本发明公开一种用于在稳定性冠状动脉疾病(冠状动脉疾病：CAD)中根据患者的个体心脏病风险(cardiac risk)进行患者分级的新方法。在稳定性CAD情况下的患者，典型地是带有经血管造影术证明的CAD的患者，即，带有受侵害的冠状动脉，在冠状动脉的内壁上有斑块(动脉粥样硬化)和在主冠状动脉中有狭窄。CAD被认为是一种严重的心脏病风险。如果CAD自身没有表现为急性心血管事件的形式，认为CAD患者是“稳定的”。

考虑到未来心血管事件的内在风险，非常需要能够在稳定性CAD患者群体中根据他们的个人心脏病风险区分不同的群体，从而能够根据某个具体患者被分入的风险组而确定其为“个人警戒状态”。这种对患者的分组通常被称为“分级”。

将高风险患者与中度或低风险患者区分开将允许为特定的患者更好地选择最适当的治疗策略，避免例如，一方面低估心脏病风险和对高风险患者用药不足，另一方面对低风险患者的不必要的治疗干预和相关费用。

因此，本发明的目的是提供新的方法，借此能够根据稳定性CAD患者的个人心脏病风险，即根据其未来发生心血管事件的个体风险，将所述患者分级。

如下文所进一步详细解释的，为了对稳定性CAD患者进行分级，发明者进行了研究以评估数种能够从患者的血液循环中被确定的分析物(生物分子，生物标记物)的潜在用途。

在所述研究过程中他们意外地发现，在很低的生理浓度范围内(此浓度至今为止被认为是低于诊断意义的且因此是正常健康个体的典型浓度)对CAD患者血液循环中的肽降钙素原(PCT)的浓度的高度灵敏测量允许对CAD患者的有用分级；而且如果将针对PCT获得的结果与对另一种作用类型的分析物(一种血管活性分析物)，例如所谓B型(或脑)利尿钠肽BNP的测量结果相组合而进行评估，所述高度灵敏PCT测定的有用性甚至能够被增加。

因此，本发明公开了如权利要求1至6中任一项所要求保护的方法和分别根据权利要求7和8，PCT的高度灵敏测定在为患者进行风险分级的心血管疾病预后的情境中(尤其是在动脉硬化和CAD中)的用途。

根据本发明被测量的降钙素原(PCT)已经成为公认的用于脓毒症诊断的生物标记：PCT反映细菌感染的严重性，并特别被用于监测感染向脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克的进展。可以使用PCT以测量全身性炎性应答的活性，控制治疗的成功，并估计预后(1)(2)(3)(4)(5)。脓毒症患者中PCT水平的升高与死亡率相关(6)。

尽管越来越多的研究在探索PCT在其他感染性疾病如肺炎、细菌性脑膜炎和疟疾中的潜在作用(7)(8)(9)，还没有研究报道关于PCT在稳定性冠状动脉疾病(CAD)患者的风险分级中的潜在用途。体外研究表明PCT在单核细胞粘附和迁移过程中有重要作用，并且对可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)基因表达有作用(10)(11)(12)。PCT水平与动脉粥样硬化中动脉壁的低度炎症间的关系及其在内膜功能紊乱中的潜在作用还未被分析。我们的预期的研究在连续参加的稳定型心绞痛患者的大型群体中检测了PCT对心血管结果的预后作用以评估PCT测量在CAD中潜在的临床应用性。

在脓毒症及相关状况的情境中，其中PCT的浓度达到了相当高的生理浓度，PCT在传统上是通过使用两种结合到PCT分子不同部分的单克隆抗体的三明治型的测定而被测量的，因此基本上只有完整的PCT分子被检测到(见，例如，(1))。典型的双面化学发光测定对PCT的典型功能性测定的灵敏度(FAS)为300ng/L(0.3ng/ml或0.3μg/L)。

最近，用于确定PCT的新的高度灵敏测定已经被研发出来了(28)。此新测定的功能性测定灵敏度(FAS，测定间CV＜20％)＜7ng/l PCT。使用此测定，可以测定健康个体中典型的PCT浓度。在500名健康个体中所述范围是＜7至63ng/L(＜0.007到0.063ng/ml)，即浓度范围远低于0.1ng/ml。所测定的中位数为13.5ng/L(平均值的95％置信区间为12.6至14.7ng/L)。

以进一步改善了的形式，所述灵敏的PCT测定可作为具有0.01ng/m l的分析测定灵敏度和至少0.05ng/ml的功能性测定灵敏度(FAS)的PCT灵敏性LIA(B.R.A.H.M.S AG，Hennigsdorf，德国)被使用。时间分辨扩增穴状化合物释放(time-resolved amplifiedcryptate emission，TRACE)技术的相关测定(Kryptor PCT，B.R.A.H.M.S AG，Hennigsdorf)具有0.06μg/L(0.06ng/ml)的功能性测定灵敏度。

最近的灵敏性PCT测定主要是连同下呼吸道感染(社区获得性肺炎，CAP；慢性阻塞性肺疾病的恶化，COPD；见(29)，(30)，(31))中抗生素治疗的指导一起被使用。在CAP的情况中，基于所测量的PCT浓度建议抗生素治疗如下：强烈鼓励，超过0.5μg/L；鼓励，大于0.25μg/L；不鼓励，少于0.25mg/L；强烈不鼓励，少于0.1μg/L(29)。换言之，0.1μg/L(或0.1ng/ml)的浓度被认为是对健康个体而言的典型浓度。

对稳定性冠状动脉疾病(稳定性CAD)患者的风险分级的方法基于对所测量的PCT浓度的差异评估，所述PCT浓度低于健康个体中的值0.1ng/ml且至今未被用于以预后为目的的诊断。

本发明在以下各部分，及其中提及的附图1至3和表1至7中进行详细讨论。被提及的表格在说明书文本末尾的单独页面上。

在附图中：

图1：显示Kaplan-Meier存活曲线，其显示根据降钙素原四分位数的心血管事件；

图2：显示Kaplan-Meier存活曲线，其显示根据降钙素原的0.05ng/ml的临界值的心血管事件；

图3：Kaplan-Meier存活曲线，其显示根据组合分析中的降钙素原和B型利尿钠肽的心血管事件。

方法：

研究群体

在1996年十一月与2004年一月之间，3326名具有经血管造影术证明的CAD及在主冠状动脉中被诊断为至少一处≥30％的狭窄的患者参与了AtheroGene注册，是在Ma inz的Johannes Gutenberg大学医学II部或者Koblenz的德国联邦军队中心医院(German FederalArmed Forces Central Hospital)的医学部进行的。之前已经描述了AtheroGene研究概念的进一步细节(13)。

在目前的分研究中，排除标准是急性冠脉综合征的临床征候(不稳定性心绞痛Braunwald分级B级或C级，急性ST段升高，和非ST段升高心肌梗死)。在过去四周中有冠状动脉搭桥手术或者冠状动脉重建的患者也被排除。排除的其他理由是在血液动力学上显著的心脏瓣膜病的证据、在之前一个月内的手术或创伤、已知的心肌病，显现的癌症，慢性炎性疾病，发热状况，或在此前的四周内使用口服抗凝血剂治疗。

典型风险因子的历史被评估如下：接受抗高血压治疗或已经证实了高血压的诊断(血压在160/90mmHg以上)的患者被认为有高血压。在使用降脂药物或者有胆固醇水平≥240mg每分升的历史的患者中，诊断有高脂蛋白血症。患者被分为目前吸烟，过去吸过烟(如果他们在多于4周且少于40年之前停止)，或从未吸过烟(如果他们从未吸过烟或已于40年或更多年之前停止)。我们认为接受针对糖尿病的饮食治疗或药物治疗的患者或当前的空腹血糖水平高于125mg每分升的患者患有糖尿病。

1124名患者在平均为3.8年(最长6.8年)的阶段内被随访。患者或者来到我们的门诊(78.2％)或者被受过训练的医疗人员电话采访。包括由于心血管原因的死亡(n＝40)，源自与冠状动脉疾病无关的死亡(n＝30)，和非致命性心肌梗死(n＝32)的随访信息从医院或普通开业医图表获得。初级终点是非致命性心肌梗死和心血管死亡。

AtheroGene研究是被Mainz大学的地方伦理委员会批准的。研究参与者具有德国国籍并尤其为Rhein-Main地区的居民。所有的患者都是高加索人。参与者是自愿的，而且是获得经书面通知的允诺后使患者参与的。

实验方法

血液样本是在进行冠状动脉血管造影术之前，在标准条件下抽取的。样本是在患者空腹最少12小时后进入导管插入术实验室时取得的。立即测量血清脂质水平。使用常规方法测量脂质水平(总胆固醇和甘油三酸酯，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国；高密度脂蛋白胆固醇，Rolf Greiner Biochemica，Mannheim，Flacht beiLimburg，德国；和根据Friedewald公式计算的低密度脂蛋白胆固醇)。通过将LDL水平除以HDL水平计算LDL-/HDL-比。

将血浆和血清样本以4000g离心10分钟，将其分成等份并储存在-80℃待分析。通过高度灵敏的发光免疫测定(B.R.A.H.M.S PCT灵敏，B.R.A.H.M.S AG，Hennigsdorf，德国；分析测定灵敏度：0.01ng/ml；功能测定灵敏度(20％，测定间变异系数)：0.05ng/ml)测定PCT。数据是使用同一批次的化学物质生成的。C反应蛋白(CRP)是通过乳胶颗粒增强的免疫测定分析的(Roche Diagnostics，Mannheim，德国；检测范围：0.1至20mg/l；测定间变异系数对于15mg/l为1.0％，对于低于4mg/l为6.5％)。血浆B型利尿钠肽(BNP)是使用荧光免疫测定测定的(Biosite，San Diego，California，USA；检测范围：5至5000pg/ml；测定间变异系数接近10％；与其他利尿钠肽的交叉反应可忽略不计)。所有的实验测量是在不知道患者临床状况时以“盲法”进行的。

统计学考虑

根据降钙素原的四分位数计算研究参与者的基线心血管风险因子、临床变量和生物标记物的平均值(±标准偏差)和比例。由于降钙素原水平的范围小，四分位数包含不同数量的患者。偏态分布的变量(|偏度|＞1)呈现为四分位数的中位数。相关性分析是通过Spearman等级相关进行的。在另一分析中，最高的PCT四分位数相对于其他PCT四分位数的风险比根据典型风险因子或者临床变量和生物标记物的中位数被二分。

通过Cox回归分析在不同的模式中分析生物标记物PCT和BNP与根据四分位数的初级终点间的关联，第一种模式针对年龄和性别进行校正而第二种模式针对潜在的混杂因素和典型风险因子(年龄，性别，身体质量指数，高血压，糖尿病，吸烟状况，LDL-/HDL-比，患病的血管数量，β-阻滞剂和抑制素治疗)进行校正。通过Kaplan-Meier法估算根据PCT浓度的四分位数的累积事件曲线图，并使用时序检验对其进行比较。所有的存活分析都是针对非致命性心肌梗死或心血管死亡的初级终点进行的。死于与心血管疾病不相关的原因的患者的数据在死亡时被删减。

PCT和BNP经对数变换以提高模式拟合。为了比较这些生物标记物的预测能力，在单变量分析和多变量分析(针对典型风险因子和临床变量进行了校正)中计算每增加一个标准偏差的风险比。使用反向逐步Cox回归法进行多变量分析，所述多变量分析以P＝0.10作为在模式中加入或排除10个变量(年龄，性别，身体质量指数，高血压，糖尿病，吸烟，LDL-/HDL-比，患病的血管数量，抑制素和β-阻滞剂治疗)的关键值。

风险比(HR)和95％置信区间(CI)以双尾概率值被报导。使用基于检验光滑曲线的显著斜率的标准方法来检查比例风险假设，所述检验是通过重标Schoenfeld残差相对于时间的分布。

为了进一步评估所述模式的预测能力，发明者将两年时的心血管终点看作二进制变量并进行了逻辑回归。为含有典型风险因子的基本模式和另外还含有PCT、CRP和BNP的模式绘制了对于所预测概率的相关接受者操作特征(ROC)曲线。连同95％CI计算了曲线下的相应面积。

发明者进一步评估了PCT和BNP对心血管风险的组合作用，并因此通过使用最高四分位数作为临界点对所述两个变量进行二分分析后测试了相互作用。报导了风险比和95％CI，以及P值。针对这四个亚组使用Kaplan-Meier法估算了另一个累积事件曲线并使用时序检验进行了比较。

因为未针对多个检验对P值进行校正，它们须被认为是描述性的。所有的计算均使用Windows的SPSS 15.0，版本15.0.1(SPSSInc.，Chicago，Illinois，USA)进行。

结果

研究群体的平均年龄为61.3±9.5岁，80.5％的患者是男性。根据PCT水平的四分位数将本分研究的患者分为4个组(表1)。未发现典型风险因子分布的显著差异。第四四分位数中的CRP水平高于其他四分位数中的(3.66mg/l对比1.81-2.10mg/l)。发现PCT和CRP之间有中等相关性(r＝0.27)。

发明者进一步在亚组分析中评估了PCT的预测值(表2)。使用中位数水平来二分连续变量。特别地，PCT水平在BNP血清浓度高于中位数37.48pg/ml的患者中有很强的预兆性，对于最高的PCT四分位数，风险增加2.41倍(95％CI 1.32-4.42；P＝0.004)。

表3概述了PCT、CRP和BNP与未来心血管事件的关联。事件的百分比跨四分位数而增加(图1)，例如在对年龄与性别进行了校正的模式中，最高PCT四分位数中的患者与未来心血管事件的风险增加2.27倍相关(95％CI：1.14-4.51；P＝0.02)。在针对大多数潜在混杂因素进行了校正的模式中，此关联仍然是显著的。如果被作为连续变量进行分析，一个PCT的标准偏差(SD)的增加显示了未来心血管事件的风险升高1.33倍(95％CI：1.02-1.74；P＝0.04)。BNP水平已被独立地与初级终点相联系，而在完全校正的模式中没能观察到CRP和心血管结果间的显著关联。

如表4所列，所有的典型风险因子和临床变量都被加入了反向多元逐步回归分析。对连续变量进行了对数变换，并以每一个SD的增加对连续变量进行了处理。PCT(HR 1.30，95％CI：1.00-1.70；P＝0.05)被选为心血管风险的独立预测因子。最终模式还显示了LDL-/HDL-比、女性性别和胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)作为初级终点的预测因子。

在另一亚分析中，选择0.05ng/ml的PCT水平(依照功能测定灵敏度)作为心血管风险预测的临界值。39名PCT水平超过0.05ng/ml的患者中的25％经历了心血管事件，并有显著较差的预后(图2)。当被加入反向多元逐步回归分析中时，超过0.05ng/ml的PCT水平与升高4.22倍的心血管风险相关联(95％CI：2.07-8.59；P＜0.001)(表5)。

为了进一步探究PCT和BNP是否在获得自典型风险因子的信息以外增加了信息，发明者将2年时的心血管终点看作二进制变量计算了与不同的逻辑回归模式的预测相关的ROC曲线下的面积(AUC)(表6)。由于有随访不足2年的患者，仅1057名患者可用于此分析；其中的46名经历了的心血管事件。包括典型风险因子(例如年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、吸烟状况、LDL-/HDL-比、患病血管数量、β-阻滞剂和抑制素治疗)的基本模式显示AUC为0.74(95％CI：0.67-0.81)。表6呈现了比较该基本模式与另外包括PCT或BNP或二者，或其全部的模式的分析。包含对PC T的一个SD增加改善了所述基本模式的预测价值，报导了从0.74到0.77的增加。BNP的一个SD增加显示了超出应用所述基本模式之外的最多附加信息。所述基本模式与BNP和PCT的组合产生了此模式的最高的预后准确性。1年和3年随访过程中的结果是相似的(数据未显示)。

由于在具有超过中位数的BNP水平的患者中PCT的强预测价值(表2)和当BNP与PCT在模式中与典型风险因子相组合时对于心血管事件的高预后准确性(表6)，发明者最后探索了PCT在什么程度上可能增加BNP的预后价值(表7)。相互作用的测试是阴性的(P＝0.78)，发明人假设这两种生物标记物有加成效果。在上四分位数中具有两种标志物水平升高的患者有最高的未来心血管事件风险(HR 7.04；95％CI：3.40-14.57；P＜0.001)。图3提供了根据组合分析中PCT和BNP水平的Kaplan-Meier存活曲线。

讨论

在具有经血管造影术记录的CAD的这一预期患者同期组群中，证明了PCT与未来心血管事件的独立关联。在针对大多数潜在混杂因素进行校正后，这种关联并未有可观的改变，表明除典型风险因子和其他临床变量之外，PCT提供了有关心血管预后的重要信息。PCT和BNP的组合分析改善了本研究中未来心血管事件的预后准确性。

至今，只有两项研究评估了PCT在CAD处置中的潜在用途。Erren等人(14)只在带有额外的外周动脉疾病(PAD)的CAD患者中发现了略有增加的PCT水平，并讨论了将PCT作为多重标记物法中动脉粥样硬化负荷的标记物。

Ilhan等人(15)发现经历心血管事件的CAD患者中有更高的PCT水平(0.40±0.04ng/ml，相对于对照组中的0.19±0.02ng/ml)。在这里发明者证明了PCT作为未来心血管事件的独立预测因子，特别是为有高BNP水平的患者增加了信息，显示PCT在高风险个体中进行更好地分级的潜力。

影响某些类型组织的局部或全身炎症，和与创伤有关的宿主应答(16)(17)(18)(19)(20)，以及连续的单核细胞活化是PCT产生的前提(4)。外周血单核细胞中PCT信使RNA的表达(21)在体外不仅被脂多糖刺激，而且还被在动脉粥样硬化过程中似乎发挥关键作用的促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所刺激(22)(23)(24)(25)。因此，略有增加的PCT水平可能是动脉粥样硬化引起的血管壁内炎症活性的附带现象。然而，PCT似乎在单核细胞活化中发挥起因性作用：作为起初只在粘附单核细胞中产生的化学吸引物，其募集发炎组织的晚期实质细胞以进一步产生PCT。因此，PCT还可能对白细胞迁移有影响(4)(10)(11)(14)。进一步的研究需要调查，在体外被证明的PCT对一氧化氮合酶基因表达的刺激作用(12)是否也对由动脉粥样硬化引起的内皮功能紊乱有影响。

在本研究中，上四分位数中带有PCT和BNP水平的组合升高的患者初级终点的风险增加7.0倍，相比而言，只有BNP升高时风险增加3.2倍。因而，PCT显著改善了基本模式的AUC(典型风险因子)用于风险预测并甚至在生物标记物BNP之外获得了附加信息。

BNP是公认的左心室功能障碍的标记物。脓毒症标记物PCT还可能是低度炎症的标志物，尤其是如数个体外研究中所示的针对单核细胞活化和内皮功能紊乱。BNP和PCT所代表的两种不同的致病机理将解释对未来心血管事件的预后准确度的改善。需要进一步的研究来评估PCT在严重的细菌感染之外的疾病中的风险预测作用，并进一步阐明其在炎症级联中的病理生理学作用。

由于表7和图3的分析中临界值的选择是数据驱动的，其结果只能给出线索，但必须在独立的研究中被验证。

总之，PCT在CAD患者群体中是与未来的心血管事件独立相关的且可能为风险分级增加信息，尤其是在高危个体中。

总结：

背景：降钙素原(PCT)是公认的用于诊断和治疗监测脓毒症的生物标记。体外研究表明，PCT对单核细胞的活化甚至对一氧化氮的合成有作用。当前预期性研究检验了PCT在已确定的冠状动脉疾病(CAD)患者中对心血管结果的预后作用。

方法：在预期性AtheroGene调查的一个分研究中，在1124名稳定性CAD患者中，根据PCT的基线浓度，评估了在平均3.8年(最长6.8年)的随访中心血管死亡和非致命性心肌梗死的风险(N＝72)。

结果：当与第一四分位数相比时，PCT的最高四分位数中患者的针对年龄和性别校正后的风险比与心血管死亡和非致命性心肌梗死的相对风险的2.27倍的增加(95％置信区间(CI)：1.14-4.51；P＝0.02)相关。对典型风险因子和临床变量的校正并没有削弱这种关系。包含对PCT的一个标准偏差增加改善了针对心血管风险预测的基本模式的预测值(典型风险因子)，所述预测值是由更高的心血管风险的曲线下面积(AUC)(CI：3.40-14.57；P＜0.001)监测的。

结论：PCT的基线浓度与稳定性CAD患者中的未来心血管事件是独立相关的。

表1

根据四分位数的研究群体的基线特征

所示数据是患者的百分比、平均值±标准偏差、或中位数和偏态分布变量(|偏度|＞1)的25th/75th四分位数间距。对于818名患者可得到左心室射血分数，对于1032名患者可得到B-型利尿钠肽。LDL表示低密度脂蛋白，HDL表示高密度脂蛋白。要将胆固醇的数值转换为毫摩尔每升，乘以0.02586；要将甘油三酸酯的数值转换为毫摩尔每升，乘以0.01129。

表2

根据典型风险因子的最高降钙素原四分位数相对于其他降钙素原四分位数的风险比(95％置信区间)(对于年龄和性别校正过的)

用中位数水平来二分连续变量

*仅对于性别进行了校正 **仅对于年龄进行了校正

表3

根据基线降钙素原、C-反应蛋白和B-型利尿钠肽的四分位数的未来心血管事件的风险比

*多变量风险因子校正包括年龄、性别、身体质量指数、高血压、糖尿病、吸烟状况、LDL-/HDL-比、患病血管的数量、干扰素和β-阻滞剂治疗。

表4

心血管风险预测因子的反向多元逐步cox回归分析的最终模式

表5

心血管风险预测因子的反向多元逐步cox回归分析的最终模式

表6

对于2年后初级终点的预测，除典型风险因子(基本模式)之外，降钙素原、C反应蛋白和B型利尿钠肽对ROC曲线下面积的增加效果(均经过对数变换)

表7

组合分析中，根据降钙素原和B型利尿钠肽的基线水平，对于未来心血管事件的风险比和95％置信区间(完全校准的*)

*多变量风险因子校正包括年龄、性别、身体质量指数、高血压、糖尿病、吸烟状况、LDL-/HDL-比、患病血管的数量、干扰素和β-阻滞剂治疗。

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