产如本文所述的抗体的方法，其中如本文所述的宿主细胞在产生所述抗体的条件下培养或维持。因此，本发明提供了生产如本文所述的抗体的方法，其中能够表达抗体的重组宿主细胞在产生所述抗体的条件下培养或维持。
[0078] 特别优选的是宿主细胞和使用该宿主细胞的生产方法，该宿主细胞包含：
[0079] -本文所述的质粒或表达盒，其包含编码序列以表达抗体轻链；和
[0080] -本文所述的质粒或表达盒，其包含编码序列以表达抗体重链。
[0081] 根据另一方面，本发明提供了生产如本文所述的抗体的方法，包括：
[0082] a)用肺炎克雷伯氏菌的O1抗原免疫非人类动物并分离产生抗体的B细胞；
[0083] b)从分离的B细胞形成永生化细胞系；
[0084] c)筛选细胞系以鉴定产生特异性结合O1抗原的单克隆抗体的细胞系；和[0085] d)产生具有与单克隆抗体相同的表位结合特异性的人源化或人IgG1或IgG3形式的抗体或其IgG1或IgG3衍生物。
[0086] 具体方法包括产生转换变体克隆(switch varian clone)的过程，所述转换变体克隆产生IgG类，比如基本上由免疫球蛋白γ基因编码的IgG类，以及IgG1或IgG3亚类。
[0087] 本发明进一步提供了鉴定候选抗体的方法，其包括：
[0088] a)提供含有抗体或抗体产生细胞的样品；和
[0089] b)评估：
[0090] i.样品中或由样品产生的抗体与半乳聚糖-II表位的结合；和
[0091] ii.在血清样品中杀死肺炎克雷伯氏菌O1血清型的CDC活性；
[0092] 其中抗体与表位之间的阳性结合反应，和阳性CDC活性将抗体鉴别为候选抗体。
[0093] 本发明进一步提供了生产如本文所述的抗体的方法，包括：
[0094] a)提供如本文所述鉴定的候选抗体；和
[0095] b)产生具有与单克隆抗体相同的表位结合特异性的人源化或人IgG1或IgG3形式的抗体或其IgG1或IgG3衍生物。
[0096] 本发明进一步提供了人造组合物，其包含本文所述单克隆抗体，特别是由重组宿主细胞产生和从宿主细胞培养物中分离的抗体。这种组合物特别地不包含会污染组合物的任何人血清蛋白。特别地，组合物是仅包含单组单克隆抗体的单克隆抗体组合物。因此，认为所述组合物是人造的而不是天然存在的。
[0097] 本发明进一步提供了包含如本文所述的抗体的药物制剂，优选包含肠胃外或粘膜制剂，任选地含有药学上可接受的载体或赋形剂。
[0098] 这样的药物组合物可以含有抗体作为唯一活性物质，或与其它活性物质或者活性物质的混合物组合，比如至少两种或三种不同抗体的组合或混合物。
[0099] 根据本发明，本发明具体提供的抗体用于医学、诊断或分析用途。
[0100] 本发明进一步提供了本文所述抗体的医学用途，以及治疗需要免疫预防或治疗的主体的相应方法。
[0101] 特别是，本发明提供了本文所述的抗体，用于治疗处于有风险患有或患有肺炎克雷伯氏菌感染或定植的主体，包括向主体施用有效量的抗体以限制主体的感染或改善由所述感染引起的病情，优选用于治疗或预防任何原发性和继发性的菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
[0102] 因此，本发明提供了治疗处于有风险患有或患有肺炎克雷伯氏菌感染或定植的主体的方法，包括向主体施用有效量的抗体以限制主体中的感染或改善由所述感染导致的病情，优选用于治疗或预防任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
[0103] 特别是，主体是免疫功能低下或免疫抑制的患者或其接触者。
[0104] 特别是，主体是以受损的吞噬细胞数量和/或功能为特征的宿主组，所述宿主组是以下任意的：
[0105] a)患有遗传性或获得性原发性或继发性免疫缺陷的患者；
[0106] b)选自以下组成的组的患者：小于x月龄的新生儿，年龄大于65岁的老年患者，患有糖尿病、肾衰竭、肝硬化、21三体综合征、外伤或HIV的患者，或经历过外科手术或用皮质类固醇系统性治疗的患者；或
[0107] c)入院患者或医院人员，尤其是急症室或重症监护室的入院患者或医院人员，暴露于患有肺炎克雷伯氏菌病的患者时有感染(contracting infection)风险。
[0108] 特别是，抗体用于预防肺炎克雷伯氏菌病的医院内或医源性暴发。
[0109] 特别是，提供根据本发明使用的抗体，其中通过使所述主体的生物样品与抗体接触来离体确定主体中gal-II O-型肺炎克雷伯氏菌的系统性感染或定植，其中抗体的特异性免疫反应确定感染或定植。
[0110] 特别是，生物样品是体液或组织样品，优选的样品选自以下组成的组：血液样品、粪便样品、皮肤样品、尿液样品、脑脊髓液和呼吸道样本比如气管内抽吸物、胸膜液、肺液(lung tap)、鼻拭子或痰，或来自任何前述样品的肺炎克雷伯氏菌分离株。特别是，测试体液样品的特异性免疫反应，该样品选自以下组成的组：尿、血液、血液分离物或血液培养物、抽吸物、痰、插管主体的灌洗液，和粪便。
[0111] 特别是，处理生物样品以产生源自生物样品的肺炎克雷伯氏菌分离株，该分离株可由其gal-II基因型或表型，和/或O1(D-gal-II)抗原表达水平进一步表征。用于生产细菌分离株的优选样品制备方法采用细菌富集和培养步骤。
[0112] 特别是，处理生物样品以直接测定样品中的O1水平，任选地在富集或纯化的准备步骤之后，以降低基质效应并增加测试的特异性和敏感性。准备步骤包括根据标准培养程序培养生物样本，例如但不限于标准生长培养基中的血培养，以及如在常规微生物学实验室中进行的在固体琼脂上培养样本(包括表型分析-即抗菌谱)。可以对细菌进行传代培养以扩增不同生长培养基中的CFU(标准培养基和/或化学成分确定的培养基；高营养、低营养、有限生长培养基组合物)来增强毒力因子的表达。可以制备细菌悬液并在标准缓冲溶液中洗涤以去除潜在的基质效应。
[0113] 特别是，O1抗原由免疫测定法中的至少一种测定，优选ELISA、CIA、RIA、IRMA、凝集测定法、免疫色谱法、试纸条测定法和蛋白质印迹法中的任一中，或质谱法、核磁共振(NMR)，或确定指示O1表达的相应DNA或RNA的方法，优选采用核酸杂交测定法或核酸扩增测定法。
[0114] 根据具体的方面，使用本发明的抗体的免疫疗法可以有效地防止活的细菌攻击，例如在各种动物模型中所确定的。
[0115] 抗体通过其CDC活性或补体介导的杀伤作用特异性地有效对抗gal-II O-型肺炎克雷伯氏菌，例如通过体外血清杀菌测定法(SBA)测定，例如高于对照样品(没有加入抗体或加入不相关的对照mAb)至少20％的细菌杀灭。
[0116] 抗体通过抗体介导的吞噬作用特异性地有效对抗gal-II O-型肺炎克雷伯氏菌，例如通过体外调理吞噬细胞杀伤测定法(OPK)测定，例如高于对照样品(没有加入抗体或加入不相关的对照mAb)至少20％的输入细菌摄入量或低于对照样品20％的最终CFU计数。
[0117] 根据进一步的具体方面，抗体在体外和/或体内是杀菌性的，并且特异性杀死动物(包括人类和非人类动物)中的目标病原体，并且抑制体内发病机理，优选任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎的模型。
[0118] 根据具体实施方案，抗体以预防性有效剂量施用来预防菌血症，优选小于1mg/kg。
[0119] 根据另一具体实施方案，抗体以治疗有效剂量施用来治疗菌血症，优选小于10mg/kg。
[0120] 特别是，抗体以包含抗体和药学上可接受的载体的药物制剂施用。
[0121] 特别是，抗体与抗生素药物组合施用。用于与免疫疗法组合的示例性抗生素是通常用于治疗感染肺炎克雷伯氏菌的患者的那些抗生素，例如碳青霉烯类、多粘菌素、替加环素(tygecycline)，或β内酰胺与非β内酰胺类抑制剂中的任何一种或多种。
[0122] 根据本发明，如本文所述的抗体特别提供用于医学、诊断或分析用途。
[0123] 本发明进一步提供了本文所述的抗体用于诊断目的的用途，特别用于诊断肺炎克雷伯氏菌感染或定植，或相关疾病比如主体中的原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎、或脑膜炎。
[0124] 特别是，主体是人类，特别是免疫功能低下或免疫抑制的患者或其接触者。
[0125] 特别是，提供的抗体用于本文所述的用途，其中通过使所述主体的生物样品与抗体接触来离体测定主体中gal-II O-型肺炎克雷伯氏菌的系统性感染或定植，其中抗体的特异性免疫反应确定有感染或定植。
[0126] 特别是，生物样品是体液或组织样品，优选样品选自以下组成的组：血液样品、粪便样品、皮肤样品、尿液样品、脑脊髓液和呼吸道样本比如气管内抽吸物、胸膜液、肺液、鼻拭子或痰，或来自任何前述样品的肺炎克雷伯氏菌分离株。特别是，测试体液样品的特异性免疫反应，该样品选自尿液、血液、血液分离物或血液培养物、抽吸物、痰、插管主体的灌洗液，和粪便。
[0127] 特别是，处理生物样品以产生源自生物样品的肺炎克雷伯氏菌分离株，该分离株可进一步通过其gal-II基因型或表型，和/或gal-II抗原表达水平来表征。用于产生细菌分离株的优选样品制备方法采用细菌富集和培养步骤。
[0128] 特别是，处理生物样品以直接测定样品中的gal-II水平，任选地在富集或纯化的准备步骤之后，以降低基质效应并增加测试的特异性和敏感性。准备步骤包括根据标准培养程序培养生物样本，例如但不限于标准生长培养基中的血培养，以及如在常规微生物学实验室中进行的在固体琼脂上培养样品(包括表型分析-即抗菌谱)。可以对细菌进行传代培养以扩增不同生长培养基中的CFU(标准培养基和/或化学成分确定的培养基；高营养、低营养、有限生长培养基组合物)来增强毒力因子的表达。可以制备细菌悬液并在标准缓冲溶液中洗涤以去除潜在的基质效应。
[0129] 特别是，gal-II抗原通过免疫测定法中的至少一种测定，优选ELISA、CIA、RIA、IRMA、凝集测定法、免疫色谱法、试纸条测定法和蛋白质印迹法中的任一种，或质谱法、核磁共振(NMR)，或确定指示gal-II表达的相应DNA或RNA的方法，优选采用核酸杂交测定法或核酸扩增测定法。
[0130] 特别是，根据本发明的诊断用途是指从临床样本回收的纯的肺炎克雷伯氏菌培养物体外测定肺炎克雷伯氏菌的血清型，以确定细菌是否为O1型(即表达gal-II)。
[0132] a)抗体；和
[0133] b)其它诊断试剂；
[0134] c)和任选的固相，以固定抗体和诊断试剂中的至少一种。
[0135] 诊断制剂任选地在组合物或成套试剂盒中包含本发明的抗体和另外的诊断试剂。
[0136] 诊断试剂盒优选包含全部必要组分以确定生物样品中gal-II的表达，任选地没有常见或非特异性物质或组分比如水、缓冲液或赋形剂。储存稳定的试剂盒可以优选储存至少6个月，更优选至少1或2年。它可以由干(例如冻干)组分组成，和/或包含防腐剂。
[0137] 优选的诊断试剂盒作为包装或预包装单元提供，例如其中所述组分仅包含在一个包装中，这有利于常规实验。这样的包装可以包括一种或多种测试所必需的试剂，例如适合执行一系列生物样品的测试。所述试剂盒还可以适当地含有gal-II抗原制剂作为标准或参照对照。
[0138] 诊断组合物可以是在与生物样品的反应混合物中即时使用的试剂，或这种试剂的保藏形式，例如储存稳定的形式比如冻干；速冻(例如在液氮中)、超低温储存(-70℃和-80℃)、冷储存(-20℃和5℃)和受控室温(15℃-27℃)；标准样品储存例如甘油储液、组织石蜡块，(口腔)拭子和其它标准生物样品储存方法，其中保藏形式的试剂可以重构或制备以获得即用型试剂。这种即用型试剂通常为水溶液形式，特别是(生理)缓冲剂条件(例如EDTA缓冲液、磷酸盐缓冲液、HBSS、柠檬酸盐缓冲液等)。
[0139] 特别是，另外的诊断试剂是与抗体和/或与其抗原结合的抗体的反应产物特异性反应的试剂。合适的诊断试剂适用于进行用于诊断或监测主体中肺炎克雷伯氏菌O1感染或定植的免疫测定。合适的诊断试剂可以是溶剂、缓冲液、染料、抗凝血剂、特异性结合本发明抗体和/或抗体-抗原免疫复合物的配体。
[0140] 特别是，本发明提供了本发明的抗体的诊断制剂，其任选地含有具有标记的抗体和/或具有标记的另外的诊断试剂，比如一试剂，其特异性识别抗体或抗体与相应靶抗原的免疫复合物，和/或固相，以固定抗体和诊断试剂中的至少一种。
[0141] 抗体或诊断试剂可以直接标记或间接标记。间接标记可以包含标记的结合剂，其与针对gal-II抗原的抗体或诊断试剂形成复合物。
[0142] 标记通常是可以在测定中检测到的分子或分子的一部分。示例性标记是发色团、荧光染料或放射性分子。在一些实施方案中，抗体或诊断试剂与可检测的标记缀合，所述可检测的标记可以包括其自身可检测的分子(例如荧光部分、电化学标记、金属螯合物等)以及可通过产生可检测的反应产物而间接检测的分子(例如酶如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或通过其本身可检测的特异性结合分子而间接检测的分子(例如生物素、洋地黄毒苷(digoxigenin)、麦芽糖、寡组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐(phenylarsenate)、ssDNA、dsDNA等)。
[0143] 优选的诊断制剂或测定法包含固定在固相上的本发明的抗体，所述固相例如乳胶微球、金颗粒等，例如以测试从待测试样品获得的gal-II型细菌抗体的凝集。
[0144] 本发明进一步提供了诊断由肺炎克雷伯氏菌O1菌株引起的主体中的肺炎克雷伯氏菌O1(O1血清型)感染或定植的方法，包括：
[0145] a)提供根据本发明的抗体，和
[0146] b)检测抗体是否与待测试的主体的生物样品中的半乳聚糖-II表位特异性免疫反应，由此诊断肺炎克雷伯氏菌O1感染或定植。
[0147] 根据具体的方面，本发明提供了伴随式诊断，以通过本发明的诊断或本发明的诊断方法确定肺炎克雷伯氏菌O1，特别是MDR肺炎克雷伯氏菌对主体的感染，以提供用针对这种感染的治疗剂治疗的基础，例如采用免疫疗法，比如用本发明的抗体治疗。
[0148] 根据具体的方面，本发明提供了灵敏的床旁诊断，以通过测定游离LPS(例如来自活细菌数量有限的临床样本)来诊断肺炎克雷伯氏菌O1，特别是MDR肺炎克雷伯氏菌对主体的感染。此类测定的灵敏度特别地小于100ng的LPS，优选小于10ng的LPS。附图说明
[0149] 图1.来自各种来源的MDR克雷伯氏菌分离株的血清型分布。
[0150] 图2.用O1特异性mAb进行免疫印迹。将从O1、O2和O3菌株纯化的1μg LPS分离并印迹(blot)到PVDF膜上。鼠mAb 8E9与分离的LPS样品的结合用HRP缀合的抗小鼠IgG特异性抗体检测。
[0151] 图3.用人/鼠嵌合(8E9)和人源化(G2-27和G2-33)O1特异性mAb对肺炎克雷伯氏菌O1菌株进行表面染色。将鼠mAb 8E9首先嵌合(也称为8E9)，随后进一步人源化产生G2-27和G2-33。这些与8E9共享相同的CDR，但是鼠框架(FR)序列由人类序列取代。
[0152] 用流式细胞术检测菌株A)ATCC 43816(O1：K2)或B)Kp24(O1：K+)上的O1特异性mAb的表面结合。直方图显示测量的荧光强度。
[0153] 图4.肺炎克雷伯氏菌菌血症的小鼠模型中通过O1特异性mAb保护。用嵌合或人源化的O1特异性mAb或不相关的对照mAb预防性地免疫小鼠。在随后的静脉内攻击后监测存活率。图显示了三次独立实验的组合数据，每组5只小鼠。
[0154] 图5.血清杀菌测定法确定CDC活性。将肺炎克雷伯氏菌菌株PCM-37(O1：K37)在存在各种浓度的特异性或对照mAb的两种不同的(图A：正常人血清#1；和B：正常人血清#2)50％耗尽的人血清样品中培养。杀菌活性用在培养期(3h)结束时相对于开始(T0)时回收细菌的百分比表示，通过在两个时间点的等分试样铺板确定。
[0155] 图6.序列
[0156] SEQ ID 1：VH CDR1＝CDR1
[0157] SEQ ID 2：VH CDR2＝CDR2
[0158] SEQ ID 3：VH CDR3＝CDR3
[0159] SEQ ID 4：VL CDR1＝CDR4
[0160] SEQ ID 5：VL CDR2＝CDR5
[0161] SEQ ID 6：VL CDR3＝CDR6
[0162] SEQ ID 7：人IgG1的恒定区(同种异型G1m1,17)
[0163] SEQ ID 8：人IgG1Fc
具体实施方式
[0164] 如本文所用的术语“抗体”应指组成为或包含抗体结构域的多肽或蛋白质，抗体域理解为免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定和/或可变结构域，具有或不具有接头序列。如果包含由至少两条通过环序列连接的抗体结构域结构的β链组成的β-桶结构，则多肽理解为抗体结构域。抗体结构域可以是天然结构或通过诱变或衍生化修饰，例如修饰抗原结合性质或任何其它性质，比如稳定性或功能性质，比如与Fc受体FcRn和/或Fcγ受体的结合。
[0165] 如本文所述的抗体具有特异性结合位点以结合一个或多个抗原或此类抗原的一个或多个表位，特别地包含可变抗体结构域对(即VL/VH对)的CDR结合位点和恒定抗体结构域，特别是全长抗体。
[0166] 如本文所述的术语“抗体”应特别指IgG1或IgG3结构，其在本文中理解为包含两个VH/VL对的结构，其中每个VH结构域是包含VH-CH1-CH2-CH3结构域序列的HC的一部分，并且每个VL结构域是包含VL-CL(特别是κ)结构域序列的LC的一部分，具有连接序列或铰链区，并且其中CH2-CH3结构域二聚形成Fc。IgG1或IgG3结构的抗体通常包含具有人IgG1或IgG3框架序列的可变和恒定抗体结构域，或任何该抗体结构域的末端伸长或缩短的序列。同样，环序列或β-桶序列可以突变而不损害抗体结构域三级结构。术语“全长抗体”通常用于指包含至少Fc结构域的主要部分(包含至少形成Fcγ受体结合位点的CH2-CH3界面区，和至少形成FcRn结合位点的N-末端CH2区)的任何抗体分子。短语“全长抗体”在本文中特别用于强调特定抗体分子不是缺乏Fc区的抗体片段(例如Fab或scFv片段)。
[0167] 术语“抗体”应特别包括分离形式的抗体，其基本上不含针对不同靶抗原的其它抗体或包含抗体结构域的不同结构排列的其它抗体。尽管如此，分离的抗体可以包含在组合制剂中，其含有分离的抗体与例如至少一种其它抗体(比如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段)的组合。
[0168] 术语“抗体”应该用于动物来源的抗体，包括人类物种，比如哺乳动物，包括人、鼠、兔、山羊、羊驼(lama)、牛和马，或禽类，比如母鸡，该术语应该特别包括基于动物起源的序列(例如人类序列)的重组抗体。
[0169] 如本文所述的抗体特别地为人或人源化的。人源化抗体具体可以是包含不同物种来源序列的人/鼠或人/非人嵌合抗体。例如，人/鼠嵌合抗体同时包含人和鼠来源的序列，并且通常包含人Fc区、人Fc或包含抗体的Fc区或Fc部分的人恒定区。
[0170] 关于抗体使用的术语“人”应理解为包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。人抗体包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因动物中分离的抗体。
[0171] 关于抗体使用的术语“人源化”是指具有基本上源自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子的剩余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域或仅包含嫁接到可变结构域中适当框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或修饰的，例如通过一个或多个氨基酸取代，优选修饰来更接近类似人免疫球蛋白。某些形式的人源化抗体保留所有CDR序列(例如含有来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。其它形式具有一个或多个相对于原始抗体改变的CDR。
[0172] 关于抗体使用的术语“嵌合”是指那些重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与衍生自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源的抗体，而链的其余部分与另一物种或类别中的相应序列同源。典型地，轻链和重链的可变区模拟衍生自一种哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分与衍生自另一种哺乳动物物种的抗体的序列同源。例如，可变区可以来源于目前已知的来源，使用容易获得的来自非人宿主生物的B细胞或杂交瘤，与衍生自例如人细胞制备物的恒定区组合。
[0173] 示例性人或人源化抗体可以通过以下制备和分离：经转化以表达抗体的重组宿主细胞，或从抗体或抗体结构域的重组、组合文库分离的抗体，或通过任何其它涉及将抗体基因序列剪接至其它DNA序列的手段制备、表达、产生或分离的抗体。
[0174] 应该理解，术语“抗体”还指抗体的衍生物，特别是功能活性衍生物。抗体衍生物理解为一个或多个抗体结构域或抗体的任何组合和/或融合蛋白，其中抗体的任何结构域可以在一个或多个其它蛋白质的任何位置融合，比如其它抗体，例如包含CDR环的结合结构、受体多肽，以及配体、支架蛋白、酶、毒素等。抗体的衍生物可以通过各种化学技术比如共价偶联、静电相互作用、二硫键等与其它物质缔合或结合而获得。与抗体结合的其它物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子或它们的任何组合(例如PEG、前药或药物)。在一个具体的实施方案中，抗体是包含允许与生物可接受的化合物特异性相互作用的附加标签的衍生物。对可用于本发明的标签没有特别限制，只要它对抗体与其靶标的结合没有或具有可耐受的负面影响即可。合适的标签的实例包括His-标签、Myc-标签、FLAG-标签、Strep-标签、钙调蛋白-标签、GST-标签、MBP-标签和S-标签。在另一个具体实施方案中，抗体是包含标记的衍生物。如本文所用的术语“标记”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合至抗体以产生“标记的”抗体。所述标记本身可以被检测到，例如，放射性同位素标记或荧光标记，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
[0175] 如本文所述的优选衍生物在抗原结合方面具有功能活性，优选其具有抗肺炎克雷伯氏菌的效力，如在CDC(SBA)和/或OPK测定中确定的，或者具有防止细菌攻击的效力。
[0176] 特别是，衍生自本发明抗体的抗体可以包含在功能上有活性以差异性结合O1抗原(例如特异性或选择性地结合O1抗原)的至少一个或多个其CDR区或CDR变体。
[0177] 衍生自亲本抗体或抗体序列(比如亲本CDR或FR序列)的抗体在本文中特别理解为通过例如在计算机或重组工程中或者通过化学衍生或合成获得的突变体或变体。
[0178] 应理解，术语“抗体”还指抗体的变体，包括具有亲本CDR序列的功能活性CDR变体的抗体和亲本抗体的功能活性变体抗体。
[0179] 术语“变体”应特别指抗体，比如突变抗体或抗体片段，例如通过诱变方法获得，特别是缺失、交换，将插入物引入到特定抗体氨基酸序列或区域或化学衍生氨基酸序列，例如在恒定结构域中，以工程改造抗体稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变结构域中，以改善抗原结合性质，例如通过本领域可用的亲和力成熟技术。可以使用任何已知的诱变方法，包括在所需位置上的点突变，例如通过随机化技术获得。在某些情况下，位置是随机选择的，例如用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸使抗体序列随机化。术语“诱变”是指用于改变多核苷酸或多肽序列的任何本领域公认的技术。优选的诱变类型包括易错PCR诱变、饱和诱变或其它定点诱变。
[0180] 术语“变体”应特别包含功能活性变体。
[0181] 如本文所用的术语CDR序列的“功能活性变体”应理解为“功能活性CDR变体”，并且如本文所用的抗体的“功能活性变体”应理解为“功能活性抗体变体”。功能活性变体是指通过一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代，或化学衍化氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列内的核苷酸，或在序列的远端的任一端或两端，例如在CDR序列中N末端和/或C末端1、2、3或4个氨基酸，和/或居中的1、2、3或4个氨基酸(即在CDR序列的中间)的化学衍生来修饰该序列(亲本抗体或亲本序列)而产生的序列，并且其修饰不会影响，尤其是不会损害该序列的活性。在结合位点对选择的靶抗原具有特异性的情况下，抗体的功能活性变体仍将具有预定的结合特异性，尽管这可以改变，例如以改变对特定表位的精确特异性，亲和力，亲合力，Kon或Koff比率等。例如，亲和力成熟的抗体特别理解为功能活性变体抗体。因此，亲和力成熟的抗体中的修饰的CDR序列理解为功能活性的CDR变体。
[0182] 特别是，本发明的抗体的功能活性变体具有特异性结合肺炎克雷伯氏菌O1的gal-II抗原的效力，和杀死循环中/血清中O1血清型的肺炎克雷伯氏菌的CDC活性。
[0183] 可以获得功能活性变体，例如通过改变亲本抗体的序列，例如包含与本文所述的任何亲本抗体相同的结合位点的抗体，但除了结合位点之外在抗体区域内具有修饰，或者通过结合位点内的修饰衍生自此类亲本抗体但不损害抗原结合，并且优选具有与亲本抗体基本相同的生物活性，或者甚至具有改善的活性，包括特异性或选择性结合肺炎克雷伯氏菌的O1抗原的能力，和杀菌性CDC活性或SBA测定中的补体介导的杀伤效力。任选地，功能活性变体可以进一步包括OPK测定中抗体介导的吞噬作用的效力，例如具有基本上相同的生物活性，如通过靶向(MDR)肺炎克雷伯氏菌的特异性结合测定或功能测试所确定的。
[0184] 抵抗或杀死肺炎克雷伯氏菌的抗体能够限制或预防感染和/或改善由这种感染引起的病情，或抑制肺炎克雷伯氏菌发病机理，特别是传播和复制进入宿主的无菌体腔/位点，或在宿主的无菌体腔/位点内传播和复制。就此而言，本文所述的以杀菌性CDC活性为特征的杀菌性抗体也理解为“保护性抗体”，意思是所述抗体负责对在主动或被动免疫中观察到的传染原(infectious agent)进行免疫。特别地，使用本文所述的保护性抗体用于治疗目的是可能的，例如用于预防或治疗，以预防、改善、治疗或至少部分阻止由病原体诱导的疾病症状、副作用或疾病进展。特别是，保护性抗体能够杀死或阻止活的肺炎克雷伯氏菌细胞的复制，例如通过诱导CDC或调理吞噬活性，或在治疗施用后(即在确定的感染时给予)从无菌体位点除去全部细菌细胞或其LPS分子。或者，预防性施用的保护性抗体通过上述或其它机制之一抑制感染的建立(即肺炎克雷伯氏菌从非无菌位点扩散至无菌体腔)。
[0185] 如本文所用的术语“基本上相同的生物活性”是指由基本上相同的活性表示的活性是可比抗体或亲本抗体所确定活性的至少20％，至少50％，至少75％，至少90％，例如至少100％，或至少125％，或至少150％，或至少175％，或例如高达200％，或甚至更高的活性。
[0186] 如本文所述的优选的变体或衍生物在抗原结合方面具有功能活性，优选其具有特异性结合O1抗原并且不结合肺炎克雷伯氏菌的其它抗原的效力，Kd值差异为至少2个log，优选至少3个log，并且进一步包括在CDC或SBA测定中的补体介导的杀伤效力，例如以实现相对于不含该抗体的对照样品的细菌数的显著降低，和/或任选地进一步包括在OPK测定中抗体介导的吞噬作用效力，比如以实现相对于不含该抗体的对照样品的细菌数的显著降低，例如具有基本上相同的生物活性，如通过对靶向肺炎克雷伯氏菌的特异性结合测定或功能测试所确定。在各种测定中活性的显著下降通常意味着至少50％，优选至少60％、70％、80％、90％、95％或98％的下降直至完全下降约100％(+/-1％)。
[0187] 在一个优选的实施方案中，亲本抗体的功能活性变体：
[0188] a)是抗体的生物活性片段，所述片段包含至少80％的分子序列，优选至少90％，或至少95％和最优选至少97％、98％或99％的分子序列；
[0189] b)是源自通过至少一个氨基酸取代、添加和/或缺失的抗体，其中功能活性变体与分子或其一部分具有序列同一性，比如至少50％序列同一性的抗体，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％、98％或99％；和/或
[0190] c)由抗体或其功能活性变体和另外至少一个与多肽或核苷酸序列异源的氨基酸或核苷酸组成。
[0191] 在本发明的一个优选实施方案中，如本文所述的抗体的功能活性变体与上述变体基本上相同，但分别与其多肽或核苷酸序列不同，不同之处在于其来源于不同的物种的同源序列。这些称为天然存在的变体或类似物。
[0192] 术语“功能活性变体”还包括天然存在的等位基因变体，以及突变体或任何其它非天然存在的变体。如本领域所知，等位基因变体是(多)肽的替代形式，其特征在于具有基本上不改变多肽的生物功能的一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。
[0193] 功能活性变体可以通过多肽或核苷酸序列中的序列改变来获得，例如通过一个或多个点突变，其中当与本发明组合使用时，所述序列改变保留或改善未改变的多肽或核苷酸序列的功能。这种序列改变可以包括但不限于(保守的)取代、添加、缺失、突变和插入。
[0194] 特定的功能活性变体是CDR变体。CDR变体包括CDR区中由至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学改变或部分改变，该修饰允许变体保留未修饰序列的生物特征。CDR氨基酸序列的部分改变可以通过一个至几个氨基酸的缺失或取代，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或者通过一个至几个氨基酸的添加或插入，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过一个到几个氨基酸的化学衍生，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或其组合来进行。氨基酸残基中的取代可以是保守取代，例如，用一个疏水性氨基酸取代另一个疏水性氨基酸。
[0195] 保守取代是发生在与它们的侧链和化学性质相关的氨基酸家族内的那些。这类家族的实例是具有碱性侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂肪族侧链、具有非极性芳族侧链、具有不带电荷的极性侧链、具有小侧链、具有大侧链的氨基酸等等。
[0197] 优选的点突变是指相同极性和/或电荷的氨基酸的交换。对此，氨基酸是指由64个三联体密码子编码的20种天然存在的氨基酸。这20种氨基酸可以分成那些具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
[0198] 下面显示了“中性”氨基酸以及它们各自的三个字母和单个字母的代码和极性：
[0199] 丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；
[0200] 天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；
[0201] 半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；
[0202] 谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；
[0203] 甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；
[0204] 异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；
[0205] 亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；
[0206] 蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；
[0207] 苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；
[0208] 脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；
[0209] 丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；
[0210] 苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；
[0211] 色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；
[0212] 酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；
[0213] 缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；和
[0214] 组氨酸：(His，H)极性，正(10％)中性(90％)。
[0215] “正”电荷氨基酸是：
[0216] 精氨酸：(Arg，R)极性，正；和
[0217] 赖氨酸：(Lys，K)极性，正。
[0218] “负”电荷氨基酸是：
[0219] 天冬氨酸：(Asp，D)极性，负；和
[0220] 谷氨酸：(Glu，E)极性，负。
[0221] 关于本文所述的抗体序列和同源物的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为候选序列中的氨基酸残基与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比，这是在对比序列并在必要时引入间隙以实现最大百分比序列同一性之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
[0222] 抗体变体特别理解为包括具有特定糖基化模式的同源物、类似物、片段、修饰或变体，例如，由糖基化工程改造产生，它们是功能性的并且可以用作功能等价物，例如结合到特异性靶标并具有功能性。
[0223] 可以将特定抗体经工程改造来掺入修饰以增加Fc效应子功能，特别是增强CDC活性和/或OPK活性。
[0224] 这种修饰可以通过诱变来实现，例如Fcγ受体结合位点中的突变或通过衍生物或试剂干扰抗体形式的CDC活性，从而实现Fc效应子功能的增加。
[0225] 通常理解的Fc效应子功能的显著增加是指Fc效应子功能的增加是未修饰(野生型)形式的至少10％，优选至少20％、30％、40％或50％，如由CDC或OPK活性测量。
[0226] 关于抗体序列，术语“糖基化工程改造”变体应指由于糖基化工程改造而具有修饰的免疫原性或免疫调节的(例如抗炎)性质、CDC的糖基化变体。所有抗体在重链恒定区的保守位置含有碳水化合物结构，每种同种型都具有不同的一系列N-连接的碳水化合物结构，其可变地影响蛋白质组装、分泌或功能活性。IgG1或IgG3型抗体通常是在它们的CH2结构域中的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。与Asn297连接的两个复合双触角寡糖掩埋在CH2结构域之间，与多肽主链形成广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能比如CDC或OPK是必需的。除去N297处的N-聚糖，例如通过突变N297，例如至A，或T299通常导致减少的CDC和OPK的非糖基化抗体形式。特别地，本发明的抗体可以是糖基化或糖基化工程改造的。
[0227] 抗体糖基化的主要差异发生在细胞系之间，并且对于在不同培养条件下生长的给定细胞系甚至可以看到微小差异。在细菌细胞中的表达通常提供非糖基化抗体。据报道，用四环素调节的β-(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(催化平分型GIcNAc形成的糖基转移酶)表达的CHO细胞具有改善的ADCC活性(Umana等人，1999，Nature Biotech.17:176-180)。除了选择宿主细胞外，在重组生产抗体期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等。
[0228] 术语“抗原结合位点”或“结合位点”是指参与抗原结合的抗体部分。抗原结合位点由重(“H”)和/或轻(“L”)链的N端可变(“V”)区域或其可变结构域的氨基酸残基形成。称为“高变区”的重链和轻链V区内的三个高度不同的区段插入在称为框架区的较保守的侧翼区段之间。抗原结合位点提供了与结合的表位或抗原的三维表面互补的表面，并且高变区称为“互补决定区”或“CDR”。掺入CDR中的结合位点在本文中也称为“CDR结合位点”。
[0229] 与如本文所使用的术语“抗原”可互换的术语“靶”或“靶抗原”应指完整的靶分子或由抗体结合位点识别的此类分子的片段。特别地，抗原的亚结构，例如多肽或碳水化合物结构，例如通常称为“表位”，例如B细胞表位或T细胞表位，其是免疫相关的，可以通过这样的结合位点识别位。特定的抗原如gal-II抗原是碳水化合物结构，并且可以作为任选提供在人造载体上的分离的抗原提供，或者以表达该抗原的肺炎克雷伯氏菌细胞或其细胞部分的形式提供。
[0230] 如本文所使用的术语“表位”应特别指可完全构成特异性结合配偶体或成为与抗体的结合位点结合的特异性结合配偶体的一部分的分子结构。表位可以由碳水化合物、肽结构、脂肪酸、有机物、生物化学或无机物质或其衍生物及其任何组合组成。表位可以是线性或构象表位。线性表位由多肽或碳水化合物链的一级序列的单个片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。
[0231] 构象表位由通过折叠多肽形成三级结构而聚集在一起的氨基酸或碳水化合物组成，并且所述氨基酸不一定在线性序列中彼此相邻。特别是，关于多肽抗原，构象表位或不连续表位的特征在于存在两个或更多个分离的氨基酸残基，其在一级序列中分开，但当所述多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，在分子表面组装成一致的结构。
[0232] 这里，术语“表位”应特别指由抗体识别的单个表位。
[0233] 术语“表达”通过以下方式理解。含有所需的表达产物的编码序列和控制序列的核酸分子可用于表达目的，所述表达产物如本文所述的抗体，所述控制序列如可操作连接的启动子。用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码的蛋白质。为了实现转化，可以将表达系统包含在载体中；但是，相关的DNA也可以整合到宿主染色体中。特别地，所述术语是指宿主细胞和相容的载体在合适的条件下，例如用于表达由载体携带并导入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白质。
[0234] 编码DNA是编码特定多肽或蛋白质(例如抗体)的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是引起、调节或介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自相同的基因或来自不同的基因，并且可以来自相同或不同的生物体。重组克隆载体通常会包含一个或多个用于克隆或表达的复制系统，一个或多个在宿主中用于选择的标记，例如抗生素抗性，和一个或多个表达盒。
[0235] 本文使用的“载体”定义为克隆重组核苷酸序列(即重组基因)转录和它们的mRNA在合适的宿主生物体中翻译所需的DNA序列。
[0236] “表达盒”是指编码可在限定的限制性位点处插入到载体中的表达产物的DNA编码序列或DNA片段。盒式限制性位点设计用于确保盒在适当的阅读框中的插入。通常，将外源DNA插入载体DNA的一个或多个限制性位点，然后由载体携带与可传播的载体DNA一起进入宿主细胞中。具有插入的或添加的DNA的DNA片段或序列，比如表达载体，也可称为“DNA构建体”。
[0237] 表达载体包含表达盒并且另外通常包含用于在宿主细胞或基因组整合位点中自主复制的起点，一个或多个可选择的标记(例如氨基酸合成基因或赋予抗生素(比如博莱霉素、卡那霉素、G418或潮霉素)抗性的基因)，许多限制酶切割位点，合适的启动子序列和转录终止子，这些组件可操作地连接在一起。如本文所用的术语“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合的核苷酸序列。普通类型的载体是“质粒”，其通常是双链DNA的自含式分子，其可以容易地接受另外的(外源)DNA并且可以容易地引入合适的宿主细胞中。质粒载体通常含有编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适合插入外源DNA的限制性位点。特别地，术语“载体”或“质粒”是指可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞中的媒介，以便转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)。
[0238] 如本文所用的术语“宿主细胞”应指经转化以产生特定重组蛋白(如本文所述的抗体)的原代主体细胞及其任何子代。应该理解的是，并非所有子代都与亲代细胞完全相同(由于故意或无意的突变或环境差异)，但是，这些改变的子代包括在这些术语中，只要子代保留与起始转化细胞相同的功能。术语“宿主细胞系”是指用于表达重组基因以产生重组多肽如重组抗体的宿主细胞的细胞系。如本文所用的术语“细胞系”是指已经获得了长时间增殖能力的特定细胞类型的已建立的克隆。这种宿主细胞或宿主细胞系可以维持在细胞培养中和/或培养以产生重组多肽。
[0239] 本文所用的关于核酸、抗体或其它化合物的术语“分离的”或“分离”应指这样的化合物，其与其天然联结的环境充分分离，使得以“基本上纯”的形式存在。“分离的”不一定意味着排除人造或合成混合物具有其它化合物或材料，或存在不干扰基本活性的杂质，并且可能存在杂质，例如由于不完全纯化而存在的杂质。特别地，本发明分离的核酸分子还旨在包括不是天然存在的例如密码子优化的核酸或cDNA，或化学合成的那些。
[0240] 同样，本发明分离的抗体特别地非天然存在，例如提供于与另一抗体或活性剂的组合制剂中，所述组合不是天然存在的，或天然存在的抗体的优化的或亲和力成熟的变体，或具有经工程改造以改善抗体的可制造性的框架区的抗体。通过这样优化或改造，抗体包含一个或多个合成序列或特征，这不会在自然界中抗体的背景下发现。
[0241] 关于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。这个术语，当应用于DNA时，是指从与它在其起源的生物体的天然存在的基因组中紧邻的序列中分离的DNA分子。例如，“分离的核酸”可以包含插入到载体，比如质粒或病毒载体，或整合到原核或真核细胞或宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。当应用于RNA时，术语“分离的核酸”主要指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，所述术语可指与其天然状态下(即在细胞或组织中)与其相关的其它核酸充分分开的RNA分子。“分离的核酸”(DNA或RNA)可以进一步表示由生物或合成手段直接产生的分子，其与其产生过程中存在的其它组分分开。
[0242] 关于多肽或蛋白质，比如本发明的分离的抗体或表位，术语“分离的”应特别指没有或基本上不含与它们天然相关的材料的化合物，所述材料比如在发现它们的自然环境中的其它化合物，或当通过重组DNA技术在体外或体内实施这种制备时其制备环境(例如细胞培养)中的其它化合物。分离的化合物可以用稀释剂或佐剂配制，并且仍然对于实际目的是分离的-例如，当用于诊断或治疗时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。特别地，本发明的分离的抗体不同于针对肺炎克雷伯氏菌菌株产生的多克隆血清制剂，因为其以分离和纯化的形式提供，优选提供于包含分离的抗体作为唯一活性物质的制剂中。但是，这并不排除分离的抗体提供于包含有限数量的其它明确定义的(分离的)抗体的组合产品中。分离的抗体也可以提供在固体、半液体或液体载体，比如珠粒上。
[0243] 如本文所用的术语“Fc区”应指与通过木瓜蛋白酶消化IgG分子而获得的可结晶片段相关的抗体部分。Fc区由IgG重链的C-末端区组成——由通过二硫键连接的IgG分子的两条重链的(C-末端)大约一半组成。Fc可以包括铰链区或铰链区的一部分，铰链区为Fc和Fab区之间的免疫球蛋白重链的富含脯氨酸的部分。IgG的Fc区包含两个恒定结构域CH2和CH3。Fc区不具有抗原结合活性并且包含碳水化合物部分和Fc受体(包括新生儿Fc受体(FcRn))的结合位点。例如，包含人IgG1Fc区的抗体分别含有人IgG1SEQ ID 7和SEQ ID 8的野生型恒定区或Fc，或其包含Fc序列的变体，该变体基于至少一个氨基酸修饰而不同于野生型Fc序列。
[0244] 抗体的Fc区可以与许多Fc受体相互作用，包括例如FcγRIs、FcγRIIs、FcγRIIs、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。对于IgG类，Fcγ受体(FcγR)是重要的，特别是关于补体介导的杀菌活性。
[0246] 不同的IgG亚类对FcγR具有不同的亲和力，其中IgG1和IgG3通常比IgG2和IgG4与受体结合得实质上更好(substantially better)。
[0247] 在补体依赖性细胞毒性中，C1q与抗体结合，并且该结合触发补体级联，导致在靶细胞表面形成膜攻击复合物(MAC)(C5b至C9)，这是由经典的途径补体激活引起。Fc上的特异性位点充当补体蛋白C1q的界面。人IgG1和IgG3的C1q结合所需的氨基酸残基位于CH2结构域中。
[0248] 在活化补体中，人IgG1和IgG3通常是四种人IgG亚类中最高效的。典型地，IgG分子上的C1q结合位点涉及CH2结构域中的残基Glu233-Pro238、Phe241、Val264-Asp270、Tyr296-Asn297、Lys322、Pro329-Glu333中的至少一个或多个。IgG1(比如Glu216-Pro232)和IgG3(比如Glu216-Pro277)的铰链区中的残基在C1q结合中也可以很重要。
[0249] IgG Fc部分上的位点(CH2和CH3结构域之间)介导与新生儿Fc受体FcRn的相互作用，其结合将内吞抗体从内体再循环回血流。IgG Fc上FcRn的结合位点也是细菌蛋白质A和G结合的位点。
[0250] Fc区的特定特征是在N297发生的保守的N-连接糖基化。该碳水化合物在抗体中起着结构和功能的作用，并且是使用哺乳动物表达系统产生抗体的主要原因之一。IgG Fc结构域与FcγR和C1q的高效结合特别需要糖基化。N297碳水化合物的组成的改变或其消除可影响Fc与FcγR或C1q的结合。
[0251] 本文使用的术语“生物样品”是指从主体(比如人类)获得的任何材料，含有或可能含有可包含肺炎克雷伯氏菌的生物材料。生物样品可以是组织、液体或细胞培养样品。根据本发明使用的样品的实例包括但不限于患者样品，例如组织或体液，特别是呼吸道样本，比如气管内抽吸物、胸膜液、肺液、鼻拭子或痰、血液样品、粪便样品、皮肤和尿液样品或脑脊髓液。
[0252] 生物样品通常包含复杂的生物基质，比如含有多种类型的生物和小的有机分子的复杂粘性生物流体，例如富含蛋白质物质的粘液渗出物。可以使用合适的添加剂或提取程序来减少与样品中的基质相关的非特异性结合和/或通过溶解和/或分解样品基质的粘性或固体组分来降低基质粘度。可采用样品制备方法，其从生物体中释放标记和/或分解和/或液化生物基质。可以分析的生物基质包括含有粘液的样品，比如鼻分泌物、唾液、痰、咽分泌物、尿道或阴道分泌物，以及此类膜表面的洗涤物。
[0253] 合适的样品制备方法包括减少生物基质对测定的影响的方法步骤。这样的方法步骤可以包括但不限于例如捕获、色谱法、旋转-离心和透析。
[0254] 从主体获得的材料也可以是细菌分离物的形式，例如以用于培养分离的肺炎克雷伯氏菌的细胞培养物或细胞培养产物的形式。培养基可以有选择性地仅仅富集肺炎克雷伯氏菌群，或是非选择性的。
[0255] 细菌分离物制备通常涉及孵育步骤以保持样品处于增强肺炎克雷伯氏菌增殖的条件下，从而富集样品中的肺炎克雷伯氏菌群。
[0256] 一旦获得分离物，可通过生物化学和/或血清学测试进一步研究细菌，例如以确定O型和表达的gal-II的水平。有几种分型方法可用于研究肺炎克雷伯氏菌菌株。这些方法通常包括血清分型、毒素分型、遗传关系/系统发育的标准分型包括多位点序列分型(MLST)，或脉冲场凝胶电泳(PFGE)。
[0257] 本文所用术语O1抗原，也称为“半乳聚糖-II”、“gal-II”或“D-gal II”，应指肺炎克雷伯氏菌的LPS O-抗原的碳水化合物结构，其包含半乳糖聚合物和包含至少一个重复单元：[-3)-α-D-Galp-(1–3)-β-D-Galp-(1-]的结构。
[0258] 包含gal-II结构的相应O-抗原在本文中称为“O1抗原”，其包括由本文所述的O1特异性抗体识别的“gal-II表位”。O1抗原理解为O1型肺炎克雷伯氏菌(肺炎克雷伯氏菌O1)的LPS的外部部分，其是包含掺入其中的一个或多个特异性gal-II表位的表面可接近的抗原性碳水化合物结构。
[0259] 如本文所用，“特异性”结合、识别或靶向是指结合剂(例如抗体或其抗原结合部分)对异源分子群中的靶抗原或相应表位显示出可观的亲和力。因此，在指定条件下(例如免疫测定)，结合剂特异性结合靶Gal-II抗原并且不以显著量结合存在于样品中的其它分子。特异性结合是指就靶标同一性而言，结合是选择性的，如所选择的，具有高、中或低结合亲和力或亲合力。如果结合常数或结合动力学与另一靶标相比存在至少10倍差异(理解为至少1个log的差异)，优选差异至少100倍(理解为至少2个log的差异)，以及更优选至少1000倍(理解为至少3个log的差异)，则通常实现选择性结合。
[0260] 本发明的优选抗体以高亲和力，特别是以高的缔合和/或低的解离速率，或高的结合亲合力特异性地结合O1抗原。抗体的结合亲和力通常以抗体的浓度来表征，其中抗原结合位点的一半被占据时的抗体浓度，称为解离常数(Kd或KD)。通常认为具有Kd<10-7M的结合剂是高亲和力结合剂，在一些情况下，例如出于治疗目的具有更高的亲和力，例如Kd<10-8M，优选Kd<10-9M，甚至更优选的是Kd<10-10M。
[0261] 亲和力成熟是产生对靶抗原具有增加的亲和力的抗体的过程。根据本文公开的本发明的各种实施方案，可以使用本领域可用的制备和/或使用亲和力成熟文库的任何一种或多种方法以产生亲和力成熟的抗体。示例性的此类亲和力成熟的方法和用途，比如随机诱变、细菌突变株传代、定点诱变、突变热点靶向、简约诱变、抗体改组、轻链改组、重链改组、CDR1和/或CDR1诱变，和根据本文公开的本发明的各种实施方案生产和使用适合实施方法和用途的亲和力成熟文库的方法，包括例如Prassler et al.(2009)；Immunotherapy,Vol.1(4),pp.571-583；Sheedy et al.(2007),Biotechnol.Adv.,Vol.25(4),pp.333-352；WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；US2002/0177170；WO2003/074679中公开的那些。
[0262] 随着抗体的结构变化(包括氨基酸诱变或由于体细胞突变在免疫球蛋白基因区段中造成的结果)，产生针对抗原的结合位点的变体并选择更大的亲和力。亲和力成熟的抗体可表现出比亲本抗体高几个log级的亲和力。单种亲本抗体可以经历亲和力成熟。或者，对靶抗原具有相似结合亲和力的抗体库可视为亲本结构，其经变化以获得亲和力成熟的单种抗体或亲和力成熟的此类抗体的库。
[0263] 根据本发明的抗体的优选亲和力成熟变体显示结合亲和力增加至少2倍，优选至少5倍，优选至少10倍，优选至少50倍，或优选增加至少100倍。在采用各亲代分子文库的选择活动过程中可以采用亲和力成熟，用具有中等结合亲和力的抗体来获得具有结合亲和力Kd<10-8M的特异性靶向结合特性的本发明抗体。或者，亲和力可以通过根据本发明的抗体的亲和力成熟而进一步提高，以获得对应于Kd小于10-9M，优选小于10-10M或甚至小于10-11M，最优选皮摩尔范围的高值。
[0264] 在某些实施方案中，通过亲和ELISA测定法测定结合亲和力。在某些实施方案中，通过BIAcore、ForteBio或MSD测定法来测定结合亲和力。在某些实施方案中，结合亲和力通过动力学方法确定。在某些实施方案中，结合亲和力由平衡/溶液法测定。
[0265] 使用术语“具有相同的特异性”，“具有相同的结合位点”或“结合相同的表位”指示相等的单克隆抗体表现出相同或基本相同的即相似的免疫反应(结合)特征并竞争结合预先选择的目标结合序列。抗体分子对特定靶标的相对特异性可以通过竞争测定来相对确定，例如，如Harlow等人描述的，ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)。
[0266] 如本文关于抗体所使用的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合部分，以与第二抗体或其抗原结合部分的结合充分相似的方式与表位结合，使得与不存在第二抗体时的第一抗体的结合相比，第一抗体与其同源表位结合的结果在第二抗体存在下可检测地下降。可选地，在第一抗体存在下第二抗体与其表位的结合也可检测地下降，可以是但不一定是这种情况。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其相应表位的结合。但是，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位结合的情况下，无论是相同程度、较大程度或者较小程度，都称抗体彼此“竞争”结合它们相应的表位。本发明特别包括与任何示例性抗体竞争结合gal-II抗原的抗体。
[0267] 本文中的竞争是指通过竞争ELISA分析或ForteBio分析测定的比约30％更大的相对抑制。可能需要设定更高的相对抑制的阈值作为在特定情况下是合适的竞争水平的标准，例如，在使用竞争分析来选择或筛选新抗体时，该新抗体设计有结合抗原的预期功能。因此，例如，可以设定竞争性结合的标准，其中检测到至少40％的相对抑制，或至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或甚至至少100％时，认为抗体具有足够竞争性。
[0268] 如本文所用的术语“诊断试剂盒”是指试剂盒或成套组件，其中组合物或混合物可用于进行一种或多种分析物或标记的测量/检测以确定疾病或病情，或者预测疾病或疾病进展。尤其是，试剂盒至少含有检测分子和/或结合剂，其中检测分子和/或结合剂特异性识别分析物或标记，或这种分析物或标记的反应产物。另外，试剂盒中可以包含各种试剂或工具。诊断试剂盒可以包含用于实施本发明方法的任何有用的试剂，包括比如微珠或平面阵列或孔的基底，用于生物标记分离的试剂，针对特定靶标的检测分子，试剂比如用于核酸测序或扩增的引物，用于核酸杂交的阵列，可检测的标记、溶剂或缓冲液等，各种接头，各种测定组分，阻断剂等。
[0269] 试剂盒还可以包括用于诊断方法的说明。这样的说明可以例如提供于包括在试剂盒中的器械上，例如用来制备用于诊断目的的生物样品的工具或器械，比如在确定标记之前分离含有细胞和/或蛋白质的部分。所述试剂盒可方便地以储存稳定形式提供，比如具有至少6个月的保质期的商业试剂盒。
[0270] 特定诊断试剂盒还包含固体支持物，其包含检测分子或具有针对目标标记的固定化图案(patterned)阵列的检测分子，优选包括含有针对第一标记的第一结合试剂的第一区域和含有针对第二标记的第二结合试剂的第二区域。
[0271] 特别是可以使用夹心形式。例如，一种或多种结合剂在与生物样品接触之前与基质缀合。所述一种或多种结合剂可以与可检测的标记缀合以用作检测分子。在其它实施方案中，所述一种或多种结合剂与可检测的标记缀合。在这种构造中，一种或多种结合剂可以在与生物样品接触之前与基底缀合以用作捕获剂。此外，一种或多种结合剂可以在与生物样品接触之前与基底缀合，和/或一种或多种结合剂与可检测的标记缀合。在这种情况下，一种或多种结合剂可以充当捕获剂和检测剂中的任一或两者。
[0272] 诊断试剂盒特别地用于免疫测定法，其中检测分子是通过免疫反应与分析物或标记结合的特异性结合剂。这种结合剂可以是结合靶抗原的抗体或抗体片段或抗体样支架。
[0273] 合适的免疫测定法是ELISA、CIA、RIA、IRMA、凝集测定法、免疫色谱法、试纸条测定法和蛋白质印迹法中的任一种。
[0274] 术语“肺炎克雷伯氏菌感染”和“肺炎克雷伯氏菌定植”以如下方式理解：肺炎克雷伯氏菌是革兰氏阴性细菌，它是肠杆菌科成员。它是一种无处不在的细菌，其也可以定植于人类宿主，通常在肠道或上呼吸道。作为机会致病菌，在免疫系统没有对其适当控制的情况下，它可以从这些位点侵入无菌体位点。在这些位点的不受控制的细菌复制将会诱发炎症，在很大程度上由从肺炎克雷伯氏菌释放的内毒素(即LPS)分子介导。在菌血症的情况下，内毒素分子可以引发感染性休克。
[0275] 肺炎克雷伯氏菌定植是指主体在可检测到的位点处具有足够高浓度的肺炎克雷伯氏菌，但细菌没有引起任何体征或症状。定植可以持续很长一段时间，分解(resolution)受到对生物体的免疫响应、来自其它生物体的竞争的影响，以及有时受到使用抗微生物剂的影响。
[0276] 通常，由肺炎克雷伯氏菌引起的菌血症可以用已知的常规抗菌疗法成功治疗，比如用抗生素、类固醇和非类固醇炎症抑制剂治疗。本发明提供了新的免疫疗法，采用特异性识别肺炎克雷伯氏菌的抗体，其任选地与抗细菌或抗炎疗法组合。用于治疗患有肺炎克雷伯氏菌感染的患者的示例性抗生素是氨基糖苷类、头孢菌素类、氨基青霉素类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、替加环素(tygecycline)、粘菌素等。
[0277] 多重耐药性(MDR)肺炎克雷伯氏菌特别理解为表现出对三种或更多种抗生素的抗性的那些菌株，例如以下药剂/组：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类、呋喃妥因、甲氧苄啶(及其组合)、磷霉素、多粘菌素、氯霉素、氨曲南或替加环素。
[0278] 随着最近出现抗生素耐药菌株，治疗这种性质的菌血症变得更加困难了。患有肺炎克雷伯氏菌病的患者与没有患肺炎克雷伯氏菌病的患者相比，患者的住院时间、ICU停留时间更长，死亡率更高，且医疗保健成本更高。当患者被肺炎克雷伯氏菌严重定植时，肺炎克雷伯氏菌病预防，可以通过预防而不是治疗来改善患者护理并降低医院内感染。
[0279] 肺炎克雷伯氏菌病特别地理解为由肺炎克雷伯氏菌感染引起的疾病。这些疾病包括局部和全身性疾病。严重的疾病例如是原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
[0280] 本文使用的术语“重组”是指“通过基因工程制备或产生”。重组宿主特别地包括表达载体或克隆载体，或者它经过基因工程改造以含有重组核酸序列，特别是使用外源于宿主的核苷酸序列。通过在宿主中表达相应的重组核酸产生重组蛋白。如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，比如(a)从对人免疫球蛋白基因是转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库或抗体的抗原结合序列文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组抗体包括经工程改造以包含例如在抗体成熟期间发生的重排和突变的抗体。根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如Maniatis，Fritsch&Sambrook，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1982)。
[0281] 选择性结合可以通过本领域已知的重组抗体优化方法进一步改进。例如，本文描述的免疫球蛋白链的可变区的某些区域可以进行一种或多种优化策略，包括轻链改组、目的诱变、CDR融合和所选CDR和/或框架区的定向诱变。
[0282] 本文所用术语“主体”应指温血哺乳动物，特别是人类或非人类动物。肺炎克雷伯氏菌是极其重要的人类病原体，也是兽药领域的新兴问题。它存在于范围广泛的非人类动物物种中。因此，术语“主体”还可以特别涉及动物，包括狗、猫、兔、马、牛、猪和家禽。特别是，本发明的医学用途或相应的治疗方法适用于需要预防或治疗与肺炎克雷伯氏菌感染相关的病情的主体。主体可以是有风险患有肺炎克雷伯氏菌感染或患有疾病(包括早期或晚期疾病)的患者。术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物主体。术语“治疗”因此意味着包括预防性和治疗性治疗。
[0283] 为了肺炎克雷伯氏菌病情的预防或治疗例如治疗主体。尤其是，治疗具有感染或发生此类疾病或疾病复发的风险的主体，或患有此类感染和/或与此类感染相关的疾病的主体。
[0284] 特别是，术语“预防”是指旨在包括防止发病机理发生的预防措施或降低发病风险的预防措施。
[0285] 特别是，治疗可以通过干扰作为病症致病因子的肺炎克雷伯氏菌的发病机理进行。
[0286] 如本文所用的术语“基本上纯的”或“纯化的”应指包含至少50％(w/w)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物(比如核酸分子或抗体)的制剂。纯度通过适合所述化合物的方法(例如色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)测量。
[0287] 本文中的术语“治疗有效量”与化合物(例如本发明的抗体)的任何术语“有效量”或“足够量”可互换使用，是指当施用给主体时足以引起有益的效果或期望的结果(包括临床结果)的量或活性，因此，其有效量或同义词取决于其施用的背景。
[0288] 有效量旨在表示足以治疗、预防或抑制此类疾病或病症的化合物的量。在疾病的情况下，本文所述的治疗有效量的抗体特别地用于治疗、调节、减弱、逆转或影响疾病或病症，所述疾病或病症受益于抑制肺炎克雷伯氏菌发病机理，例如粘膜表面的粘附和定植，无菌体位点内的不受控制的复制，以及细菌产物对宿主细胞的毒性。
[0289] 对应于这种有效量的化合物的量将根据各种因素而变化，比如给定的药物或化合物、药物制剂、给药途径、疾病或病症的类型、受治疗的主体或宿主的身份等等，但仍可由本领域技术人员常规确定。
[0290] 如本文所述的治疗有效量的抗体，比如提供给有此需要的人类患者，具体可以为0.5-50mg/kg，优选5-40mg/kg，甚至更优选高达20mg/kg，高达10mg/kg，高达5mg/kg，尽管可以指示更高的剂量，例如用于治疗急性病情。如果使用高度有效的抗体，剂量可以大幅降低。在这种情况下，有效量可以为0.005至5mg/kg，优选0.05至1mg/kg，或至少0.005mg/kg，或至少0.05mg/kg，且小于10mg/kg或小于1mg/kg。
[0291] 此外，使用本发明治疗有效量的抗体的主体的治疗或预防方案可以由单次给药组成，或者包括一系列施用。例如，抗体可以一年至少一次，半年至少一次或至少一个月一次施用。但是，在另一个实施方案中，对于给定的治疗，可以将抗体从约每周一次至约每日施用于主体。治疗期的长度取决于多种因素，比如疾病的严重程度、急性或慢性疾病、患者的年龄、抗体形式的浓度和活性。还将理解，用于治疗或预防的有效剂量可以在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定可以导致剂量的变化并且变得明显。在某些情况下，可能需要长期施用。
[0292] 用于预防性治疗的剂量通常在较低的范围内(例如至少0.005mg/kg且小于1mg/kg)，并且特别地施用一次，例如当确定主体为免疫功能低下或免疫抑制和/或处于与肺炎克雷伯氏菌接触的风险中时，或者通过长期治疗时间表，例如每年或每半年至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次剂量。用于治疗性治疗的剂量通常在疾病的急性或慢性阶段并通常在较高的范围内(例如至少0.05或0.5mg/kg且小于10mg/kg)施用，并且特别施用直至疾病治愈，通过一次或多次施用，例如定期，比如每日至少1、2、3或4次施用，或者每周至少1、2、
3、4、5或6次施用，或者每月至少1、2、3或4次施用。
3、4、5或6次施用，或者每月至少1、2、3或4次施用。
[0293] 为了开发用于预防和治疗由克雷伯氏菌菌株引起的感染的单克隆抗体，特异性mAb的分子靶标适当地是LPS O-抗原，其在克雷伯氏菌中表现出有限的异质性。这种O-侧链认为是免疫相关的，因为没有被庞大的荚膜多糖完全掩盖。
[0294] 一旦鉴定出具有所需结合特性的抗体，可以通过本领域众所周知的方法(包括例如杂交瘤技术或重组DNA技术)产生此类抗体包括抗体片段。
[0295] 例如，可以使用公知的重组表达载体(例如本发明的质粒或包含编码抗体序列的核苷酸序列的表达盒)通过分离编码所需抗体链的DNA并用编码序列转染重组宿主细胞进行表达来产生重组单克隆抗体。重组宿主细胞可以是原核和真核细胞，比如上述那些。
[0296] 根据具体的方面，核苷酸序列可用于遗传操作以使抗体人源化或改善抗体的亲和性或其它特征。例如，如果抗体用于人类的临床试验和治疗，则恒定区可以工程改造为更接近人类恒定区以避免免疫应答。可能需要基因操作抗体序列以获得对gal-II靶标更大的亲和力和更高的抗肺炎克雷伯氏菌效力。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对抗体进行一个或多个多核苷酸改变并仍然保持其与靶O1抗原的结合能力。
[0297] 通过各种手段产生抗体分子通常是很好理解的。例如，美国专利6331415(Cabilly等人)描述了一种重组生产抗体的方法，其中重链和轻链同时由单个载体或由单个细胞中的两个单独载体表达。Wibbenmeyer等人(1999，Biochim Biophys Acta 1430(2)：191-202)以及Lee和Kwak(2003，J.Biotechnology 101：189-198)描述了使用在分开的宿主细胞培养物中表达的质粒从单独产生的重链和轻链产生单克隆抗体。在例如Harlow等人，ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988)中提供了与产生抗体相关的各种其它技术。
[0298] 如果需要，可以对任何示例性抗体进行测序，然后可以将多核苷酸序列克隆到载体中用于表达或增殖。编码抗体的序列可以保持在宿主细胞的载体中，然后可以扩增宿主细胞并冷冻以供将来使用。在细胞培养物中产生重组单克隆抗体可以通过本领域已知的方法通过从B细胞克隆抗体基因来进行。
[0299] 另一方面，本发明提供了包含编码用于产生本发明重组抗体的序列的分离的核酸。
[0300] 编码抗体的核酸可以具有任何合适的特性并且包含任何合适的特征或其组合。因此，例如，编码抗体的核酸可以是DNA、RNA或其杂交体的形式，并且可以包括非天然存在的碱基、修饰的骨架，例如促进核酸稳定性的硫代磷酸酯骨架，或两者。核酸可有利地掺入本发明的表达盒、载体或质粒中，其包含在靶标宿主细胞中促进期望的表达、复制和/或选择的特征。此类特征的实例包括复制起点组件、选择基因组件、启动子组件、增强子元件组件、聚腺苷酸化序列组件、终止组件等，很多合适的实例是已知的。
[0301] 本公开内容还提供了包含一种或多种本文所述核苷酸序列的重组DNA构建体。这些重组构建体与载体(比如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)连接使用，编码任何公开的抗体的DNA分子插入载体中。
[0302] 使用任何通过培养中的细胞系产生抗体分子的方法产生单克隆抗体，例如培养重组真核(哺乳动物或昆虫)或原核(细菌)宿主细胞。用于制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohler等人的杂交瘤方法(1975,Nature 256:495-497)和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor，1984，J.Immunol.133:3001；和Brodeur等人,1987,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,(Marcel Dekker,Inc.,New York),pp.51-63)。
[0303] 使用杂交瘤方法可以鉴定或获得本发明的抗体。在这种方法中，免疫小鼠或其它适当的宿主动物如仓鼠，以引发产生或能够产生特异性结合到用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。
[0304] 测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。
[0305] 然后可将MAb从杂交瘤上清液中纯化用于进一步检测其对gal-II抗原的特异性结合，以及抗体的工程改造，例如用于不同的诊断或治疗目的。
[0306] 在某些情况下，Gal-II特异性抗体通过针对单个gal-II抗原进行筛选而出现。为了增加分离差异结合克隆的可能性，可通过对不同抗原进行持续筛选而应用多种选择性压力。
[0307] 用于鉴定具有所需选择性结合特性的抗体的筛选方法可通过展示技术使用展示抗体序列或其抗原结合序列的文库(例如使用噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞；或将核酸信息翻译成相应的(多)肽的体外展示系统)。可以基于ELISA、蛋白质印迹法或用流式细胞术(例如使用标准分析)进行表面染色来评估反应性。
[0308] 分离的抗原可以例如用于从抗体文库(例如酵母展示抗体文库)中选择抗体。
[0309] 例如，本发明特别提供gal-II特异性抗体，其通过鉴定具有结合gal-II抗原的特异性的抗体的方法获得，例如通过特异性发现选择方案。因此，可以选择包括与gal-II靶标显示反应性的抗体的抗体文库用于与靶标反应。
[0310] 本发明还提供了包含如本文所述的抗体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。这些药物组合物可以根据本发明作为推注或输注或通过连续输注来施用。适合于促进这种施用手段的药物载体在本领域中是公知的。
[0311] 药学上可接受的载体通常包括生理上与本发明提供的抗体或相关组合物或组合相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的其它实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的任何组合。
[0312] 在一个这样的方面，抗体可以与适合于期望的施用途径的一种或多种载体组合，抗体可以与例如乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇任意混合，并任选进一步压片或封装用于常规施用。或者，可以将抗体溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。其它载体、佐剂和施用方式在制药领域是众所周知的。载体可以包括控释材料或时间延迟材料，比如单独或与蜡一起使用的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或本领域公知的其它材料。
[0313] 另外的药学上可接受的载体在本领域中是已知的，并在例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES中描述。液体制剂可以是溶液剂、乳剂或混悬剂，并且可以包括赋形剂如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
[0314] 考虑药物组合物，其中配制本发明的抗体和一种或多种治疗活性剂。通过将具有所需纯度的所述免疫球蛋白与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干制剂或水溶液的形式来制备本发明抗体的稳定制剂用于储存。用于体内施用的制剂特别是无菌的，优选以无菌水溶液的形式。这很容易通过无菌过滤膜或其它方法过滤完成。本文公开的抗体和其它治疗活性剂也可以配制成免疫脂质体，和/或包埋于微胶囊中。
[0315] 包括本发明抗体的药物组合物的施用可以以各种方式进行，包括口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内(intraotically)、透皮、粘膜、局部，例如凝胶、药膏、洗剂、霜剂等，腹膜内、肌内、肺内，例如使用可吸入技术或肺部递送系统，阴道、肠胃外、直肠或眼内。
[0316] 用于肠胃外给药的示例性制剂包括适合于皮下、肌内或静脉内注射的那些，例如无菌溶液、乳剂或混悬剂。
[0317] 在一个实施方案中，本发明的抗体是唯一施用给主体的治疗活性剂，例如作为疾病改善或预防的单一疗法。
[0318] 在另一个实施方案中，将本发明的抗体与混合物(cocktail)中的其它抗体组合，例如组合在混合物或成套试剂盒中，以靶向肺炎克雷伯氏菌，使得该混合物包含施用于主体的多于一种的治疗活性剂，例如作为疾病改善或预防组合疗法。
[0319] 此外，本发明的抗体可以与一种或多种其它治疗剂或预防剂组合施用，包括但不限于标准治疗，例如抗生素、类固醇和非类固醇炎症抑制剂，和/或其它基于抗体的治疗，例如采用抗菌剂或抗炎剂。
[0320] 组合疗法特别地采用标准方案，例如用于治疗肺炎克雷伯氏菌感染。这可以包括抗生素，例如替加环素(tygecycline)、粘菌素、多粘菌素B和β内酰胺与非β内酰胺抑制剂的组合。
[0321] 在组合治疗中，抗体可以作为混合物施用，或伴随一种或多种其它治疗方案一起施用，例如可以在伴随治疗之前、同时或之后进行。
[0322] 本发明的抗体或相应的药物制剂的生物学特性可以在细胞、组织和整个生物体实验中离体表征。如本领域已知的，为了测量药物对抗疾病或疾病模型的治疗的功效，或测量药物的药代动力学、药效学、毒性和其它性质，通常在动物体内对药物进行体内测试，所述动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和猴。动物可以称为疾病模型。通常在小鼠中测试治疗剂，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。这种实验可以提供有意义的数据，用于确定抗体用作治疗剂或预防剂的潜力，具有适当的半衰期、效应子功能、杀菌活性和/或对主动或被动免疫治疗的免疫应答。任何生物体，优选哺乳动物，可以用于测试。例如由于它们与人类的遗传相似性，灵长类动物猴子可以是合适的治疗模型，因此可以用于测试主题试剂或组合物的功效、毒性、药代动力学、药效学、半衰期或其它性质。药物批准最终需要人体试验，因此当然要考虑这些实验。因此，可以在人体中测试本发明的抗体和相应的药物组合物以确定其治疗或预防功效，毒性、免疫原性、药代动力学和/或其它临床特性。
[0323] 在特定情况下，患者是免疫功能低下的患者。一些免疫功能低下的患者可能患有原发性免疫缺陷或继发性免疫缺陷。一些免疫功能低下患者正在或已经在接受免疫抑制治疗或化疗药物治疗。一些免疫功能低下的患者是移植患者。
[0324] 免疫功能低下的患者可能患有吞噬疾病，比如特征在于较低的吞噬细胞数量和/或功能受损。
[0325] 以下疾病可能导致吞噬活性受损或丧失：
[0326] 吞噬细胞的原发性免疫缺陷(4)：
[0327] 1.慢性中性粒细胞减少症：
[0328] a.周期性中性粒细胞减少症
[0329] b.严重的先天性中性粒细胞减少症
[0330] c.舒-戴二氏综合征
[0331] 2.白细胞粘着缺乏症
[0332] a.类型1
[0333] b.类型2
[0334] c.Rac 2缺陷
[0335] 3.信号传导缺陷
[0336] a.干扰素-γ和白细胞介素-12缺陷
[0337] 4.细胞内杀伤的缺陷
[0338] a.儿童慢性肉芽肿病
[0339] b.髓过氧化物酶缺乏症
[0340] c.Chédiak-Higashi综合征
[0341] d.中性粒细胞特异性颗粒缺陷
[0342] 吞噬细胞的继发性免疫缺陷(5)：
[0343] 1.中性粒细胞减少症/粒细胞减少症：血液中性粒细胞/粒细胞数量减少(<1500个细胞/ml)
[0344] a.骨髓疾病(肿瘤浸润、再生障碍性贫血、恶性血液病、肉芽肿病、放射、骨髓纤维化)
[0345] b.免疫介导的中性粒细胞减少症(药物充当半抗原，自身免疫性疾病)
[0346] c.感染(细菌性败血症、疟疾、弓形体病、病毒感染，如EBV、CMV、流感)[0347] d.营养缺乏症(营养不良，B-12缺乏症)
[0348] e.药物，化学物质(大环内酯类、普鲁卡因胺(procainamides)、吩噻嗪(phenotiazid)、磺酰胺类、氯霉素、氨基比林、抗甲状腺药物，如硫脲嘧啶、甲巯咪唑、硫氰酸盐、重金属)(6)
[0349] f.化疗，免疫抑制(自身免疫性疾病的治疗，移植后)
[0350] 2.吞噬细胞功能/趋化性障碍或降低的上调吞噬细胞产生的能力(7)
[0351] a.新生儿(在压力条件下，新生儿PMN不能发挥正常吞噬和杀微生物活性的作用。从足月新生儿的血液中分离出的PMN表现出趋化性和粘附能力降低。(8)
[0352] b.老年人(减小的吞噬能力，细胞毒性，酶释放，降低的粘附力(9)
[0353] c.糖尿病(PMN较低的杀伤力，单核细胞/巨噬细胞功能障碍(10)，肾功能衰竭和肝硬化
[0354] d.21三体
[0355] e.手术，创伤
[0356] f.皮质类固醇
[0357] g.HIV
[0358] 为了识别吞噬细胞数量和功能受损的患者，可以应用本领域技术人员已知的任何合适的技术。这些包括但不限于全血细胞计数、差异白细胞计数、外周涂片、粘附性测量、趋化性、吞噬作用、吞噬细胞的细胞内杀伤、测量特定中性粒细胞酶的测定法或检测抗中性粒细胞的自身抗体的测定法。
[0359] 因此，本发明特别提供了显示出直接杀菌活性的抗体，即不依赖于宿主的细胞免疫状态。基于这种新的抗半乳聚糖-II mAb的作用方式，在肺炎克雷伯氏菌O1侵袭性感染的情况下，这种mAb可作为附加或单独治疗剂用于免疫功能低下的患者群体。所述抗体可以为有风险获得免疫功能低下状态伴随吞噬功能降低的患者提供新的预防措施(化疗或放疗前的癌症患者，接受免疫抑制治疗的患者)或为受到肺炎克雷伯氏菌爆发影响的临床病房患者提供新的预防措施。
[0360] 通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明不限于此。
[0361] 实施例
[0362] 实施例1：开发O1-特异性人源化mAb
[0363] 通过标准杂交瘤技术开发针对O1碳水化合物抗原的鼠mAb。简而言之，用亚致死剂量的活细菌将小鼠免疫4次。在脾细胞融合后，使用提取的O1LPS(免疫印迹)或衍生的生物素化多糖抗原(ELISA)以及用完整细菌细胞的流式细胞术选择特异性杂交瘤克隆。特异性mAb表达为鼠-人嵌合抗体(小鼠可变区与人IgG1恒定重链和κ恒定轻链区融合)。将最有效的mAb进行人源化，其中鼠框架区由相应的人区替换，仅留下高变CDR区作为鼠序列。
[0364] 使用分离的(SDS-PAGE)提取的纯化的LPS分子印迹到PVDF膜上，用免疫印迹证实了O1mAb的结合特异性。mAb 8E9举例说明了O1mAb的反应性模式(图2)。以1μg/ml浓度使mAb反应1小时。使用HRP标记的抗小鼠IgG二级抗体和发光绘图法将印迹显现出来。O1特异性mAb将长分子量LPS部分染色，表明与半乳聚糖-II表位特异性结合。缺乏与O2型LPS分子的结合证实了这种特异性(因为半乳聚糖-I，血清型O1的另一个O-抗原重复单元，由O1和O2LPS分子共享)。
[0365] 实施例2：O1mAb能够结合细菌表面而与荚膜类型无关
[0366] 对于预期的杀菌活性，mAb结合到表面并触发Fc依赖性效应子功能是必不可少的。但是，肺炎克雷伯氏菌通过显示高度结构变异性的丰富的荚膜多糖(CPS)遮蔽其表面分子。
因此，重要的是要表明，发现的O1-特异性mAb可以在不同的CPS包衣存在下高效地结合细菌表面。
因此，重要的是要表明，发现的O1-特异性mAb可以在不同的CPS包衣存在下高效地结合细菌表面。
[0367] 将表达K2(ATCC 43816)或基因证实的非K2(临床分离株)CPS的肺炎克雷伯氏菌O1菌株的对数中期培养物用40μg/ml人源化或嵌合的O1-特异性mAb染色，随后用Alexa 488标记的二级抗-人IgG染色。通过流式细胞术测量细菌的荧光。如图3所示，O1-特异性mAb在两种菌株上都表现出强烈的表面染色，表明不同的CPS分子不妨碍O1表位对mAb结合的可及性。
[0368] 实施例3：菌血症鼠模型中的保护能力
[0369] 在肺炎克雷伯氏菌菌血症的鼠模型中测试纯化的人源化mAb及其亲本嵌合mAb的保护效力(图4)。在用肺炎克雷伯氏菌O1：K2菌株ATCC 43816致死性静脉攻击(5×106CFU)之前24小时，用50μg mAb腹膜内免疫小鼠。每天监测致死率，持续10天。相对于在相同剂量下接受同种型匹配的不相关mAb的对照组，嵌合的mAb以及人源化衍生物均显示出显著的保护。
[0370] 实施例4：吞噬细胞非依赖性的杀菌活性
[0371] 鉴于肺炎克雷伯氏菌菌株倾向于感染免疫功能低下的吞噬能力有限的患者，我们认为重要的是找到具有直接杀菌活性的mAb。在所谓的血清杀菌性测定(SBA)中测试mAb的吞噬细胞非依赖性补体介导的杀菌活性。O1-特异性人源化mAb G2-27和G2-33以及它们的亲本鼠-人嵌合的mAb在两种测试的血清样品中都引发剂量依赖性补体介导的细菌杀死。当使用具有不相关特异性的同种型匹配的mAb或者在使用的血清热灭活(56℃，30分钟)(未显示)时没有观察到杀菌活性，证实抗体依赖性补体介导的杀伤作用。
[0372] 这种作用并非显而易见，因为报道的半乳聚糖-II-特异性鼠IgG2b(尽管它能够诱导补体依赖性调理吞噬杀伤)缺乏补体介导的杀伤作用(即在不存在吞噬细胞时观察不到杀菌活性(1)。
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