一种治疗骨科疾病的原料药及其制备方法
阅读：623发布：2023-02-13
专利汇可以提供一种治疗骨科疾病的原料药及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 治疗 骨科 疾病 的 原料药 ，该原料药为川续断皂苷VI，由含川续断皂苷VI的中药材提取制备而得，川续断皂苷VI的重量百分数含量占川续断皂苷VI提取物总量的95.0％～99.9％，其化学名称为3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂 苷元 -28-O-β-D-吡喃 葡萄糖 (1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。本发明还公开了川续断皂苷VI原料药的制备方法，该方法分为提取、浓缩、分离总皂苷、脱色、纯化精制几个步聚，该制备方法的优点是本制备方法提取率高、成本低、安全环保，适用于工业化大生产。本发明还提出了该原料药在制备防治骨质疏松、骨折、骨性关节炎的骨科疾病治疗药物方面的应用。，下面是一种治疗骨科疾病的原料药及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种治疗骨科疾病的原料药的制备方法，该原料药为川续断皂苷VI，其特征在于，包括下列步骤：
1)提取、浓缩：取续断、木通或预知子含川续断皂苷VI的中药材，用低级醇或含水的低级醇提取，滤过，得提取液A；将所得提取液A减压回收醇，浓缩至相对密度为1.20～1.40，得浓缩液B；
2)浓缩液处理：将浓缩液B加水稀释成每毫升含0.3～1.5g生药材的溶液，加碱调节pH值到7.0～10.0，静置4～36小时，滤过或离心，分取上清液，得溶液C；
3)分离总皂苷：将溶液C上样于装有大孔树脂的层析柱上，所用的大孔树脂是SA-1、SA-2、ADS-5、ADS-7、ADS-8、AB-8和D201中的一种或两种，循环吸附2～3次，用2～3倍量柱体积的0.5～5.0％的碱液洗脱后用水洗至近中性，再用2～4倍量柱体积的10～40％乙醇洗脱，弃去洗脱液；最后用4～8倍量柱体积的50-95％乙醇洗脱，收集洗脱液，得总皂苷提取液D；
4)脱色：将总皂提取液D过氧化铝或脱色树脂柱或采用活性碳进行脱色；将脱色后的总皂苷提取液减压回收醇，浓缩，干燥，得川续断皂苷VI粗品；
5)纯化、精制川续断皂苷VI：将川续断皂苷VI粗品用水或含水的低级醇制成溶液，进一步采用柱层析分离纯化或采用不同极性溶剂分级萃取纯化精制即得川续断皂苷VI，所用的不同极性溶剂分级萃取是指先用含醇的乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取数次，再用正丁醇或水饱合正丁醇萃取数次，合并正丁醇萃取液。
2.根据权利要求1所述的治疗骨科疾病的原料药的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)和步骤5)中低级醇的碳数为C1～C4，浓度为X，0％＜X≤100％。
3.根据权利要求1所述的治疗骨科疾病的原料药的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)中的提取方法为煎煮法、加热回流法、浸出法或渗漉法。
4.根据权利要求1所述的治疗骨科疾病的原料药的制备方法，其特征在于，所述的步骤2)和步骤3)中的碱液是NaOH、KOH、Ca(OH)2、K2CO3、Na2CO3、NaHCO3、氨水和三乙胺中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1所述的治疗骨科疾病的原料药的制备方法，其特征在于，所述的步骤5)中的纯化精制方法采用下列方法之一或混合使用：
1)将川续断皂苷VI粗品用洗脱液溶解，离心或微滤后上样于葡聚糖凝胶柱层析分离，洗脱液为5～80％醇，采用部分收集器收集，将主含川续断皂苷VI流分收集，合并，减压回收醇，浓缩干燥，即得精制川续断皂苷VI；
2)将川续断皂苷VI粗品用洗脱液溶解，离心或微滤后上样于反相柱层析分离，洗脱液为20～90％醇，采用部分收集器收集，将主含川续断皂苷VI流分收集，合并，减压回收醇，浓缩干燥，即得精制川续断皂苷VI；
3)将川续断皂苷VI粗品用水制成每毫升含50～300mg粗品的溶液，用碱调p H值至
8.0～11.0，先用含醇的乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取数次；再用正丁醇或水饱合正丁醇萃取数次，合并正丁醇萃取液；再用水反洗正丁醇萃取液2～4次；减压回收正丁醇至原体积的1/5～1/3后放置12～48小时，去除沉淀，继续浓缩，干燥，即得川续断皂苷VI，如纯度低于95％，采用含水的碳数为C1～C4的低级醇或混合有机溶剂进行重结晶，即得精制川续断皂苷VI。
6.根据权利要求2-5任一项所述的治疗骨科疾病的原料药的制备方法，其特征在于，所得的川续断皂苷VI的重量百分数含量占川续断皂苷VI提取物总量的95.0～
99.9％，其化学名称为3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，化学结构式为：
7.根据权利要求6所述的治疗骨科疾病的原料药的制备方法，其特征在于，所述的骨科疾病是指骨质疏松、骨折、骨性关节炎或骨质增生。
一种治疗骨科疾病的原料药及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种治疗骨科疾病的原料药，同时本发明还涉及一种治疗骨科疾病的原料药的制备方法。
背景技术
[0002] 续断为川续断科植物川续断Dipsacus asperoides.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根。始载于《神农本草经》，列为上品，记载其“味苦，微温，主伤寒，补不足，金疮，痈疡，折跌，续筋骨，妇人乳难。久服，益气力。一名龙豆，一名属折。”李时珍谓“续断、属折、接骨，皆以功命名也。”从其命名可见续断自古就为骨伤科要药。今药典记载：“味苦、辛，微温。归肝、肾经。补肝肾，强筋骨，续折伤，止崩漏。用于腰膝酸软，风湿痹痛，崩漏，胎漏，跌扑损伤。酒续断多用于风湿痹痛，跌扑损伤”。足见续断自古为骨科疾病的有效治疗药物。 [0003] 近代研究表明续断中主要化学成分有：皂苷类、环烯醚萜类、生物碱、挥发油等成分。本发明人对湖北或四川产的多批续断进量总皂苷的测定含量可达10.0％～16.0％，其中以川续断皂苷VI含量为主，2005年版中国药典规定川续断药材中川续断皂苷VI含量不少于2.0％。川续断皂苷VI又称木通皂苷D，不仅存在于续断药材中，木通、预知子、山银花中也存在，其中木通中含量也较高。至今虽从续断药材中分得20多种皂苷成分，但未见适用于工业化生产的高纯度川续断皂苷VI的制备方法报道，也未有人对高纯度川续断皂苷VI在骨科疾病应用方面报道。续断药材在传统医学中常用于腰膝酸痛、风湿痹痛、跌打损伤及安胎，现代药理学研究表明续断有促进骨损伤愈合、抗骨质疏松、抗衰老、抗菌、抗炎镇痛、免疫调节等作用。川续断皂苷VI作为续断药才中有效成分的代表成分之一，通过适宜的工艺制备高纯度的川续断皂苷VI，达至国际一类新药的要求，将有望成为一个国内外创新药物。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种治疗骨科疾病的原料药——川续断皂苷VI。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种环保安全、提取率高、可用于工业化生产的川 续断皂苷VI的制备方法。
[0006] 治疗骨科疾病的原料药川续断皂苷VI是由续断或其它含川续断皂苷VI的药材提取制备而得，其的重量百分数占提取物总量的95.0％～99.9％。
[0007] 本发明提供了一种治疗骨科疾病的原料药，该原料药为川续断皂苷VI，由含川续断皂苷VI的中药材提取制备而得，川续断皂苷VI的重量百分数含量占川续断皂苷VI提取物总量的95.0～99.9％，其化学名称为3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，化学结构式为：
[0008]
[0009] 本发明所述的骨科疾病是指骨质疏松、骨折、骨性关节炎或骨质增生。 [0010] 本发明所述的含川续断皂苷VI的中药材是指续断、木通或预知子。
[0011] 本发明所述的原料药可与药学上可接受的辅料混合制成固体制剂或液体制剂，其中所述的固体制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、贴剂或注射用冻干粉，所述的液体制剂为口服液、软胶囊、膏剂或注射液。
[0012] 本发明还提供了一种从中药材中提取川续断皂苷VI的有效方法，提取所得样品中川续断皂苷VI重量百分含量高达95.0～99.9％，本纯度在本技术领域属很高范围。该提取方法包括下列步骤：
[0013] 1)提取、浓缩：取含川续断皂苷VI的中药材，用低级醇或含水的低级醇提取，滤过，得提取液A；将所得提取液A减压回收醇，浓缩至相对密度为1.20～1.40，得浓缩液B； [0014] 2)浓缩液处理：将浓缩液B加水稀释成每毫升含0.3～1.5g生药材的溶液，加碱调节pH值到7.0～10.0，静置4～36小时，滤过或离心，分取上清液，得溶液C；
[0015] 3)分离总皂苷：将溶液C上样于装有大孔树脂的层析柱上，循环吸附2～3次，用2～3倍量柱体积的0.5～5.0％的碱液洗脱后用水洗至近中性，再用2～4倍量柱体积的
10～40％乙醇洗脱，弃去洗脱液；最后用4～8倍量柱体积的50-95％乙醇洗脱，收集洗脱液，得总皂苷提取液D；
10～40％乙醇洗脱，弃去洗脱液；最后用4～8倍量柱体积的50-95％乙醇洗脱，收集洗脱液，得总皂苷提取液D；
[0017] 5)纯化、精制川续断皂苷VI：将川续断皂苷VI粗品用水或含水的低级醇制成溶液，进一步采用柱层析分离纯化或采用不同极性溶剂分级萃取纯化精制即得川续断皂苷VI。
[0018] 上述制备方法中，所述的步骤1)和步骤5)中低级醇的碳数为C1～C4，浓度为X，0％＜X≤100％，本发明优选乙醇和正丁醇；所述的步骤1)中的提取方法为煎煮法、加热回流法、浸出法或渗漉法；所述的步骤2)和步骤3)中的碱液是NaOH、KOH、Ca(OH)2、K2CO3、Na2CO3、NaHCO3、氨水和三乙胺中的一种或几种的混合物；所述的步骤3)中分离总皂苷所用的大孔树脂是SA-1、SA-2、ADS-5、ADS-7、ADS-8、AB-8和D201中的一种或两种，本发明优选SA-2、SA-2和ADS-5；所述的步骤5)中的纯化精制方法可采用下列方法之一或混合使用： [0019] 1)将川续断皂苷VI粗品用洗脱液溶解，离心或微滤后上样于葡聚糖凝胶柱层析分离，洗脱液为5～80％醇，采用部分收集器收集，将主含川续断皂苷VI流分收集，合并，减压回收醇，浓缩干燥，即得精制川续断皂苷VI；
[0020] 2)将川续断皂苷VI粗品用洗脱液溶解，离心或微滤后上样于反相柱层析分离，洗脱液为20～90％醇，采用部分收集器收集，将主含川续断皂苷VI流分收集，合并，减压回收醇，浓缩干燥，即得精制川续断皂苷VI；
[0021] 3)将川续断皂苷VI粗品用水制成每毫升含50～300mg粗品的溶液，用碱调pH值至8.0～11.0，先用含醇的乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取数次；再用正丁醇或水饱合正丁醇萃取数次，合并正丁醇萃取液；再用水反洗正丁醇萃取液2～4次；减压回收正丁醇至原体积的1/5～1/3后放置12～48小时，去除沉淀，继续浓缩，干燥，即得川续断皂苷VI，如纯度低于95％，采用含水的碳数为C1～C4的低级醇或混合有机溶剂进行重结晶，即得精制川续断皂苷VI。
[0022] 本发明研究得出总皂苷的制备过程中的步聚1)采用正丁醇或水饱合正丁醇提取，采用水或正丁醇饱合水反洗正醇提取液，浓缩正丁醇提取液至近干，加水溶解制成每毫升相当于0.3～1.5g的药材溶液，去除不溶物，再上样于SA-1或ADS-2大孔树脂，进行总皂苷分离，所得总皂苷中川续断皂苷VI含量可达85.0％～ 95％。由于从中药或天然药物中提取单一有效成分目前技术难度尚很大，故《药品注册管理办法》规定从中药或天然药物中提取单一成分纯度大于90％即可申报中药一类新药。本发明的制备方法在第四步就可达到一类药的要求，但为提高药品质量控制，保持临床用药的安全性和有效性，非常有必要进一步提高原料药的纯度，故本发明的制备方法增加步聚5)纯化精制川续断皂苷VI，目的是获得纯度达98％以上的川续断皂苷VI。
[0023] 本发明采用质谱技术和核磁共振技术，对所得原料药川续断皂苷VI进行结构确- 1证，结果表明：本品为白色粉末，ESIMS m/z927.5[M-H].H-NMR(C5D5N)δ：6.25(1H，d，J＝
8.2Hz，Glc1-H)，5.42(1H，brs，H-12)，5.03(1H，d，J＝7.7Hz，Glc2-H)，4.97(1H，d，J＝
7.2Hz，Ara-H)，3.18(1H，dd，J＝4.0，13.8Hz，H-3)，1.17(3H，s，CH3)，1.12(3H，s，CH3)，
13
0.98(3H，s，CH3)，0.93(3H，s，CH3)，0.87(3H，s，CH3)，0.86(3H，s，CH3)。 C-NMR(C5D5N)见下表I。以上数据与文献报道的Asperosaponin VI(川续断皂苷VI)图谱数据一致(马双成，陈德昌，赵海杰.蓣知子化学成分研究(III)，天然产物研究与开发，1998，10(3)：49-51)。 [0024] 表IAsperosaponin VI和文献报道的13C-NMR数据(C5D5N，δ)
8.2Hz，Glc1-H)，5.42(1H，brs，H-12)，5.03(1H，d，J＝7.7Hz，Glc2-H)，4.97(1H，d，J＝
7.2Hz，Ara-H)，3.18(1H，dd，J＝4.0，13.8Hz，H-3)，1.17(3H，s，CH3)，1.12(3H，s，CH3)，
13
0.98(3H，s，CH3)，0.93(3H，s，CH3)，0.87(3H，s，CH3)，0.86(3H，s，CH3)。 C-NMR(C5D5N)见下表I。以上数据与文献报道的Asperosaponin VI(川续断皂苷VI)图谱数据一致(马双成，陈德昌，赵海杰.蓣知子化学成分研究(III)，天然产物研究与开发，1998，10(3)：49-51)。 [0024] 表IAsperosaponin VI和文献报道的13C-NMR数据(C5D5N，δ)
[0025]C Asperosaponin VI 文献数据 C Asperosaponin VI 文献数据
1 38.5 38.76 26 17.8 17.54
2 25.7 26.00 27 25.7 26.00
3 81.6 81.87 28 176.2 176.48
4 43.1 43.18 29 32.7 33.01
5 47.3 48.13 30 23.3 23.61
6 47.8 48.15 Ara
7 32.2 32.48 1 106.3 106.60
8 39.6 39.87 2 72.8 73.06
9 46.7 47.55 3 74.4 74.66
1036.6 36.89 4 69.3 69.59
1123.5 23.81 5 66.6 66.93
12122.6 123.00 Glc-1
13143.8 144.11 1 95.3 95.62
1441.8 42.06 2 73.5 73.82
1528.0 28.25 3 78.4 78.66
1623.0 23.29 4 70.6 70.87
1 38.5 38.76 26 17.8 17.54
2 25.7 26.00 27 25.7 26.00
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8 39.6 39.87 2 72.8 73.06
9 46.7 47.55 3 74.4 74.66
1036.6 36.89 4 69.3 69.59
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12122.6 123.00 Glc-1
13143.8 144.11 1 95.3 95.62
1441.8 42.06 2 73.5 73.82
1528.0 28.25 3 78.4 78.66
1623.0 23.29 4 70.6 70.87
[0026]1717.2 16.96 5 77.6 77.90
1841.3 41.62 6 69.0 69.32
1945.8 46.15 Glc-2
2030.4 30.67 1 104.9 105.23
2133.6 33.89 2 74.8 75.10
2232.4 32.75 3 78.0 78.34
2364.2 64.42 4 71.2 71.45
2413.2 13.54 5 78.1 78.40
2515.9 16.17 6 62.3 62.58
1841.3 41.62 6 69.0 69.32
1945.8 46.15 Glc-2
2030.4 30.67 1 104.9 105.23
2133.6 33.89 2 74.8 75.10
2232.4 32.75 3 78.0 78.34
2364.2 64.42 4 71.2 71.45
2413.2 13.54 5 78.1 78.40
2515.9 16.17 6 62.3 62.58
[0027] 本发明的制备方法解决了工业化生产高纯度川续断皂苷VI难题，对比现有技术有了明显的创新，首先本方案所提取纯化的川续断皂苷VI纯度提高，可达到95％以上，经精制的川续断皂苷VI纯度可达98.5％以上，更有利于临床用药的质量控制；本发明的制备方法可以选择采用几乎无毒或毒性较小的试剂进行提取纯化，制备效率高，药材利用率好，生产生本更低，更为环保。
[0028] 本发明提出了川续断皂苷VI在制备治疗骨质疏松、骨折、骨性关节炎或骨质增生方面应用药物制剂，是以川续断皂苷VI原料为主要成分，加入药剂学可接受的辅料，制成药剂学可接受剂型。所指辅料包括微晶纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠、乳糖、甘露醇、葡萄糖、淀粉、糊精、羧甲基淀粉钠、硫酸钙、滑石粉、硬脂酸镁、氯化钠等。所指剂型可以是片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、注射用冻干粉、口服液、贴剂、膏剂或注射液。
[0029] 本发明还进一步对提取所得川续断皂苷VI原料(ASP-VI)药进行了相关药理学研究，确证川续断皂苷VI为传统骨科药物续断的有效成分之一，试验结果如下：
[0030] (1)ASP-VI可不同程度提高小鼠痛阈，150mg/kg、300mg/kg组对小鼠热刺激引起的疼痛有镇痛作用，且呈剂量相关性。福尔马林致痛试验结果表明ASP-VI75mg/kg、150mg/kg、300mg/kg三个剂量对降低II相反应疼痛积分有一定的作用，其中与对照组相比均有显著差异，作用效果与及阳性对照药相当，阳性药物与ASP-VI对I相反应均无明显作用。 [0031] (2)慢性炎症试验表明ASP-VI可抑制棉球刺激的大鼠肉芽组织增生，与阴性对照组比较，ASP-VI90mg/kg、180mg/kg均有显著性差异(P<0.01)，提示 ASP-VI对大鼠慢性增生性炎症明显有抑制作用，作用强于阳性对照药。
[0032] (3)采用大鼠去除卵巢复制雌激素缺乏型骨质疏松及骨质疏松性骨节模型，经8周的治疗后ASP-VI270mg/kg和XDS300mg/kg组可明显改善卵巢摘除大鼠的全身骨密度和股骨硬度，表明ASP-VI和XDS对雌激素缺乏型骨质疏松有明显治疗作用。骨质疏松大鼠右侧股骨骨折模型组大鼠的骨密度较未骨折骨质疏松模型组大鼠的股骨骨密度均明显要低，经治疗8周后治疗组骨质疏松骨折大鼠股骨骨密度均有增加，其中ASP-VI270mg/kg、90mg/kg剂量组和XDS300mg/kg组骨折骨股骨密度明显高于模型组。骨质疏松骨折大鼠的进行测定，结果表明骨折大鼠骨痂钙、磷含量均明显低于假手术组，经8周治疗后，ASP-VI270mg/kg、90mg/kg剂量组，XDS目300mg/kg、100mg/kg剂量组骨痂钙明显增加；ASP-VI和XDS高剂量组骨痂磷含量均显著升高，但ASP-VI作用强于XDS。
[0033] 上述实验结果充分显示本发明药物对骨质疏松、骨折均有明显治疗作用，对骨科疾病中骨折、骨性关节炎、骨质增生等引起的疼痛、炎症临床症状有明显治疗作用。实验结果提示ASP-VI不但可提高骨质松大鼠的全身骨密度，对骨折处的骨密度和骨痂钙、磷含量均有提高作用，且ASP-VI作用明显强于XDS，提示APS-VI是续断皂苷的主要有效成分，纯度增加疗效也增加。可见本发明原料药可应用于制备骨质疏松、骨性关节炎、骨质增生和骨折性疾病的治疗药物。附图说明
[0034] 图1为Asperosaponin VI ESI(Neg)质谱
[0035] 图2为Asperosaponin VI1H-NMR谱
[0036] 图3为Asperosaponin VI 1H-NMR谱(放大谱)
[0037] 图4为Asperosaponin VI 1H-NMR谱(放大谱)
[0038] 图5为Asperosaponin VI 13C-NMR谱
[0039] 图6为Asperosaponin VI 13C-NMR谱(放大谱)
[0040] 图7为Asperosaponin VI 13C-NMR谱(放大谱)
[0041] 图8为Asperosaponin VI DEPT谱
[0042] 图9为AsperosaponinVI DEPT谱(放大谱)
[0043] 图10为纯化后样品纯度检测液相图谱
具体实施方式
[0045] 实施例1
[0046] 取续断1公斤，用8L70％乙醇提取2次，每次回流2小时，合并提取液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，加水稀释成每毫升含1.0g药材液体，用5％氢氧化钙混悬液调pH至8～9，静置12小时，取上清液，过滤，得滤液。将滤液加入1.0kg SA-2大孔树脂的层析柱上，循环吸附2次后，用3L的1.0％KOH洗脱，再用水冲洗至近中性后改用3L30％乙醇洗脱，弃去前两次洗脱液；最后用7L60％乙醇冲洗，收集洗脱液，用0.5％活性碳脱色，过滤，减压回收乙醇，浓缩、干燥，得浅黄色川续断皂苷VI粗品80.9克。
[0047] 将川续断皂苷VI粗品加水配制成800ml的溶液，用5％KOH调pH值至9.0～10.0，先用等体积含5％乙醇的乙酸乙酯萃取3次；再用等体积水饱合正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取液。再用正丁醇饱合水反洗正丁醇萃取液3次后，加0.5％活性碳60℃保温4小时脱色，过滤，滤液减压回收正丁醇到2400ml，静置过夜，取上清液继续浓缩，干燥，即得川续断皂苷VI28.3g，纯度96.8％。
[0048] 实施例2
[0049] 取续断1公斤，粉碎，用6L水饱合正丁醇浸泡过夜后开始渗漉，收集正丁醇，用等体积正丁醇饱水萃取3次，减压回收正丁醇至近干，加水稀释成每毫升含0.8g药材液体，静置12小时，过滤，取滤液，将滤液加入1.5kg ADS-5大孔树脂的层析柱上，循环吸附3次后，用3L的0.5％NaOH洗脱，再用水冲洗至近中性后改用3L30％乙醇洗脱，弃去前两次洗脱液，最后用5L70％乙醇冲洗，收集70％乙醇洗脱液，过D208脱色树脂进行脱色后，减压回收乙醇，浓缩、干燥，得淡黄色川续断皂苷VI粗品52.6克。
[0050] 将200g反相柱ODS柱填料(Grace，50μm)用甲醇浸泡过夜后，装柱(5.0cm(i.d.)×80cm)，待柱床稳定后，将柱内的溶剂系统换成50％甲醇，再将溶剂放干至填料层，备用。称取川续断皂苷VI粗品5g溶于约20ml的50％甲醇中，用吸管将样品液沿柱壁缓缓加于填料层之上，打开柱塞，待样品液渗入柱床后，依次用2000ml50％甲醇，2000ml70％甲醇洗脱，每100ml为一馏分，用旋转蒸发仪 回收至干后，再用甲醇溶解转移出来。用TLC检测样品纯度，并进行合并，共得到HPLC检测纯度为99.2％的样品川续断皂苷VI2.4725g。 [0051] 实施例3
[0052] 取续断1公斤，粉碎，用1倍量80％乙醇润湿，用6L80％乙醇浸泡15小时后开始渗漉，5ml/min，收集渗漉液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味后，加水到3000ml，静置4小时，过滤，取滤液，将滤液加入1.2kg ADS-8大孔树脂的层析柱上，循环吸附3次后，用4L的水洗脱，再用4L30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，弃去前两次洗脱液，再用4L90％乙醇冲洗，收集90％乙醇洗脱液，90％乙醇洗脱液过酸性氧化铝柱脱色(6.0cm×8.0cm)，减压回收乙醇，浓缩、真空干燥，得微黄色川续断皂苷VI粗品51.3克。
[0053] 取上述所得川续断皂苷VI粗品8g用60ml65％乙醇溶解，过0.45μm的微孔滤膜，上样于葡聚糖凝胶LH-20柱(直径8cm，长120cm)层析分离。洗脱液为65％乙醇，流速0.5cm/h，采用部分收集器收集，将含川续断皂苷VI流分收集。每100ml为一馏分，用旋转蒸发仪回收至干后，再用乙醇溶解转移出来，用TLC检测样品纯度，并进行合并，减压回收乙醇，浓缩，低温干燥，即得5.2177g白色川续断皂苷VI粉未，纯度98.7％。
[0054] 实施例4
[0055] 取木通1公斤，加10L乙醇浸泡12小时后开始渗漉，收集渗漉液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，加水稀释成每毫升含1.0g药材液体，静置24小时，过滤，将滤液加入1.2kg AB-8大孔树脂的层析柱上，循环吸附3次后，用4L的5.0％Na2CO3洗脱，再用纯化水冲洗至中性再用3L20％乙醇冲洗，弃去洗脱液，再用4L90％乙醇冲洗，收集90％乙醇洗脱液，加0.3％活性碳60℃保温30min脱色，过滤，减压回收乙醇，浓缩、干燥，得川续断皂苷VI粗品
69.4克。
69.4克。
[0056] 取上述所得川续断皂苷VI粗品10g用50ml50％乙醇溶解成每毫升含皂苷200mg，离心或微滤后上样于葡聚糖凝胶LH-20柱(直径8cm，长120cm)层析分离。洗脱液为50％乙醇，流速0.6cm/h，采用部分收集器收集，将主含川续断皂苷VI流分收集。每100ml为一馏分，用旋转蒸发仪回收至干后，再用乙醇溶解转移出来，用TLC检测样品纯度，并进行合并，减压回收乙醇，浓缩，低温干燥，即得6.7716g木通皂苷D(川续断皂苷VI)，纯度98.7％。
[0057] 实施例5
[0058] 取预知子1公斤，粉碎，用水2倍量水润湿，用6L水饱合正丁醇浸泡过液后开始渗漉，减压浓缩，回收正丁醇至相对密度为1.20(50℃)，加水稀释成每毫升含1.0g药材液体，用5％Ca(OH)2调pH值到8.0～9.0，静置6小时，过滤，取滤液，将滤液加入1.0kgASD-5大孔树脂的层析柱上，循环吸附3次后，用2L0.8％KaOH洗脱，再用水洗脱至近中性，改用4L30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，最后用6L80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，过酸性氧化铝柱脱色后，减压回收乙醇，浓缩、干燥，得川续断皂苷VI粗品56.3克。
[0059] 将200g反相柱ODS柱填料(Grace，50μm)用甲醇浸泡过夜后，装柱(5.0cm(i.d.)×80cm)，待柱床稳定后，将柱内的溶剂系统换成60％甲醇，再将溶剂放干至填料层，备用。称取川续断皂苷VI粗品5g溶于约20ml的60％甲醇中，用吸管将样品液沿柱壁缓缓加于填料层之上，打开柱塞，待样品液渗入柱床后，依次用2000ml60％甲醇，2000ml75％甲醇洗脱，每100ml为一馏分，用旋转蒸发仪回收至干后，再用甲醇溶解转移出来。用TLC检测样品纯度，并进行合并，得川续断皂苷VI1.6987g，纯度为97.4％。
[0060] 实施例6
[0061] 按1000个制剂单位投料计，取续断皂苷VI100g，葡萄糖120g，甘露醇220g，亚硫酸氢钠10g，共制成1000瓶注射用冻干粉，规格：每瓶含续断皂苷VI100mg。
[0062] 称取处方量的续断总皂苷、葡萄糖、甘露醇、亚硫酸氢钠，加注射用水5000ml，50℃搅拌溶解；加入0.2％注射用活性碳，50℃保温搅拌约30分钟；砂芯漏斗过滤；加注射用水至6000ml；以0.22μm滤膜过滤；测定中间体含量、灌装；冷冻干燥；盖胶塞、轧盖，得注射用续断总皂苷冻干粉926瓶，每瓶含皂苷VI98.2mg。
[0063] 实施例7
[0064] 按1000个制剂单位投料计，取续断皂苷VI250g，羟丙甲基纤维素100g，微晶纤维素30g，乳糖60g，微粉硅胶5g，共制成1000片，规格：每片含续断皂苷VI250mg。 [0065] 上述原辅料分别事先过100目筛，按处方量称取续断总皂苷、羟丙甲基纤维素、微晶纤维素、乳糖，混合均匀，用80％药用乙醇制软材，过24目筛制粒， 60℃条件下干燥4小时，20目筛整粒，加入微粉硅胶，压片，即得。
[0066] 实施例8
[0067] 按1000个制剂单位投料计，取续断皂苷VI300g，淀粉80g，羧甲基淀粉钠8g，硬脂酸镁5g，共制成1000粒胶囊，规格：每粒含续断皂苷VI300mg。
[0068] 上述原辅料分别事先过80目筛，按处方量称取续断皂苷VI、淀粉，羧甲基淀粉钠，混合均匀，用60％药用乙醇制软材，过24目筛制粒，60℃条件下干燥4小时，20目筛整粒，加入硬脂酸镁，填充胶囊，得续断皂苷VI胶囊952粒。
[0069] 实施例9
[0070] 按1000个制剂单位投料计，取续断皂苷VI50g，聚乙二醇4000100g，聚乙二醇600030g，共制成1000粒滴丸，规格：每粒含续断皂苷VI50mg。
[0071] 称取处方量续断皂苷VI加入60ml80％乙醇，在60℃水浴中搅拌至融溶状态，另取处方量的聚乙二醇4000和聚乙二醇6000在水浴中溶融，分次加入续断皂苷VI乙醇液，混匀，溶融后，快速移至预热至恒温滴丸设备贮液瓶中，滴制，得续断皂苷VI滴丸910粒。 [0072] 川续断皂苷VI化学结构式确证
[0073] 白 色 粉 末，ESIMS m/z927.5[M-H]-.1H-NMR(C5D5N)δ：6.25(1H，d，J＝ 8.2Hz，Glc1-H)，5.42(1H，brs，H-12)，5.03(1H，d，J＝7.7Hz，Glc2-H)，4.97(1H，d，J＝7.2Hz，Ara-H)，3.18(1H，dd，J＝4.0，13.8Hz，H-3)，1.17(3H，s，CH3)，1.12(3H，s，CH3)，0.98(3H，13
s，CH3)，0.93(3H，s，CH3)，0.87(3H，s，CH3)，0.86(3H，s，CH3)。 C-NMR(C5D5N)见下表II。以上数据与文献报道的Asperosaponin VI图谱数据一致(马双成，陈德昌，赵海杰.蓣知子化学成分研究(III)，天然产物研究与开发，1998，10(3)：49-51)。各图谱见附图1～10。其化学结构式如下：
s，CH3)，0.93(3H，s，CH3)，0.87(3H，s，CH3)，0.86(3H，s，CH3)。 C-NMR(C5D5N)见下表II。以上数据与文献报道的Asperosaponin VI图谱数据一致(马双成，陈德昌，赵海杰.蓣知子化学成分研究(III)，天然产物研究与开发，1998，10(3)：49-51)。各图谱见附图1～10。其化学结构式如下：
[0074]
[0075] 表IIAsperosaponin VI和文献报道的13C-NMR数据(C5D5N，δ)
[0076]C Asperosaponin VI 文献数据 C Asperosaponin VI 文献数据
1 38.5 38.76 26 17.8 17.54
2 25.7 26.00 27 25.7 26.00
3 81.6 81.87 28 176.2 176.48
4 43.1 43.18 29 32.7 33.01
5 47.3 48.13 30 23.3 23.61
6 47.8 48.15 Ara
7 32.2 32.48 1 106.3 106.60
8 39.6 39.87 2 72.8 73.06
9 46.7 47.55 3 74.4 74.66
1036.6 36.89 4 69.3 69.59
1123.5 23.81 5 66.6 66.93
12122.6 123.00 Glc-1
13143.8 144.11 1 95.3 95.62
1441.8 42.06 2 73.5 73.82
1528.0 28.25 3 78.4 78.66
1623.0 23.29 4 70.6 70.87
1717.2 16.96 5 77.6 77.90
1841.3 41.62 6 69.0 69.32
1945.8 46.15 Glc-2
2030.4 30.67 1 104.9 105.23
2133.6 33.89 2 74.8 75.10
2232.4 32.75 3 78.0 78.34
2364.2 64.42 4 71.2 71.45
2413.2 13.54 5 78.1 78.40
2515.9 16.17 6 62.3 62.58
1 38.5 38.76 26 17.8 17.54
2 25.7 26.00 27 25.7 26.00
3 81.6 81.87 28 176.2 176.48
4 43.1 43.18 29 32.7 33.01
5 47.3 48.13 30 23.3 23.61
6 47.8 48.15 Ara
7 32.2 32.48 1 106.3 106.60
8 39.6 39.87 2 72.8 73.06
9 46.7 47.55 3 74.4 74.66
1036.6 36.89 4 69.3 69.59
1123.5 23.81 5 66.6 66.93
12122.6 123.00 Glc-1
13143.8 144.11 1 95.3 95.62
1441.8 42.06 2 73.5 73.82
1528.0 28.25 3 78.4 78.66
1623.0 23.29 4 70.6 70.87
1717.2 16.96 5 77.6 77.90
1841.3 41.62 6 69.0 69.32
1945.8 46.15 Glc-2
2030.4 30.67 1 104.9 105.23
2133.6 33.89 2 74.8 75.10
2232.4 32.75 3 78.0 78.34
2364.2 64.42 4 71.2 71.45
2413.2 13.54 5 78.1 78.40
2515.9 16.17 6 62.3 62.58
[0077] 药效学试验
[0078] 一、试验材料
[0079] 1、受试药与对照药
[0080] 川续断皂苷VI(Asperosaponin VI，ASP-VI)，由自制，批号：071012，纯度99.2％，续断总皂苷(XDS)，批号070821，总皂苷含量84.5％(其中含ASP-VI67.6％)。对乙酰氨基酚，广东环球制药有限公司生产，批号080102；仙灵骨 保胶囊，贵州同济堂制药有限公司生产，批号070306。用前以纯化水配成所需浓度的溶液或混悬液。
[0081] 3、试剂与仪器
[0082] 甲醛溶液，广州化学试剂厂生产，批号20060704-11；丙酮，洛阳市化学试剂厂，批号：060413；盐酸，广州东红化工厂，批号070703913；氢氧化钠，天津大茂化学试剂厂，批号20070822。RB100热板仪，成都泰盟仪器科技有限公司生产；BS-124S电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司生产；DPX-L型双能X线骨密度检定仪，Lunar Co.U.S.A；INSTRON-1122型万能材料试验机，英国；游标卡尺(中国金华)；80-1型离心沉淀机(中国上海)；UV1201紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)。
[0083] 3、动物
[0084] 昆明小鼠，合格证(粤监证字)第2006A063号；SD大白鼠，合格证(粤监证字)第2006A064号均由中山大学实验动物中心提供。
[0085] 二、统计处理
[0087] 三、试验方法及结果
[0088] 1、ASP-VI抗炎镇痛作用研究
[0089] 1.1ASP-VI对热致痛的影响
[0090] 采用热板法试验，以小鼠舔后足作为疼痛表现，预先测定痛阈，取痛阈为10～30s的小鼠参加实验。取合格雌性昆明小鼠50只，随机分为5组，每组10只。分别为阴性对照组(给等容积纯化水)、300mg/kg对乙酰氨基酚组，ASP-VI75mg/kg、150mg/kg、300mg/kg三个剂量组。各组皆灌胃给药1次，0.2ml/10g。给药前及给药后1小时分别测定小鼠痛阈，如痛阈大于60s，以60s计算。结果见表1。
[0091] 表1ASP-VI对小鼠痛阈的影响(X±s，n＝10)
[0092]组别 剂量(mg/kg) 给药前痛阈值(s) 给药后痛阈值(s)
阴性对照组 18.9±5.14 19.8±6.63
对乙酰氨基酚组 300 19.2±6.21 38.3±10.27**
ASP-VI低剂量组 75 18.5±5.58 21.5±9.79
ASP-VI中剂量组 150 19.6±6.42 28.4±10.24*
ASP-VI高剂量组 300 18.3±5.87 32.2±11.20**
阴性对照组 18.9±5.14 19.8±6.63
对乙酰氨基酚组 300 19.2±6.21 38.3±10.27**
ASP-VI低剂量组 75 18.5±5.58 21.5±9.79
ASP-VI中剂量组 150 19.6±6.42 28.4±10.24*
ASP-VI高剂量组 300 18.3±5.87 32.2±11.20**
[0093] 注：与阴对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
[0094] 由表1可见，ASP-VI可不同程度提高小鼠痛阈，中、高剂量组有显著性差异(P<0.01或P<0.05)，提示ASP-VI对小鼠热刺激引起的疼痛有镇痛作用。其镇痛作用同阳性对照药对乙酰氨基酚无明显差异，且呈剂量相关性。
[0095] 1.2对福尔马林至痛和炎症的影响
[0096] 将60只雄性小鼠随机分为五组，即阴性对照组(给等容积纯化水)、对乙酰氨基酚组、XDS组、ASP-VI低、中、高剂量组。正常饲养一天后禁食给水12h后每组灌胃给药0.2ml/10g。给药1h后，于小鼠左后肢足跖部皮下注射1％福尔马林溶液20ul，并计时，立即置于直径20cm的玻璃容器中，分别记录注射甲醛溶液后0～5min(I相)和20～30min(II相)内小鼠疼痛反应的累计时间，进行评分。评分方法：舔、咬或抖足3分，提足
2分，跛行1分，走动自如0分。分别得出各组大鼠I相和II相的累计分值。累积分值＝(0t1+1t2+2t3+3t4)/(t1+t2+t3+t4)[t1、t2、t3、t4分别为0、1、2、3分的持续时间(s)]。结果见表2。
2分，跛行1分，走动自如0分。分别得出各组大鼠I相和II相的累计分值。累积分值＝(0t1+1t2+2t3+3t4)/(t1+t2+t3+t4)[t1、t2、t3、t4分别为0、1、2、3分的持续时间(s)]。结果见表2。
[0097] 表2ASP-VI对小鼠福尔马林致痛的影响(X±s，n＝10)
[0098]* **
[0099] 注：与阴对照组比较，P<0.05，P<0.01
[0100] 由表2可见数据可以看出，ASP-VI的高、中、低剂量对降低II相反应疼痛积分有一定的作用，其中与对照组相比均有显著差异，作用效果强于阳性对照药。阳性药物与ASP-VI对I相反应均无明显作用。
[0101] 1.3对大鼠慢性炎症的影响
[0102] 大鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。分别为阴性对照组(给等容积纯化水)、对乙酰氨基酚180mg/kg组，ASP-VI45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg三个剂量组。在乙醚浅麻下，剪毛消毒，于下腹部正中切开皮肤，将 重50mg的灭菌棉球植入两侧腹股沟皮下，然后缝合皮肤，消毒，整个过程为无菌操作。从手术前3天开始灌胃给药，1.0ml/100g，每天1次，连续10天。第11天处死大鼠，小心剥离取出棉球及包裹的肉芽组织，60℃干燥12小时后称重，减去原棉球重量即为肉芽组织重量，结果以每100g体重所含肉芽组织重量(双侧)表示。结果见表3。
[0103] 表3ASP-VI对大鼠慢性增生性炎症的影响(X±s，n＝10)
[0104]组别 剂量 (mg/kg) 肉芽组织重量 (mg/100g体重)
阴性对照组 - 51.8±14.9
对乙酰氨基酚组 180 32.6±8.9**
ASP-VI低剂量组 45 40.3±13.5
ASP-VI中剂量组 90 35.5±9.7**
ASP-VI高剂量组 180 29.4±9.2**
阴性对照组 - 51.8±14.9
对乙酰氨基酚组 180 32.6±8.9**
ASP-VI低剂量组 45 40.3±13.5
ASP-VI中剂量组 90 35.5±9.7**
ASP-VI高剂量组 180 29.4±9.2**
[0105] 注：与阴对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
[0106] 由表3可见，ASP-VI抑制棉球刺激的大鼠肉芽组织增生，与阴性对照组比较，ASP-VI高、中剂量组与阳性对照组均有显著性差异(P<0.01)，提示ASP-VI对大鼠慢性增生性炎症明显有抑制作用，作用强于阳性对照药。
[0107] 2ASP-VI对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响
[0108] 2.1实验方法
[0109] 模型复制实验动物选用3月龄SD雌性大鼠60只，骨质疏松模型复制参照文献法(赵咏芳，沈培芝，徐宇等.仙灵骨葆胶囊对去卵巢致骨质疏松骨量的影响，中医正骨，2000；12(5)：11～12。陈奇主编.中药药效研究思路与方法.北京：人民卫生出版社，
2005：957)，3％戊巴比妥腹腔麻醉，无菌条件下取腰椎两旁切口进入腹腔背侧，完整摘除双侧卵巢，止血缝合。另取10只大鼠设为假手术组，除不摘除卵巢外，同法操作。缝合后，正常饲养。3个月后，骨质疏松大鼠用氯氨酮麻醉，参考文献资料复制右侧股骨骨折模型(李晓林，罗新乐，余楠生等.畦鱼降钙素对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响.中国骨质疏松杂志，
2003，59(2)：111-113；卿茂盛，冻小砖，邹志鹏.续断对大鼠骨质疏松性骨折愈合影响的生物力学实验研究，中国医学物理杂志，2002，19(3)：159-161)。
2005：957)，3％戊巴比妥腹腔麻醉，无菌条件下取腰椎两旁切口进入腹腔背侧，完整摘除双侧卵巢，止血缝合。另取10只大鼠设为假手术组，除不摘除卵巢外，同法操作。缝合后，正常饲养。3个月后，骨质疏松大鼠用氯氨酮麻醉，参考文献资料复制右侧股骨骨折模型(李晓林，罗新乐，余楠生等.畦鱼降钙素对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响.中国骨质疏松杂志，
2003，59(2)：111-113；卿茂盛，冻小砖，邹志鹏.续断对大鼠骨质疏松性骨折愈合影响的生物力学实验研究，中国医学物理杂志，2002，19(3)：159-161)。
[0110] 给药与饲养将造模大鼠随机分为6组，分别为骨质疏松模型组(OPS)，骨质疏松骨折模型组(OPF)，骨质疏松骨折+仙灵骨保600mg/kg组(OPFG)， 骨质疏松骨折+ASP-VI270mg/kg组(OPFA-H)、骨质疏松骨折+ASP-VI90mg/kg组(OPFA-L)，骨质疏松骨折+XDS450mg/kg组(OPFX-H)、骨质疏松骨折+XDS150mg/kg组(OPFX-L)。各组均在造模后当天给药，假手术组(SHAM)、OP组和OPF组大鼠灌胃法给服纯化水，1.0ml/100g体重，每天1次，药物组，按规定剂量配制相应浓度，按1.0ml/100g体重，每天灌胃1次，连续用药8周。各组大鼠分笼饲养，自由摄取标准大鼠饲料，自由饮用蒸馏水。
[0111] 观察指标及测定方法各组动物均在8周处死，进行下列指标观察。
[0112] (1)骨密度(MBD)和骨抗弯强度(FBS)的测定
[0113] 处死前，大鼠腹腔注射5％氯氨酮注射液10mg/100g，当大鼠呈现稳定的昏睡状态持续10min以上时，置于DPX-L型双能X线骨密度仪(Lunar Co.U.S.A)的探头下，应用骨密度测定软件进行全身和骨折处扫描，测定全身骨密度和骨折股骨的骨密度。
[0114] 测骨密度后大鼠处死，取下左、右两侧股骨，分别先用游标卡尺测定股骨中段的宽度并计算截面积，后将股骨放在万能材料试验机的支架上(跨距＝25mm)，以5mm/min的速度下压股骨中段，记录最大的压力载荷，最后计算抗弯强度(单位截面面积上最大的压力载荷)。
[0115] (2)骨痂钙、磷含量的测定
[0116] 将测定FBS的骨折的右则股骨用丙酮震荡脱水12小时，真空干燥(105℃，24h)后称重，将标本研碎成细颗粒状，再置于6N盐酸中105℃水解12h，标本冷却后用NaOH调至pH值到6.0。用甲基百里香酚蓝比色法测定骨痂总钙量(Ca)；用孔雀绿直接显色法测定骨痂磷含量；
[0117] 计算公式：Ca(样本浓度mmol/L)＝Abs×2.5×100/0.3087
[0118] P(样本浓度mmol/L)＝Abs×1.29×200/0.1888
[0119] 2.2结果
[0120] 2.2.1药物对大鼠骨密度(MBD)和骨抗弯强度(FBS)的影响
[0121] 由下表4可见经治疗8周后，骨质疏松大鼠全身骨密度均有不同程度提高，ASP-VI高剂量组、阳性药物组和XDS高剂量组的GMBD明显高于骨质疏松模型组，但较假手术组水平还较远，可能同用药时间较短有关。右侧股骨骨折模型组大鼠的骨密度较未骨折的假手术大鼠或骨质疏松模组大鼠的股骨骨密度均明 显要低，经治疗8周后治疗药骨质疏松骨折大鼠股骨骨密度均有增加，其中ASP-VI高、低剂量组、XDS高剂量组和阳性药物组右侧骨股骨密度明显高于骨质疏松骨折模型组。提示ASP-VI不但可提高骨质松大鼠的全身骨密度，对骨折处的骨密度也有提高作用，且作用强于XDS和阳性药物。
[0122] 表4各组大鼠全身骨密度和右侧股骨骨密度测定结果(X±s，n＝8～10)
[0123]分组 剂量 (mg/kg) 全身骨密度(g/cm2) 右侧股骨骨密度(g/cm2)
SHAM - 0.402±0.0261 0.257±0.0083
ΔΔ ΔΔ
OPS - 0.337±0.0385 0.232±0.0113
##ΔΔ
OPF - - 0.203±0.0099
* ▲▲
OPFG 600 0.373±0.0343 0.238±0.0107
▲
OPFA-L 90 0.360±0.0318 0.236±0.0111
OPFA-H 270 0.386±0.0262** 0.249±0.0082▲▲
OPFX-L 150 0.351±0.0395 0.218±0.0113
* ▲▲
OPFX-H 450 0.371±0.0319 0.237±0.0107
SHAM - 0.402±0.0261 0.257±0.0083
ΔΔ ΔΔ
OPS - 0.337±0.0385 0.232±0.0113
##ΔΔ
OPF - - 0.203±0.0099
* ▲▲
OPFG 600 0.373±0.0343 0.238±0.0107
▲
OPFA-L 90 0.360±0.0318 0.236±0.0111
OPFA-H 270 0.386±0.0262** 0.249±0.0082▲▲
OPFX-L 150 0.351±0.0395 0.218±0.0113
* ▲▲
OPFX-H 450 0.371±0.0319 0.237±0.0107
[0124] 注：与骨质疏松假手术组(SHAM)比较，ΔΔP<0.01；与骨质疏松骨折假手术组##(OPS)比较；P<0.01；
[0125] 与OPS组比较，*P<0.05，**P<0.01；与OPF组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01； [0126] 由下表5可见骨质疏松大鼠股骨抗弯强度均不同程度低于假手术组，发生骨折的右股骨更显著。经治疗8周后，ASP-VI高、低剂量组，XDS高剂量组和阳性药物组未发生骨折的左股骨抗弯强度明显高于骨质疏松模型组。右侧股骨骨折的模型组大鼠的股骨抗弯强度较未骨折的假手术大鼠或骨质疏松模组大鼠均明显要低，经治疗8周后治疗药骨质疏松骨折大鼠股骨抗弯强度均有增加，其中ASP-VI高剂量组、XDS高剂量组和阳性药物组明显高于骨质疏松骨折模型组。
[0127] 表5各组大鼠左股骨和右股骨抗弯强度测定结果(X±s，n＝8～10)
[0128]2 2
分组 剂量 (mg/kg) 左股骨抗弯强度 (N/mm) 右股骨抗弯强度 (N/mm)
SHAM - 22.26±2.58 22.26±2.58
OPS - 16.12±3.08ΔΔ 16.49±2.27ΔΔ
##ΔΔ
OPF - - 12.78±1.89
** ▲
OPFG 600 19.16±2.85 14.92±1.87
*
OPFA-L 90 18.93±2.67 14.13±1.93
** ▲▲
OPFA-H 270 20.11±2.64 15.35±2.02
OPFX-L 150 17.44±3.21 13.44±1.56
OPFX-H 450 19.38±2.79** 14.75±2.13▲
分组 剂量 (mg/kg) 左股骨抗弯强度 (N/mm) 右股骨抗弯强度 (N/mm)
SHAM - 22.26±2.58 22.26±2.58
OPS - 16.12±3.08ΔΔ 16.49±2.27ΔΔ
##ΔΔ
OPF - - 12.78±1.89
** ▲
OPFG 600 19.16±2.85 14.92±1.87
*
OPFA-L 90 18.93±2.67 14.13±1.93
** ▲▲
OPFA-H 270 20.11±2.64 15.35±2.02
OPFX-L 150 17.44±3.21 13.44±1.56
OPFX-H 450 19.38±2.79** 14.75±2.13▲
[0129] 注：与骨质疏松假手术组(SHAM)比较，ΔΔP<0.01；与骨质疏松骨折假手术组(OPS)比较；##P<0.01；
[0130] 与OPS组比较，*P<0.05，**P<0.01；与OPF组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01； [0131] 2.2.2药物对大鼠骨痂钙、磷含量的影响
[0132] 由下表6可见骨质疏松骨折大鼠骨痂钙、磷含量均明显低于未骨折假手术组。经8周治疗后，ASP-VI高、低剂量组，XDS高、低剂量组及阳性药物组骨痂钙明显增加；ASP-VI高剂量组、XDS高剂量组和仙灵骨葆胶囊组骨痂磷含量均显著升高。提示ASP-VI和XDS对骨质疏松骨折大鼠的明显治疗作用，且APS-VI作用明显强于XDS。
[0133] 表6骨痂钙和磷含量的变化(X±s，n＝8～10)
[0134]分组 剂量(mg/kg) 钙(mg) 磷(mg)
OPS - 56.33±1.16 32.11±1.76
## ##
OPF - 43.67±1.56 22.16±2.86
OPFG 600 51.29±1.93** 27.10±2.82**
** *
OPFA-L 90 49.52±1.28 25.15±2.33
** **
OPFA-H 270 57.18±2.45 30.63±2.07
**
OPFX-L 150 46.61±1.73 23.89±2.31
** **
OPFX-H 450 50.73±2.20 28.24±1.90
OPS - 56.33±1.16 32.11±1.76
## ##
OPF - 43.67±1.56 22.16±2.86
OPFG 600 51.29±1.93** 27.10±2.82**
** *
OPFA-L 90 49.52±1.28 25.15±2.33
** **
OPFA-H 270 57.18±2.45 30.63±2.07
**
OPFX-L 150 46.61±1.73 23.89±2.31
** **
OPFX-H 450 50.73±2.20 28.24±1.90
[0135] 注：与骨质疏松骨折假手术组(OPS)比较；##P<0.01；与OPF组比较，*P<0.05，**P<0.01
[0136] 四、结论
[0137] 试验采用本发明提取所得川续断皂苷VI(APS-VI)进行骨科疾病方面的药理作用研究，观察APS-VI的药理活性，为临床应用提供依据。试验结果表明：
[0138] (1)ASP-VI可不同程度提高小鼠痛阈，150mg/kg、300mg/kg组对小鼠热刺激引起的疼痛有明显镇痛作用，其镇痛作用同阳性对照药对乙酰氨基酚相近，且呈剂量相关性。福尔马林致痛试验结果表明ASP-VI的75mg/kg、150mg/kg、300mg/kg三个剂量对降低II相反应疼痛积分均有降低，与对照组相比均有显著差异，作用效果与及阳性对照药相当，阳性药物与ASP-VI对I相反应均无明显作用。
[0139] (2)慢性炎症试验结果表明ASP-VI可抑制棉球刺激的大鼠肉芽组织增生，与阴性对照组比较，ASP-VI90mg/kg、180mg/kg与阳性对照组均有显著性差异(P<0.01)，提示ASP-VI对大鼠慢性增生性炎症明显有抑制作用，作用强于阳性对照药。
[0140] (3)采用大鼠去除卵巢复制雌激素缺乏型骨质疏松及骨质疏松性骨折模型， 经8周的治疗后ASP-VI270mg/kg和XDS300mg/kg组可明显改善卵巢摘除大鼠的全身骨密度和股骨硬度，表明ASP-VI和XDS对雌激素缺乏型骨质疏松有明显治疗作用。
[0141] 骨质疏松大鼠右侧股骨骨折模型组大鼠的骨密度较未骨折骨质疏松模型组大鼠的股骨骨密度均明显要低，经治疗8周后治疗药骨质疏松骨折大鼠股骨骨密度均有增加，其中ASP-VI270mg/kg、90mg/kg剂量组和XDS450mg/kg组骨折骨股骨密度明显高于模型组。对骨质疏松骨折大鼠骨痂钙、磷进行测定，结果表明骨折大鼠骨痂钙、磷含量均明显低于假手术组，经8周治疗后，ASP-VI270mg/kg、90mg/kg剂量组，XDS450mg/kg、150mg/kg剂量组骨痂钙明显增加；ASP-VI、XDS高剂量组和仙灵骨葆胶囊组骨痂磷含量均显著升高。 [0142] 本试验结果提示ASP-VI不但可提高骨质松大鼠的全身骨密度，对骨折处的骨密度和骨痂钙、磷含量均有提高作用，但ASP-VI作用明显强于XDS，提示APS-VI是续断皂苷的主要有效成分，纯度增加疗效也增加。
[0143] 上述实验结果充分显示本发明药物ASP-VI对骨质疏松、骨折有明显治作用，且对骨科疾病中骨性关节炎、骨质增生、骨折等疼痛或炎症临床症状有明显治疗作用。
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