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一种 机械通气 肺损伤的早期诊断方法

阅读：724发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种机械通气肺损伤的早期诊断方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及机械通气肺损伤早期诊断领域，公开了一种机械通气肺损伤的早期诊断方法，通过获取肺上皮细胞组织，并将所述肺上皮细胞组织置于RPMI-1640培养基中进行培养，测定纤溶酶原激活物抑制剂 -1PAI-1的表达情况，根据所述PAI-1的表达情况，对机械通气肺损伤进行诊断。本发明以PAI-1作为监测机械通气肺损伤的生物指标，能够对机械通气肺损伤进行早期诊断。，下面是一种机械通气肺损伤的早期诊断方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种机械通气肺损伤的早期诊断方法，其特征在于，包括：
获取肺上皮细胞组织，并将所述肺上皮细胞组织置于RPMI-1640培养基中进行培养；
测定纤溶酶原激活物抑制剂-1PAI-1的表达情况；
根据所述PAI-1的表达情况，对机械通气肺损伤进行诊断。
2.根据权利要求1所述的机械通气肺损伤的早期诊断方法，其特征在于，所述测定纤溶酶原激活物抑制剂-1PAI-1的表达情况，包括通过细胞免疫荧光染色实验，测定所述PAI-1的表达情况；或者，通过流式细胞术检测，测定所述PAI-1的表达情况；或者，通过逆转录PCRRT-PCR法，测定所述PAI-1的表达情况；通过蛋白质印迹法Western-blot法，测定所述PAI-1的表达情况。
3.根据权利要求1所述的机械通气肺损伤的早期诊断方法，其特征在于，所述根据所述PAI-1的表达情况，对机械通气肺损伤进行诊断步骤之前，还包括：
测定白细胞介素-8IL-8的表达情况。
4.根据权利要求1所述的机械通气肺损伤的早期诊断方法，其特征在于，所述将所述肺上皮细胞组织置于RPMI-1640培养基中进行培养，包括：
将所述肺上皮细胞组织培养于RPMI1640中，并将培养基置于CO2孵箱内培养和加载，其中，孵箱温度为37℃，CO2含量5％。

说明书全文

一种机械通气 肺损伤的早期诊断方法

技术领域

[0001] 本发明涉及机械通气肺损伤早期诊断领域，尤其涉及一种机械通气肺损伤的早期诊断方法。

背景技术

[0002] 在对急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)引起的呼吸功能衰竭的治疗过程中，机械通气(mechanical ventilation,MV)是必不可少的手段之一，并且在手术全麻过程中经常用到机械通气。但是机械通气会带来负面作用，它会加剧原有肺脏的损伤甚至可以诱发健康的肺脏产生损伤，此类现象被称为机械通气肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)。一般而言，VILI早期出现机械性损伤，随后以炎症细胞、细胞因子介导的生物伤为主。机械性损伤可以造成生物伤，生物伤也可以加重机械性损伤。现有技术中，VILI早期情况不易诊断，往往耽误了最佳的治疗时机。

发明内容

[0003] 本发明提供一种机械通气肺损伤的早期诊断方法，解决现有技术中VILI早期情况不易诊断的技术问题。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0004] 一种机械通气肺损伤的早期诊断方法，包括：

[0005] 获取肺上皮细胞组织，并将所述肺上皮细胞组织置于RPMI-1640培养基中进行培养；

[0006] 测定纤溶酶原激活物抑制剂-1PAI-1的表达情况；

[0007] 根据所述PAI-1的表达情况，对机械通气肺损伤进行诊断。

[0008] 本发明提供一种机械通气肺损伤的早期诊断方法，通过获取肺上皮细胞组织，并将所述肺上皮细胞组织置于RPMI-1640培养基中进行培养，测定纤溶酶原激活物抑制剂-1PAI-1的表达情况，根据所述PAI-1的表达情况，对机械通气肺损伤进行诊断。本发明以PAI-1作为监测机械通气肺损伤的生物指标，能够对机械通气肺损伤进行早期诊断。附图说明

[0009] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。

[0010] 图1为本发明实施例提供的一种机械通气肺损伤的早期诊断方法的流程图。

具体实施方式

[0011] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0012] 本发明实施例提供了一种机械通气肺损伤的早期诊断方法，如图1所示，包括：

[0013] 步骤101、获取肺上皮细胞组织，并将所述肺上皮细胞组织置于RPMI-1640培养基中进行培养；

[0014] 其中，将所述肺上皮细胞组织培养于RPMI1640中，并将培养基置于CO2孵箱内培养和加载，其中，孵箱温度为37℃，CO2含量5％。

[0015] 步骤102、测定纤溶酶原激活物抑制剂-1PAI-1的表达情况；

[0016] 其中，纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator,uPA)的主要抑制物，PAI-1、uPA以及其尿激酶型纤溶酶原激活物受体uPAR(urokinase type plasminogen activator receptor)一起构成了细胞周围的纤溶系统，三者之间相互作用并接受其他细胞因子表达的影响，从而精确调控细胞外基质沉积和降解的动态平衡。PAI-1除了其传统的调节细胞外纤溶功能以外，还可以调节细胞粘附、运动、分化、增殖，在机体免疫和炎症及感染的控制方面有着重要的作用。本发明基于这一原理，将PAI-1作为检测VILI的敏感指标，机械通气产生PAI-1，并激活IL-8、引起其下游炎性因子聚集，最终导致肺上皮细胞形态学发生改变，造成肺部损伤。

[0017] 步骤102中测定纤溶酶原激活物抑制剂-1PAI-1的表达情况，可以采用多种方法，包括：

[0018] 1、细胞免疫荧光染色实验

[0019] 细胞用PBS冲洗3次，4％多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗3×5min，0.5％Triton X-100(sigma公司，美国)的PBS室温处理5min，2％BSA室温处理30min，加1:100PAI-I一抗(北京博奥森生物技术有限公司，中国)并置于湿盒中，37℃共同孵育
1h，PBS冲洗3×5min，1:100稀释的FITC标记的二抗(北京博奥森生物技术有限公司，中国)37℃温育30min或室温1小时，避光，PBS冲洗3×5min，甘油封片(由90％甘油和10％的PBS组成)，倒置荧光显微镜(IX70，Olympus，美国)下观察拍照。

[0020] 2、流式细胞术检测

[0021] 细胞经胰酶消化收获，PBS洗涤两次后用试剂盒自带的Binding Buffer洗涤l次，重悬于200μL Binding Buffer中；加入5μL Annexin V-FITC试剂，避光室温孵育15-20min；加10μLPI(50μg/ml)，补加Binding Buffer 200μL，进行流式细胞仪测定。

[0022] 3、逆转录PCRRT-PCR法

[0023] 总RNA提取，逆转录。其中，real-time PCR反应体系为：FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10ul，β-actin和PAI-1引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列分别如下：β-actin上游引物为：5′-agagctacgagctgcctgac-3′；下游引物为：5′-agcactgtgttggcgtacag-3′；产物片段为：184bp。PAI-1上游引物为：5′-ctctctctgccctcaccaac-3′；下游引物为：5′-gtggagaggctcttggtctg-3′,产物片段为212bp。荧光定量PCR(美国Roche)读取CT(cycle threshold)值，首先计算各样本测定基因X的CT值与内对照基因Beta-actin的CT值的差值，即ΔCT＝CT(X)-CT(beta-actin)，再用各实验组样本的ΔCT减去正常对照组样本的ΔCT，得到ΔΔCT，利用2-ΔΔCT进行计算。

[0024] 4、蛋白质印迹法Western-blot法

[0025] 以SDS-PAGE凝胶电泳分离，4℃封闭过夜。通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的组织细胞进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得PAI-1在所分析的细胞中表达情况。

[0026] 步骤103、根据所述PAI-1的表达情况，对机械通气肺损伤进行诊断。

[0027] 本发明实施例步骤103之前，还可以通过酶联免疫吸附实验ELISA测定白细胞介素-8IL-8的表达情况，以便进一步确诊，提高诊断的可靠性。

[0028] 酶联免疫吸附实验的具体过程如下：

[0029] 收集实验细胞的上清液，通过IL-8ELISA试剂盒，对IL-8OD进行检测，以492nm处的OD值为横坐标，标准品浓度为纵坐标，在双对数坐标纸上做标准曲线，根据样品的OD值从标准曲线上查出IL-8浓度。

[0030] 以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

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