首页 / 专利库 / 解剖与生理 / 脑脊液 / 用于区分性诊断的标志物和其应用方法

用于区分性诊断的标志物和其应用方法

阅读：235发布：2021-10-11

专利汇可以提供用于区分性诊断的标志物和其应用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于 疾病 和/或状态的区分性诊断的诊断标志物的鉴定方法和应用方法。在各个方面，本发明涉及方法和组合物，其可以确定疾病或者状态中的一种——优选地多种——的存在或者不存在，所述的疾病或者状态显示出一个或者多个相似或者相同的症状。这样的方法和组合物可以被用来提供用于确定疾病或者状态的检验和检验设备，所述的疾病或者状态是在临床环境中显示的一个或者多个非特异性症状的 基础 。，下面是用于区分性诊断的标志物和其应用方法专利的具体信息内容。

1.对象的基于症状的诊断方法，包括：
分析在从所述对象获得的检验样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者 含量，其中所述的标志物是被选出以确定在所述对象中，在所述对象所显示的症 状的区分性诊断内的一系列状态的存在或者不存在；和
将所述检验样品中所述标志物的存在或者含量与所述一系列状态中的每一个 的存在或者不存在相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的症状选自：呼吸困难、发热、胸痛、 腹痛、代谢状态紊乱、神经功能障碍、高血压、头晕和头痛。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的症状是呼吸困难，所述的一系列状态 选自：哮喘、慢性阻塞性肺疾病(“COPD”)、气管狭窄、阻塞性支气管内肿瘤、 肺纤维化、尘肺、淋巴管癌、脊柱后侧凸、胸腔积液、肌萎缩性侧索硬化、充血 性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心房纤颤、心肌病、瓣膜功能障碍、左 心室肥大、心包炎、心律失常、肺栓塞、代谢性酸中毒、慢性支气管炎、肺炎、 焦虑、败血症和动脉瘤夹层形成。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的一系列状态包括心肌梗塞和肺栓塞、 心肌梗塞和充血性心力衰竭、肺栓塞和充血性心力衰竭，或者心肌梗塞、肺栓塞 和充血性心力衰竭。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述的症状是呼吸困难，所述的一系列标志 物包括独立地选自下列的一系列标志物：心脏损伤的特异性标志物、神经组织损 伤的特异性标志物、组织损伤的非特异性标志物、有关血压调节的标志物、有关 肺损伤的标志物、有关炎症的标志物、有关凝血和止血的标志物，和有关凋亡的 标志物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的症状是呼吸困难，所述的一系列标志 物包括选自下列的至少一个源自对象的标志物：游离的心脏肌钙蛋白I、游离的心 脏肌钙蛋白T、在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两者都含有的复合 物中的心脏肌钙蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或者两者都含有 的复合物中的心脏肌钙蛋白T、总心脏肌钙蛋白I、总心脏肌钙蛋白T、肌酸激酶 -MB、S100ao、A型利钠肽、B型利钠肽、降钙素基因相关肽、降钙素、尿紧张素 1、尿舒张素、肾上腺髓质素、肌红蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、血栓前体蛋白、 D-二聚体、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、7s胶原蛋白片段、肺表面活性蛋白、二棕 榈酰磷脂酰胆碱、KL-6、平滑肌肌球蛋白轻链、IL-lra、髓过氧化物酶、C-反应蛋 白、单核细胞化学引诱肽-1和MMP-9，或者其相关的标志物。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包含至少一 种心脏肌钙蛋白形式、B型利钠肽或者与B型利钠肽有关的标志物，以及D-二聚 体。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述的症状是胸痛，所述的一系列状态选自： 稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、心肌缺血、心脏坏死、心房纤颤、心肌梗塞、 肌肉骨骼损伤、胆囊炎、胃食管返流、肺栓塞、心包炎、主动脉壁夹层形成、肺 炎、焦虑。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的一系列状态包括主动脉壁夹层形成、 心肌缺血、心肌坏死、心肌梗塞和心房纤颤。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述的症状是胸痛，所述的一系列标志物包 括独立地选自下列的一系列标志物：心脏损伤的特异性标志物、神经组织损伤的 特异性标志物、组织损伤的非特异性标志物、有关血压调节的标志物、有关炎症 的标志物、有关凝血和止血的标志物和有关凋亡的标志物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的症状是胸痛，所述的一系列标志物 含有选自下列的至少一个源自对象的标志物：游离的心脏肌钙蛋白I、游离的心脏 肌钙蛋白T、在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有的复合物 中的心脏肌钙蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有的 复合物中的心脏肌钙蛋白T、总心脏肌钙蛋白I、总心脏肌钙蛋白T、肌酸激酶-MB、 S100ao、A型利钠肽、B型利钠肽、NT-前BNP、降钙素基因相关肽、降钙素、尿 紧张素1、肌红蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、血栓前体蛋白、D-二聚体、平滑肌肌 球蛋白重链、IL-lra、髓过氧化物酶、C-反应蛋白、单核细胞化学引诱肽-1和MMP-9， 或者其相关的标志物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包含至少 一种心脏肌钙蛋白形式、B型利钠肽或者与B型利钠肽相关的标志物，以及平滑 肌肌球蛋白重链。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包含至少 一种心脏肌钙蛋白形式和平滑肌肌球蛋白重链。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包含至少 一种心脏肌钙蛋白形式、B型利钠肽或者与B型利钠肽相关的标志物、心房利钠 肽或者与心房利钠肽相关的标志物、肌酸激酶MB，和平滑肌肌球蛋白重链。
15.根据权利要求2所述的方法，其中所述的症状是腹痛，所述的一系列状态选自： 主动脉壁夹层形成、肠系膜栓塞、胰腺炎、阑尾炎、心肌缺血、心肌梗塞、感染 性疾病、流感、食道癌、胃腺癌、直肠腺癌、胰管腺癌、囊腺癌和胰岛细胞瘤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的一系列状态包括主动脉壁夹层形成、 心肌缺血和心肌梗塞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的症状是腹痛，所述的一系列标志物 含有选自下列的至少一个源自对象的标志物：游离的心脏肌钙蛋白I、游离的心脏 肌钙蛋白T、在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有的复合物 中的心脏肌钙蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有的 复合物中的心脏肌钙蛋白T、总心脏肌钙蛋白I、总心脏肌钙蛋白T、B型利钠肽、 与B型利钠肽相关的标志物、平滑肌肌球蛋白重链，和肌红蛋白。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包含至少 一种心脏肌钙蛋白形式、B型利钠肽或者与B型利钠肽相关的标志物，和平滑肌 肌球蛋白重链。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包含至少 一种心脏肌钙蛋白形式和平滑肌肌球蛋白重链。
20.根据权利要求2所述的方法，其中所述的症状是神经功能障碍，所述的一系列 状态选自：中风、缺血性中风、蛛网膜下腔出血、短暂缺血发作、脑内出血、出 血性中风、脑肿瘤、脑缺氧、低血糖、偏头痛、心房纤颤、心肌梗塞、心脏缺血、 外周血管疾病、偏头痛和癫痫。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的一系列状态包括缺血性中风、出血 性中风、短暂缺血发作、心房纤颤、心肌缺血和心肌梗塞。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述的症状是神经功能障碍，所述的一系 列标志物包括独立地选自下列的一系列标志物：心脏损伤的特异性标志物、神经 组织损伤的特异性标志物、组织损伤的非特异性标志物、有关血压调节的标志物、 有关炎症的标志物、有关凝血和止血的标志物，和有关凋亡的标志物。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述的症状是神经功能障碍，所述的一系 列标志物含有选择下列的至少一个源自对象的标志物：游离的心脏肌钙蛋白I、游 离的心脏肌钙蛋白T、在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有 的复合物中的心脏肌钙蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或者两者 均含有的复合物中的心脏肌钙蛋白T、总心脏肌钙蛋白I、总心脏肌钙蛋白T、C 反应蛋白、肌酸激酶-BB、肌酸激酶-MB、IL-lra、D-二聚体、神经营养素-3、c-Tau、 血管内皮生长因子、血栓前体蛋白、B型利钠肽、心房利钠肽、白介素-6、基质金 属蛋白酶-9、S-100β、凝血酶-抗凝血酶III复合物、caspase-3、细胞色素c，和冯 威勒布兰特因子的一种形式，或者其相关的标志物。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述的检验样品选自：血液样品、血清样 品、血浆样品、脑脊液样品、尿液样品、唾液样品、痰样品和胸腔渗出液样品。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述的一系列标志物选自：游离的心脏肌钙 蛋白I、游离的心脏肌钙蛋白T、在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两 者均含有的复合物中的心脏肌钙蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个 或者两者均含有的复合物中的心脏肌钙蛋白T、总心脏肌钙蛋白I、总心脏肌钙蛋 白T、B型利钠肽、心房利钠肽、肺表面活性蛋白D、D-二聚体、钙依赖磷脂结合 蛋白V、烯醇化酶、肌酸激酶-BB、肌酸激酶MB、糖原磷酸化酶、心型脂肪酸结 合蛋白、磷酸甘油酸变位酶、S100β、S100ao、纤维蛋白溶酶-α2-抗纤维蛋白溶酶 复合物、β-血小板球蛋白、血小板因子4、纤维蛋白肽A、血小板源性生长因子、 凝血酶原片段1+2、P-选择蛋白、凝血酶-抗凝血酶III复合物、冯威勒布兰特因子、 组织因子、血栓前体蛋白、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、诱导型一氧化氮合酶、 溶血磷脂酸、丙二醛修饰的低密度脂蛋白、基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、 基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-9、TIMP1、TIMP2、TIMP3、C-反应蛋白、 白介素-1、白介素-1受体拮抗剂、白介素-6、肿瘤坏死因子α、可溶性细胞内粘附 分子-1、血管细胞粘附分子、单核细胞趋化蛋白-1、caspase-3、细胞色素c、人非 依赖谷胱甘肽的脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶、嗜酸细胞阳离子蛋白、KL-6、 降钙素原、结合珠蛋白、s-CD40配体、S-FAS配体、α2肌动蛋白、碱性钙调蛋 白1、CSRP2弹性蛋白、LTBP4、平滑肌肌球蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、transgelin、 醛固酮、血管紧张素I、血管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降钙素、降钙素 基因相关肽、内皮素1、内皮素2、内皮素3、肾素、抗利尿激素、APO B48、胰 腺弹性蛋白酶1、胰腺脂肪酶、sPLA2、胰蛋白酶原激活肽、α烯醇化酶、LAMP3、 磷脂酶D、PLA2G5、蛋白D、SFTPC、防御素HBD1、防御素HBD2、CXCL-1、 CXCL-2、CXCL-3、CCL2、CCL3、CCL4、CCL8、降钙素原、蛋白C、血清淀粉 样蛋白A、s-谷胱甘肽、s-TNF P55、s-TNF P75、TAFI、TGFβ、MMP-11、脑脂 肪酸结合蛋白、CA11、CABP1、CACNA1A、CBLN1、CHN2、切割的Tau、CRHR1、 DRPLA、EGF、GPM6B、GPR7、GPR8、GRIN2C、GRM7、HAPIP、HIF1α、 HIP2、KCNK4、KCNK9、KCNQ5、MAPK10、n-乙酰天冬氨酸、NEUROD2、 NRG2、PACE4、磷酸甘油酸变位酶、PKCγ、c-Tau、前列腺素E2、PTEN、PTPRZ1、 RGS9、SCA7、secretagogin、SLC1A3、SORL1、SREB3、STAC、STX1A、STXBP1、 BDNF、血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、神经激肽A、P物质、IL-lra、白介素-1、白 介素-11、白介素-13、白介素-18、白介素-4和白介素-10，或者其相关的标志物。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述的分析步骤包含，用含有多个不连续的 可寻址的位置的检验表面接触所述的检验样品，每一位置适合于结合以检测所述 的一系列标志物中的一个。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述的一系列标志物是用夹心免疫分析来 检测。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述的检验表面是有孔的膜。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述的检验表面是无孔的表面。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述的检验表面是在毛细空间内。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述的检验表面含有固定在所述的多个不 连续的可寻址的位置处的不连续的颗粒，其中所述的不连续的颗粒含有结合于该 处的抗体。
32.用于实施基于症状的诊断方法的检验装置，其中所述的方法包括，分析在从对 象获得的检验样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者含量，其中所述的标 志物是被选出以确定在所述对象中，在所述对象所显示的症状的区分性诊断内的 一系列状态的存在或者不存在；和将所述检验样品中所述标志物的存在或者含量 与所述一系列状态中的每一个的存在或者不存在相关联，所述的检测装置包含：
含有多个不连续的可寻址的位置的检验表面，每一所述的位置含有抗体，该 抗体被选出用于结合，以检测定位在所述位置的所述一系列标志物中的一个。
33.根据权利要求32所述的检验装置，其中所述的检验表面含有固定在所述的多 个不连续的可寻址的位置处的不连续颗粒，其中所述的不连续颗粒含有所述的抗 体。
34.根据权利要求32所述的检验装置，其中所述的症状选自：呼吸困难、发热、 胸痛、腹痛、代谢状态紊乱、神经功能障碍、高血压、头晕和头痛。
35.鉴定用于实施基于症状的诊断方法的标志物组的方法，包括：
确定含有源自对象的一系列标志物的一个或者多个候选组的鉴定对象群体中 一系列状态的存在或者不存在的能力，所述的状态处于由所述的对象群体中的个 别对象所显示的症状的区分性诊断范围内，其中正确鉴定所述的一系列状态的存 在或者不存在的候选组被鉴定为标志物组。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述的症状选自：呼吸困难、发热、胸痛、 腹痛、代谢状态紊乱、神经功能障碍、高血压、头晕和头痛。
37.用于在对象中区分收缩性心力衰竭和舒张性心力衰竭的方法，包括：
分析从所述的对象获得的检验样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者 含量，其中所述的标志物是被选出用来区分收缩性心力衰竭和舒张性心力衰竭的， 和
将所述检验样品中所述标志物的存在或者含量与所述对象中收缩性心力衰竭 和舒张性心力衰竭的存在相关联。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述的方法包含，分析选自下列的标志物 的存在或者含量：B型利钠肽、与B型利钠肽相关的标志物、心房利钠肽、与心 房利钠肽相关的标志物、抗利尿激素、内皮素-2、尿舒张素、肾上腺髓质素、降钙 素基因相关肽、降钙素、尿紧张素2和血管紧张素2。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述的方法包含，分析选自下列的标志物 的存在或者含量：B型利钠肽、与B型利钠肽相关的标志物、心房利钠肽、与心 房利钠肽相关的标志物，和尿紧张素2。
40.用于实施诊断方法的检验装置，其中所述的方法包含，分析从对象获得的检验 样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者含量，其中所述的标志物是被选出 用来在对象中区分收缩性心力衰竭和舒张性心力衰竭的。
41.用于在对象中区分心房纤颤和充血性心力衰竭的方法，包含
分析从所述的对象获得的检验样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者 含量，其中所述的标志物是被选出用来区分心房纤颤和充血性心力衰竭的；和
将所述检验样品中所述标志物的存在或者含量与在所述对象中心房纤颤和充 血性心力衰竭的存在相关联。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述的方法包含，分析选自下列的标志物 的存在或者含量：心房利钠肽、与心房利钠肽相关的标志物、B型利钠肽，和与B 型利钠肽相关的标志物。
43.用于实施诊断方法的检验装置，其中所述的方法包含，分析从对象获得的检验 样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者含量，其中所述的标志物是被选出 用来在对象中区分心房纤颤和充血性心力衰竭的。
44.用于在对象中区分心房纤颤和心肌梗塞的方法，包含：
分析从所述对象获得的检验样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者含 量，其中所述的标志物是被选出用来区分心房纤颤和心肌梗塞的；和
将所述检验样品中所述标志物的存在或者含量与在所述对象中心房纤颤和心 肌梗塞的存在相关联。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述的方法包含，分析选自下列的标志物 的存在或者含量：心房利钠肽、与心房利钠肽相关的标志物、游离的心脏肌钙蛋 白I、游离的心脏肌钙蛋白T、在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两者 均含有的复合物中的心脏肌钙蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或 者两者均含有的复合物中的心脏肌钙蛋白T、总心脏肌钙蛋白I、总心脏肌钙蛋白 T，和肌红蛋白。
46.用于实施诊断方法的检验装置，其中所述的方法包含，分析从对象获得的检验 样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者含量，其中所述的标志物是被选出 用来在对象中区分心房纤颤和心肌梗塞的。
47.用于在对象中区分主动脉壁夹层形成、心肌缺血和心肌梗塞的方法，包含：
分析从所述对象获得的检验样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者含 量，其中所述的标志物是被选出用来区分主动脉壁夹层形成、心肌缺血和心肌梗 塞的；和
将所述检验样品中所述标志物的存在或者含量与在所述对象中主动脉壁夹层 形成、心肌缺血和心肌梗塞的存在相关联。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述的方法包含，分析选自下列的标志物 的存在或者含量：B型利钠肽、与B型利钠肽相关的标志物、游离的心脏肌钙蛋 白I、游离的心脏肌钙蛋白T、在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两者 均含有的复合物中的心脏肌钙蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或 者两者均含有的复合物中的心脏肌钙蛋白T、总心脏肌钙蛋白I、总心脏肌钙蛋白 T、平滑肌肌球蛋白重链，和肌红蛋白。
49.用于施行诊断方法的检验装置，其中所述的方法包含，分析从对象获得的检验 样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者含量，其中所述的标志物是被选出 用来在对象中区分主动脉壁夹层形成、心肌缺血和心肌梗塞的。
50.分析对象样品中源自对象的一系列标志物的方法，所述标志物是被选出以在多 种心血管疾病间进行区分的，包括：
检验所述样品中，一个或者多个源自对象的有关血压调节的标志物的存在或 者含量，和一个或者多个源自对象的有关心肌损伤的标志物的存在或者含量，和
基于所述标志物的存在或者含量，对所述对象已经发展成为所述的多种心血 管疾病中的各疾病的风险或者正在向所述的多种心血管疾病中的各疾病发展的风 险进行表征，其中所述标志物中的一个或者多个的含量不与预先确定的阈含量相 比较。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述的表征步骤是不将任何所述标志物的 含量和预先确定的阈含量相比较而进行的。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述的一个或者多个源自对象的有关血压 调节的标志物选自：A型利钠肽、B型利钠肽、C型利钠肽、尿紧张素II、精氨酸 血管加压素、醛固酮、血管紧张素I、血管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降 钙素、降钙素原、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、钙磷蛋白、内皮素-2，、内 皮素-3、肾素和尿舒张素，或者其相关的标志物；所述的一个或者多个源自对象的 有关心肌损伤的标志物选自：游离的心脏肌钙蛋白I、游离的心脏肌钙蛋白T、在 含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有的复合物中的心脏肌钙蛋 白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有的复合物中的心脏 肌钙蛋白T、游离的和复合的心脏肌钙蛋白I、游离的和复合的心脏肌钙蛋白T、 钙依赖磷脂结合蛋白V、β-烯醇化酶、肌酸激酶-MB、糖原磷酸化酶-BB、心型脂 肪酸结合蛋白、磷酸甘油酸变位酶-MB和S-100ao，或者其相关的标志物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述的方法包含，分析所述的样品中，下 列标志物的存在或者含量：B型利钠肽、与B型利钠肽相关的标志物、肌酸激酶 -MB，和总心脏肌钙蛋白I或者总心脏肌钙蛋白T。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述的方法进一步包含，分析所述的样品 中，一个或者多个源自对象的有关炎症的标志物的存在或者含量。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述的一个或者多个源自对象的有关炎症 的标志物选自：急性期反应物、细胞粘附分子如血管细胞粘附分子(“VCAM”)、 细胞间粘附分子-1(“ICAM-1”)、细胞间粘附分子-2(“ICAM-2”)和细胞间粘附 分子-3(“ICAM-3”)、髓过氧化物酶(MPO)、C-反应蛋白、白介素如IL-1β、IL-6 和IL-8、白介素-1受体激动剂、单核细胞化学引诱蛋白-1、非依赖谷胱甘肽的脂质 运载蛋白型前列腺素D合成酶、肥大细胞类胰蛋白酶、嗜酸细胞阳离子蛋白、结 合珠蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、Fas配体、可溶性Fas(Apo-1)、 TRAIL、TWEAK、纤维结合素、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)和血管内皮生长 因子(“VEGF”)，或者其相关的标志物。
56.根据权利要求50所述的方法，其中所述的方法进一步包含，分析所述的样品 中，一个或者多个源自对象的有关组织损伤的非特异性标志物的存在或者含量。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述的一个或者多个源自对象的有关组织 损伤的非特异性标志物选自：天冬氨酸氨基转移酶、肌红蛋白、肌动蛋白、肌球 蛋白和乳酸脱氢酶。
58.根据权利要求50所述的方法，其中所述的方法包含，分析所述的样品中，下 列标志物的存在或者含量：肌酸激酶-MB、总心脏肌钙蛋白I、肌红蛋白和B型利 钠肽，或者其相关的标志物，其中D-二聚体和/或髓过氧化物酶的存在或者含量被 任选地加入所述方法中或者被用于替代所述方法中所述标志物的一个。
59.根据权利要求50所述的方法，其中所述的方法包含，分析所述的样品中，下 列标志物的存在或者含量：总心脏肌钙蛋白I、C-反应蛋白、B-型利钠肽或者与B 型利钠肽相关的标志物，或者其相关的标志物，其中D-二聚体和/或髓过氧化物酶 的存在或者含量被任选地加入所述方法中或者被用于替代所述方法中所述标志物 的一个。
60.根据权利要求50所述的方法，其中所述的方法包含，分析所述的样品中，下 列标志物的存在或者含量：肌酸激酶-MB、总心脏肌钙蛋白I、肌红蛋白、C-反应 蛋白、B-型利钠肽或者与B型利钠肽相关的标志物，或者其相关的标志物，其中 D-二聚体和/或髓过氧化物酶的存在或者含量被任选地加入所述方法中或者被用于 替代所述方法中所述标志物的一个。
61.根据权利要求50所述的方法，其中所述的方法包含，分析所述的样品中，下 列标志物的存在或者含量：肌红蛋白、C-反应蛋白、B-型利钠肽或者与B型利钠 肽相关的标志物，或者其相关的标志物，其中D-二聚体和/或髓过氧化物酶的存在 或者含量被任选地加入所述方法中或者被用于替代所述方法中所述标志物的一 个。
62.根据权利要求50所述的方法，其中所述的方法包含，分析所述的样品中，下 列标志物的存在或者含量：肌酸激酶-MB、总心脏肌钙蛋白I和肌红蛋白；肌酸激 酶-MB、总心脏肌钙蛋白I、C-反应蛋白和肌红蛋白；或者其相关的标志物，其中 D-二聚体和/或髓过氧化物酶的存在或者含量被任选地加入所述方法中或者被用于 替代所述方法中所述标志物的一个。
63.根据权利要求50所述的方法，其中所述的方法包含，分析所述的样品中，下 列标志物的存在或者含量：B-型利钠肽或者与B型利钠肽相关的标志物、肌酸激 酶-MB、总心脏肌钙蛋白I、肌红蛋白、C-反应蛋白，或者其相关的标志物，其中 D-二聚体和/或髓过氧化物酶的存在或者含量被任选地加入所述方法中或者被用于 替代所述方法中所述标志物的一个。
64.根据权利要求50所述的方法，其中所述的方法进一步包含，分析所述的样品 中，一个或者多个源自对象的有关凝血和止血的标志物的存在或者含量。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述的一个或者多个源自对象的有关凝血 和止血的标志物选自：纤维蛋白溶酶、纤维蛋白原、D-二聚体、β-血小板球蛋白、 血小板因子4、纤维蛋白肽A、血小板源性生长因子、凝血酶原片段1+2、纤维蛋 白溶酶-α2-抗纤维蛋白溶酶复合物、凝血酶-抗凝血酶III复合物、P-选择蛋白、凝 血酶、冯威勒布兰特因子、组织因子和血栓前体蛋白。
66.根据权利要求50所述的方法，其中所述的多种心血管疾病选自：心肌梗塞、 充血性心力衰竭、急性冠脉综合症、不稳定性心绞痛和肺栓塞。
67.用于施行权利要求50所述方法的的检验装置，包含：
含有多个不连续的可寻址的位置的检验表面，所述可寻址的位置对应于所述 的源自对象的一系列标志物，每一所述的位置含有一种固定在所述位置的抗体， 所述抗体是被选出用于结合，以检测所述的源自对象的一系列标志物中的一个。
68.分析对象样品中源自对象的一系列标志物的方法，所述标志物是被选出用于在 多种脑血管疾病间进行区分的，该方法包括：
分析所述的样品中，一个或者多个源自对象的有关血压调节的标志物的存在 或者含量，和一个或者多个源自对象的有关神经组织损伤的标志物的存在或者含 量，和
基于所述标志物的存在或者含量，对所述对象已经发展成为所述的多种脑血 管疾病中的各疾病的风险或者正在向所述的多种脑血管疾病中的各疾病发展的风 险进行表征，其中所述标志物中的一个或者多个的含量不与预先确定的阈含量相 比较。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述的表征步骤是不将任何所述标志物的 含量和预先确定的阈含量相比较而进行的。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述的一个或者多个源自对象的有关血压 调节的标志物选自：A-型利钠肽、B型利钠肽、C型利钠肽、尿紧张素II、精氨酸 血管加压素、醛固酮、血管紧张素I、血管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降 钙素、降钙素原、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、钙磷蛋白、内皮素-2、内皮 素-3、肾素、尿舒张素，或者其相关的标志物，其中所述的一个或者多个源自对象 的有关心肌损伤的标志物选自：游离的心脏肌钙蛋白I、游离的心脏肌钙蛋白T、 在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有的复合物中的心脏肌钙 蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有的复合物中的心 脏肌钙蛋白T、游离的和复合的心脏肌钙蛋白I、游离的和复合的心脏肌钙蛋白T、 钙依赖磷脂结合蛋白V、β-烯醇化酶、肌酸激酶-MB、糖原磷酸化酶-BB、心型脂 肪酸结合蛋白、磷酸甘油酸变位酶-MB、S-100ao，或者其相关的标志物，其中所 述的一个或者多个源自对象的有关神经组织损伤的标志物选自：小脑肽原1、小脑 肽1、小脑肽3、chimerin1、chimerin2、calbrain、钙结合蛋白D、脑微管蛋白、 脑脂肪酸结合蛋白(“B-FABP”)、脑源性神经营养因子(“BDNF”)、碳酸酐酶XI、 CACNA1A钙通道基因、神经生长因子、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩蛋白1、 载脂蛋白E4-1、蛋白4.1B、14-3-3蛋白、睫状神经营养因子、肌酸激酶-BB、C-tau、 胶质纤维酸性蛋白(“GFAP”)、神经细胞粘附分子(“NCAM”)、神经元特异性烯 醇化酶、S-100β、前列腺素D合成酶、神经激肽A、神经紧张肽、secretagogin， 或者其相关的标志物。
71.根据权利要求68所述的方法，其中所述的方法进一步包含，分析所述的样品 中，一个或者多个源自对象的有关炎症的标志物的存在或者含量。
72.根据权利要求68所述的方法，其中所述的方法进一步包含，分析所述的样品 中，一个或者多个源自对象的有关凝血和止血的标志物的存在或者含量。
73.根据权利要求68所述的方法，其中所述的方法进一步包含，分析所述的样品 中，一个或者多个源自对象的有关凋亡的标志物的存在或者含量。
74.根据权利要求68所述的方法，其中所述的表征步骤是不将任何所述源自对象 的标志物的含量和预先确定的阈含量相比较而进行的。
75.根据权利要求68所述的方法，其中所述的多种脑血管疾病选自：缺血性中风、 出血性中风、短暂缺血发作和蛛网膜下腔出血。
76.用于实施权利要求68所述方法的的检验装置，包含：
含有多个不连续的可寻址的位置的检验表面，所述可寻址的位置对应于所述 的源自对象的一系列标志物，每一所述的位置含有固定在所述位置的抗体，所述 抗体是被选出用于结合，以检测所述的源自对象的一系列标志物中的一个。
77.分析对象样品中源自对象的一系列标志物的方法，所述标志物是被选出用于鉴 定患有心肌梗塞的对象的，该方法包括：
分析所述的样品中，一个或者多个源自对象的有关心肌损伤的一系列标志物 的存在或者含量，所述标志物选自：B型利钠肽、游离的心脏肌钙蛋白I、游离的 心脏肌钙蛋白T、在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含有的复 合物中的心脏肌钙蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或者两者均含 有的复合物中的心脏肌钙蛋白T、游离的和复合的心脏肌钙蛋白I、游离的和复合 的心脏肌钙蛋白T、总心脏肌钙蛋白I、总心脏肌钙蛋白T、肌酸激酶-MB、肌红 蛋白、caspase-3、细胞色素c、糖原磷酸化酶-MB、钙依赖磷脂结合蛋白V、β- 烯醇化酶、心型脂肪酸结合蛋白、c-反应蛋白、S-100ao，或者其相关的标志物， 和
基于所述标志物的存在或者含量，对所述对象患心肌梗塞的风险进行表征， 其中所述标志物中每一个的含量都不与预先确定的阈含量相比较。
78.在对象中诊断中风的方法，包括：
确定从所述的对象获得的样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者含量， 其中所述的一系列标志物独立地选自下列中的两个成员或者更多成员：神经组织 损伤的特异性标志物、有关血压调节的标志物、有关凝血和止血的标志物、有关 炎症的标志物，和有关凋亡的标志物，和
将所述一系列标志物的存在或者含量与中风在所述对象中的发生相关联。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述的一系列标志物独立地选自：腺苷酸 激酶、脑源性神经营养因子、钙结合蛋白D、肌酸激酶-BB、胶质纤维酸性蛋白、 乳酸脱氢酶、髓磷脂碱蛋白、神经细胞粘附分子(NCAM)、c-tau、神经肽Y、神 经元特异性烯醇化酶、神经营养素-3、含脂质蛋白、S-100β、血栓调节蛋白、蛋 白激酶Cγ、心房利钠肽(ANP)、前-ANP、B-型利钠肽(BNP)、NT-前BNP、 前-BNP C-型利钠肽、尿紧张素II、精氨酸血管加压素、醛固酮、血管紧张素I、 血管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降钙素、降钙素原、降钙素基因相关肽、 肾上腺髓质素、钙磷蛋白、内皮素-2、内皮素-3、肾素、尿舒张素、急性期反应物、 细胞粘附分子、C-反应蛋白、白介素、白介素-1受体激动剂、单核细胞化学引诱 蛋白-1、caspase-3、非依赖谷胱甘肽的脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶、肥大细 胞类胰蛋白酶、嗜酸细胞阳离子蛋白、结合珠蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死 因子β、Fas配体、可溶性Fas(Apo-1)、TRAIL、TWEAK、纤维结合素、巨噬细 胞迁移抑制因子(MIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、caspase-3、组织蛋白酶D、 α-血影蛋白、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白原、D-二聚体、β-血小板球蛋白、血小板 因子4、纤维蛋白肽A，、血小板源性生长因子、凝血酶原片段1+2、纤维蛋白溶酶 -α2-抗纤维蛋白溶酶复合物、凝血酶-抗凝血酶III复合物、P-选择蛋白、凝血酶、 冯威勒布兰特因子、组织因子、血栓前体蛋白，或者其相关的标志物。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一种选自下列的神经组织损伤的特异性标志物：腺苷酸激酶、脑源性神经营养因 子、c-tau、钙结合蛋白D、肌酸激酶-BB、胶质纤维酸性蛋白、乳酸脱氢酶、髓磷 脂碱蛋白、神经细胞粘附分子(NCAM)、神经元特异性烯醇化酶、神经营养素-3、 含脂质蛋白、S-100β、血栓调节蛋白、蛋白激酶Cγ，或者其相关的标志物。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括下列 标志物中的至少一个：NCAM、肌酸激酶-BB、c-tau、S-100β，或者其相关的标 志物。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括下列 标志物中的至少两个：NCAM、肌酸激酶-BB、c-tau、S-100β，或者其相关的标 志物。
83.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个与凋亡相关的标志物。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个与凋亡相关的标志物，其选自caspase-3、组织蛋白酶D、α-血影蛋白，或者 其相关的标志物。
85.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个与炎症相关的标志物。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个与炎症相关的标志物，其选自：急性期反应物、细胞粘附分子、C-反应蛋白、 白介素、白介素-1受体激动剂、单核细胞化学引诱蛋白-1、caspase-3、非依赖谷 胱甘肽的脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶、肥大细胞类胰蛋白酶、嗜酸细胞阳 离子蛋白、结合珠蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、Fas配体、可溶性 Fas(Apo-1)、TRAIL、TWEAK、纤维结合素、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、 血管内皮生长因子(VEGF)，或者其相关的标志物。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个与炎症相关的标志物，其选自：基质金属蛋白酶-9、VEGF、C-反应蛋白，或 者其相关的标志物。
88.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个有关血压调节的标志物。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个有关血压调节的标志物，其选自：心房利钠肽(ANP)、前-ANP、B-型利钠肽 (BNP)、NT-前BNP、前BNP C型利钠肽、尿紧张素II、精氨酸血管加压素、醛 固酮、血管紧张素I、血管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降钙素、降钙素原、 降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、钙磷蛋白、内皮素-2、内皮素-3、肾素、尿舒 张素，或者其相关的标志物。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括BNP 或者其相关的标志物。
91.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个神经组织损伤的特异性标志物、至少一个与炎症相关的标志物，和至少一个 与凋亡相关的标志物。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个有关血压调节的标志物和/或至少一个有关凝血和止血的标志物。
93.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 四个选自下列中的标志物：IL-lra、C-反应蛋白、冯威勒布兰特因子(vWF)、肌酸 激酶-BB、c-Tau、D-二聚体、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、神经细胞粘附分子(NCAM)、BNP、S100β、细胞色素c和caspase-3。
94.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括BNP、 肌酸激酶-BB、c-Tau、D-二聚体、C-反应蛋白、S100β、NCAM和caspase-3，其 中所述的源自对象的一系列标志物中的1个至3个可任选地被选自IL-lra、MMP-9、 细胞色素c和VEGF的相等数目的标志物所替代。
95.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括肌酸 激酶-BB、D-二聚体、C-反应蛋白和S100β。
96.根据权利要求78所述的方法，其中的检验方法是免疫分析方法。
97.根据权利要求78所述的方法，其中所述的关联步骤包含：确定所述的源自对 象的一系列标志物中每一个的浓度，并分别地将每一标志物的浓度和阈水平相比 较。
98.根据权利要求78所述的方法，其中所述的相关步骤包含：确定所述的源自对 象的一系列标志物中每一个的浓度，基于所述的源自对象的一系列标志物中每一 个的浓度，计算出单一的指示值，并将该指示值和阈水平相比较。
99.根据权利要求78所述的方法，其中所述的方法包含：确定所述的源自对象的 标志物中至少一个的随时间的变化，其中所述的随时间的变化被用于所述的关联 步骤中。
100.根据权利要求78所述的方法，其中当和正常对象比较时，所述方法在至少 85％的特异性时可以以至少70％的灵敏度区分出中风。
101.根据权利要求78所述的方法，其中当和正常对象比较时，所述方法在至少 90％的特异性时可以以至少80％的灵敏度区分出中风。
102.根据权利要求78所述的方法，其中当和正常对象比较时，所述方法在至少 90％的特异性时可以以至少90％的灵敏度区分出中风。
103.根据权利要求78所述的方法，其中当和显示出与中风症状相类似的症状的对 象比较时，所述在至少85％的特异性下可以以至少70％的灵敏度区分出中风。
104.用于实施权利要求78所述方法的装置，其包括多个不连续的位置，每一位置 被设置和排列以便固定而检测所述的源自对象的一系列标志物中的一个。
105.在患有蛛网膜下腔出血的对象中表征未来的脑血管痉挛风险的方法，包括：
确定从所述对象中获得的样品中，源自对象的一系列标志物的存在或者含量， 其中所述的一系列标志物独立地选自：神经组织损伤的特异性标志物、有关血压 调节的标志物、有关炎症的标志物，和有关凋亡的标志物；和
将所述对象中所述一系列标志物的存在或者含量和所述的未来脑血管痉挛的 风险相关联。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述的一系列标志物独立地选自：腺苷 酸激酶、脑源性神经营养因子、钙结合蛋白-D、肌酸激酶-BB、胶质纤维酸性蛋白、 乳酸脱氢酶、髓磷脂碱蛋白、神经细胞粘附分子(NCAM)、c-tau、神经肽Y、神 经元特异性烯醇化酶、神经营养素-3、含脂质蛋白、S-100β、血栓调节蛋白、蛋 白激酶Cγ、心房利钠肽(ANP)、前-ANP、B-型利钠肽(BNP)、NT-前BNP、 前BNP C型利钠肽、尿紧张素II、精氨酸血管加压素、醛固酮、血管紧张素I、血 管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降钙素、降钙素原、降钙素基因相关肽、 肾上腺髓质素、钙磷蛋白、内皮素-2、内皮素-3、肾素、尿舒张素、急性期反应物、 细胞粘附分子、C-反应蛋白、白介素、白介素-1受体激动剂、单核细胞化学引诱 蛋白、caspase-3、细胞色素c、非依赖谷胱甘肽的脂质运载蛋白型前列腺素D合成 酶、肥大细胞类胰蛋白酶、嗜酸细胞阳离子蛋白、结合珠蛋白、肿瘤坏死因子α、 肿瘤坏死因子β、Fas配体、可溶性Fas(Apo-1)、TRAIL、TWEAK、纤维结合素、 巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、caspase-3、组织蛋 白酶D、α-血影蛋白，或者其相关的标志物。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至 少一个神经组织损伤的特异性标志物。
108.根据权利要求3所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至少 一个神经组织损伤的特异性标志物，其选自：腺苷酸激酶、脑源性神经营养因子、 钙结合蛋白-D、肌酸激酶-BB、胶质纤维酸性蛋白、乳酸脱氢酶、髓磷脂碱蛋白、 神经细胞粘附分子(NCAM)、神经元特异性烯醇化酶、神经营养素-3、含脂质蛋 白、S-100β、血栓调节蛋白、蛋白激酶Cγ，或者其相关的标志物。
109.根据权利要求105所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至 少一个与凋亡相关的标志物。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至 少一个与凋亡相关的标志物，其选自：caspase-3、细胞色素c、组织蛋白酶D、α -血影蛋白，或者其相关的标志物。
111.根据权利要求109所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括 caspase-3或者其相关的标志物。
112.根据权利要求105所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至 少一个与炎症相关的标志物。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至 少一个与炎症相关的标志物，其选自：急性期反应物、细胞粘附分子、C-反应蛋 白、白介素、白介素-1受体激动剂、单核细胞化学引诱蛋白-1、caspase-3、非依赖 谷胱甘肽的脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶、肥大细胞类胰蛋白酶、嗜酸细胞 阳离子蛋白、结合珠蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、Fas配体、可溶性 Fas(Apo-1)、TRAIL、TWEAK、纤维结合素、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、 血管内皮生长因子(VEGF)，或者其相关的标志物。
114.根据权利要求105所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至 少一个有关血压调节的标志物。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至 少一个有关血压调节的标志物，其选自：心房利钠肽(ANP)、pro-ANP、B-型利 钠肽(BNP)、NT-前BNP、前BNP C型利钠肽、尿紧张素II、精氨酸血管加压素、 醛固酮、血管紧张素I、血管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降钙素、降钙素 原、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、钙磷蛋白、内皮素-2、内皮素-3、肾素、 尿舒张素，或者其相关的标志物。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括 BNP、NT-前BNP、前-BNP或者其相关的标志物。
117.根据权利要求105所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括至 少一个神经组织损伤的特异性标志物、至少一个炎症相关的标志物，和至少一个 凋亡相关的标志物。
118.根据权利要求105所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括选 自下列中的一个或者多个标志物：IL-lra、C-反应蛋白、冯威勒布兰特因子(vWF)、 血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、神经细胞粘附分子 (NCAM)、BNP和caspase-3。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括 VEGF、NCAM和caspase-3。
120.根据权利要求105所述的方法，其中的检验方法是免疫分析方法。
121.根据权利要求105所述的方法，其中所述的关联步骤包括：确定所述的源自 对象的一系列标志物中每一个的浓度，并分别地将每一标志物浓度和阈水平相比 较。
122.根据权利要求105所述的方法，其中所述的关联步骤包括：确定所述的源自 对象的一系列标志物中每一个的浓度，基于所述的源自对象的一系列标志物中每 一个的浓度，计算出单一的指示值，并且将指示值和阈水平相比较。
123.根据权利要求105所述的方法，其中所述方法包括：确定所述的源自对象的 标志物中至少一个的随时间的变化，其中所述的随时间的变化被用于所述的关联 步骤中。
124.根据权利要求78所述的方法，其中所述方法进一步将中风与一个或者多个类 似于中风的状态区分开来，所述的类似于中风的状态选自：脑肿瘤、动脉瘤、触 电、烧伤、感染、脑缺氧、头部损伤、应激、脱水、神经麻痹、低血糖、偏头痛、 多发性硬化、外周血管疾病、外围神经病变、癫痫、硬膜下血肿、昏厥，和短暂 性单侧衰弱。
125.根据权利要求78所述的方法，其中所述方法进一步在各种中风类型中进行区 分，所述的中风类型选自：血栓形成性中风、栓塞性中风、腔隙性中风、低灌注、 脑内出血、蛛网膜下腔出血、缺血性中风、出血性中风、短暂性缺血发作、急性 中风，和非急性中风。
126.根据权利要求78所述的方法，其中一个或者多个标志物被选出，以选择性地 确定在所述对象中中风发作的时间。
127.根据权利要求126所述的方法，其中一个或者多个标志物被选出，以确定所 述中风的发作是否是在12小时以内。
128.根据权利要求126所述的方法，其中一个或者多个标志物被选出，以确定所 述中风的发作是否是在6小时以内。
129.根据权利要求126所述的方法，其中一个或者多个标志物被选出，以确定所 述中风的发作是否是在3小时以内。
130.根据权利要求126所述的方法，其中一个或者多个标志物被选出，以确定所 述中风的发作是否是在12小时至48小时之间的时限以内。
131.根据权利要求78所述的方法，其中一个或者多个标志物被选出以从非急性中 风中区分出急性中风。
132.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括选自 下列中的多个标志物：基质金属蛋白酶-9、冯威勒布兰特因子的一种或者多种形式、 血管细胞粘附分子、C-反应蛋白、S100β，或者其相关的标志物。
133.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括选自 下列中的多个标志物：B-型利钠肽、胶质纤维酸性蛋白、白介素-8、β-神经生长 因子、冯威勒布兰特因子-Al、C-反应蛋白，或者其相关的标志物。
134.根据权利要求78所述的方法，其中至少一个标志物是BNP或者与其相关的 标志物。
135.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括选自 下列中的多个标志物：B-型利钠肽、胶质纤维酸性蛋白、白介素-8、肌酸激酶-BB、 单核细胞化学引诱蛋白-1、白介素-1受体拮抗剂，或者其相关的标志物。
136.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括选自 下列中的多个标志物：B-型利钠肽、胶质纤维酸性蛋白、C-反应蛋白、肌酸激酶-BB、 基质金属蛋白酶-9、白介素-8、β-神经生长因子，或者其相关的标志物。
137.根据权利要求78所述的方法，其中所述的源自对象的一系列标志物包括选自 下列中的多个标志物：B-型利钠肽、胶质纤维酸性蛋白、C-反应蛋白、肌酸激酶-BB、 caspase-3、单核细胞化学引诱蛋白-1、冯威勒布兰特因子-整联蛋白，或者其相关 的标志物。
138.含有多个标志物的组，其被选出以选择性地鉴定，在显示出与中风的诊断相 关联的一个或者多个症状的个体中，中风的发生或者不发生，其中所述的标志物 被选出用于在所述对象中从一个或者多个类似于中风的状态中，区分出中风的发 生。
139.根据权利要求138所述的组，其中所述的标志物被选出用于鉴定中风的发生 或者未发生，其具有至少80％的特异性和至少80％的灵敏度。
140.根据权利要求138所述的组，其中所述的标志物被选出用于鉴定中风的发生 或者未发生，其具有至少90％的特异性和至少90％的灵敏度。
141.包含多个不连续的可寻址的位置的装置，其包括用于多个标志物中的一个的 接收物，其是被选出用以选择性地鉴定，在显示出一个或者多个与中风的诊断相 关联的症状的对象中，中风的发生或者未发生，其中所述的标志物是被选出用以 从一个或者多个类似于中风的状态中，区分出所述对象中中风的发生。
142.预测患有血管疾病的对象的一个或者多个未来临床后果风险的方法，包括：
确定来自所述对象的样品中，血栓前体蛋白的存在或者含量；和
将血栓前体蛋白的存在或者含量与对象的所述一个或者多个临床后果的风险 相关联。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述血管疾病选自：急性冠脉综合症、 动脉粥样硬化、缺血性中风、脑内出血、蛛网膜下腔出血、短暂缺血发作、心脏 收缩功能障碍、心脏舒张功能障碍、动脉瘤、主动脉壁夹层形成、心肌缺血、心 绞痛、心肌梗塞、充血性心力衰竭、扩张性充血性心肌病、肥大性心肌病、限制 性心肌病、肺原性心脏病、心律失常、瓣膜性心脏疾病、心内膜炎、肺栓塞、静 脉血栓形成和外周血管疾病。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述的血管疾病是急性冠脉综合症。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述的一个或者多个未来临床后果选自： 死亡、非致命心肌梗塞、需要再次入院治疗的再发缺血、需要紧急血管置换术的 再发缺血，和充血性心力衰竭。
146.根据权利要求145所述的方法，其中关联步骤包括：确定所述样品中血栓前 体蛋白的浓度，并将所述浓度和阈浓度相比较，其中小于所述阈浓度的血栓前体 蛋白浓度提示所述一个或者多个临床后果的第一种风险，大于所述阈浓度的血栓 前体蛋白浓度提示所述一个或者多个临床后果的第二种风险。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述阈浓度提供至少大约0.6的ROC曲 线面积。
148.根据权利要求146所述的方法，其中所述阈浓度提供大约4或更高或者大约 0.25或更低的优势比。
149.根据权利要求146所述的方法，其中所述阈浓度提供大约1.25或更高或者大 约0.8或更低的危险性比。
150.根据权利要求146所述的方法，其中所述阈浓度是在患有急性冠脉综合症的 对象的样品中所测定到的血栓前体蛋白浓度中位数。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述血栓前体蛋白浓度中位数是大约8.9 μg/ml。
152.根据权利要求142所述的方法，进一步包括确定所述样品中一个或者多个其 它的源自对象的标志物的存在或者含量，并且，所述的关联步骤包括将血栓前体 蛋白和所述的一个或者多个其它的源自对象的标志物的存在或者含量与对象的所 述一个或者多个临床后果的风险相关联。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述的一个或者多个其它的源自对象的 标志物独立地选自：心肌损伤的特异性标志物、神经组织损伤的特异性标志物、 有关血压调节的标志物、有关凝血和止血的标志物、有关炎症的标志物和有关凋 亡的标志物。
154.根据权利要求153所述的方法，其中所述的一个或者多个其它的源自对象的 标志物包括一个或者多个心肌损伤的特异性标志物。
155.根据权利要求153所述的方法，其中所述的一个或者多个其它的源自对象的 标志物包括一个或者多个神经组织损伤的特异性标志物。
156.根据权利要求153所述的方法，其中所述的一个或者多个其它的源自对象的 标志物包括一个或者多个与血压调节相关的标志物。
157.根据权利要求153所述的方法，其中所述的一个或者多个其它的源自对象的 标志物包括一个或者多个与凝血和止血相关的标志物。
158.根据权利要求153所述的方法，其中所述的一个或者多个其它的源自对象的 标志物包括一个或者多个与凋亡相关的标志物。
159.根据权利要求153所述的方法，其中所述的一个或者多个其它的源自对象的 标志物选自：钙依赖磷脂结合蛋白V、B-型利钠肽、β-烯醇化酶、游离的心脏肌 钙蛋白I、复合的心脏肌钙蛋白I、游离的和复合的心脏肌钙蛋白I、游离的心脏肌 钙蛋白T、复合的心脏肌钙蛋白T、游离的和复合的心脏肌钙蛋白T、肌酸激酶-MB、 糖原磷酸化酶-BB、心脏型脂肪酸结合蛋白、磷酸甘油酸变位酶-MB、S-100ao、腺 苷酸激酶、脑源性神经营养因子、钙结合蛋白-D、肌酸激酶-BB、胶质纤维酸性蛋 白、乳酸脱氢酶、髓磷脂碱蛋白、神经细胞粘附分子(NCAM)、c-tau、神经肽Y、 神经元特异性烯醇化酶、神经营养素-3、含脂质蛋白、S-100β、血栓调节蛋白、 蛋白激酶Cγ、心房利钠肽(ANP)、前-ANP、B-型利钠肽(BNP)、NT-前BNP、 前-BNP C-型利钠肽、尿紧张素II、精氨酸血管加压素、醛固酮、血管紧张素I、 血管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降钙素、降钙素原、降钙素基因相关肽、 肾上腺髓质素、钙磷蛋白、内皮素-2、内皮素-3、肾素、尿舒张素、急性期反应物、 细胞粘附分子、C-反应蛋白、白介素、白介素-1受体激动剂、单核细胞化学引诱 蛋白-1、caspase-3、非依赖谷胱甘肽的脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶、肥大 细胞类胰蛋白酶、嗜酸细胞阳离子蛋白、结合珠蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏 死因子β、Fas配体、可溶性Fas(Apo-1)、TRAIL、TWEAK、纤维结合素、巨噬 细胞迁移抑制因子(MIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、caspase-3、组织蛋白酶 D、α-血影蛋白、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白原、D-二聚体、β-血小板球蛋白、血 小板因子4、纤维蛋白肽A、血小板源性生长因子、凝血酶原片段1+2、纤维蛋白 溶酶-α2-抗纤维蛋白溶酶复合物、凝血酶-抗凝血酶III复合物、P-选择蛋白、凝血 酶、冯威勒布兰特因子、组织因子，或其相关的标志物。
160.根据权利要求153所述的方法，其中所述多个源自对象的标志物包括BNP或 者其相关的标志物。
161.根据权利要求153所述的方法，其中所述多个源自对象的标志物包括游离的 心脏肌钙蛋白I、复合的心脏肌钙蛋白I、游离的和复合的心脏肌钙蛋白I、游离的 心脏肌钙蛋白T、复合的心脏肌钙蛋白T、游离的和复合的心脏肌钙蛋白T、或者 其相关的标志物。
162.根据权利要求153所述的方法，其中所述多个源自对象的标志物包括C反应 蛋白或者其相关的标志物。
163.根据权利要求153所述的方法，其中所述多个源自对象的标志物包括 Caspase-3或者其相关的标志物。
164.根据权利要求153所述的方法，其中所述多个源自对象的标志物包括髓过氧 化物酶或者其相关的标志物。
165.根据权利要求142所述的方法，其中所述样品来源于人。
166.根据权利要求142所述的方法，其中所述样品选自血液、血清和血浆。
167.根据权利要求142所述的方法，其中所述的检验方法是免疫分析方法。
168.根据权利要求153所述的方法，其中所述的关联步骤包括：确定血栓前体蛋 白和所述的一个或者多个其它的源自对象的标志物的浓度，并单独地将每一浓度 和相应的阈水平相比较。
169.根据权利要求153所述的方法，其中所述的关联步骤包括：确定血栓前体蛋 白和所述的一个或者多个其它的源自对象的标志物的浓度，基于各个浓度计算出 单一的指示值，并将该指示值和阈水平相比较。
170.根据权利要求142所述的方法，其中所述的方法包括确定血栓前体蛋白浓度 随时间的变化，其中所述的随时间的变化被用于所述关联步骤中。
171.用于实施权利要求153所述方法的装置，其包括多个不连续的位置，每一个 不连续的位置被设置和排列以便固定，从而检测血栓前体蛋白或者所述的一个或 者多个其它的源自对象的标志物中的一个。
172.在对象中诊断动脉粥样硬化的方法，包括：
确定来自所述对象的样品中，单核细胞化学引诱蛋白-1或者其相关标志物的 存在或者含量；和
将单核细胞化学引诱蛋白-1的存在或者含量与对象中动脉粥样硬化的存在或 者不存在相关联。
173.根据权利要求172所述的方法，其中所述的关联步骤包括：确定所述样品中 单核细胞化学引诱蛋白-1或者其相关标志物的浓度，并将所述浓度和阈浓度相比 较，其中小于所述阈浓度的单核细胞化学引诱蛋白-1或者其相关标志物浓度提示 动脉粥样硬化的第一种风险，大于所述阈浓度的单核细胞化学引诱蛋白-1或者其 相关标志物浓度提示动脉粥样硬化的第二种风险。
174.根据权利要求172所述的方法，其中所述的关联步骤进一步包括：确定所述 对象的选自下列的一个或者多个风险因子的存在或者量：性别、年龄、糖尿病的 诊断、高血压的诊断、过去吸烟史、胆固醇浓度、动脉粥样硬化的家族史，其中 一个或者多个所述风险因子的存在或者量以及单核细胞化学引诱蛋白-1或者其相 关标志物的存在或者含量被关联于该对象中动脉粥样硬化的存在或者不存在。
175.根据权利要求173所述的方法，其中所述的阈浓度提供大约1.3或更多或者 大约0.77或更少的优势比。
176.根据权利要求173所述的方法，其中所述的阈浓度被选出以提供大约2或更 多或者大约0.5或更少的优势比。
177.根据权利要求173所述的方法，其中所述的血栓前体蛋白浓度中位数大于大 约120pg/ml。
178.根据权利要求173所述的方法，其中所述的血栓前体蛋白浓度中位数大于大 约150pg/ml。
179.根据权利要求173所述的方法，其中所述的血栓前体蛋白浓度中位数大于大 约200pg/ml。
180.根据权利要求172所述的方法，进一步包括确定所述样品中一个或者多个其 它的源自对象的标志物的存在或者含量，并且所述的关联步骤包括：将单核细胞 化学引诱蛋白-1或者其相关标志物以及所述的一个或者多个其它的源自对象的标 志物的存在或者含量与该对象中动脉粥样硬化的存在或者不存在相关联。
181.根据权利要求180所述的方法，其中所述的一个或者多个其它的源自对象的 标志物独立地选自：心肌损伤的特异性标志物、神经组织损伤的特异性标志物、 有关血压调节的标志物、有关凝血和止血的标志物、有关炎症的标志物和有关凋 亡的标志物。
182.根据权利要求172所述的方法，其中的检验方法是免疫分析方法。

说明书全文

技术领域

【001】本发明涉及用于疾病和状态的区分性诊断(differential diagnosis)的诊 断标志物(markers)的鉴别和应用。在各个方面，本发明涉及方法和组合物，其 可以确定一种——和，优选地，多种——疾病和/或状态的存在或者不存在，所述 的疾病和/或状态表现出一个或者多个相似或者相同的症状。

背景技术

【002】提供关于本发明背景的下述讨论，仅仅是为了帮助读者理解本发明，而 不是承认它们被描述作为或者构成本发明的现有技术。
【003】某些疾病或者状态的临床表现，常常可以是显著相似的，即使基础的 (underlying)疾病，以及要给予患有所述各种疾病的个体的适合的治疗，可以是 完全不同的。例如，对象可以出现在急救室中，呈现出迷惑性的简单的表面症候 群(例如，发热、气促、头晕、头痛)，这样的表面症候群可以是各种不相关的状 态的特征。区分性诊断方法涉及对已知与一种或多种疾病相关的症状和/或诊断检 测结果进行比较，所述的一种或多种疾病对于对象所显示的症状和/或诊断结果而 言，显示出了相似的临床表现。
【004】以气促(临床上称作“呼吸困难”)作为例子，患者经常以此症状作为 最初的临床表现，出现在临床情况中。如果孤立地考虑，此症状可以指示不同的 状态，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(“COPD”)、气管狭窄、阻塞性支气管内肿瘤、 肺纤维化、尘肺、淋巴管性癌病、脊柱后侧凸、胸腔积液、肌萎缩性侧索硬化、 充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心肌病、瓣膜功能障碍、左心室肥 大、心包炎、心律失常、肺栓塞、代谢性酸中毒、慢性支气管炎、肺炎、焦虑、 败血症、急性冠脉综合症、动脉瘤夹层形成，等等。参见，例如，Kelley’s Textbook of Internal Medicine，4th，Ed.，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA， 2000，pp.2349-2354，“Approach to the Patient With Dyspnea”；Mulrow et al.，J.Gen. Int.Med.8：383-92(1993)。
【005】在呼吸困难的例子中，区分性诊断包括，从众多的可能原因之中，鉴定 出在特定的对象中引起气促的特定条件。这些方法常常需要临床医生整合从一组 检验测试获得的信息，导致作出临床诊断，该诊断最接近地代表了症状和/或由对 象所获得的诊断检测结果的范围。所需的检测可以包括X线摄影术、心电图、活 动平板运动试验、血液化学分析、超声心动图、支气管激发试验、肺量测定法、 呼吸量测定法、食管pH监测、喉镜检查、计算机体层摄影术、组织学、细胞学、 磁共振成像，等等。参见，例如，Morgan and Hodge，Am.Fam.Physician 57：711-16 (1998)。由于可能需要进行各种检测，获得充分的信息以得出诊断可以花费数小时 或者甚至数天。
【006】胸痛的区分性诊断需要临床医生考虑许多可能的原因，包括在呼吸性疼 痛和下列疼痛之间进行区分：与心绞痛有关的疼痛，或者与心肌梗塞有关的疼痛， 以及与胸膜炎有关的疼痛和与胸壁疼痛。
【007】在患有心力衰竭的患者中，舒张功能障碍和收缩功能障碍的区分性诊断 是重要的，因为对其中每一种功能障碍的治疗是不同的。从心力衰竭中进一步将 心房纤颤区分性地鉴别出来，对于正确的治疗，是至关重要的。
【008】在感染方面，对病毒感染和细菌感染的区分性诊断，对于临床医生施行 正确的治疗，是至关重要的。
【009】症状的急性程度和严重程度常常提示，必须如何迅速地确立诊断和开始 治疗。对经历着与呼吸困难和胸痛有关的各种急性状态的患者，即时的诊断和护 理可能是至关重要的。参见，例如，Harris，Aust.Fam.Physician 31：802-06(2002) (哮喘)；Goldhaber，Eur.Respir.J.Suppl.35：22s-27s(2002)(肺栓塞)；Lundergan et al.， Am.Heart J.144：456-62(2002)(心肌梗塞)。然而，即使在表面症状看起来相对稳定 的情况下，快速的诊断和快速的开始治疗，既可以缓解即时的不适，又可以在预 后方面提供有利的改善。
【0010】在前面部分中所引用的每一参考文献，以其整体在此并入作为参考，包 括所有的表、图和权利要求。
发明概述
【0011】本发明涉及用于疾病和状态的区分性诊断和临床结果的预测的诊断标 志物的鉴别和应用。此处描述的方法和组合物，可以满足本领域中对于快速、灵 敏和特异的诊断检验和预后检验的需要，以用于各种疾病的诊断和区别，所述的 疾病在一个或者多个临床特征上相关。
【0012】在各个方面，本发明涉及用于鉴定一个或者多个症状的基础原因的材料 和方法，所述的症状在单独被考虑时，可以和多种可能的基础疾病或者状态有关； 本发明涉及在诊断和治疗患者和/或监测治疗方案的进程中，应用这样的标志物； 本发明涉及应用此类标志物鉴定处于基础疾病或状态的一个或者多个不利后果风 险中的对象；本发明还涉及用于筛选化合物和药物组合物的材料和方法，所述化 合物和药物组合物在治疗或者预防疾病或者状态中，可能提供益处。
【0013】在评价疾病的诊断标志物水平或者预后标志物水平的传统方法中，对于 感兴趣的标志物，一个“阈”通常被确立，并且将该标志物在样品中的浓度，与 该阈值相比较；大于已确定的阈的值，提示了一种状态(例如，疾病)，小于已确 定的阈的值，提示了另一种状态(例如，正常)。例如，美国心脏协会(American Heart Association)已经规定，心脏肌钙蛋白I浓度高于正常人群的99个百分点浓 度，应被用于纳入心肌梗塞。在此处描述的方法中，对于一个或者多个标志物， 这样的阈浓度可以被确立，并且这些阈以相似的方式，被用于确定对象的诊断/预 后。然而，随着一系列标志物数量的增加，对每一标志物应用单独的阈，可能变 得不易施行。因此，在一些优选实施方案中，多个标志物被评价，不依赖于标志 物组(panel)中的一个或者多个标志物的具体的阈，来确定具体的诊断和/或预后。 相反地，本发明可以应用将多个标志物作为一个统一的整体的评价方法。在一个 简单的例子中，两个或者多个标志物的比值，而不是标志物的绝对数量，可以被 用于确定诊断/预后。然而，甚至更优选地，这样的一组标志物的特定“指纹”形 式的变化可以，有效地作为具体的诊断指示物或者预后指示物。之后描述了用于 确定“组反应值”的方法，其将多个标志物的浓度整合为单个结果。在这些方法 中，在样品中测定的每一标志物的浓度都对此组反应值有贡献，其可以与阈组反 应相比较，如同其简单地是一个单一标志物的浓度。这是诊断方法的一个例子， 其中一个或者多个标志物的量没有和预先确定的阈水平比较。
【0014】在一个方面，本发明公开了用于确定在对象中疾病或者状态的存在或者 不存在(“诊断”)的方法，该对象在一个或者多个身体特征(即，一个或者多个 “症状”)方面，显示了可察觉的变化，该变化提示了作为观察到的症状(多个症 状)的基础的多种可能的病因。这些方法包括，分析来自对象的检测样本中，一 个或者多个标志物的存在或者含量，所述标志物是针对观察到的症状(多个症状) 的可能病因中的一个或者多个。在来自对象的样本中，这种标志物(多个标志物) 的存在或者含量，可以被用来纳入或者排除可能病因中的一个或者多个，从而提 供一个诊断(纳入)和/或者排除一个或者多个诊断(排除)。
【0015】在一些实施方案中，这些标志物可以被用于纳入或者排除气促，或者“呼 吸困难”的一个或者多个可能的病因。尽管本发明之后是就，在与呼吸困难相关 的疾病或者状态的区分性诊断方面，一般性地做了描述，技术人员将理解，此处 描述的，基于症状的区分性诊断的概念，普遍地适用于提示多种可能的病因的任 何身体特征，如发热、胸痛(或者“心绞痛”)、腹痛、神经功能障碍、代谢状态 紊乱如异常的水代谢、电解质代谢、矿物质代谢、或酸碱代谢、高血压、头晕、 头痛，等等。
【0016】在优选的实施方案中，本发明涉及方法，其中分析检测样本中，与多数 可能的病因有关的，各种标志物的存在或者含量，因此，基于单一样品的分析， 该方法可以适用于纳入或者排除多种可能的基础原因。
【0017】在呼吸困难的例子中，多种标志物被优选地选出，以纳入或者排除下列 诊断中的一个或多个——优选地为多个：哮喘、心房纤颤、慢性阻塞性肺疾病 (“COPD”)、气管狭窄、阻塞性支气管内肿瘤、肺纤维化、尘肺、淋巴管性癌病、 脊柱后侧凸、胸腔积液、肌萎缩性侧索硬化、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、 心肌梗塞、急性冠脉综合症、心肌病、瓣膜功能障碍、左心室肥大、心包炎、心 律失常、肺栓塞、代谢性酸中毒、慢性支气管炎、肺炎、焦虑、败血症、或者动 脉瘤夹层形成。在一种特别优选的实施方案中，该方法涉及，限定呼吸困难的原 因，以纳入或者排除心肌缺血和心脏坏死，心力衰竭和肺栓塞。在又一种特别优 选的实施方案中，该方法涉及，限定呼吸困难的原因，以纳入或者排除心肌缺血 和心脏坏死、心力衰竭、肺栓塞和心房纤颤。也可以将多个标志物用于风险的预 测，风险是指，对象可能遭受未来的临床结果如死亡，或者遭受一个或者多个非 致命的并发症，如可能需要再次入院治疗。技术人员将理解，同样的多个标志物 既可以提供诊断信息，也可以提供预后信息。用于诊断的标志物和用于预后的标 志物，可以是相同的，或者不同，这样，用于一个目的中的一个或者多个标志物 可以不用于另一目的。
【0018】在腹痛的例子中，多个标志物被优选地选出，以纳入或者排除下列多种 疾病：主动脉瘤、肠系膜栓塞、胰腺炎、阑尾炎、心肌梗塞、上面描述的一种或 多种感染性疾病、流感、食道癌、胃腺癌、直肠腺癌、胰腺肿瘤包括胰管腺癌、 囊腺癌、和胰岛细胞瘤。
【0019】在代谢状态紊乱的例子中，多个标志物被优选地选出，以纳入或者排除 下列多种疾病：糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、酒精性酮症酸中毒、呼吸性酸中毒、 呼吸性碱中毒、非生酮高血糖、低血糖、肾功能衰竭、间质性肾疾病、COPD、肺 炎、肺水肿、哮喘。
【0020】如此处所详细描述，多种标志物作为组的一部分被应用，如此后所描述， 以和对对象的诊断和/或者预后相关联。这样的组可以包含2个、3个、4个、5个、 6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或者更多的标志物或者单独的标志物。 用于诊断呼吸困难原因的优选的组含有多种标志物，其独立地选自由下列标志物 组成的集合：心脏损伤的特异性标志物、神经组织损伤的特异性标志物、组织损 伤的非特异性标志物、有关血压调节的标志物、有关炎症的标志物、有关凝血和 止血的标志物、有关肺部损伤的标志物，和有关凋亡的标志物。在此后描述了， 在这些集合中的每一个中的代表性标志物。优选地，这样的组含有来自此集合的2 个、3个、4个、5个、或者更多个不同成员的标志物。因此，用于诊断呼吸困难 原因的特别优选的组，包含一个或者多个心脏损伤的特异性标志物，和一个或者 多个有关血压调节的标志物；一个或者多个心脏损伤的特异性标志物，和一个或 者多个有关凝血和止血的标志物；一个或者多个有关血压调节的标志物，和一个 或者多个有关凝血和止血的标志物；或一个或者多个心脏损伤的特异性标志物， 一个或者多个有关血压调节的标志物，和一个或者多个有关凝血和止血的标志物， 其中这些特别优选的组中的每一个，可以任选地含有一个或者多个组织损伤的非 特异性标志物、有关炎症的标志物、有关肺部损伤的标志物、和/或者有关凋亡的 标志物。当单独被考虑时，一个或者多个标志物可能缺乏诊断价值或者预后价值， 但是当作为组的一部分被应用时，这种标志物在确定具体诊断和/或预后中，可以 具有重要的价值。
【0021】用于此处描述方法的心脏损伤的优选的特异性标志物包括，例如，钙依 赖磷脂结合蛋白(annexin)V、β-烯醇化酶、心脏肌钙蛋白I(游离的和/或复合 的)、心脏肌钙蛋白T(游离的和/或复合的)、肌酸激酶-MB、糖原磷酸化酶-BB、 心型脂肪酸结合蛋白、磷酸甘油酸变位酶-MB和S-100ao。用于此处描述方法的优 选的组织损伤非特异性标志物包括，例如，天冬氨酸氨基转移酶、肌红蛋白、肌 动蛋白、肌球蛋白，和乳酸脱氢酶。
【0022】用于此处描述方法的有关血压调节的优选的标志物(多个标志物)含有， 例如，一个或者多个标志物，其选自下列集合：心房利钠肽(“ANP”)、前-APN、 B型利钠肽(“BNP”)、NT-前BNP、前BNP C型利钠肽、尿紧张素II、精氨酸血 管加压素、醛固酮、血管紧张素I、血管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降 钙素、降钙素原、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、钙磷蛋白(calcyphosine)、 内皮素-2、内皮素-3、肾素和尿舒张素，或者与其相关的标志物。
【0023】用于此处描述方法的有关炎症的优选的标志物(多个标志物)含有，例 如，一个或者多个标志物，其选自下列集合：急性期反应物，细胞粘附分子如血 管细胞粘附分子(“VCAM”)、细胞间粘附分子1(“ICAM-1”)、细胞间粘附分子2 (“ICAM-2”)和细胞间粘附分子3(“ICAM-3”)，髓过氧化物酶(MPO)、C反应 蛋白、白介素如IL-1β、IL-6和IL-8，白介素-1受体激动剂，单核细胞化学引诱蛋 白-1、非依赖谷胱甘肽的脂质运载蛋白(Lipocalin)型前列腺素D合成酶、肥大细 胞胰蛋白酶、嗜酸细胞阳离子蛋白、结合珠蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子 β、Fas配体、可溶性Fas(Apo-1)、TRAIL、TWEAK、纤维结合素(fibronectin)、 巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、和血管内皮生长因子(“VEGF”)，或者和其相关 的标志物。用于此处的术语“急性期反应物”是指，响应于应激状态或者炎症状态， 浓度被升高的蛋白质，应激状态或者炎症状态在各种损害期间发生，包括感染、 损伤、手术、创伤、组织坏死，和类似损害。急性期反应物的表达和血清浓度升 高对于损害的类型不是特异性的，而是作为对损害的稳态反应的一部分。
【0024】除了在上面列举为“炎症相关标志物”的那些急性期反应物，有关炎症的 一个或者多个标志物也可以选自急性期反应物的集合，包括海帕西啶(hepcidin)、 HSP-60、HSP-65、HSP-70、不对称二甲基精氨酸(一种一氧化氮合成酶的内源性 抑制剂)、基质金属蛋白11，3和9、防御素HBD1、防御素HBD2、血清淀粉样 蛋白A、氧化LDL、胰岛素样生长因子、转化生长因子β、e-选择蛋白、谷胱甘肽 -S-转移酶、缺氧诱导因子1α、诱导型一氧化氮合酶(“I-NOS”)、细胞内粘附分子、 乳酸脱氢酶、单核细胞化学引诱物肽1(“MCP-1”)、n-乙酰天冬氨酸、前列腺素 E2、核因子受体激活物(“RANK”)配体、TNF受体超家族成员1A、脂多糖结合 蛋白(“LBP”)和血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)，或者其相关的标志物。
【0025】用于此处描述方法的有关凝血和止血的优选的标志物(多个标志物)含 有，例如，选自下列集合的一个或者多个标志物，包括纤维蛋白溶酶、纤维蛋白 原、血栓前体蛋白、D-二聚体、β-血小板球蛋白、血小板因子4、纤维蛋白肽 (fibrinopeptide)A、血小板源性生长因子、凝血酶原片段1+2、纤维蛋白溶酶-α2- 抗纤维蛋白溶酶复合物、凝血酶-抗凝血酶III复合物、P-选择蛋白、凝血酶，和冯 威勒布兰特因子(von Willebrand factor)、组织因子或者其相关的标志物。
【0026】用于此处描述方法的有关肺部损伤的优选的标志物含有，例如，选自下 列集合的一个或者多个标志物，包括嗜中性白细胞弹性蛋白酶、7s胶原蛋白片段、 一种(多种)肺表面活性蛋白、二棕榈酰磷脂酰胆碱、KL-6，和泛素结合的肺蛋白， 或者其相关的标志物。
【0027】用于此处描述方法的有关凋亡的优选的标志物含有，例如，选自下列集 合的一个或者多个标志物，包括血影蛋白、组织蛋白酶D、半胱天冬酶3(caspase-3)、 细胞色素c、s-乙酰谷胱甘肽、和泛素融合降解蛋白1同型物。
【0028】如此后所详细描述，本发明的方法和组合物可以被选出，以通过在收缩 性心力衰竭和舒张性心力衰竭之间区分，而再次细分充血性心力衰竭，这通过分 析得自对象的检测样本中，一个或者多个标志物的存在或者含量而实施，标志物 的存在或者含量可以被用于纳入或者排除收缩性心力衰竭和/或者舒张性心力衰 竭，或者可以被用于在充血性心力衰竭的这两种原因之间进行区分。类似地，此 处的方法和组合物可以在心房纤颤和心力衰竭之间进行区分，通过分析得自对象 的检测样本中，一个或者多个标志物的存在或者含量而实施，标志物的存在或者 含量可以被用于纳入或者排除心力衰竭或者心房纤颤。同样地，此方法可以被用 于在收缩功能障碍和舒张功能障碍和心房纤颤之间进行区分，和/或在收缩功能障 碍和舒张功能障碍、心房纤颤、心肌缺血和心脏坏死之间区分。
【0029】例如，对于作为呼吸困难的基础的各种疾病的区分性诊断，可能需要在 心力衰竭和心房纤颤之间辨别。用于进行这种辨别的优选的组，优选地包括多数 有关血压调节的标志物，优选地是BNP或者BNP相关肽，和ANP或者ANP相关 肽。另外的标志物可以被加入这样的组，以区分收缩功能障碍和舒张功能障碍和 心房纤颤。用于进行这种鉴别的优选的标志物组，优选地包括多个有关血压调节 的标志物。最优选地，这样的组含有BNP、降钙素基因相关肽、降钙素、尿紧张 素1，和ANP，或者相关的肽。同样的，可以限定标志物，以区分收缩功能障碍 和舒张功能障碍、心房纤颤、心肌缺血和心脏坏死。在这种情形下，优选的标志 物组包括各种有关血压调节的标志物，一个或者多个心脏坏死的标志物，和任选 的包括一个或者多个组织损伤的非特异性标志物。最优选地，这样的组包括BNP、 降钙素基因相关肽、降钙素、尿紧张素1、ANP、和心脏肌钙蛋白I或者T(游离 的和/或者复合的)、或者相关的肽，并且任选地包括肌红蛋白、肌酸激酶MB和/ 或S100ao，或者相关的肽。
【0030】而且，凝血和止血的一个或者多个标志物，最优选地为D-二聚体和/或 血栓前体蛋白或者相关肽，可以被加入，以协助这样的组纳入或者排除肺栓塞。 同样地，血管组织损伤的一个或者多个标志物，优选地为平滑肌肌球蛋白，最优 选地为平滑肌肌球蛋白重链或者相关肽，可以被加入这样的组，以协助这样的组 纳入或者排除主动脉夹层形成。最终地，有关炎症的一个或者多个标志物，优选 地是IL-1ra、髓过氧化物酶、MMP-9、和/或者C反应蛋白，也可以对这种组提供 附加的信息，用于疾病的进一步辨别。
【0031】用于区分呼吸困难原因的特别优选的标志物包括选自下列集合的2个或 者多个标志物：心脏损伤的特异性标志物、组织损伤的非特异性标志物、有关炎 症的标志物、有关血压调节的标志物、和有关凝血和止血的标志物。最优选是的 含有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或者更多这样的标志物的组，标志 物最优选地选自下列集合，包括心脏特异的肌钙蛋白I(游离的和/或复合的)、心 脏特异的肌钙蛋白T(游离的和/或复合的)、肌酸激酶MB、S100ao、A型利钠肽、 B型利钠肽、降钙素基因相关肽、降钙素、尿紧张素1、肌红蛋白、平滑肌肌球蛋 白轻链、血栓前体蛋白、D-二聚体、平滑肌肌球蛋白重链、IL-1ra、髓过氧化物酶、 caspase-3、细胞色素c、C反应蛋白、单核细胞化学吸引物肽-1、和MMP-9，或者 其相关标志物。一个或者多个标志物可以从此特别优选的标志物名单中被替代、 加入或者减去，而仍能够提供临床上有用的结果。
【0032】这些标志物可以被组合成各种组合。例如，优选的组可以包括下列标志 物中的2个、3个、4个、5个、或者更多个：B型利钠肽或者有关B型利钠肽的 标志物、肌酸激酶-MB、心脏总肌钙蛋白I、心脏总肌钙蛋白T、C反应蛋白、D- 二聚体、和肌红蛋白。
【0033】特别优选的标志物包括肌酸激酶-MB、心脏总肌钙蛋白I、肌红蛋白、 和B型利钠肽或者有关B型利钠肽的标志物；心脏总肌钙蛋白I、C反应蛋白、和 B型利钠肽或者有关B型利钠肽的标志物；肌酸激酶-MB、心脏总肌钙蛋白I、肌 红蛋白、C反应蛋白、和B型利钠肽或者有关B型利钠肽的标志物；肌红蛋白、C 反应蛋白、和B型利钠肽或者有关B型利钠肽的标志物；肌酸激酶-MB、心脏总 肌钙蛋白I、和肌红蛋白；或者肌酸激酶-MB、心脏总肌钙蛋白I、C反应蛋白和 肌红蛋白。这些特别优选的组可以进一步含有D-二聚体和/或髓过氧化物酶；并且 D二聚体和/或髓过氧化物酶可以被用于替代这些特别优选的组中的标志物的一个 或者两个。
【0034】这样的组可以诊断一个或者多个——优选地区分多个——选自下列集 合的心血管疾病，包括心肌梗塞、充血性心力衰竭、急性冠脉综合症、ST升高的 ACS、非ST升高的ACS、不稳定性心绞痛、和/或者肺栓塞；和/或可以预测对象 可能遭受未来的临床结果的风险，如死亡、非致命性心肌梗塞、需要紧急血管置 换的再发缺血、和/或需要再次入院治疗的再发缺血；和/或预测这些疾病的未来后 果的风险。可以将表现出相似症状但不是充血性心力衰竭的疾病或者状态(“CHF 类似”)与充血性心力衰竭鉴别开来的一个标志物(或多个标志物)，在此处被称 为“CHF区分性诊断标志物”；可以将表现出相似症状但不是心肌梗塞的疾病或者 状态(“MI类似”)与心肌梗塞鉴别开来的一个标志物(或多个标志物)，在此处 被称为“MI区分性诊断标志物”。
【0035】按照相似的方式，组可以含有被选出以在多种心血管疾病中进行诊断和 /或区分的多种标志物。在优选的实施方案中，本发明公开了方法，其用于确定有 关中风的诊断或预后，或者用于在中风的类型和/或TIA之间进行鉴别。这些方法 包括，分析取自对象的检测样本中，脑损伤的一个或者多个标志物的存在或者含 量。这些方法可以包括鉴定一个或者多个标志物，其存在或者含量与中风和/或TIA 的诊断、预后或区分鉴别相联系。一旦这样的标志物(或多个标志物)被确定， 在取自感兴趣的对象的样本中，这种标志物(或多个标志物)的水平可以被测定。 在一些实施方案中，可以将这些标志物同与中风和/或TIA的诊断、预后或者区分 鉴别相联系的水平相比较。通过将对象的标志物水平(或多个水平)与诊断性标 志物水平(或多个水平)相关联，患者的中风的存在或者不存在、将来的不利后 果发生的概率等等，可以被迅速地和准确地确定。
【0036】本发明也公开了用于确定对象中疾病或者状态的存在或者不存在的方 法，该对象在一个或者多个症状方面显示了可察觉的变化，该变化提示了作为观 察到的症状(或多个症状)的基础的多种可能的病因，其中一个病因是中风。这 些方法包括，分析取自对象的检测样本中，一个或者多个标志物的存在或者含量， 所述标志物被选择以纳入或者排除中风、或者中风的一个类型或者多个类型作为 观察到的症状(或多个症状)的可能的病因。在观察到的症状(或多个症状)的 区分性诊断范围内的、除中风之外的病因，在此被称为“中风类似病因”，可以将 中风类似病因和中风的一个类型或者多个类型鉴别开来的标志物(或多个标志 物)，在此被称为“中风的区分性诊断标志物”。在取自对象的样本中，这种标志 物(或多个标志物)的存在或者含量可以被用于纳入或者排除下列病因中的一个 或多个：中风、血栓性中风、栓塞性中风、腔隙性中风、低灌注、亚临床性脑缺 血、脑内出血和蛛网膜下腔出血，从而提供某诊断(纳入)和/或者排除某诊断(排 除)。
【0037】在有关脑血管疾病的这些方面，优选的标志物组包括多个标志物，其独 立地选自由下列标志物组成的集合：神经组织损伤的特异性标志物、有关血压调 节的标志物、有关凝血和止血的标志物、有关炎症的标志物和有关凋亡的标志物。 优选地，这样的组含有此集合中的2个、3个、4个或者5个不同成员。
【0038】前面描述了有关血压调节、炎症以及凝血和止血的代表性的标志物。有 关神经组织损伤的一个或者多个标志物包括那些选自下列集合的标志物：小脑肽 原(precerebellin，一种与补体C1qB链的球形结构域类似的小脑特异性蛋白)1、 小脑肽(cerebellin)1、小脑肽3、chimerin(一种表达于脑部的GTP酶激活性蛋 白)1、chimerin 2、calbrain(一种钙离子结合蛋白)、钙结合蛋白(calbindin)D、 脑微管蛋白、脑脂肪酸结合蛋白(“B-FABP”)、脑源性神经营养因子(“BDNF”)、 碳酸酐酶XI、CACNA1A钙通道基因、神经生长因子β、齿状核红核苍白球丘脑 下核萎缩蛋白(atrophin)1、载脂蛋白E4-1、蛋白4.1B，、14-3-3蛋白、睫状神经 营养因子、肌酸激酶-BB、C-tau、胶质纤维酸性蛋白(“GFAP”)、神经细胞粘附分 子(“NCAM”)、神经元特异性烯醇化酶、S-100β、前列腺素D合成酶、神经激肽 A、神经紧张肽(neurotensin)和secretagogin(一种人胰腺β细胞和神经内分泌细 胞特异性钙结合蛋白)。有关神经组织损伤的另外的示例性标志物在下面被描述。
【0039】被选出用以在多种脑血管疾病中进行诊断和/或区分的优选的标志物，包 括选自下列集合的多个标志物：腺苷酸激酶、脑源性神经营养因子、钙结合蛋白D、 肌酸激酶-BB、胶质纤维酸性蛋白、乳酸脱氢酶、髓磷脂碱蛋白、神经细胞粘附分 子(NCAM)、c-tau、神经肽Y、神经元特异性烯醇化酶、神经营养素(neurotrophin) 3、蛋白脂蛋白、S-100β、血栓调节素、蛋白激酶Cγ、心房利钠肽(ANP)、前ANP、 B-型利钠肽(BNP)、NT-前BNP、前-BNP C型利钠肽、尿紧张素II、精氨酸抗利 尿激素、醛固酮、血管紧张素I、血管紧张素II、血管紧张素III、缓激肽、降钙素、 降钙素原、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素(adrenomedullin)、钙磷蛋白 (calcyphosine)、内皮素-2、内皮素-3、肾素、尿钠素(urodilatin)、急性期反应物、 MMP-9、细胞粘附分子、C反应蛋白、白介素、白介素-1受体激动剂、单核细胞 趋化蛋白-1、半胱天冬酶-3、lipocalin-型前列腺素D合成酶、肥大细胞类胰蛋白酶、 嗜酸性细胞阳离子蛋白、KL-6、结合珠蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、 Fas配体、可溶性Fas(Apo-1)、TRAIL、TWEAK、纤维结合素、巨噬细胞迁移抑 制因子(MIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、半胱天冬酶-3、组织蛋白酶(cathepsin) D、α-血影蛋白、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白原、D-二聚体、β-血小板球蛋白、血小 板因子4、纤维蛋白肽A、血小板源性生长因子、凝血酶原片段1+2、纤维蛋白溶 酶-α2-抗纤维蛋白溶酶复合物、凝血酶-抗凝血酶III复合物、P-选择蛋白、凝血酶、 冯威勒布兰特因子(von Willebrand factor)、组织因子和血栓前体蛋白，或者其相 关的标志物。
【0040】最优选的标志物组含有有关神经组织损伤的至少一个标志物和炎症的 至少一个标志物，优选地含有选自下列集合的2个、3个、4个、5个、6个、7个、 8个或者更多的标志物：IL-1ra、C反应蛋白、冯威勒布兰特因子(vWF)、肌酸激 酶-BB、肌酸激酶-MB、c-Tau、D-二聚体、血栓前体蛋白、血管内皮生长因子 (VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、神经细胞粘附分子(NCAM)、BNP、 S100β、细胞色素c和半胱天冬酶-3。
【0041】本发明的优选的标志物可以区别缺血性中风、出血性中风和TIA。这样 的标志物在此处被称为“中风区别标志物”。特别优选的标志物是区别血栓性中风、 栓塞性中风、腔隙性中风、低灌注、脑内出血和蛛网膜下腔出血型中风的标志物。 为了下列讨论的目的，所描述的适用于中风的诊断和预后的方法，通常可以被认 为适用于TIAs的诊断和预后。
【0042】本发明其他的优选的标志物可以鉴定那些患有处于随后的不利后果风 险中的中风的对象。例如，表现脑内出血型中风和蛛网膜下腔出血型中风的一部 分患者，可能容易发生由脑血管痉挛引起的随后的血管损伤。在另一个例子中， 为了鉴定不利后果的风险，临床上正常的对象可以被筛选出来。优选的标志物包 括半胱天冬酶-3、NCAM、MCP-1、S100b、MMP-9、vWF、BNP、CRP、NT-3、 VEGF、CKBB、MCP-1钙结合蛋白、凝血酶-抗凝血酶III复合物、IL-6、IL-8、髓 磷脂碱蛋白、组织因子、GFAP和CNP。这些术语中的每一个在此后被定义。特别 优选的标志物是那些在表现蛛网膜下腔出血的患者中，预测随后的脑血管痉挛的 标志物，例如冯威勒布兰特因子、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9、或者这 些标志物的组合。其它的特别优选的标志物是那些区分缺血性中风和出血性中风 的标志物。
【0043】其它的特别优选的标志物是那些在表现蛛网膜下腔出血的患者中，预测 随后的脑血管痉挛的标志物，例如一个或者多个有关血压调节的标志物、有关炎 症的标志物、有关凋亡的标志物和/或神经组织损伤的特异标志物。另一方面，这 样的组可以含有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、 20个或者更多的标志物或者单独的标志物。单独地应用或者成组地应用的优选的 标志物(或多个标志物)可以选自下列集合：IL-1ra、C反应蛋白、冯威勒布兰特 因子(vWF)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、神经 细胞粘附分子(NCAM)、BNP和半胱天冬酶-3，或者其相关标志物。
【0044】获得关于发作的真正时间的信息可能是至关重要的，因为已报道，早期 治疗对于正确治疗是至关重要的。获得此发作时间的信息可能是困难的，经常是 基于与中风受害者的同伴的谈话得出。因此，在各种实施方案中，标志物和标志 物组被选出，以区分自中风发作起的大致时间。对于本发明的用途，术语“急性 中风”是指在之前12个小时内发生的中风，更优选地在之前6个小时内发生，最 优选地在之前3个小时内发生；而术语“非急性中风”是指在大于12小时之前发 生的中风，优选地在12和48小时之间以前发生，最优选地在12和24小时之间 以前发生。下面描述了用于区别急性中风和非急性中风的优选的标志物，它们在 此处被称为中风“发作时间标志物”。
【0045】优选的组含有用于下列用途的标志物：中风的诊断；中风的诊断和是否 发生急性中风的指征；中风的诊断和是否发生非急性中风的指征；中风的诊断、 是否发生急性中风的指征和是否发生非急性中风的指征；中风的诊断和是否发生 缺血性中风的指征；中风的诊断和是否发生出血性中风的指征；中风的诊断、是 否发生缺血性中风的指征和是否发生出血性中风的指征；中风的诊断和对随后的 不利后果的预测；中风的诊断和对随后的脑血管痉挛的预测；和中风的诊断，是 否发生出血性中风的指征，和对随后的脑血管痉挛的预测。
【0046】如上所指出，组也可以包括中风的区分性诊断；中风的区分性诊断和是 否发生急性中风的指征；中风的区分性诊断和是否发生非急性中风的指征；中风 的区分性诊断、是否发生急性中风的指征和是否发生非急性中风的指征；中风的 区分性诊断和是否发生缺血性中风的指征；中风的区分性诊断和是否发生出血性 中风的指征；中风的区分性诊断、是否发生缺血性中风的指征和是否发生出血性 中风的指征；中风的区分性诊断和对随后的不利后果的预测；中风的区分性诊断 和对随后的脑血管痉挛的预测；和中风的区分性诊断，是否发生出血性中风的指 征，和对随后的脑血管痉挛的预测。
【0047】标志物在这样的组中的存在或者含量可以和多种脑血管疾病的存在与 否相关联。另外的标志物在下面被描述。如在此后所描述，根据其它的标志物在 组中的状态，此处所描述的标志物可以提示多种疾病。例如，在源自各种原因的 炎症中，一些标志物通常被升高。因此，单独地看，一个单一的标志物本身可能 不是诊断性的，但是作为组的一部分，该标志物可以提供重要的诊断和/或预后信 息。
【0048】在一个相关的方面，被选出以在多种脑血管疾病中进行诊断和/或区分的 标志物的存在或者含量，也可以被应用于预后，以便确定患者是否具有未来发作 脑血管疾病的风险。这样的应用在监测已知处于这种发作的增加的风险中的患者 方面，可以发现特别的益处。例如，已知经受过颈动脉内膜切除术的患者处于脑 缺血的风险中。这种缺血的后果包括术中中风和围手术期中风、神经缺陷和死亡。 脑缺血也是例如低温停循环、主动脉瓣置换术、二尖瓣置换术、冠状动脉手术、 主动脉瘤的移植内修复(endograft repair)、冠状动脉旁路移植手术、喉罩插入以及 先天性心脏缺陷修复过程中的一个风险。因此，本发明也涉及用于监测经受着这 样的过程的患者的状态的方法和组合物，以确定处于风险中的患者。
【0049】在又一个方面，本发明描述了血栓前体蛋白(“TpPTM”)和单核细胞化 学引诱蛋白-1(MCP-1)，它们作为代表性的独立标志物，可用于对患有血管疾病 的患者进行风险分级和诊断。例如，在ACS的例子中，TpPTM和/或MCP-1可以 允许确定患者可能遭受未来的临床结果的风险，如死亡、非致命性心肌梗塞、需 要紧急的血管置换的再发缺血，和/或需要重新入院治疗的再发缺血。风险分级的 时间范围(即，可以被预测的预后风险的时期)可以是从1天至5年，更优选地 从1周至2年，最优选地从1个月至1年。尽管此后描述了有关急性冠脉综合症 (″ACS″)的患者，然而根据此处所描述的方法，TpPTM和MCP-1也可以被用于 各种方面，以提供各种血管疾病的诊断和预后信息，凝血和止血和/或炎症包含在 所述血管疾病中。
【0050】可以对其应用此处所描述的各个方面的优选疾病，包括选自下列集合的 一种或者多种疾病：败血症、急性冠脉综合症、动脉粥样硬化、缺血性中风、脑 内出血、蛛网膜下出血、短暂性缺血发作、心脏收缩功能障碍、心脏舒张功能障 碍、动脉瘤、主动脉壁夹层形成、心肌缺血、心绞痛、心肌梗塞、充血性心力衰 竭、扩张性充血性心肌病、肥大性心肌病、限制性心肌病、肺原性心脏病、心律 失常、瓣膜性心脏疾病、心内膜炎、肺栓塞、静脉血栓形成和外周血管疾病。
【0051】在此方面的一个优选的实施方案中，本发明以对患有血管疾病的对象， 预测一个或者多个临床结果风险的方法为特征，它通过分析取自该对象的检测样 品中TpPTM和/或MCP-1的存在或者含量，并应用在该样品中测定的TpPTM和/或 MCP-1的存在或者含量，将该患者的一个或者多个临床结果的风险联系起来而实 施。
【0052】如此后所描述，TpPTM和/或MCP-1可以和指定的一个或者多个临床结 果的风险相联系，而不考虑任何其它的标志物。因此，在一些实施方案中，仅通 过提供一个或者多个预先确定的阈浓度，这样一种联系就可以被形成，在阈浓度 以下，对象具有第一种风险水平，和在阈浓度以上，对象具有第二种风险水平。 基于TpPTM和/或MCP-1浓度已被测定的血管疾病患者群体，对象可以被指定一种 相对的预后风险，并且随后的临床结果在数天、数月或者数年期间跟随发生。根 据本领域已知的方法，群体TpPTM和/或MCP-1(相关的)浓度可以被分为最高之 三分之一值(tertiles)、最高之四分之一值(quartiles)、最高之五分之一值(quintiles) 等，并且对每一亚群确定相关的风险水平。而后，根据被测定的TpPTM和/或MCP-1 浓度，可以将患者指定于这些预后风险亚群中的一种。
【0053】在其它的实施方案中，如此处所描述，TpPTM和/或MCP-1被用作组的 一部分，以将对象与一个或者多个临床结果的风险关联起来。这样的组可以含有2 个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或者更多个 标志物或者单独的标志物，其中至少一个是TpPTM或者MCP-1。优选的组含有多 种标志物，其独立地选自下列集合：TpPTM、MCP-1和一个或者多个另外的标志物， 另外的标志物独立地选自下列集合：心脏损伤的特异标志物、神经组织损伤的特 异标志物、有关血压调节的标志物、有关炎症的标志物、有关凝血和止血的标志 物，和有关凋亡的标志物。这些集合中的每一个中的代表性标志物在此后被描述。 当单独地被考虑时，与TpPTM和/或MCP-1共同考虑的一个或者多个标志物可能缺 乏诊断价值或者预后价值，但是当被用作组的一部分时，这样的标志物在确定具 体的诊断和/或者预后的过程中，可以具有巨大的价值。
【0054】包含在这样的组中的其它合适的标志物，在此后被详细描述。用于这样 的组的特别优选的标志物除了TpPTM之外，包括BNP、心脏肌钙蛋白I(游离的或 者复合的)、心脏肌钙蛋白T(游离的或者复合的)、CRP、肌酸激酶-MB、MMP-9、 半胱天冬酶-3、肌红蛋白、髓过氧化物酶、sCD40L，或者其相关的标志物。一个 或者多个标志物可以从此特别优选的名单中被替代、加入或者减去，而仍能够提 供临床上有用的结果。
【0055】在本发明的另一个方面，描述了诊断血管疾病的方法。这样的方法包括 分析取自对象的检测样品，检测TpPTM和/或MCP-1以及一个或者多个另外的标志 物的存在或者含量，并且应用TpPTM和/或MCP-1以及一个或者多个另外的标志物 (或多个标志物)的存在或者含量，确定在对象中血管疾病的存在或者不存在。 因而在此方面，TpPTM和/或MCP-1被用于诊断性组的一部分。如上所述，这种组 可以含有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个， 或者更多个标志物或者单独的标志物，其中至少一个是TpPTM或者MCP-1。优选 的组含有TpPTM和/或MCP-1以及一个或者多个另外的标志物，另外的标志物独立 地选自下列集合：心脏损伤的特异标志物、神经组织损伤的特异标志物、有关血 压调节的标志物、有关炎症的标志物、有关凝血和止血的标志物，和有关凋亡的 标志物。
【0056】在本发明的一个相关方面，描述了诊断动脉粥样硬化的方法。这样的方 法包括分析取自对象的检测样品中MCP-1(和任选地一个或者多个另外的标志物) 的存在或者含量，并且应用MCP-1(和一个或者多个另外的标志物，如果被测定 的话)的存在或者含量，确定在对象中动脉粥样硬化的存在或者不存在。当MCP-1 被用作此方面的诊断性组的一部分时，此组可以含有2个、3个、4个、5个、6 个、7个、8个、9个、10个、15个、20个，或者更多个标志物或者单独的标志 物，其中至少一个是MCP-1。优选的组含有MCP-1和一个或者多个另外的标志物， 另外的标志物独立地选自下列集合：心脏损伤的特异标志物、神经组织损伤的特 异标志物、有关血压调节的标志物、有关炎症的标志物、有关凝血和止血的标志 物，和有关凋亡的标志物。
【0057】本发明的标志物组可以用本领域中的技术人员熟知的许多方式被分析。 例如，组中的每一成员可以和“正常”值比较，或者和提示特定疾病或者后果的 值比较。具体的诊断/预测可以基于每一标志物和这样的值之间的比较；或者，只 要标志物的一个子集超出了正常范围，此子集便可以提示具体的诊断/预测。例如， 组中的一些标志物可以被用以诊断(或者排除)心肌梗塞，而组中的其它成员可 以诊断(或者排除)充血性心力衰竭，而组中的再其它的成员可以诊断(或者排 除)主动脉壁夹层形成。标志物通常也可以被用于多种用途，通过，例如，为标 志物提供不同的阈或者不同的权重因子，以用于不同的用途(或多个用途)。例如， 可以将某一浓度或者权重的标志物，单独地应用或者作为更大的组中的一部分而 应用，以便诊断(或者排除)心肌梗塞，并且可以将不同浓度或者权重的同样的 标志物，单独地应用或者作为更大的组中的一部分而应用，以便诊断(或者排除) 充血性心力衰竭等。
【0058】在一些实施方案中，仅仅通过指示物(或多个指示物)的存在或者不存 在，便将一个或者多个诊断或者预后指示物与状态或者疾病关联起来。例如，一 种检验分析可以被设计，以至于标志物的阳性信号仅在高于感兴趣的特定阈浓度 时出现，而在低于该浓度时，该检验不提供高于背景的信号。在其它的实施方案 中，诊断或者预后指示物(或多个指示物)的阈浓度(或多个浓度)可以被确立， 并且可以简单地将患者样品中的指示物(或多个指示物)的水平与所述阈水平(或 多个水平)相比较。
【0059】诊断和/或预后检验的灵敏度和特异性不仅取决于该检验的分析“质量” —它们也取决于对构成异常结果的内容的定义。实际上，接受器工作特性 (Receiver Operating Characteristic)曲线，或者“ROC”曲线，通常是通过绘制在 “正常”群体和“疾病”群体中，变量的值与其相对频率之间的关系曲线而得出 的。对于任何特定的标志物，对于患有疾病和不患有疾病的对象，标志物水平的 分布很可能会互相重叠。在这样的情况下，该检测不能以100％的准确性绝对地区 分正常和疾病，并且重叠的区域提示了该检测在何处不能区分正常和疾病。一个 阈被选出，超过该阈(或者低于该阈，取决于标志物随疾病如何变化)，该检测就 认为是异常的，而低于该阈，该检测就认为是正常的。ROC曲线下的面积是得到 的测定结果允许正确地确定一种状态的概率的量度。ROC曲线甚至在检测结果不 一定给出精确数值时也可被应用。只要某人可以对结果分级，他就可以做出一条 ROC曲线。例如，对“疾病”样品的检测结果可能根据程度被分级(例如1＝低程 度，2＝中等程度，3＝高程度)。此分级可以和“正常”群体中的结果关联起来，并 且作出ROC曲线。这些方法在本领域是公知的，参见，例如，Hanley et al.，Radiology 143：29-36(1982)。优选地，一个阈被选出，以提供大于大约0.5的ROC曲线面积， 更优选地，大于大约0.7，进一步更优选地，大于大约0.8，甚至更优选地，大于 大约0.85，最优选地，大于大约0.9。就这一点，术语“大约”是指给定测量结果 的+/-5％。
【0060】如此后所描述，“组反应值(panel response value)”优选地通过绘制ROC 曲线来确定，该曲线表示了一特定的标志物组的灵敏度与该组在各个截止点的 1-(特异性)的关系。在这些方法中，来自对象的标志物测定结果的曲线图被整合， 以提供单一的值，它可被认为是所述组“结果”。因此，组中的多个标志物被一起 考虑，以提供全面的概率(以数字记分或者风险百分数来表示)。在这样的实施方 案中，某标志物子集的增加可能足以提示对一个患者的具体诊断/预后，而不同的 标志物子集的增加则可能足以提示另一个患者的相同或者不同的诊断/预后。权重 因子也可以被应用于组中的一个或者多个标志物，例如，当一个标志物在确定一 个具体的诊断/预后中有特别高的利用时，其可以被加权以至于它独自的指定水平 就足以表示阳性的结果。同样地，权重因子可以规定，一个特定标志物的指定水 平并不足以表示阳性的结果，而是在另一个标志物也对该分析起作用时才表示该 结果。
【0061】在一些实施方案中，标志物和/或标志物组被选出，显示至少大约70％ 的灵敏度，更优选地，至少大约80％的灵敏度，甚至更优选地，至少大约85％的 灵敏度，进一步更优选地，至少大约90％的灵敏度，最优选地，至少大约95％的 灵敏度，而同时具有至少大约70％的特异性，更优选地，至少大约80％的特异性， 甚至更优选地，至少大约85％的特异性，进一步更优选地，至少大约90％的特异 性，最优选地，至少大约95％的特异性。在特别优选的实施方案中，灵敏度和特 异性均为至少大约75％，更优选地，至少大约80％，甚至更优选地，至少大约85％， 进一步更优选地，至少大约90％，最优选地，至少大约95％。就这一点，术语“大 约”是指特定测量的+/-5％。
【0062】在其它的实施方案中，阳性似然比、阴性似然比、优势比(odds ratio)、 或者危险性比(hazard ratio)被用作一个检测预测风险或者诊断疾病的能力的量度。 在阳性似然比的例子中，数值1提示，在“患病的”和“对照的”组的对象中， 阳性结果均是同样的可能性；大于1的数值提示，阳性结果在患病组中是更加可 能的；小于1的数值提示，阳性结果在对照组中是更加可能的。在阴性似然比的 例子中，数值1提示，在“患病的”和“对照的”组的对象中，阴性结果均是同 样的可能性；大于1的数值提示，阴性结果在检测组中是更加可能的；小于1的 数值提示，阴性结果在对照组中是更加可能的。在一些优选的实施方案中，标志 物和/或者标志物组被优选地选出，以显示至少大约1.5或更多的阳性似然比，或 者大约0.67或更少的阴性似然比，优选地，阳性似然比至少大约2或者更多，进 一步优选地，至少大约5或者更多，甚至更优选地，至少大约10或者更多，最优 选地，至少大约20或者更多；阴性似然比大约0.5或者更少，进一步优选地，大 约0.2或者更少，甚至更优选地，大约0.1或者更少，最优选地，大约0.05或者更 少。就这一点，术语“大约”是指给定测量结果的+/-5％。
【0063】在几率比的例子中，数值1提示，在“患病的”和“对照的”组的对象 中，阳性结果均是同样的可能性；大于1的数值提示，阳性结果在患病组中是更 加可能的；小于1的数值提示，阳性结果在对照组中是更加可能的。在一些优选 的实施方案中，标志物和/或者标志物组被优选地选出，以显示至少大约2或更多 或者大约0.5或更少的优势比，更优选地，至少大约3或更多或者大约0.33或更 少，进一步优选地，至少大约4或更多或者大约0.25或更少，甚至更优选地，至 少大约5或更多或者大约0.2或更少，最优选地，至少大约10或更多或者大约0.01 或更少。就这一点，术语“大约”是指特定测量结果的+/-5％。
【0064】在危险性比的情形下，数值1提示，在“患病的”和“对照的”组中， 终点(例如，死亡)的相对风险是相等的；大于1的数值提示，在患病组中，风 险较大；小于1的数值提示，在对照组中，风险较大。在一些优选的实施方案中， 标志物和/或标志物组被优选地选出，以显示至少大约1.1或更多或者大约0.91或 更少的危险性比，更优选地，至少大约1.25或更多或者大约0.8或更少，进一步 优选地，至少大约1.5或更多或者大约0.67或更少，甚至更优选地，至少大约2 或更多或者大约0.5或更少，最优选地，至少大约2.5或更多或者大约0.4或更少。 就这一点，术语“大约”是指特定测量结果的+/-5％。
【0065】技术人员将理解，将诊断指示物或预后指示物同诊断或未来临床结果的 预后风险相联系，是一种统计学分析。例如，与小于或者等于X水平的患者相比， 大于X的标志物水平可以表示，患者更加可能遭受不利的后果，如统计学显著性 的水平所确定。另外地，标志物浓度相对于基线水平的变化，可以反映出患者的 预后，并且标志物水平的变化程度，可以和不利事件的严重程度有关。统计学显 著性通常可以通过比较两个或者更多个的群体，确定可信区间和/或p值来确定。 参见，例如，Dowdy and Wearden，Statistics for Research，John Wiley & Sons，New York，1983。本发明的优选的可信区间是90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、 99.9％和99.99％，而优选的p值是0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001 和0.0001。
【0066】在其它的实施方案中，可以此处所描述的一个或者多个诊断/预后标志物 进行多次测定，标志物的时间变化可以被用于确定诊断或者预后。例如，一个对 象样品中的标志物浓度可以在最初的时间被测定，并且在第二个时间从第二个对 象样品中再次被测定。在这样的实施方案中，从最初的时间至所述的第二个时间， 标志物的增加可以提示一个具体的诊断，或者一个具体的预后。同样地，从最初 的时间至第二个时间，标志物的降低可以提示一个具体的诊断，或者一个具体的 预后。可以将此“时间变化”参数作为一个标志物，包含在本发明的标志物组中。 在一个相关的实施方案中，可以对一个或者多个诊断/预后标志物进行多次测定， 标志物的时间变化可以被用于监测合适的治疗的效果。在这样的实施方案中，在 有效的治疗的期间，可以期望看到标志物(或多个标志物)的降低或者增加。
【0067】技术人员将理解，尽管在一些实施方案中，比较性的测定是由相同的诊 断标志物在多个时间点形成的，但也可以在一个时间点测定一个特定的标志物， 而在第二个时间点测定第二个标志物，并且这些标志物的比较也可以提供诊断信 息。类似地，技术人员将理解，在一段时间中，标志物的一系列的测定结果以及 变化或者组合得到的结果，也可以具有诊断价值和/或预后价值。
【0068】在其它的实施方案中，预后指示物或者诊断指示物的水平变化的阈程度 可以被确立，并且可以简单地将患者样品中指示物的水平变化程度与该水平变化 的阈程度相比较。本发明的标志物水平的优选的阈变化是大约5％、大约10％、大 约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约50％、大约75％、大约100％、 和大约150％。就这一点，术语“大约”是指+/-10％。在又其它的实施方案中，“列 线图”可以被确立，据此，预后指示物或者诊断指示物的水平可以直接地和特定 后果的相关倾向联系起来。技术人员可以熟悉地应用这种列线图，以将两种数值 联系起来，同时理解，此测定的误差和标志物浓度的误差是相同的，原因是单独 的样品测量结果被参考，而不是群体均数。
【0069】在又另一个方面，本发明涉及用于确定用于对象的治疗方案的方法。所 述方法优选地包括如此处所描述的确定诊断或者预后，并选择适合于该诊断的一 个或者多个治疗方案。在优选的实施方案中，一个治疗方案被选出，以通过降低 与该诊断相关的不利后果的倾向，来改善对象的预后。如上所述，这样的方法也 可以被用于筛选药物化合物，以寻找能改善患者预后的药剂。
【0070】在进一步的方面，本发明涉及用于确定患者的诊断或者预后的试剂盒和 设备。试剂盒优选地含有用于进行此处所描述的检验的设备和试剂，和进行检验 的说明书。所述设备优选地含有多个不连续的、独立可寻址的位置，或“诊断区 (diagnostic zone)”，其中的每一个区都和感兴趣的特定标志物有关。样品和所述 设备反应之后，信号由诊断区生成，然后，其可以和感兴趣的标志物的存在或者 含量相关联。任选地，试剂盒可以含有一个或者多个用于将标志物水平(或多个 水平)转变为诊断或者预后的手段。这种试剂盒优选地含有足够的试剂，以便进 行一个或者多个这样的测定，和/或含有美国食品药物管理局(FDA)或者其它政 府批准的标签。
附图简述
【0071】图1显示了在ACS对象加入OPUS-TIMI 16研究后的12个月期间，TpPTM 的浓度和临床结果的关系。
【0072】图2显示了对象中MCP-1浓度和动脉粥样硬化的关系，所述对象在临 床上并不表现出明显的动脉粥样硬化，如通过确定CAC所测定的那样。
发明详述
【0073】本发明涉及用于在对象中对疾病进行基于症状的区分性诊断的方法和 组合物。
【0074】提出寻求医学治疗的患者，在身体特征或者功能上经常表现出一个或者 几个主要的可观察到的变化，而这些正是疾病的指示。通常地，这些“症状”是 非特异性的，因为许多潜在的疾病可以表现出同样的可观察到的症状或者多个症 状。非特异性症状典型地可以包括下列的一个或者多个：气促(或者呼吸困难)、 胸痛、发热、头晕和头痛。这些症状可以是十分普遍的，并且必须被医生加以考 虑的疾病的数量可以是惊人地广泛的。
【0075】以气促(临床上被称为“呼吸困难”)作为例子，此症状孤立地被考虑 时，可以提示不同的状态如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(“COPD”)、气管狭窄、肺 损伤、阻塞性支气管内肿瘤、肺纤维化、尘肺、淋巴管性癌病、脊柱后侧凸、胸 腔积液、肌萎缩性侧索硬化、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心房 纤颤、心肌病、瓣膜功能障碍、左心室肥大、心包炎、心律失常、肺栓塞、代谢 性酸中毒、慢性支气管炎、肺炎、焦虑、败血症、动脉瘤夹层形成，等等。参见， 例如，Kelley’s Textbook of Internal Medicine，4th Ed.，Lippincott Williams & Wilkins， Philadelphia，PA，2000，pp.2349-2354，“Approach to the Patient With Dyspnea”； Mulrow et al.，J.Gen.Int.Med.8：383-92(1993)。
【0076】类似地，胸痛，当孤立地被考虑时，可以提示稳定性心绞痛、不稳定性 心绞痛、心肌缺血、心房纤颤、心肌梗塞、肌骨骼损伤、胆囊炎、胃食管返流、 肺栓塞、心包炎、主动脉壁夹层形成、肺炎、焦虑等等。而且，在不是明确的心 肌梗塞的情形下，将胸痛分类为稳定性心绞痛或者不稳定性心绞痛(或者甚至是 轻度的心肌梗塞)，是完全主观的。该诊断，以及在此情形下的鉴别，不是通过可 以定量动脉阻塞程度的血管造影术，而是通过医生对临床症状的解释来获得的。
【0077】区分性诊断是指，基于对象中可观察到的特征性的性质和那些潜在疾病 的特征性的性质的比较，诊断在该特定对象中的具体疾病(或多个疾病)和/或具 体状态(或多个状态)的方法，所述疾病和状态是特定对象的症状的基础。取决 于在区分性诊断中必须被考虑的疾病和状态的范围，医生必须施用的试验分析的 种类和数量可以是非常多的。例如，在呼吸困难的情形下，医生可以选用下列集 合中的试验分析，包括X线摄影术、心电图、活动平板运动试验、血液化学分析、 超声心动图、支气管激发试验、肺量测定法、呼吸量测定法、食管pH监测、喉镜 检查、计算机体层摄影术、组织学、细胞学、磁共振成像，等等。参见，例如， Morgan and Hodge，Am.Fam.Physician 57：711-16(1998)。然后，医生必须整合从一 套试验获得的信息，得出最接近地代表症状的范围和/或来自对象的诊断试验结果 的临床诊断。
【0078】本发明描述了方法和组合物，其可以协助对一个或者多个非特异性症状 的区分性诊断，这是通过提供诊断标志物来实施的，所述标志物经设计以便可以 纳入或者排除一种——优选为多种——针对观察到的症状的可能病因。此处所描 述的基于症状的区分性诊断的概念，可以包括提供诊断标志物的组，所述组经设 计以便对它们进行考虑时便可相应的区分可能的疾病，所述疾病是在患者中观察 到的非特异性症状的基础。
【0079】如此处所应用，术语“发热”是指口腔体温超过100度或者直肠体温超 过100.8度。在发热的情形下，多个标志物被优选地选出，以纳入或者排除下列疾 病中的多个：败血症；动脉炎；结节病；和一种或者多种感染性疾病，包括由葡 萄球菌属(Staphyloccus species)，奈瑟菌属(Nisseria species)，肺炎双球菌属 (Pneumococcal species)，李斯特氏菌属(Listeria species)，炭疽菌(Anthrax)， 诺卡氏菌属(Nocardia species)，沙门氏菌属(Salmonella species)，志贺氏杆菌属 (Shigella species)，嗜血杆菌属(Haemophilus species)，布鲁氏菌属(Brucella species)，弧菌属(Vibrio species)包括霍乱弧菌(V.cholerae)，土拉弗朗西斯菌 (Franciscella tularensis)，鼠疫杆菌(Yersinia pestis)，假单胞菌属(Pseudomonas species)，梭菌属(Clostridia species)包括破伤风梭菌(C.tetani)、产气荚膜梭菌 (C.perfringens)、多枝梭菌(C.ramosum)、肉毒梭菌(C.botulinum)和败毒梭菌 (C.septicum)，放线菌属(Actinomyces species)，梅毒螺旋体(Treponema pallidum)，疏螺旋菌属(Borrelia species)包括伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)，钩 端螺旋体属(Leptospira species)，分支杆菌属(Mycobacterium)包括结核杆菌(M. tuberculosis)、牛分支杆菌(M.bovis)、麻风杆菌(M.leprae)和非洲结核菌(M. africanum)，组织胞浆菌属(Histoplasma species)，大肠杆菌(Escherichia coli)， 球孢子菌属(Coccidioides species)，子囊酵母菌属(Blastomyces species)，副球菌 属(Paracoccidioides species)，孢子丝菌属(Sporothrix species)，隐球菌属 (Cryptococcus species)，念珠菌属(Candida species)和曲霉菌属(Aspergillus species)引起的感染；里克次氏体疾病包括落基山斑疹热、Q热(Qfever)、斑疹 伤寒、战壕热和猫抓热(cat-scratch fever)；寄生虫病包括疟疾、巴贝西虫病、非 洲昏睡病、锥虫病、利什曼病、弓形体病和阿米巴病；由流感病毒、副流感病毒、 腮腺炎病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、 艾柯病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、肝炎A，B，C，D或者E病毒、细 胞巨化病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、α病毒 (Alphavirus)；黄病毒包括黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒，和圣路易 斯脑炎病毒、西尼罗河病毒、科罗拉多壁虱热病毒、狂犬病病毒、沙粒病毒、马 尔堡病毒(Marburg)和埃博拉病毒引起的病毒感染。
【0080】如在此所应用，术语“神经功能障碍”是指具有神经原性病因的一个或 者多个正常生理功能或者精神功能的丧失。技术人员将理解，神经功能障碍是各 种全身疾病(例如，酒精中毒、血管疾病、中风、自身免疫、代谢紊乱、衰老等 等)的普遍症状。具体的神经功能障碍包括但不限于疼痛、头痛、失语、运动不 能、认识障碍、健忘症、恍惚、昏迷、谵妄、痴呆、癫痫、偏头痛失眠、嗜睡、 震颤、运动障碍、瘫痪等等。
【0081】如在此所应用，术语“高血压”是指收缩压高于或者等于140mmHg， 和/或者舒张压高于或者等于90mmHg。高血压可以包括孤立的收缩性高血压(即， 舒张压不升高)。在高血压的情形下，多个标志物被优选地选出，以纳入或者排除 下列多个疾病：左心室衰竭、动脉粥样硬化、肾脏疾病包括慢性肾小球肾炎和多 囊性肾病、主动脉缩窄、肾动脉狭窄、和甲状旁腺功能亢进。
【0082】如在此所应用，术语“症状的区分性诊断内的状态”是指一种病理状态， 已知其在遭受该病理状态的对象的一个或者多个身体特征方面，与正常对象相比， 造成特定的可察觉的变化。对本领域的技术人员，区分性诊断的概念是被充分确 立的。参见，例如，Beck，Tutorials in Differential Diagnosis，Churchill Livingstone， 2002；Zackon，Pulmonary Differential Diagnosis，Elsevier，2000；Jamison，Differential Diagnosis for Primary Practice，Churchill Livingstone，1999；Bouchier et al.，French′s Index of Differential Diagnosis，Oxford University Press，1997。
【0083】如在此所应用，术语“标志物”是指蛋白质、多肽、糖蛋白、蛋白聚糖、 脂类、脂蛋白、糖脂、磷脂、核酸、碳水化合物等等，小分子，或者一个或者多 个对象的其它特征，被用作筛选取自对象的检测样品的靶。用作本发明标志物的 “蛋白质或者多肽”预期包括其任何片段，特别地，包括免疫学上可检测的片段。 如在此所应用，“标志物”也可以包含如下面所定义的衍生的标志物，并且也可以 包含这样的特性，例如，如患者的病史、年龄、性别和种族。
【0084】如在此所应用，术语“衍生的标志物”是指一个值，其为一个或者多个 测定的标志物的函数。例如，衍生的标志物可以和一个或者多个测定的标志物值 在一段时间间隔内的变化有关，可以和测定的标志物值的比有关，可以是不同测 定时间的标志物值，或者可以是复合函数例如组反应函数。
【0085】如在此所应用，术语“相关的标志物”是指特定标志物或者其生物合成 的母体的一个或者多个片段，可以作为标志物的代替物或者作为独立的标志物被 检测到。例如，人BNP是通过水解此后被称作BNP1-108的108个氨基酸前体分子 的蛋白得到的。成熟的BNP，或者“BNP利钠肽”，或者“BNP-32”，是32个氨基 酸的分子，带有此前体的77-108位氨基酸，其可以被称为BNP77-108。剩余的残基 1-76在此后被称为BNP1-76。另外地，相关的标志物可以是母体标志物共价修饰的 结果，例如通过甲硫氨酸残基的氧化、泛素化、半胱氨酰化、亚硝基化、糖基化 等等。
【0086】进一步将BNP考虑为一个例子，108个氨基酸的BNP前体前BNP (BNP1-108)的序列如下，成熟的BNP(BNP77-108)带有下划线：
HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV    50
WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPR SPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL  100
GCKVLRRH  108
(SEQ ID NO：1)。
【0087】BNP1-108以更大的前体前BNP原被合成，具有下列序列(“原”序列显示 为黑体)：
MDPQTAPSRA LLLLLFLHLA FLGGRSHPLG SPGSASDLET SGLQEQRNHL 50
QGKLSELQVE QTSLEPLQES PRPTGVWKSR EVATEGIRGH RKMVLYTLRA 100
PR SPKMVQGS    GCFGRKMDRI    SSSSGIGCKV    LRRH 134
(SEQ ID NO：2)。
【0088】尽管成熟的BNP本身可以被用作本发明的标志物，前BNP原、BNP1-108 和BNP1-76分子代表了BNP相关标志物，其可以作为成熟BNP的代替品或者本身 作为标志物被测定。此外，这些分子的一个或者多个片段，包括选自下列集合的 BNP相关多肽：BNP77-106、BNP79-106、BNP76-107、BNP69-108、BNP79-108、BNP80-108、 BNP81-108、BNP83-108、BNP39-86、BNP53-85、BNP66-98、BNP30-103、BNP11-107、BNP9-106、 和BNP3-108，也可以出现在循环中。此外，利钠肽片段，包括BNP片段，可以含 有一个或者多个可氧化的甲硫氨酸，其氧化成为甲硫氨酸亚砜或者甲硫氨酸砜， 产生另外的BNP相关标志物。参见，例如，美国专利10/419,059号，2003年4 月17日提交，将其整体在此并入作为参考，包括所有的表、图和权利要求。
【0089】由于标志物片段的产生是一个渐进的过程，其可以是，除其他因素之外， 触发标志物释放入组织的事件起始和样品被得到或者分析的时间之间的实测时间 的函数；样品获得和样品被分析的时间之间的实测时间的函数；组织中组织样品 的类型的函数；贮存条件的函数；蛋白水解酶存在的量的函数；等等，当设计对 一个或者多个标志物的检验时，和当进行这样的检验时，为了提供准确的预后或 者诊断结果，考虑此降解可能是必要的。此外，区分多个标志物片断的个别的抗 体，可以被个别地应用，以分别的检测不同片段的存在或者含量。与在单一的检 验中检测多种片段相比，此分别检测的结果可以提供更准确的预后结果或者诊断 结果。例如，不同的权重因子可以被用于各种片段测定，以提供对样品中最初存 在的利钠肽含量的更加准确的估计。
【0090】以相似的方式，此处所描述的标志物中的许多是以较大的前体分子被合 成的，其而后被加工，提供成熟的标志物；和/或者以标志物片段的形式出现在循 环中。因此，对此处描述的标志物中的每一个，“相关的标志物”可以被鉴定并且以 和上面描述的用于BNP的类似的方式被应用。
【0091】多肽标志物从循环中的去除常常涉及降解通路。而且，这种降解通路的 抑制剂可以在一些疾病的治疗中产生影响。参见，例如，Trindade and Rouleau， Heart Fail.Monit.2：2-7，2001。然而，多肽标志物的测定通常着重于完整形式的测 定，不考虑分子的降解状态。在理解多肽标志物的降解通路和降解期间形成的产 物的基础上，为了准确地测定样品中特定多肽标志物的生物学活性形式，检验可 以被设计。对感兴趣的生物学活性多肽标志物(多个标志物)和源于该标志物的 失活片段的无意识的测定，可以导致对样品中生物学活性形式(多个形式)浓度 的过高估计。
【0092】没有考虑可能存在于临床样品中的降解片段，对任何诊断或者预测方法 的精确性，可以具有严重的后果。例如，考虑一种简单的情况，其中夹心免疫分 析被提供用于BNP，曾经存在的生物学活性的BNP的明显的量(例如，50％)， 现在已被降解为失活的形式。用结合生物学活性BNP片段和失活的片段(多个片 段)所共有的区域的抗体所进行的免疫分析，将过高估计出现于样品中的生物学 活性BNP的量2倍，潜在地导致“假阳性”结果。对出现于样品中的生物学活性 形式(多个形式)的过高估计，对患者的治疗也可以具有严重的后果。再次考虑 BNP的例子，BNP浓度可以被用于确定治疗是否有效(例如，通过监测BNP，考 察经治疗，升高的水平是否回复至正常)。上面所讨论的同样的“假阳性”BNP结 果可以引导医生继续、增加或修改治疗，原因是存在当前治疗是无效的错误印象。
【0093】同样地，考虑到此处所描述的一个或者多个标志物的复合状态，是必要 的。例如，肌钙蛋白主要以“三元复合物”存在于肌肉中，包括三种肌钙蛋白多肽(T、 I和C)。但是肌钙蛋白I和肌钙蛋白T可以I/T/C三元复合物之外的形式循环于血 液中。相反地，(i)游离的心脏特异的肌钙蛋白I，(ii)二元复合物(例如，肌钙 蛋白I/C复合物)，和(iii)三元复合物中的每一种均在血液中循环。而且，随着 时间的过去，在一个患者中，肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的“复合状态”可以改变， 例如，由于游离的肌钙蛋白多肽结合于其它的循环肌钙蛋白多肽。没有考虑蛋白 标志物的“复合状态”的免疫分析，可能检测不到存在的所有标志物。
【0094】优选地，此后所描述的方法利用了源自对象的一个或者多个标志物。如 在此所应用，术语“源自对象的标志物”是指蛋白质、多肽、磷脂、核酸、朊病毒、 糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂、脂类、脂蛋白、碳水化合物、或者由对象的一种或者 多种细胞表达或者产生的小分子标志物。一个或者多个标志物的存在、不存在、 含量、或者含量的变化，可以提示一种具体疾病是存在的，或者可以提示一种具 体疾病是不存在的。不源自对象的另外的标志物可以被应用，如和具体疾病、种 族、从发作起的时间、性别等等相关的，由致病的或者有传染性的生物表达的分 子。这样的标志物优选地是鉴定上面所描述的感染性疾病的蛋白质、多肽、磷脂、 核酸、朊病毒或者小分子标志物。
【0095】如此处所应用，术语“检验样品”是指所获得的体液样品，其用于感兴 趣的对象如患者的诊断、预测或者评价的目的。在一些实施方案中，这样的样品 可以被获得，用于确定渐进的状态的后果，或者确定在一种状态中治疗方案的效 果的用途。优选的检测样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰、 和胸膜渗出液。此外，本领域的技术人员将认识到，一些检测样品在分级分离或 者纯化过程之后，可能更容易地被分析，例如，将全血分离为血清或者血浆成分。
【0096】如此处所应用，“一系列”是指至少2。优选地，是指至少3，更优选地， 是至少5，甚至更优选地，是至少10，甚至更优选地，是至少15，和最优选地， 是至少20。在特别优选的实施方案中，是一个大的数目，即，至少是100。
【0097】如此处所应用，术语“对象”是指人或者非人的生物。因此，此处所描 述的方法和组合物适用于人和兽的疾病。进一步地，尽管对象优选地是活的生物， 此处所描述的本发明也可以被用于死后的分析。优选的对象是“患者”，即，接受 着医学处理的活着的人。这包括没有明确疾病的人，其被进行病理体征的研究。
【0098】如此处所应用，术语“诊断”是指方法，通过该方法，技术人员可以估 计和/或者确定，患者是否患有特定的疾病或者状态。技术人员经常在一个或者多 个诊断指示物，即，标志物的基础上作出一个诊断，标志物的存在、不存在、或 者含量指示该状态的存在、严重情况、或者不存在。
【0099】相似地，“预后”通常是通过检测一个或者多个“预后指示物”被确定 的。标志物是指这些物质，其在患者中(或者取自该患者的样品中)的存在或者 含量，显示了特定的后果或者过程会发生的概率。例如，当取自此患者样品中的 一个或者多个预后指示物到达充分高的水平时，与显示较低的标志物水平的类似 的患者相比，该水平可以显示，患者处于经历未来中风的增加的概率中。预后指 示物的水平或者水平的变化，又和发病或者死亡的概率增加相关，其被认为是与 患者中“不利后果的增加的倾向相关”。优选的预后标志物可以预测患者中风后迟 发性神经缺陷的发作，或者未来中风的可能性。
【00100】如此处所应用，在提及诊断和预后标志物的应用时，术语“和……相关 联”是指将患者中的标志物(多个标志物)的存在或者含量，与其在已知遭受特 定状态，或者处于特定状态风险中的人中的存在或者含量相比较，或者与其在已 知不遭受特定状态的人中的存在或者含量相比较。如上面所讨论，可以将患者样 品中的标志物水平和与已知具体诊断相联系的水平相比较。样品的标志物水平已 被联系于一个诊断；即，技术人员可以应用标志物水平确定患者是否患有具体类 型的诊断，并且从而做出反应。或者，可以将样品的标志物水平和已知与好的后 果(例如，疾病的不存在，等等)相关的标志物水平相比较。在优选的实施方案 中，标志物水平的情况与总概率或者具体的后果相关。
【00101】如此处所应用，短语“确定诊断”是指方法，通过该方法，技术人员可 以确定患者中具体疾病的存在或者不存在。术语“诊断”不是指以100％的准确性 确定具体疾病的存在或者不存在的能力，或者甚至是确定特定的过程或者后果与 不发生相比，更可能发生的能力。相反地，技术人员将理解，术语“诊断”是指某种 疾病在对象中出现的增加的概率。在优选的实施方案中，诊断提示了疾病存在的 大约5％的增加的可能性、大约10％的可能性、大约15％的可能性、大约20％的可 能性、大约25％的可能性、大约30％的可能性、大约40％的可能性、大约50％的 可能性、大约60％的可能性、大约75％的可能性、大约90％的可能性、和大约95％ 的可能性。术语“大约”就此而言是指+/-2％。
【00102】相似地，如此处所应用，术语“确定预后”是指方法，通过该方法，技 术人员可以确定患者中一个或者多个未来的临床结果的可能性。技术人员将理解， 术语“预后”是指在未来的时期，在患者中，一些临床结果会发生的增加的概率。 在优选的实施方案中，预后提示了相对于“对照”群体，某临床结果的大约5％的 增加的可能性、大约10％的可能性、大约15％的可能性、大约20％的可能性、大 约25％的可能性、大约30％的可能性、大约40％的可能性、大约50％的可能性、 大约60％的可能性、大约75％的可能性、大约90％的可能性、和大约95％的可能 性。术语“大约”就此而言是指+/-2％。
【00103】如此处所应用，术语“不连续的”是指不相邻的表面区域。即，如果不 是任一区域部分的一个边界，完全地环绕了两个区域的每一个，这两个区域是彼 此不连续的。
【00104】如此处所应用，术语“独立地可寻址的”是指表面的不连续区域，从该 区域可以获得特异的信号。
【00105】如此处所应用，术语“抗体”是指源自一个或多个免疫球蛋白基因、模 仿免疫球蛋白基因，或者主要由免疫球蛋白基因编码而得到的肽或者多肽，或者 其片段，其可以特异地结合抗原或者抗原决定部位。参见，例如，Fundamental Immunology，3rd Edition，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y(1993)；Wilson(1994)J. Immunol.Methods 175：267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25： 85-97。术语抗体包括抗原结合部分，即，“抗原结合位点”，(例如，保持对抗原的 结合能力的片段、子序列、互补决定区(CDRs))，包括(i)Fab片段，一个单价 的片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成；(ii)F(ab′)2片段，一个二价的片 段，包括两个Fab片段，其在铰链区通过二硫键连接；(iii)Fd片段，包括VH和 CHl结构域；(iv)Fv片段，由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb 片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)，由一个VH结构域组成；和(vi) 分离的互补决定区(CDRs)。单链抗体也被包括在术语“抗体”中。
【00106】如此处所应用，术语“心肌损伤的特异性标志物”是指典型地和心脏组 织相关的分子，并且其可以和心脏损伤相联系，但是不和其它种类的损伤相联系。 这样的心脏损伤的特异性标志物包括钙依赖磷脂结合蛋白V、B型利钠肽、β烯醇 化酶、心脏肌钙蛋白I(游离的和/或者复合的)、心脏肌钙蛋白T(游离的和/或者 复合的)、肌酸激酶-MB、糖原磷酸化酶-BB、心型脂肪酸结合蛋白、磷酸甘油酸 变位酶-MB和S-100ao。
【00107】如此处所应用，术语“神经组织损伤的特异性标志物”是指典型地和神经 组织相关的分子，并且其可以和神经损伤相联系，但是不和其它种类的损伤相联 系。神经组织损伤的代表性的特异标志物在此后被详细描述。
【00108】 呼吸困难(气促)的区分性诊断
【00109】就与呼吸困难相关的疾病和状态的区分性诊断方面，本发明在此作了一 般性的描述。然而，技术人员将理解，此处所描述的基于症状的区分性诊断的概 念，可以普遍适用于提示多种可能病因的任何身体特征，如发热、神经功能障碍、 胸痛(“心绞痛”)、头晕、头痛等。
【00110】确定用于基于症状的区分性诊断的合适的标志物的第一个步骤，需要考 虑可能引起观察到的非特异性症状的可能诊断结果。在呼吸困难的情形下，可能 的原因是各种各样的。在一种优选的实施方案中，下面的讨论考虑了三个可能的 诊断：充血性心力衰竭、肺栓塞和心肌梗塞；和三个潜在的标志物，可以将其纳 入用于这些可能诊断的区分性诊断组(differential diagnosis panel)中：分别是BNP、 D-二聚体和心肌钙蛋白。在另一种优选的实施方案中，对于用于三个可能诊断— 充血性心力衰竭、肺栓塞和心肌梗塞—的标志物，其区分性诊断组中包含了三个 潜在的标志物：分别是BNP相关肽、D-二聚体和心肌钙蛋白。在一个优选的实施 方案中，在呼吸困难的情形下，三个可能的诊断包括充血性心力衰竭、肺栓塞和 心肌梗塞。在又一个优选的实施方案中，在呼吸困难的情形下，四个可能的诊断 包括充血性心力衰竭、肺栓塞、心肌梗塞和心房纤颤。包含在区分性诊断组中的 潜在的标志物包括下列中的一个或者多个：BNP、BNP相关肽、D-二聚体、心肌 钙蛋白、ANP和ANP相关肽。
【00111】BNP
【00112】B型利钠肽(BNP)，也被称为脑型利钠肽，是32个氨基酸、4kDa的 肽，其涉及尿钠排泄系统，以调节血压和液体平衡。Bonow，R.0.，Circulation93： 1946-1950(1996)。BNP前体是以108个氨基酸分子被合成的，被称为“前BNP 原”，其被蛋白水解加工为76个氨基酸的N-末端肽(氨基酸1-76)，被称为“NT 前BNP”，和32个氨基酸的成熟的激素，被称为BNP或者BNP32(氨基酸77-108)。 已经表明，这些种类中的每一个——NT前BNP、BNP 32和前BNP原——可以在 人血浆中循环。Tateyama et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.185：760-7(1992)； Hunt et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.214：1175-83(1995)。两种形式，前BNP 原和NT前BNP，和衍生于BNP、前BNP原和NT前BNP的肽以及作为BNP、 前BNP原和NT前BNP的蛋白水解结果而出现在血液中的肽，共同地被描述为 BNP相关的标志物或者与BNP相关联的标志物。
【00113】BNP和BNP相关肽主要被发现于心室的分泌性颗粒中，并且响应于心 室容积扩大和压力超载，从心脏被释放出来。Wilkins，M.et al.，Lancet349：1307-10 (1997)。BNP的升高与升高的心房压和肺动脉楔压、降低的心室收缩和舒张功能、 左心室肥大和心肌梗塞相关联。Sagnella，G.A.，Clinical Science 95：519-29(1998)。 而且，有许多的报道，升高的BNP浓度和充血性心力衰竭和肾功能衰竭相关联。 因此，患者的BNP水平可以指示出呼吸困难的几个可能的基础原因。
【00114】D-二聚体
【00115】D-二聚体是交联的纤维蛋白降解产物，分子量大约是200kDa。D-二聚 体的正常血浆浓度＜150ng/ml(750pM)。在患有急性心肌梗塞和不稳定性心绞痛的 患者中，D-二聚体的血浆浓度升高，但是在稳定性心绞痛中，不升高。Hoffmeister， H.M.et al.，Circulation91：2520-27(1995)；Bayes-Genis，A.et al.，Thromb.Haemost. 81：865-68(1999)；Gurfinkel，E.et al.；Br.Heart J.71：151-55(1994)；Kruskal，J.B.et al.，N.Engl.J.Med.317：1361-65(1987)；Tanaka，M.and Suzuki，A.，Thromb.Res.76： 289-98(1994)。
【00116】在与凝血和纤溶活化相关的任何状态期间，D-二聚体的血浆浓度也可以 升高，包括中风、手术、动脉粥样硬化、创伤和血栓性血小板减少性紫癜。在血 凝块被纤维蛋白溶酶蛋白水解分解后，D-二聚体即刻被释放入血流中。在患有不 稳定性心绞痛的患者中，D-二聚体的血浆浓度可以超过2μg/ml。Gurfinkel，E.et al。 Br.Heart J.71：151-55(1994)。血浆D-二聚体是纤溶的特异标志物，并且提示与急 性心肌梗塞和不稳定性心绞痛相关的血栓形成前状态。在患有急性肺栓塞的患者 中，D-二聚体的血浆浓度也几乎总是会升高；因此，D-二聚体的正常水平可以允 许排除肺栓塞。Egermayer et al.，Thorax 53：830-34(1998)。
【00117】心脏肌钙蛋白
【00118】肌钙蛋白I(TnI)是肌钙蛋白复合物的25kDa的抑制性元件，发现于肌 肉组织。在Ca2+不存在时，TnI和肌动蛋白结合，抑制肌动球蛋白(actomyosin) 的ATP酶活性。发现于心脏组织的TnI异构体(cTnI)和骨骼肌TnI有40％的不 同，这允许两种异构体可以被免疫学地区分。cTnI的正常血浆浓度是＜0.1ng/ml (4pM)。在心脏细胞死亡后，cTnI被释放入血流；因此，在患有急性心肌梗塞的患 者中，血浆cTnI浓度升高。至于患有不稳定性心绞痛的患者的血浆cTnI浓度变化 的研究，则产生了混杂的结果，但是在患有稳定性心绞痛的个体中，血浆中的cTnI 不升高。Benamer，H.et al.，Am.J.Cardiol.82：845-50(1998)；Bertinchant，J.P.et al.， Clin.Biochem.29：587-94(1996)；Tanasijevic，M.J.et al.，Clin.Cardiol.22：13-16 (1999)；Musso，P.et al.，J.Ital.Cardiol.26：1013-23(1996)；Holvoet，P.et al.，JAMA 281：1718-21(1999)；Holvoet，P.et al.，Circulation 98：1487-94(1998)。
【00119】在患有急性心肌梗塞的患者中，cTnI的血浆浓度在发作后4-6小时显著 升高，在12-16小时之间达到峰值，并且持续升高达1周。与不稳定性心绞痛相关 联的cTnI的释放动力学是相似的。测定心脏肌钙蛋白的具体形式，包括游离的心 脏肌钙蛋白I，以及心脏肌钙蛋白I和心脏肌钙蛋白C和/或T的复合物，可以使 使用者能够确定ACS的不同阶段。可以以与被描述用于心脏肌钙蛋白I相似的方 式，应用游离的或者复合的心脏肌钙蛋白T。心脏肌钙蛋白T复合物在单独应用， 或者表示为与总心脏肌钙蛋白I的比率时，可以用于提供有关进展性心肌损伤存在 的信息。渐进的缺血可以导致心脏肌钙蛋白TIC复合物的释放，由此，心脏肌钙 蛋白TIC：总心脏肌钙蛋白I的较高的比率，可以提示由迁延性(unresolved)缺 血引起的持续损伤。参见，美国专利6,147,688、6,156,521、5,947,124和5,795,725 号，其以整体在此并入作为参考，包括所有的表、图和权利要求。本领域中的技 术人员认识到，在测定心脏肌钙蛋白时，可以测定心脏肌钙蛋白I和心脏肌钙蛋白 T的不同的异构体。
【00120】本领域中的技术人员认识到，在测定心脏肌钙蛋白时，可以测定心脏肌 钙蛋白I和心脏肌钙蛋白T的不同形式。因此，可以优选地测定游离的肌钙蛋白I、 游离的心脏肌钙蛋白T、在含有肌钙蛋白T和肌钙蛋白C中的一个或两个的复合 物中的心脏肌钙蛋白I、在含有肌钙蛋白I和肌钙蛋白C中的一个或两个的复合物 中的心脏肌钙蛋白T、总心脏肌钙蛋白I(指游离的心脏肌钙蛋白I和复合的心脏 肌钙蛋白I)，和/或总心脏肌钙蛋白T。如此处所应用，术语“至少一种心脏肌钙 蛋白形式”是指这些前述形式中的任意一种。
【00121】ANP
【00122】A-型利钠肽(ANP)(也被称为心房利钠肽或者心舒血管素，Forssmann etal Histochem Cell Biol 110：335-357(1998))，是28个氨基酸的肽，其响应于心房 扩张、血管紧张素II刺激、内皮素和交感神经刺激(由β-肾上腺素受体介导)而 合成、存储和从心房肌细胞释放出来。ANP以前体分子(前ANP)的形式被合成， 通过蛋白水解切割，转变成活性形式ANP，同时也形成N-末端ANP(1-98)。已 报道，N-末端ANP和ANP在心房纤颤和心力衰竭的患者中增加(Rossi et al.Journal of the American College of Cardiology 35：1256-62(2000))。除了心房利钠肽 (ANP99-126)本身，也已有报道，来自其N-末端的前激素部分的线性肽片段， 也具有生物学活性。然而，技术人员将认识，由于其和ANP之间的关系，N-末端 ANP分子的浓度也可以提供患者的诊断或预后信息。短语“ANP相关的标志物或 者ANP相关肽”是指除了28个氨基酸的ANP分子本身之外的，从前ANP分子 (1-126)产生的任何多肽。ANP和ANP相关肽的蛋白水解降解，也在文献中被 描述，并且这些蛋白水解片段也被包含在术语“ANP相关肽”中。
【00123】在血容量过多、心房纤颤和充血性心力衰竭期间，升高的ANP水平也 被发现。ANP参与钠水平衡、血容量和动脉压的长期调节。此激素降低醛固酮由 肾上腺皮质的释放，增加肾小球滤过率(GFR)，引起利钠和利尿(保钾)，并且 降低肾素释放，从而降低血管紧张素II。这些作用有助于降低血容量并因此降低 中心静脉压(CVP)、心输出量和动脉血压。几个ANP的异构体已经被鉴定，并 且它们和中风发生率的关系已被研究。参见，例如，Rubatu et al.，Circulation 100： 1722-6，1999；Estrada et al.，Ana.J.Hypertens.7：1085-9，1994。
【00124】ANP的慢性升高似乎主要是通过降低全身的血管抵抗而降低动脉血压。 全身的血管舒张的机制可能涉及ANP受体介导的血管平滑肌cGMP升高，以及通 过减弱交感神经的血管紧张性。后一机制可能涉及ANP作用于中枢神经系统中的 位点，以及通过抑制交感神经末梢释放去甲肾上腺素。ANP可以被视为肾素-血管 紧张素系统的反向调节系统。作为中性内肽酶(NEP)抑制剂的一类新的药物在心 力衰竭中被证明是有效的。这些药物抑制造成ANP降解的中性内肽酶，并且从而 升高ANP的血浆水平。当该药物联合了NEP和ACE抑制剂两者的性质时，NEP 抑制在心力衰竭中是特别有效的。
【00125】基于前述的讨论，技术人员将认识到，例如，增加的BNP提示了充血 性心力衰竭，但是也可以提示其它的心脏相关状态如心肌梗塞。因此，有关心肌 损伤的标志物如心脏肌钙蛋白I和/或心脏肌钙蛋白T的加入，可以允许对疾病进 行进一步的区分，所述的疾病是观察到的呼吸困难和增加的BNP水平的基础。在 此情形下，心脏肌钙蛋白的增加的水平可以被用于诊断为心肌梗塞。
【00126】类似地，BNP也可以提示肺栓塞。有关凝血和止血的标志物如D二聚体 的加入，可以允许对疾病的进一步区分，所述的疾病是观察到的呼吸困难和增加 的BNP水平的基础。在此情形下，D二聚体的正常水平可以被用来排除肺栓塞。
【00127】在此后的实施例中提供了代表性标志物组的详细描述。技术人员将容易 地承认，根据此处描述的用于诊断标志物的鉴定和应用的方法，可以将其它的标 志物取代入或者加入此标志物组，以进一步区分呼吸困难的原因。下面的各节描 述了另外的合适的标志物。
【00128】如此处所详细讨论，前述的标志物组设计的原则，可以被广泛地用于基 于症状的区分性诊断。例如，在腹痛的情形下，多个标志物被优选地选出，以纳 入或者排除下列多种疾病：主动脉壁夹层形成、肠系膜栓塞、胰腺炎、阑尾炎、 心绞痛、心肌梗塞、上面描述的一个或者多个感染性疾病、流感、食道癌、胃腺 癌、直肠腺癌、胰腺肿瘤包括胰管腺癌、囊腺癌，和胰岛细胞瘤。在一个优选的 实施方案中，对腹痛的可能诊断包括主动脉瘤、肠系膜栓塞、胰腺炎、阑尾炎、 心绞痛和心肌梗塞。
【00129】前述的原则也可以被用于再将区分性诊断细分为临床技术人员所需的 特定的详细水平。例如，对各种症状的区分性诊断可能需要在心力衰竭和心房纤 颤之间进行区分。用于进行这种区分的代表性的标志物组，优选地分别含有BNP 或者BNP相关肽，以及ANP或者ANP相关肽。另外的标志物可以被限定，以在 收缩功能障碍和舒张功能障碍以及心房纤颤之间进行区分。在此情形下，优选的 标志物包括BNP、降钙素基因相关蛋白、降钙素和尿紧张素I，以用于收缩功能 障碍和舒张功能障碍的区分，包括ANP或者ANP相关肽，以用于心房纤颤的检 测。同样地，标志物可以被限定，以在收缩功能障碍和舒张功能障碍、心房纤颤、 心肌缺血和心脏坏死之间进行区分。在此情形下，优选的标志物包括BNP、降钙 素基因相关蛋白、降钙素和尿紧张素I，以用于收缩功能障碍和舒张功能障碍的 区分，和ANP或者ANP相关肽，用于心房纤颤的检测，以及BNP和心脏肌钙蛋 白，以用于心肌缺血和心肌坏死的检测。
【00130】在胸痛的情形下，本发明可以提供下列标志物：可以在主动脉壁夹层形 成、心肌缺血和心脏坏死之间区分的标志物；可以在主动脉壁夹层形成、心肌缺 血、和心肌梗塞之间区分的标志物；可以在主动脉壁夹层形成、心肌缺血、心脏 坏死和心力衰竭之间区分的标志物；可以在主动脉壁夹层形成、心肌缺血、心脏 坏死和心肌梗塞之间区分的标志物；可以在主动脉壁夹层形成、心肌缺血、心脏 坏死和心房纤颤之间区分的标志物；和/或可以在主动脉壁夹层形成、心肌缺血以 及心脏坏死、心肌梗塞和心房纤颤之间区分的标志物。根据前述，用于主动脉壁 夹层形成的特别优选的标志物是平滑肌肌球蛋白，最优选地是平滑肌肌球蛋白重 链，用于心房纤颤的特别优选的标志物是ANP或者ANP相关标志物。
【00131】优选的标志物组是那些：含有平滑肌肌球蛋白(或者平滑肌肌球蛋白重 链和/或平滑肌肌球蛋白轻链)和ANP或者ANP相关标志物，以区分主动脉壁夹 层形成和心房纤颤；含有平滑肌肌球蛋白(或者平滑肌肌球蛋白重链和/或者平滑 肌肌球蛋白轻链)，ANP或者ANP相关标志物，和BNP或者BNP相关标志物， 以区分主动脉壁夹层形成、心房纤颤和心肌缺血；含有平滑肌肌球蛋白(或者平 滑肌肌球蛋白重链和/或者平滑肌肌球蛋白轻链)，BNP或者BNP相关标志物，和 心脏肌钙蛋白形式，以区分主动脉壁夹层形成、心肌缺血和心肌梗塞；含有平滑 肌肌球蛋白(或者平滑肌肌球蛋白重链和/或者平滑肌肌球蛋白轻链)，BNP或者 BNP相关标志物，肌酸激酶MB，肌红蛋白，和心脏肌钙蛋白形式，以区分主动 脉壁夹层形成、心肌缺血、心脏坏死和心肌梗塞。
【00132】充血性心力衰竭是从两种主要的病理产生的异源性状态：左心室舒张功 能障碍和收缩功能障碍，其单独地出现或者联合出现。Gaasch，JAMA271：1276-80 (1994)。患有临床心力衰竭的患者中多达40％有舒张功能障碍，而收缩功能正常。 Soufer et al.，Am.J.Cardio.55：1032-6(1984)。患者的护理决策和预后依赖于这些病 理中的一个或者两个是否存在的确认。Shamsham and Mitchell，Am.Fam.Physician 2000；61：1319-28(2000)。有关区分收缩功能和舒张功能的代表性标志物组含有选 自下列集合的一个或者多个标志物：BNP、BNP相关肽、醛固酮、ANP、ANP相 关肽、尿扩张素、血管紧张素1、血管紧张素2、血管紧张素3、缓激肽、降钙素、 降钙素基因相关肽、内皮素-2、内皮素-3、肾素、尿紧张素1、尿紧张素2、抗凝 血酶III、D二聚体、MMP-3、MMP-9、MMP-11、I型胶原蛋白羧基末端前肽(PICP)、 胶原蛋白羧基末端尾肽(ICTP)、纤维蛋白原、纤维结合素和抗利尿激素(血管加 压素)。有关收缩功能障碍和舒张功能障碍的标志物包括BNP、ANP和ANP相关 标志物。用于区分收缩性心力衰竭和舒张性心力衰竭的优选的标志物包括选自下 列集合的一个或者多个标志物：BNP、BNP相关肽、降钙素基因相关肽、尿紧张 素2、内皮素2、降钙素和血管紧张素2。用于鉴别收缩功能障碍和舒张功能障碍 的特别优选的标志物包括选自下列集合的一个或者多个标志物：BNP、血管紧张 素2、尿紧张素2和降钙素基因相关肽。
【00133】有关区分主动脉壁夹层形成、心肌缺血和心肌梗塞的代表性的标志物组 包括选自下列集合的一个或者多个标志物：平滑肌肌球蛋白和/或平滑肌肌球蛋白 重链，BNP和/或BNP相关肽，一种或者多种肌钙蛋白形式和肌红蛋白。
【00134】有关区分心房纤颤、心肌梗塞和/或充血性心力衰竭的代表性的标志物组 包括选自下列集合的一个或者多个标志物：ANP、ANP相关肽、一种或者多种肌 钙蛋白形式、肌红蛋白、BNP和BNP相关肽。
【00135】在代谢状态紊乱的情形下，多个标志物被优选地选出，以纳入或者排除 下列中的多个：糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、酒精性酮症酸中毒、呼吸性酸中毒、 呼吸性碱中毒、非生酮性高血糖、低血糖、肾功能衰竭、间质性肾疾病、COPD、 肺炎、肺水肿、哮喘。
【00136】 神经功能障碍的区分性诊断
【00137】在神经功能障碍的情形下，多个标志物被优选地选出，以纳入或者排除 下列中的多个：中风、脑肿瘤、脑缺氧、低血糖、偏头痛、心房纤颤、心肌梗塞、 心脏缺血、外周血管疾病和癫痫。在此情形下，优选的标志物包括脑损伤的特异 性标志物，如腺苷酸激酶、脑源性神经营养因子、钙结合蛋白D、肌酸激酶-BB、 胶质纤维酸性蛋白、乳酸脱氢酶、髓磷脂碱蛋白、神经细胞粘附分子、神经元特 异烯醇化酶、神经营养素-3、含脂质蛋白、S-100β、血栓调节蛋白、蛋白激酶Cγ； 和/或心脏损伤的一个或者多个非特异性标志物，如β-血小板球蛋白、D-二聚体、 纤维蛋白肽A、纤维蛋白溶酶-α2-抗纤维蛋白溶酶复合物、血小板因子4、凝血酶 原片段1+2、凝血酶-抗凝血酶III复合物、组织因子、冯威勒布兰特因子、肾上腺 髓质素、心脏肌钙蛋白I(用于心肌缺血和心肌坏死)、头激活物(head activator)、 血红蛋白α2链、caspase-3、血管内皮生长因子(VEGF)、一种或者多种内皮素(例 如，内皮素-1、内皮素-2和内皮素-3)、白介素-8、心房利钠肽、B型利钠肽(用 于心肌缺血和心肌坏死)和C型利钠肽；和/或一种或者多种急性期反应物如C反 应蛋白、血浆铜蓝蛋白、纤维蛋白原、α1-酸性糖蛋白、α1-抗胰蛋白酶、结合珠蛋 白、胰岛素样生长因子-1、白介素-1β、白介素1受体拮抗剂、白介素-6、转化生长 因子β、肿瘤坏死因子α、E选择蛋白、细胞间粘附分子1、基质金属蛋白酶(例 如基质金属蛋白酶9(MMP-9))、单核细胞化学引诱蛋白1和血管细胞粘附分子。
【00138】中风是急性发作的病理状态，由向脑供血并由此供应氧气和养料的血管 的阻塞或者破裂引起。损伤的直接位置被称为“核(core)”，其含有作为缺血和物 理损伤结果的已经死亡的脑细胞。“半影区”由神经学地或者化学地和所述核中的 细胞联系的脑细胞组成。半影区中的细胞是受损的，但是在中风期间引起的损伤 去除之后，仍然具有完全恢复的能力。然而，随着由于出血而产生的缺血或者出 血的持续，死亡细胞的核可以从损伤位点扩大，导致半影区细胞的同时扩张。核 扩张的起始容积和速度关系到中风的严重程度，并且在大多数情况下，关系到神 经学后果。
【00139】脑含有两种主要类型的细胞，神经元和神经胶质细胞。神经元是脑中最 重要的细胞，负责在脑内通过电信号和化学信号维持通信联系。神经胶质细胞主 要作为脑的结构性成分起作用，它们大约比神经元多10倍。中枢神经系统(CNS) 的神经胶质细胞是星形胶质细胞和少突胶质细胞。星形胶质细胞是脑中的主要间 质细胞，它们伸展细胞突起，这样的突起与神经元缠绕并围绕神经元，使它们孤 立于其它神经元。星形细胞也可以在其围绕毛细管的突起末端形成“终足”。少突 细胞是在中枢神经系统中的轴突外周形成髓鞘的细胞。每一个少突细胞具有将多 达50个轴突插入鞘内的能力。许旺式细胞(Schwann cells)是外周神经系统(PNS) 中的神经胶质细胞。许旺式细胞在外周的轴突周围形成髓鞘，并且每一许旺式细 胞在鞘内插入单一的轴突。
【00140】中风期间的细胞死亡作为中枢神经系统细胞的缺血损害或者物理损害 的结果而发生。在缺血中风期间，梗塞发生，大大降低了梗塞位点之外的血液流 动或者使血液流动停止。紧靠着梗塞的区域很快地缺少细胞生存所必需的养料的 合适的血液浓度。缺少维持重要功能如新陈代谢所必须的养料的细胞很快地死亡。 出血性中风可以通过直接创伤、颅内压的升高和血中损伤性生物化学物质的释放 诱导细胞死亡。当细胞死亡，它们释放其胞浆内容物进入细胞外环境。
【00141】中枢神经系统的毛细血管内皮细胞之间的紧密连接的屏障作用被称为 “血-脑屏障”。此屏障对蛋白质和其它分子，既包括大分子又包括小分子，通常是 不可渗透的。在其它组织如骨骼肌、心脏和平滑肌中，内皮细胞之间的连接是疏 松的，足以允许大多数分子通过，但是蛋白质不能通过。
【00142】由中枢神经系统(CNS)的神经元和神经胶质细胞(细胞内脑区，cellular brain compartment)分泌的物质可以自由地穿入细胞外环境(细胞外脑区， extracellular brain compartment)。同样地，细胞外脑区的物质可以穿入细胞内脑区。 物质在细胞内脑区和细胞外脑区之间的穿行受调节物质进入和排出的正常的细胞 机制的限制。发现于细胞外脑区的物质也能够自由地穿入脑脊液，反之亦然。该 运动是由扩散控制的。
【00143】脉管系统和中枢神经系统之间的物质运动受血脑屏障的限制。此限制可 以通过内皮细胞中的协同运输机制被避开，协同运输机制运输其它的物质，营养 物质，如葡萄糖和氨基酸穿过屏障，以供中枢神经系统的细胞消耗。进一步地， 脂溶性物质如分子氧和分子二氧化碳，以及任意的脂溶性药物或者麻醉剂可以自 由地穿过血脑屏障扩散。
【00144】当中枢神经系统损伤伴随或者跟随着血脑屏障渗透性的增加时，取决于 标志物的大小，在中风或者其它的神经系统疾病期间，由受损的脑细胞释放的脑 损伤的特异标志物将仅发现于外周血液中。这对于较大的分子是特别可靠的。较 小的分子可以由于被动扩散、主动运输或者血脑屏障渗透性增加而出现在外周血 中。血脑屏障渗透性的增加可以由于物理崩解而升高，在如肿瘤浸润和外渗或者 血管破裂的情况下，或者由于缺血引起的内皮细胞死亡而升高。在中风期间，血 脑屏障通过内皮细胞死亡被损害，并且出现在局部细胞外环境中的死亡细胞的任 何胞浆成分可以进入血流。
【00145】因此，脑损伤的特异性标志物也可以发现于血液或者血液成分如血清和 血浆，以及遭受着中风或者TIAs患者的脑脊液(CSF)中。而且，在缺血性中风 中，阻塞物质的清除可以引起由再灌注期间的氧化侵害造成的损伤，并且患有缺 血性中风的患者有时可以经历出血转变，原因是再灌注或者溶栓治疗。另外地， 损伤可以由血管痉挛引起，其为出血后在脑基底的高容量动脉的病灶性狭窄或者 弥散性狭窄。血脑屏障渗透性的增加与损伤的严重程度有关，并且在侵害消退后 其完整性重建。如果存在血脑屏障渗透性的充分升高，允许这些大分子扩散过去， 脑损伤的特异性标志物将仅出现在外周血中。在这点上，在中风或者任何其它影 响中枢神经系统的神经系统疾病之后，脑损伤的大多数特异性标志物可以在脑脊 液中被发现。而且，许多关于中风时凝血或者纤溶的许多研究，是应用脑脊液进 行的。
【00146】中风时的凝血级联反应
【00147】主要有两种机制被用于停止或者预防血管损伤后的血液丢失。第一个机 制涉及血小板的活化，以促进粘附于血管损伤的位置。之后，活化的血小板聚集 形成血小板栓，以减少或者暂时停止血液丧失。血小板聚集、血小板栓形成和组 织修复的过程，通过由活化的血小板分泌的多种因子，可被加速或者增强。血小 板聚集和栓的形成是通过活化的血小板之间纤维蛋白原桥的形成来介导的。第二 种机制，凝血级联反应的同时激活，导致由纤维蛋白原形成纤维蛋白，以及加强 血小板栓的不溶性纤维蛋白凝块的形成。
【00148】凝血级联反应是酶促通路，其涉及许多丝氨酸蛋白酶，通常以失活的、 或者酶原形式存在。脉管系统中外来表面的存在或者血管损伤分别导致内源性凝 血通路和外源性凝血通路的激活。之后，跟随最终的共同通路——其导致纤维蛋 白借助于丝氨酸蛋白酶凝血酶的生成——最终地，形成交联的纤维蛋白凝块。在 凝血级联反应中，一个活化的酶最初被形成，其可以激活其它的酶，其它的酶又 激活其它的酶，此过程如果以不受调节的状态存在，可以持续至所有的凝血酶被 激活。幸运的是，存在适当的机制，包括纤溶作用和内源性蛋白酶抑制剂的作用， 可以调节凝血通路的活化和凝块形成。
【00149】纤维蛋白溶解是蛋白水解性质的凝块溶解过程。以类似于凝血的方式， 纤溶由丝氨酸蛋白酶介导，丝氨酸蛋白酶由其酶原形式被活化。丝氨酸蛋白酶， 纤维蛋白溶酶负责将纤维蛋白降解为较小的降解产物，它们从凝块中释放，导致 凝块溶解。为了调节血凝块形成，纤溶在凝血后不久被激活。内源性丝氨酸蛋白 酶抑制剂也作为纤溶的调节剂而起作用。
【00150】凝血或者纤溶标志物在脑脊液中的存在，将提示凝血或者纤溶的活化的 发生，这依赖于所应用的标志物，并与血脑屏障渗透性增加相联系。在这点上， 应用脑脊液，关于与急性中风相联系的凝血或者纤溶标志物的存在，可以获得更 多的明确的结论。
【00151】血小板是圆形的或者椭圆形的盘状物，具有2-4μm的平均直径，通常以 200,000-300,000/μl的浓度被发现在血液中。它们在维持稳态中起重要的作用，这 是通过维持血管完整性、通过在血管损伤位点形成血小板栓而启动止血，和通过 促成纤维蛋白的形成过程以稳定血小板栓而实施的。当血管损伤发生时，血小板 粘附于损伤位点并相互粘附，而且会被由粘附的血小板和受损的内皮细胞释放的 各种物质刺激而聚集。随后发生释放反应，血小板分泌其细胞内颗粒内容物，血 小板栓形成。在凝血级联反应中，通过凝血酶的纤维蛋白形成，使血小板栓巩固， 随后通过交联的纤维蛋白，血凝块收缩和血小板栓稳定。在同时发生的凝血级联 反应中产生的活化的凝血酶，也具有诱导血小板活化和聚集的能力。
【00152】凝血级联反应可以通过或外源性通路或内源性通路被活化。这些酶促通 路共享一个最终的共同通路。凝血活化的结果是交联的纤维蛋白凝块的形成。纤 溶是蛋白水解凝块溶解的过程，其是在凝血活化后不久被激活，也许是在试图控 制凝块形成的速度和量。尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和组织型纤溶酶原激活 剂(tPA)蛋白水解地切割纤溶酶原，生成活化的丝氨酸蛋白酶纤溶酶。纤溶酶蛋 白水解地消化交联的纤维蛋白，导致凝块溶解和纤维蛋白降解产物的产生和释放。
【00153】凝血级联反应共同通路的第一个步骤涉及凝血酶原被因子Xa/Va凝血 酶原酶复合物蛋白水解地切割，产生活化的凝血酶。凝血酶是丝氨酸蛋白酶，其 蛋白水解切割纤维蛋白原，形成纤维蛋白，在凝块形成过程中，纤维蛋白最终地 并入交联的网络中。
【00154】用于中风和其它脑损伤的区分性诊断的方法和标志物组，在2002年8 月20日提交的美国专利10/225,082中被描述，其以整体在此并入，包括所有的表、 图和权利要求。如此处所描述，优选的标志物组诊断和/或区分中风、蛛网膜下出 血、脑内出血和/或者出血性中风；和/或可以区分缺血性中风和出血性中风。特别 优选的是在下列类型的中风之间进行区分的标志物：血栓形成性中风、栓塞性中 风、腔隙性中风、低灌注、脑内出血和蛛网膜下出血类型的中风。特别优选的标 志物组包括BNP、IL-6、S-100β、MMP-9、TAT复合物和vWF A1-整联蛋白(integrin)； BNP、S-100β、MMP-9和vWF-A1-整联蛋白；vWF-A1、VEGF和MMP-9；caspase-3、 MMP-9和GFAP；caspase-3、MMP-9、vWF-A1和BNP；NCAM、BDNF、Caspase-3、 MMP-9、vWF-A1和VEGF；NCAM、BDNF、Caspase-3、MMP-9、vWF-A1和S-100β； VEGF；NCAM、BDNF、Caspase-3、MMP-9、vWF-A1、和MCP-1；VEGF；NCAM、 BDNF、Caspase-3、MMP-9、VEGF和vWF A1-整联蛋白；BDNF、MMP-9、S-100β、 vWF A1-整联蛋白、MCP-1和GFAP；BDNF、caspase-3、MMP-9、vWF-A1、S-100β 和GFAP；NCAM、BDNF、MMP-9、vWF-A1、S-100β和GFAP；NCAM、BDNF、 caspase-3、MMP-9、S-100β和GFAP；caspase-3、NCAM、MCP-1、S100β、MMP-9、 vWFA1-整联蛋白和BNP；caspase-3、NCAM、MCP-1、S 100β、MMP-9、vWFA1、 BNP和GFAP；CRP、NT-3、vWF、MMP-9、VEGF和CKBB；CRP、MMP-9、 VEGF、CKBB和MCP-1；CRP、NT-3、MMP-9、VEGF、CKBB和MCP-1；和 CRP、MMP-9、VEGF、CKBB、MCP-1。钙结合蛋白、vWF VP1、vWF A3、vWF A1-A3、TAT复合物、含脂质蛋白、IL-6、IL-8、髓磷脂碱蛋白、S-100β、组织因 子、GFAP、vWFA1-整联蛋白、CNP和NCAM。
【00155 】由此处提及标志物组成的组可以被构建，以提供感兴趣的区分性诊断的 相关信息。这样的组可以应用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9 个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、1 7个、18个、19个或者 20个单独的标志物而构建。在各种临床环境中，可以由本领域的技术人员进行单 个标志物的分析，或者构成更大的标志物组的标志物子集的分析，以便最优化临 床的灵敏度和特异性。各种临床环境包括但不限于流动诊断、急救、重症监护、 加强监护、监护系统、住院病人、门诊病人、医生办公室、医疗诊所和健康普查 环境。此外，在前述的每一环境中，本领域的技术人员可以应用单独的标志物或 者包含更大的标志物组的标志物子集，结合诊断性阈的判断，来最优化临床灵敏 度和特异性。检验分析的临床灵敏度被定义为，所述的检验分析正确预测的患病 者的百分率，检验分析的特异性被定义为，所述的检验分析正确预测的非患病者 的百分数(Tietz Textbook of Clinical Chemistry，2nd edition，Carl Burtis and Edward Ashwood eds.，W.B.Sanders and Company，p.496)。下面提供了对另外的代表性标 志物的简单讨论，以便通过此处所描述的方法，确定合适的标志物组。
【00156】 急性冠脉综合症
【00157】心肌缺血是由心肌氧供给和需求的不均衡引起的。具体地，由于不充分 的血液供应，氧的需求超过供给。心脏占总体重的较小百分数，但是它占机体7 ％的氧消耗。心脏组织代谢是高度需氧的，并且几乎不具有储备用以补偿不充分 的血液供应。当血液供应被降低至对心肌的需求而言是不充足的水平时，组织迅 速地变得缺氧，毒性的细胞代谢物不能被去除。心肌细胞迅速地利用遗留在局部 微血管中的氧供应，并且，有氧代谢持续的时间长度间接地与动脉的阻塞程度成 比例。一旦氧供给被耗尽，氧化磷酸化不能被持续，原因是作为电子受体的氧不 再能够获得，丙酮酸不能被转变为乙酰辅酶A，并进入柠檬酸循环。心肌代谢向 无氧代谢转变，利用糖原和葡萄糖储备，并且，丙酮酸被酵解成乳酸。乳酸积累 是患有ACS的个体胸痛的首要原因。随着缺血持续，由于乳酸和其它酸性中间产 物积累，ATP水平下降，可利用的能量来源被耗尽，心脏组织变得更加酸性。如 果在缺氧事件后15-20分钟被再灌注，心脏组织可以复原。在细胞的糖原储备被耗 尽之后，细胞逐渐地显示坏死的特征，包括线粒体崩解和细胞膜完整性的丧失。 再灌注时，这些受损的细胞死亡，可能是由于细胞不能维持离子平衡的结果。细 胞膜完整性的丧失导致细胞的胞浆成分被释放入血液循环。
【00158】稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛和心肌梗塞共享一个共同的特征：与心 肌缺血有关的压榨性胸痛。通过医生对临床症状的解释，心绞痛被分类为稳定的 或者不稳定的，带有或者不带有诊断性的ECG变化。心绞痛分类为“稳定的”或 者“不稳定的”，这不是指斑块本身的稳定性，而是指引起胸痛所需要的劳累程度。 最显著地，在不是明确的心肌梗塞的情形下，将胸痛分类为稳定性心绞痛或者不 稳定性心绞痛(或者甚至轻度心肌梗塞)，是完全主观的。诊断，以及在此情形下 的区别，不是通过可以定量动脉阻塞程度的血管造影术进行的，而是通过医生对 临床症状的解释进行的。
【00159】稳定性心绞痛的特征在于压榨性胸痛，其发生于劳累或者受压时，而通 过休息或者舌下含服硝酸甘油被缓解。患有稳定性心绞痛的患者的冠状血管造影 术通常揭示，至少一支冠状动脉发生50-70％阻塞。稳定性心绞痛通常通过临床症 状和ECG变化的评估而被诊断。患有稳定性心绞痛的患者可以具有短暂的ST片 段异常，但是与稳定性心绞痛有关的这些变化的灵敏度和特异性是低的。
【00160】不稳定性心绞痛的特征在于休息时的压榨性胸痛，其通过舌下含服硝酸 甘油而缓解。心绞痛胸痛常常通过舌下含服硝酸甘油被缓解，并且该疼痛常常在 30分钟内平息。不稳定性心绞痛有三类严重程度：第一类的特征是，新发作、严 重的心绞痛，或者加速的心绞痛；第二类，休息时的亚急性心绞痛，特征是增加 的严重程度、持续时间，或者对硝酸甘油的需求增加；第三类的特征是，休息时 的急性心绞痛。不稳定性心绞痛代表了稳定性心绞痛和AMI之间的临床状态，被 认为主要是由于动脉粥样硬化的严重程度和范围的进展、冠状动脉痉挛，或者出 血成为非阻塞斑块，随后引起出血性阻塞。患有不稳定性心绞痛的患者的冠状血 管造影术通常揭示，至少一支冠状动脉发生90％或者更多的阻塞，导致氧的供给 不能满足甚至基本的心肌氧需求。稳定性动脉粥样硬化斑块的缓慢生长，或者不 稳定性动脉粥样硬化斑块的破裂，以及随后形成血栓，可以引起不稳定性心绞痛。 这些原因均可以导致冠状动脉的严重狭窄。不稳定性心绞痛通常与动脉粥样硬化 斑块的破裂、血小板活化和血栓形成相关。不稳定性心绞痛通常通过临床症状、 ECG的变化和心脏标志物(如果有的话)的变化被诊断。对患有不稳定性心绞痛 患者的治疗包括，硝酸盐、阿司匹林、GPIIb/IIIa抑制剂、肝素和β阻断剂。溶栓 治疗没有被证实对不稳定性心绞痛患者有益处，钙通道抑制剂可能也没有效果。 患者也可以接受血管成形术和支架。最终地，患有不稳定性心绞痛的患者处于发 生AMI的风险中。
【00161】心肌梗塞的特征在于持续30分钟以上的压榨性胸痛，可以伴有诊断性 的心电图(ECG)Q波。大多数患有AMI的患者有冠状动脉疾病，并且多达25％ 的AMI病例是“沉默”或者无症状梗塞，并且患有糖尿病的个体趋于对沉默性梗 塞更易感。群体研究表明，非致命性心肌梗塞中的20-60％是未被患者察觉的沉默 性梗塞。AMI的非典型的临床表现可以包括充血性心力衰竭，不伴有严重发作或 者延长的发作的心绞痛，疼痛的定位不典型，中枢神经系统表现类似中风、忧虑 和神经过敏、突发的躁狂或者精神错乱、昏厥，虚弱，急性消化不良，和外周栓 塞。AMI通常通过临床症状、ECG的变化和心脏蛋白，最特别的是心肌钙蛋白、 肌酸激酶MB和肌红蛋白的升高而被诊断。在过去的十年期间，对AMI的治疗已 经改进，造成患者后果的改善，和有关AMI的死亡率降低30％。通过给予限制梗 塞面积并且改善后果的药剂，对AMI患者的治疗被实现，这是通过去除阻塞物质、 增加对心脏组织的氧供应、或者降低心脏组织的氧需求实现的。治疗可以包括下 列：追加氧、阿司匹林、GPIIb/IIIa抑制剂、肝素、溶栓剂(tPA)、硝酸酯(硝酸 甘油)、镁、钙通道拮抗剂、β肾上腺能受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂、 血管成形术(PTCA)和冠状动脉腔内支架。
【00162】从胸痛发作起30分钟的时间点，被认为代表了由缺血引起的可逆性心 肌损伤的时间窗。稳定性心绞痛和不稳定性心绞痛的血管造影特征分别是，50-70 ％的动脉阻塞或者90％或更多的动脉阻塞，心肌梗塞的特征在于完全的或者几乎 完全的阻塞。一个通常的误解是，稳定性心绞痛和不稳定性心绞痛是指斑块的稳 定性，或它们同心肌梗塞是独立的疾病。由于稳定性心绞痛常常进展成为不稳定 性心绞痛，并且不稳定性心绞痛常常进展成为心肌梗塞，稳定性心绞痛、不稳定 性心绞痛和心肌梗塞均可以作为不同严重程度的冠状动脉疾病而加以表征。近来， 下列冠状动脉疾病进展的生理模式已被提出：炎症→斑块破裂→血小板活化→早 期血栓形成→早期坏死。此模式被设计，以适合下列理论：炎症发生于稳定性心 绞痛期间，以及，斑块破裂、血小板活化和早期血栓的标志物可以被用于确定和 监测不稳定性心绞痛发展的严重程度。在心绞痛发作期间造成的心肌损伤是，确 定地，可逆的，而在心肌梗塞期间造成的损伤是不可逆的。因此，在此模式中， 存在两个被提出的断点(break points)，用于区分稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛 和心肌梗塞。第一个断点发生于炎症和斑块破裂之间，理论是，在稳定性心绞痛 中不发生斑块破裂。第二个断点发生于早期血栓形成和早期坏死之间，理论是， 在不稳定性心绞痛期间招致的心肌损伤是可逆的。认识到，除早期心肌坏死之外 的这些事件可以和所有形式的冠状动脉疾病相联系，并且沿着此诊断通路的进展 不一定提示疾病进展，是重要的。冠状动脉疾病从轻度的不稳定性心绞痛到严重 的不稳定性心绞痛和心肌梗塞的进展，与斑块的不稳定性和动脉阻塞的程度相关。 此进展可以缓慢的发生，如稳定的斑块增大并变得更加阻塞，或者可以迅速的发 生，如不稳定斑块破裂，引起血小板活化和阻塞性血栓形成。由于心肌梗塞最经 常地共享与不稳定性心绞痛相同的病理生理变化，可能这两个事件之间唯一的不 同是心肌损伤的可逆性。确定地，不稳定性心绞痛引起可逆性损伤，而心肌梗塞 引起不可逆性损伤。已发表的报道提示了，在患有不稳定性心绞痛的患者中，存 在心肌坏死。确定地，这些患者可能确实在经历早期AMI。然而，即使这些患者 被诊断为不稳定性心绞痛而不是早期AMI，高度的严重程度提示，他们将从早期 的积极治疗中大大受益。心肌缺血是稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛和心肌梗塞 的发病机理中的主要决定因素，并且它们不应该被看作是单独的疾病。相反地， 它们反映了由缺血造成的心肌损伤的增加的严重程度。
【00163】炎症机制在动脉粥样硬化过程中起重要作用。在发病机理的基础上，在 巨噬细胞、T淋巴细胞和平滑肌细胞之间，存在着复杂的相互作用。越来越多的实 验证据提示，炎症参与了ACS的发病机理并影响其临床进展。在患有ACS的患者 中，冠状动脉粥样硬化斑块的特征是大量的炎性渗出物。而且，在这些患者中， 炎症反应的系统的体征可以被观察到：活化的循环炎症细胞(噬中性粒细胞、单 核细胞和淋巴细胞)，以及促炎细胞因子，如白介素(IL)1和6和急性期反应蛋 白，特别是C反应蛋白(CRP)的浓度增加。
【00164】 血栓前体蛋白
【00165】凝血酶首先从纤维蛋白原去除纤维蛋白肽A，生成desAA纤维蛋白单体， 其可以和所有其它的源自纤维蛋白原的蛋白，包括纤维蛋白降解产物、纤维蛋白 原降解产物、desAA纤维蛋白和纤维蛋白原形成复合体。desAA纤维蛋白单体一 般地指可溶性纤维蛋白，原因是它是纤维蛋白原切割后的第一个产物，但是它不 通过因子VIIa交联成不溶性纤维蛋白凝块。desAA纤维蛋白单体也可以经历凝血酶 的进一步蛋白水解切割，以去除纤维蛋白肽B，生成desAABB纤维蛋白单体。此 单体可以和其它desAABB纤维蛋白单体多聚化，形成可溶的desAABB纤维蛋白 聚合物，也被称作可溶性纤维蛋白或者血栓前体蛋白(TpPTM)。
【00166】TpPTM是不溶性纤维蛋白的直接前体，不溶性纤维蛋白形成一种“网样” 结构，为新形成的血栓提供结构上的刚性。在这方面，血浆中TpPTM的测定是活 性凝块形成的直接量度。据报道，TpPTM的正常血浆浓度＜6ng/ml(Laurino，J.P.et al.，Ann.Clin.Lab.Sci.27：338-345，1997)。American Biogenetic Sciences已开发了 一种针对TpPTM的检验分析(美国专利号5,453,359、5,837,540和5,843,690)。研 究已经测定，患有AMI的患者的TpPTM升高(Laurino et al.，Ann.Clin.Lab.Sci.27： 338-345，1997；Carville et al.，Clin.Chem.42：1537-1541，1996)。也报道，在患有不 稳定性心绞痛的患者中，TpPTM的血浆浓度被升高(Laurino et al.，Ann.Clin.Lab.Sci. 27：338-345，1997)，尽管其他的工作人员发现，在对照组、不稳定性心绞痛和慢性 稳定性劳累性心绞痛中，TpPTM的水平是相似的(Fiotta et al.，Blood Coagul. Fibrinolysis 13：247-255，2002)。
【00167】在理论上，TpPTM在血浆中的浓度将被升高，这发生在引起凝血活化或 者是作为凝血活化结果的任何情况中，包括弥散性血管内凝血、败血症、肺栓塞、 深静脉血栓形成、充血性心力衰竭、手术、癌症、肠胃炎和可卡因服用过量(Laurino etal。Ann.Clin.Lab.Sci.27：338-345，1997；Song et al.，Haematologica 87：1062-1067， 2002；La Capra et al。Blood Coagul.Fibrinolysis 11：371-377，2000)。在凝血酶活化 后，TpPTM便被立刻释放入血流。血流中的TpPTM可能具有短的半衰期，原因是它 将在凝块形成的位置，迅速地转变为不溶的纤维蛋白。血浆TpPTM浓度被报道为， 在AMI发作后3小时内到达顶峰，发作后12小时，回落至正常。在冠状血管疾 病(CVD)中，TpPTM的血浆浓度可以超过30ng/ml(Laurino et al.，Ann.Clin.Lab. Sci.27：338-345，1997)。
【00168】 MCP-1
【00169】单核细胞趋化蛋白1(也称作单核细胞化学引诱蛋白1，MCP-1)，是一 种10kDa的趋化因子，其吸引单核细胞和嗜碱性细胞，但是不吸引中性粒细胞或 者嗜酸性细胞。MCP-1通常被发现处于单体形式和同源二聚体形式之间的平衡状 态，并且其通常由单核细胞和血管内皮细胞产生和分泌(Yoshimura，T.et al.，FEBS Lett.244：487-493，1989；Li，Y.S.etal，Mol.Cell.Biochem.126：61-68，1993)。MCP-1 参与各种涉及单核细胞浸润的疾病的发病机理，包括牛皮癣、风湿性关节炎和动 脉粥样硬化。MCP-1在血浆中的正常浓度＜0.1ng/ml。在患有AMI的患者中，MCP-1 血浆浓度升高，在患有不稳定性心绞痛的患者中，可以升高，但是升高不与稳定 性心绞痛相关(Soejima，H.et al.，J.Am.Coll.Cardiol.34：983-988，1999；Nishiyama， K.et al.，Jpn.Circ.J.62：710-712，1998；Matsumori，A.et al.，J.Mol.Cell.Cardio.29： 419-423，1997)。有趣的是，MCP-1也可以涉及在动脉粥样硬化期间，吸引单核细 胞进入动脉壁。
【00170】MCP-1血清浓度的升高和各种与炎症有关的状态相关，包括酒精性肝 病、肺间质疾病、败血症和系统性红斑狼疮(Fisher，N.C.et al.，Gut45：416-420，1999； Suga，M.et al.，Eur.Respir.J.14：376-382，1999；Bossink，A.W.et al.，Blood 86：3841-3847，1995；Kaneko，H.et al.J.Rheumatol.26：568-573，1999)。在单核细胞 和内皮细胞活化后，MCP-1被释放入血流。已报道，患有AMI的患者，MCP-1 在血浆中的浓度接近1ng/ml(100pM)，并且可以保持升高的水平达一个月(Soejima， H.et al.，J.Am.Coll.Cardiol.34：983-988，1999)。在ACS的情况下，MCP-1释放入 血流和从血流中清除的动力学目前是未知的。MCP-1是涉及单核细胞迁移的促炎 状态存在的特异标志物。
【00171】 用在组中的代表性标志物
【00172】(i)心肌损伤的特异性标志物
【00173】除了上面被详细描述的心肌钙蛋白之外，下列是心肌损伤的代表性特异 标志物。此列举不意味着是限制性的。
【00174】钙依赖磷脂结合蛋白(annexin)V，也被称作脂皮质蛋白V、内联蛋白 (endonexin)II、钙磷脂结合蛋白(calphobindin)I、钙结合蛋白33、胎盘抗凝 血蛋白I、促凝血酶原激酶抑制剂、血管抗凝剂α和锚连蛋白CII，其是一种33kDa 的钙结合蛋白，为组织因子的间接抑制剂和调节剂。Giambanco，I.et al.，J. Histochem.Cytochem.39：P1189-1198，1991；Doubell，A.F.et al.，Cardiovasc.Res. 27：1359-1367，1993。Annexin A的正常血浆浓度是＜2ng/ml(Kaneko，N.et al.，Clin. Chim.Acta251：65-80，1996)。一个研究已发现，在患有AMI的个体中，annexinA 的血浆浓度升高，但是在患有陈旧性心肌梗塞、胸痛症状、瓣膜性心脏疾病、肺 部疾病和肾脏疾病的患者中，没有显著升高。Kaneko，N.et al..Clin.Chim.Acta 251： 65-80，1996。
【00175】烯醇化酶是一种78kDa的同源二聚或者异源二聚的胞浆蛋白，由α亚基、 β亚基和γ亚基生成。烯醇化酶催化糖酵解通路中的2-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙 酮酸的互变。烯醇化酶以αα、αβ、ββ、αγ和γγ异构体的形式存在。α亚基在大多 数组织中被发现，β亚基在心肌和骨骼肌中被发现，γ亚基主要在神经元和神经内 分泌组织中被发现。β-烯醇化酶由αβ烯醇化酶和ββ烯醇化酶组成，并且对肌肉特 异。已经报道，在患有AMI的个体的血清中，β-烯醇化酶升高，但是在患有心绞 痛的个体中不升高(Nomura，M.et al.，Br.Heart J.58：29-33，1987； Herraez-Dominguez，M.V.et al.，Clin.Chim.Acta 64：307-315，1975)。在心脏手术、 肌营养不良和骨骼肌损伤期间，β-烯醇化酶的血浆浓度也被升高(Usui，A.et al.， Cardiovasc.Res.23：737-740，1989；Kato，K.et al.，Clin.Chim.Acta 131：75-85，1983； Matsuda，H.et al.，Forensic Sci.Int.99：197-208，1999)。
【00176】肌酸激酶(CK)是一种85kDa的胞浆酶，其催化从ATP和肌酸可逆性 地生成ADP和磷酸肌酸的反应。CK是由M链和B链组成的同源二聚体或者异源 二聚体。CK由2种亚基组成，每一种亚基具有43kDa的分子量。由两种亚单位的 不同配对形成三种同工酶：B(对于脑)和M(对于肌肉)。CK-MM在骨骼肌中 占优势(占总CK的大约99％)，在心肌中占优势(占总CK的大约55％)；CK-BB 在脑组织中占优势(占总CK的超过90％)；CK-MB在心肌中最普遍(达总CK 的大约45％)。心肌梗塞之后，CK-MB水平在3至8小时内变得升高，在9至30 小时内达到高峰，在48至72小时之后回复正常。Thygesen，K.et al.，Eur.J.Clin. Invest.16：1-4，1986；Koukkunen，H.et al.，Ann.Med.30：488-496，1998；Bertinchant，J. P.et al.，Clin.Biochem.29：587-594，1996；Benamer，H.et al.，Am.J.Cardiol. 82：845-850，1998；Norregaard-Hansen，K.et al.，Eur.Heart J.13：188-193，1992。在确 定不稳定性心绞痛的严重程度中，CK-MB可以是有用的，原因是心肌缺血的程度 和不稳定性心绞痛的严重程度成正比例。
【00177】糖原磷酸化酶(GP)是一种188kDa的细胞内变构酶，在无机磷酸存在 时，它在糖原分解期间，催化从糖原的非还原末端去除葡萄糖(以葡萄糖-1-磷酸 的形式释放)的反应。GP以同源二聚体的形式存在，它与另一同源二聚体结合， 形成四聚的酶激活的磷酸化酶A。存在三种可以被免疫学区分的GP异构体。BB 异构体被发现于脑组织和心脏组织，MM异构体被发现于骨骼肌和心脏组织，LL 异构体主要被发现于肝脏(Mair，J.et al.，Br.Heart J.72：125-127，1994)。在患有 AMI的患者中，和患有带有一过性ST-T段升高的不稳定性心绞痛的患者中，血浆 GP-BB浓度显著升高，但在稳定性心绞痛中不升高(Mair，J.et al.，Br.Heart J.72： 125-127，1994；Mair，J.，Clin.Chim.Acta 272：79-86，1998；Rabitzsch，G et al.，Clin. Chem.41：966-978，1995；Rabitzsch，G et al.，Lancet 341：1032-1033，1993)。GP-BB 也被用于，在经历冠状动脉旁路手术的患者中，检测围手术期的AMI和心肌缺血 (Rabitzsch，G et al.，Biomed.Biochim.Acta 46：S584-S588，1987；Mair，P.et al.，Eur. J Clin.Chem.Clin.Biochem.32：543-547，1994)。由于GP-BB也被发现在脑中，在 缺血性脑损伤期间，血浆GP-BB浓度也可以升高。
【00178】心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一种参与脂类代谢的胞浆的15kDa 脂结合蛋白。心型FABP抗原不仅在心脏组织中被发现，而且在肾脏、骨骼肌、主 动脉、肾上腺、胎盘和脑中被发现(Veerkamp，J.H.和Maatman，R.G，Prog.Lipid Res. 34：17-52，1995；Yoshimoto，K.et al.，Heart Vessels 10：304-309，1995)。在患有AMI 和不稳定性心绞痛的患者中，血浆H-FABP浓度升高(Ishii，J.et al.，Clin.Chem.43： 1372-1378，1997；Tsuji，R.et al.，Int.J Cardiol.41：209-217，1993)。通过测定肌红蛋 白与FABP的比值(克/克)可以确定心肌组织为H-FABP的一个来源。在胸痛发 作后，血浆H-FABP浓度可以被显著升高1-2小时，这比CK-BB和肌红蛋白的变 化早(Tsuji，R.et al.，Int.J.Cardiol.41：209-217，1993；Van Nieuwenhoven，F.A.et al.， Circulation 92：2848-2854，1995；Tanaka，T.et al.，Clin.Biochem.24：195-201，1991)。
【00179】磷酸甘油酸变位酶(PGAM)是一种57kDa的同源二聚的或者异源二聚 的细胞内糖酵解酶，由29kDa的M或者B亚基组成，在镁存在下，可以催化3- 磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸的互变。心脏组织含有同工酶MM、MB和BB，而骨 骼肌主要含有PGAM-MM，大多数其它组织含有PGAM-BB(Durany，N.and Carreras，J.，Comp.Bioclaem.Physiol.B.Bioclaem.Mol.Biol.114：217-223，1996)。
【00180】S-100是一种21kDa的同源二聚的或者异源二聚的胞浆内Ca2+结合蛋白， 由α亚基和β亚基产生。其被认为参与了沿着Ca2+依赖性信号转导通路的细胞过 程的活化(Bonfrer，J.M.et al.，Br.J Cancer 77：2210-2214，1998)。S-100ao(αα异构 体)被发现于横纹肌、心脏和肾脏，S-100a(αβ异构体)被发现于神经胶质细胞， 但不在许旺式细胞(Schwann cells)中，S-100β(ββ异构体)以高浓度被发现于神 经胶质细胞和许旺式细胞中，其在该处是主要的胞浆成分(Kato，K.and Kimura，S.， Biochim.Biophys.Acta 842：146-150，1985；Hasegawa，S.et al.，Eur.Urol.24： 393-396，1993)。有报道，在患有AMI的患者中，S-100ao的血清浓度被升高，但 在患有带有可疑的AMI的心绞痛患者中不是这样(Usui，A.et al.，Clin.Chem.36： 639-641，1990)。AMI患者的S-100ao血清浓度在入院时显著升高，入院之后8小 时增加至高峰，一周之后降低并回复至基线(Usui，A.et al.，Clin.Chem.36：639-641， 1990)。此外，在AMI发作之后，S-100ao看起来比CK-MB较早地显著升高(Usui， A.et al.，Clin.Chem.36：639-641，1990)。
【00181】(ii)有关血压调节的代表性标志物
【00182】除了在上面详细讨论的ANP、BNP和其相关的标志物，下面提出了本 领域中已知的有关血压调节的代表性标志物。此列举不意味着是限制性的。
【00183】C型利钠肽(CNP)是一种22个氨基酸的肽，其为人脑中的主要的活性 利钠肽；CNP也被认为是内皮源性的舒张因子，它和一氧化氮(NO)的作用方式 相同(Davidson et al.，Circulation 93：1155-9，1996)。CNP在结构上与心房利钠肽 (ANP)和B型利钠肽(BNP)有关；然而，ANP和BNP主要在心肌被合成，而 CNP是以前体(前CNP)在血管内皮被合成(Prickett et al.，Biochem.Biophys.Res. Commun.286：513-7，2001)。
【00184】尿紧张素(urotensin)II是具有丙氨酸-甘氨酸-苏氨酸-丙氨酸-天冬氨酸 -半胱氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-缬氨酸 (Ala-Gly-Thr-Ala-Asp-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val)序列的肽，在第6位的半胱 氨酸和第11位的半胱氨酸之间有二硫键。人尿紧张素2(UTN)是以前原形式 (prepro)被合成的。加工后的尿紧张素2具有潜在的血管活性效应和心脏刺激效 应，其作用于G蛋白偶联受体GPR14上。
【00185】血管加压素(精氨酸血管加压素，AVP；抗利尿激素，ADH)是由垂体 后叶释放的肽激素。它在体内的主要功能是通过影响肾脏对水的处理，调节细胞 外液体量。存在几个调节AVP释放的机制。血容量减少，如在出血时发生，导致 心房压降低。当心房压下降时，心房壁和进入心房的大静脉(心肺压力感受器) 中的特化受体的触发频率降低。来自这些感受器的传入在下丘脑形成突触；心房 感受器的触发通常抑制AVP由垂体后叶释放。随着血容量减少或者降低的中心静 脉压，心房压力感受器触发减少，导致AVP释放增加。下丘脑渗透压感受器感受 细胞外的克分子渗透压浓度并在克分子渗透压浓度升高时，刺激AVP释放，如在 脱水时发生。最终地，位于下丘脑区域的血管紧张素II受体调节AVP释放—血管 紧张素II增加刺激AVP释放。
【00186】降钙素基因相关肽(CGRP)是37个氨基酸的多肽，其为降钙素基因的 产物，通过对mRNA前体的选择性剪接而得到。通过包含或者排除作为初级转录 物的一部分的不同的外显子，降钙素基因(CALC-I)初级RNA转录物被加工为 不同的mRNA片段。编码降钙素的mRNA是甲状腺C细胞中CALC-I转录的主要 产物，然而CGRP-ImRNA(CGRP＝降钙素基因相关肽)在中枢神经系统和外周 神经系统的神经组织中产生。在第三种RNA序列中，降钙素序列丢失，并且选择 性地，CGRP序列在该mRNA中被编码。CGRP是具有血管舒张性质的显著的血 管活性肽。CGRP对钙和磷的代谢没有影响，主要在有关血管平滑肌细胞的神经细 胞中被合成。前CGRP，CGRP的前体，和PCT具有部分相同的N末端氨基酸序 列。
【00187】降钙素原(procalcitonin)是116个氨基酸(14.5kDa)的蛋白质，由位 于染色体11p15.4处的Calc-1基因编码。Calc-1基因产生2种转录子，其为选择性 剪接事件的结果。前降钙素原(pre-procalcitonin)含有25个氨基酸的信号肽，其 被甲状腺的C细胞加工为57个氨基酸的N末端片段、32个氨基酸的降钙素片段， 和21个氨基酸的钙抑肽片段。降钙素原由其它体细胞作为糖基化产物完整地分泌。 Whicher et al.，Ann.Clin.Biochem.38：483-93(2001)。血浆降钙素原已被确定为败血 症及其严重程度的标志物。Yukioka et al.，Ann.Acad.Med.Singapore30：528-31 (2001)；Pettila et al.，Intensive Care Med.28：1220-25(2002)。
【00188】血管紧张素II是一种八肽激素，由肾素作用于循环底物—血管紧张素原 —而形成，血管紧张素原经过蛋白水解切割，形成十肽的血管紧张素I。血管内 皮，特别是在肺中，具有一种酶，血管紧张素转换酶(ACE)，其切掉2个氨基酸， 形成八肽激素，血管紧张素II(AII)。
【00189】肾上腺髓质素(AM)是52个氨基酸的肽，其在许多组织中产生，包括 肾上腺髓质、肺脏、肾脏和心脏(Yoshitomi et al.，Clin.Sci.(Colch)94：135-9，1998)。 在实验动物中，AM的静脉内给予引起长期持续的降压效应，伴随心输出量的增加。 AM作为前体分子被合成(前AM)。也已报道，从AM前体加工得到的N末端肽 作为降压的肽起作用(Kuwasako et al.，Ann.Clin.Biochem.36：622-8，1999)。
【00190】内皮素是三种相关肽(内皮素-1、内皮素-2和内皮素-3)，其由血管内皮 生成的分离的基因编码，其中的每一个都显示了潜在的血管收缩活性。内皮素-1 (ET-1)是21个氨基酸残基的肽，它以212个残基的前体(前ET-1原)形式被合 成，该前体含有17个氨基酸残基的信号肽，在信号肽被去除后，形成称为大ET-1 的肽。此分子在色氨酸21和缬氨酸22之间被内皮素转换酶进一步水解处理。大 ET-1和ET-1均显示生物学活性；然而，成熟的ET-1形式显示出更强的血管收缩 活性(Brooks and Ergul，J.Mol.Endocrinol.21：307-15，1998)。相似地，内皮素2和 内皮素3也是长度为21个氨基酸残基，它们分别通过大内皮素2和大内皮素3的 水解而产生的(Yap et al.，Br.J.Pharmacol.129：170-6，2000；Lee et al.，Blood 94： 1440-50，1999)。
【00191】(iii)有关凝血和止血的代表性标志物
【00192】有关凝血和止血的标志物的血清浓度的升高，可以和凝块出现相联系， 或者和任何引起纤溶活化或者作为纤溶活化结果的病理状态相联系，包括动脉粥 样硬化、弥散性血管内凝血、急性心肌梗塞、手术、创伤、不稳定性心绞痛、中 风、肺栓塞、静脉血栓形成和血栓性血小板减少性紫癜。除了上面详细描述的D 二聚体和TpP之外，下列是有关凝血和止血的代表性标志物。此列举不意味着是 限制性的。
【00193】纤维蛋白溶酶是一种78kDa的丝氨酸蛋白酶，其蛋白水解地消化交联的 纤维蛋白，导致血凝块分解。70kDa丝氨酸蛋白酶抑制剂α2-抗纤维蛋白溶酶 (α2AP)通过和纤维蛋白溶酶形成共价的1∶1化学计量复合物，调节纤维蛋白溶 酶活性。形成的约150kDa的纤维蛋白溶酶-α2AP复合物(PAP)，也被称为纤维蛋 白溶酶抑制复合物(PIC)，在α2AP和于纤溶期间被激活的纤维蛋白溶酶接触后立 即形成。
【00194】β-血小板球蛋白(β-thromboglobulin，βTG)是36kDa的血小板α颗 粒成分，在血小板活化时被释放。在患有不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞的患者 中，而不是患有稳定性心绞痛的患者，β-TG的血浆水平似乎被升高(De Caterina， R.et al.，Eur.Heart J.9：913-922，1988；Bazzan，M.et al.，Cardiologia 34，217-220， 1989)。在患有不稳定性心绞痛的患者中，血浆β-TG的升高似乎也和缺血的时期 有关(Sobel，M.et al.，Circulation 63：300-306，1981)。与ACS相联系的β-TG的血 浆浓度可以达到70ng/ml(2nM)，但是在样品处理期间，此值可能受血小板活化 的影响。
【00195】血小板因子4(PF4)是40kDa的血小板α颗粒成分，在血小板活化时 被释放。PF4是血小板活化的标志物，具有结合和中和肝素的能力。在患有急性心 肌梗塞和不稳定性心绞痛的患者中，而不是患有稳定性心绞痛的患者，PF4的血浆 浓度似乎被升高(Gallino，A.et al.，Am.Heart J.112：285-290，1986；Sakata，K.et al.， Jpn.Circ.J.60：277-284，1996；Bazzan，M.et al.，Cardiologia 34：217-220，1989)。在患 有不稳定性心绞痛的患者中，血浆PF4的升高似乎也与缺血的时期相关(Sobel，M. et al.，Circulation 63：300-306，1981)。
【00196】纤维蛋白肽A(FPA)是16个氨基酸，1.5kDa的肽，通过凝血酶的作用 从纤维蛋白原的氨基末端被放出。在患有急性心肌梗塞、不稳定性心绞痛和变体 心绞痛的患者中，但不是在患有稳定性心绞痛的患者中，血浆FPA浓度被升高 (Gensini，G.F.et al.，Thromb.Res.50：517-525，1988；Gallino，A.et al.，Am.Heart J. 112：285-290，1986；Sakata，K.et al.，Jpn.Circ.J.60：277-284，1996；Theroux，P.et al.， Circulation 75：156-162，1987；Merlini，P.A.et al.，Circulation 90：61-68，1994；Manten， A.et al.，Cardiovasc.Res.40：389-395，1998)。此外，血浆FPA可以提示心绞痛的严 重程度(Gensini，G.F.et al.，Thromb.Res.50：517-525，1988)。
【00197】血小板源生长因子(PDGF)是28kDa的分泌性的同二聚体或者异二聚 体蛋白，由同源的亚基A和/或B组成(Mahadevan，D.et al.，J.Biol.Chem. 270：27595-27600，1995)。PDGF由血管损伤位点附近的聚集的血小板和单核细胞释 放，并且涉及了动脉粥样硬化的发病机制。患有急性心肌梗塞和不稳定性心绞痛 的个体中的血浆PDGF浓度，比在健康对照组或者患有稳定性心绞痛的个体中高 (Ogawa，H.et al.，Am.J.Cardiol.69：453-456，1992；Wallace，J.M.et al.，Ann.Clin. Biochem.35：236-241，1998；Ogawa，H.et al.，Coron.Artery Dis.4：437-442，1993)。
【00198】凝血酶原片段1+2是32kDa的多肽，在凝血酶活化期间由凝血酶的氨基 末端释放。据报道，在患有急性心肌梗塞和不稳定性心绞痛的患者中，而不在患 有稳定性心绞痛的患者中，F1+2的血浆浓度被升高(Merlini，P.A.et al.，Circulation 90：61-68，1994)。其它的报道已提示，在心血管疾病中，血浆F1+2浓度没有显著 的变化(Biasucci，L.M.et al.，Circulation 93：2121-2127，1996；Manten，A.et al.，Cardiovasc.Res.40：389-395，1998)。
【00199】P-选择蛋白，也被称为颗粒膜蛋白-140、GMP-140、PADGEM和CD-62P， 是表达于血小板和内皮细胞中的140kDa的粘附分子。P-选择蛋白存储于血小板的 α颗粒中和内皮细胞的Weibel-Palade小体中。P-选择蛋白的膜结合形式和可溶形 式已经被鉴定。通过阻断白细胞和激活的血小板和内皮细胞之间的相互作用，可 溶的P-选择蛋白可以在调节炎症和血栓形成中起重要的作用(Gamble，J.R.et al.， Science 249：414-417，1990)。在患有急性心肌梗塞和不稳定性心绞痛的患者中，血 浆可溶性P-选择蛋白的浓度显著升高，但在稳定性心绞痛的患者中，甚至在运动 负荷实验之后，也不升高(Ikeda，H.et al.，Circulation 92：1693-1696，1995；Tomoda， H.and Aoki，N.，Angiology49：807-813，1998；Hollander，J.E.et al.，J.Am.Coll. Cardiol.34：95-105，1999；Kaikita，K.et al.，Circulation 92：1726-1730，1995；Ikeda， H.et al.，Coron.Artery Dis.5：515-518，1994)。对于急性心肌梗塞，膜结合P-选择 蛋白的灵敏度和特异性与可溶性P-选择蛋白的相比，是71％比76％和32％比45％ (Hollander，J.E.et al.，J.Am.Coll.Cardiol.34：95-105，1999)。对于不稳定性心绞痛 +急性心肌梗塞，膜结合P-选择蛋白的灵敏度和特异性与可溶性P-选择蛋白的相 比，是71％比79％和30％比35％(Hollander，J.E.et al.，J.Am.Coll.Cardiol.34：95-105， 1999)。
【00200】凝血酶是37kDa的丝氨酸蛋白酶，其蛋白水解地切割纤维蛋白原形成纤 维蛋白，在凝块形成期间，纤维蛋白最终整合为交联的网络。抗凝血酶III(ATIII) 是65kDa的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其为凝血酶、因子XIa、因子XIIa、因子IXa的蛋 白水解活性的生理调节剂。大约100kDa的凝血酶III-ATIII复合物(TAT)的正常 血浆浓度是＜5ng/ml(50pM)。在患有急性心肌梗塞和不稳定性心绞痛的患者中， 特别是在自发的缺血期，TAT浓度是升高的(Biasucci，L.M.et al.，Am.J.Cardiol. 77：85-87，1996；Kienast，J.et al.，Thromb.Haemost.70：550-553，1993)。进一步地，在 患有稳定性心绞痛的个体的血浆中，TAT浓度可以是升高的(Manten，A.et al.， Cardiovasc.Res.40：389-395，1998)。对于患有ACS的患者血浆中的TAT浓度，其 它的发表的报道没有发现明显的不同(Manten，A.et al.，Cardiovasc.Res.40：389-395， 1998；Hoffmeister，H.M.et al.，Atheroscelrosis 144：151-157，1999)。
【00201】冯威勒布兰特因子(vWF)是由血小板、巨核细胞和内皮细胞产生的血 浆蛋白，由220kDa的单体联合形成一系列的高分子量多聚体而形成。这些多聚体 通常在从600至2000kDa的分子量范围内。vWF的A1结构域结合于血小板糖蛋 白Ib-IX-V复合体和VI型非纤维状胶原蛋白，A3结构域结合I型和III型非纤维 状胶原蛋白(Emsley，J.et al.，J.Biol.Chem.273：10396-10401，1998)。存在于vWF 分子中的其它的结构域包括介导血小板-血小板相互作用的整联蛋白结合结构域， 和似乎与11A型冯威勒布兰特病的发病机制有关的蛋白酶裂解结构域。vWF总量 的测定将允许本领域的技术人员确定vWF总浓度的变化。此测定可以通过对各种 形式的vWF分子的测定而进行。A1结构域的测定使得可以进行循环中活性vWF 的测定，这可提示促凝血状态的存在，因为对于血小板结合，A1结构域是可接近 的。在这方面，特异地测定vWF分子的分析，所述的vWF分子带有暴露的A1 结构域和整联蛋白结合结构域，或者带有A1结构域和A3结构域，将允许活性vWF 的鉴定，活性vWF可以被得到以分别用于介导血小板-血小板相互作用或者介导血 小板和血管内皮下的交联。
【00202】组织因子(TF)是45kDa的细胞表面蛋白，表达于脑、肾脏和心脏中， 以在转录上受调节的方式表达于血管周的细胞和单核细胞。组织因子可以在血流 中以可溶形式被检测到，其结合于因子VIIa，或者与因子VIIa，和也可以含有因 子Xa的组织因子通路抑制剂形成复合物。TF也表达于巨噬细胞表面，其通常在 动脉粥样硬化斑块中被发现。在患有不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞的患者中， 而不在患有稳定性心绞痛的患者中，TF升高(Falciani，M.et al.，Thromb.Haemost. 79：495-499，1998；Suefuji，H.et al.，Am.Heart J.134：253-259，1997；Misumi，K.et al.， Am.J.Cardiol.81：22-26，1998)。而且，与稳定性心绞痛相比，在不稳定性心绞痛 中，TF在巨噬细胞上的表达和动脉粥样硬化斑块中的TF活性更加常见(Soejima， H.et al.，Circulation 99：2908-2913，1999；Kaikita，K.et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc. Biol.17：2232-2237，1997；Ardissino，D.et al.，Lancet349：769-771，1997)。
【00203】(iv)有关急性期反应的代表性标志物
【00204】急性期蛋白是一组蛋白，如C-反应蛋白和甘露糖结合蛋白，它们由肝脏 中的细胞产生并且促进炎症、激活补体级联反应，刺激巨噬细胞的趋化性。除了 上面详细描述的MCP-1之外，下列是有关急性期反应的代表性标志物。此列举不 意味着是限制性的。
【00205】人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)是30kDa的丝氨酸蛋白酶，通常包 含在嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中。HNE在嗜中性粒细胞活化时被释放，并且 其活性受循环着的α1-蛋白酶抑制剂调节。血浆HNE浓度通常通过检测HNE-α1-PI 复合物被测定。这些复合物的正常浓度是50ng/ml，提示了HNE的大约25ng/ml (0.8nM)的正常浓度。HNE的释放也可以通过对血浆中一种特异的HNE-衍生的 纤维蛋白肽，纤维蛋白肽Bβ30-43的特异检测而被测定。在患有冠脉狭窄的患者中， 血浆HNE升高，并且与带有简单斑块的患者相比，带有复合斑块患者的升高较大 (Kosar，F.et al.，Angiology49：193-201，1998；Amaro，A.et al.，Eur.Heart J. 16：615-622，1995)。在患有稳定性心绞痛的患者中，血浆HNE不明显升高，但是 在患有不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞的患者中升高，如通过测定纤维蛋白肽 Bβ30-43所确定，其在不稳定性心绞痛中的浓度比与急性心肌梗塞有关的浓度高2.5 倍(Dinerman，J.L.et al.，J.Am.Coll.Cardiol.15：1559-1563，1990；Mehta，J.et al.， Circulation 79：549-556，1989)。
【00206】诱导性一氧化氮合酶(iNOS)是位于上皮细胞巨噬细胞中的130kDa的 胞浆蛋白，其表达受细胞因子，包括干扰素-γ、白介素-1β、白介素-6和肿瘤坏死 因子α以及脂多糖的调节。iNOS催化L-精氨酸合成一氧化氮(NO)，它的诱导 导致了NO持续高输出的产生，NO具有抗微生物活性并且介导各种生理事件和炎 症事件。由iNOS产生的NO较由组成性表达的NOS生成的NO量多大约100倍
(Depre，C.et al.，Cardiovasc.Res.41：465-472，1999)。在心肌缺血期间，iNOS的表 达可以不是升高的，这提示在心绞痛和急性心肌梗塞的区分中，iNOS可以是有用 的(Hammerman，S.I.et al.，Am.J.Physiol.277：H1579-H1592，1999；Kaye，D.M.et al.，Life Sci62：883-887，1998)。
【00207】溶血磷脂酸(LPA)是溶血磷脂中间产物，在磷酸甘油酯和三酰基甘油 合成时形成。在不稳定性心绞痛时，LPA最有可能直接由于斑块破裂而释放。
【00208】丙二醛修饰的低密度脂蛋白(MDA修饰的LDL)是在LDL的apoB-100 的氧化期间，由于磷脂酶活化、前列腺素合成或者血小板活化而形成的。在稳定 性心绞痛、不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞中，氧化的LDL的血浆浓度升高，提 示它可以是动脉粥样硬化的标志物(Holvoet，P.，Acta Cardio.53：253-260，1998； Holvoet，P.et al.，Circulation 98：1487-1494，1998)。血浆MDA修饰的LDL在稳定性 心绞痛中不升高，但是在不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞中，显著地升高(Holvoet， P.，Acta Cardio.53：253-260，1998；Holvoet，P.et al.，Circulation 98：1487-1494，1998； Holvoet，P.et al.，JAMA 281：1718-1721，1999)。在患有急性心肌梗塞的患者中， MDA修饰的LDL的血浆浓度可以接近20μg/ml(～50μM)，在患有不稳定性心绞 痛的患者中，是15μg/ml(～40μM)(Holvoet，P.et al.，Circulation 98：1487-1494， 1998)。
【00209】基质金属蛋白酶-1(MMP-1)，也被称为胶原酶-1，是41/44kDa的锌和 钙结合蛋白酶，主要切割I型胶原，但是也能切割II型、III型、VII型、X型胶原。 活化的41/44kDa酶可以经历自裂解，产生仍具有活性的22/27kDa形式。MMP-1 可以被发现于血流中，它们以游离的形式或者以和其天然的抑制剂TIMP-1构成复 合物的形成而存在。MMP-1被发现于动脉粥样硬化斑块的肩区，此为最容易破裂 的区域，它们还可能涉及动脉粥样硬化斑块的不稳定(Johnson，J.L.et al.， Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18：1707-1715，1998)。而且，MMP-1涉及心肌再灌 注损伤的发病机理(Shibata，M.et al.，Angiology 50：573-582，1999)。
【00210】脂多糖结合蛋白(LBP)是肝脏产生的～60kDa的急性期蛋白。在人类 中，LBP结合于脂多糖并且参与LPS的处理。已报道，LBP介导LPS向单核细胞 上的LPS受体(CD40)的迁移，以及进入HDL的过程。也报道，LBP保护小鼠 免受LPS引起的败血症性休克。
【00211】基质金属蛋白酶-2(MMP-2)，也被称为明胶酶A，是66kDa的锌和钙 结合蛋白酶，是作为失活的72kDa前体被合成的。成熟的MMP-3切割I型明胶和 IV型、V型、VII型、X型胶原。MMP-2通常被发现于血浆中，与其生理调节剂TIMP-2 形成复合物(Murawaki，Y.et al.，J.Hepatol.30：1090-1098，1999)。动脉粥样硬化病 灶内的血管平滑肌细胞中，MMP-2表达升高，并且在斑块不稳定的情形下，它可 以被释放入血流(Kai，H.et al.，J.Am.Coll.Cardiol.32：368-372，1998)。在患有稳 定性心绞痛、不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞的患者中，血清MMP-2浓度升高， 与稳定性心绞痛相比，在不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞中的升高要显著得多 (Kai，H.et al.，J.Am.Coll.Cardiol.32：368-372，1998)。在患有不稳定性心绞痛和 急性心肌梗塞的个体的血清中，MMP-2在入院时便升高，最大水平接近1.5μg/ml (25nM)(Kai，H.et al.，J.Am.Coll.Cardiol.32：368-372，1998)。
【00212】基质金属蛋白酶-3(MMP-3)，也被称为基质分解素-1，是45kDa的锌 和钙结合蛋白酶，它是作为失活的60kDa前体被合成。男性的血清MMP-3浓度较 女性大约高2倍(Manicourt，D.H.et al.，Arthritis Rheum.37：1774-1783，1994)。 MMP-3被发现于动脉粥样硬化斑块的肩区，此为最容易破裂的区域，它可以参与 动脉粥样硬化斑块的不稳定(Johnson，J.L.et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18： 1707-1715，1998)。
【00213】基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，也被称为明胶酶B，是84kDa的锌和钙 结合蛋白酶，它是作为失活的92kDa前体被合成。MMP-9可以以单体、同源二聚 体和带有25kDa的α2-微球蛋白相关蛋白的异源二聚体的形式存在(Triebel，S.et al.， FEBS Lett.314：386-388，1992)。在患有不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞的患者中， 而不在稳定性心绞痛的患者中，血浆MMP-9浓度显著地升高(Kai，H.et al.，J.Am. Coll.CardioL32：368-372，1998)。
【00214】基质金属蛋白酶和它们的抑制剂之间的平衡是影响肿瘤侵害和转移的 至关重要的因素。TIMP家族代表了抑制金属蛋白酶的一类小的(21-28kDa)相关 蛋白。据报道，金属蛋白酶1的组织抑制剂(TIMP1)涉及对正常发育的人骨骼的 骨建造和骨再建的调节，涉及急性骨髓性白血病的浸润性表型，这显示了多形X- 染色体失活。已知TIMP1作用于MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、 MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13和MMP-16。金属蛋白酶2的 组织抑制剂(TIMP2)和金属蛋白酶(如胶原酶)复合，不可逆地使它们失活。已 知TIMP2作用于MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、 MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16和MMP-19。两个选择性的剪接形式可以 和SYN4相联系，并涉及急性骨髓性白血病的浸润性表型。不像一些其它TIMP 基因家族成员的诱导性表达，此基因的表达主要是组成性的。金属蛋白酶3的组 织抑制剂(TIMP3)拮抗金属蛋白酶活性，并且可以抑制肿瘤生长、血管发生、浸 润和转移。TIMP-3的丢失涉及肿瘤发生的获得。
【00215】(v)有关炎症的代表性标志物
【00216】急性期蛋白是有关局部炎症或者全身炎症的更大一群蛋白的一部分。下 面的对有关炎症的另外的标志物的代表性列举不是意味着是限制性的。
【00217】白介素(Ils)是被称为细胞因子的更大一类多肽的一部分。这些是在免 疫系统的各种细胞之间传递信号的信使分子。它们最经常地由巨噬细胞和淋巴细 胞分泌，并且它们的产生是响应于损伤或者感染而被诱导的。它们的作用影响免 疫系统以及其它组织和器官，包括肝脏和脑的其它细胞。至少有18种ILs被描述。 IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和IL-10被优选地用作本发明的标志物。下表显示 了代表性白介素的部分功能。
                           表1：代表性白介素的选择的功能* 功能   IL-1   IL-2   IL-4   IL-6   IL-8   IL-10 增强免疫反应   +   +   +   +   -   + 抑制免疫反应   -   -   -   -   -   + 增强炎症   +   +   +   +   +   - 抑制炎症   -   -   -   -   -   + 促进细胞生长   +   +   -   -   -   - 趋化性(趋化因子)   -   -   -   -   +   - 致热   +   -   -   -   -   -
【00218】白介素-1β(IL-1β)是17kDa的分泌性促炎细胞因子，其涉及急性期反 应并且是许多疾病的致病介质。IL-1β通常由巨噬细胞和上皮细胞产生。IL-1β也 由遭受凋亡的细胞分泌。血浆IL-1β浓度的升高与促炎状态如创伤和感染时的急性 期反应的激活相关。
00219】白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)是IL-1家族中的17kDa的成员，主要表 达在肝细胞、上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中。IL-1ra有细胞内 形式和细胞外形式，它们通过选择性剪接产生。IL-1ra被认为参与了生理的IL-1 活性的调节。在患有急性心肌梗塞以及可发展为心肌梗塞、死亡或者难治性心绞 痛的不稳定性心绞痛的患者中，IL-1ra的血浆浓度升高(Biasucci，L.M.et al.， Circulation 99：2079-2084，1999；Latini，R.et al.，J.Cardiovasc.Pharmacol.23：1-6， 1994)。而且，与无并发的急性心肌梗塞相比，严重的急性心肌梗塞时的IL-1ra显 著升高(Latini，R.et al.，J.Cardiovasc.Pharmacol.23：1-6，1994)。
【00220】白介素-6(IL-6)是20kDa的分泌蛋白，其为生血素家族促炎细胞因子。 其主要功能是介导肝脏蛋白的急性期产生，并且其合成受细胞因子IL-1的诱导。 IL-6通常由巨噬细胞和T淋巴细胞产生。患有急性心肌梗塞和不稳定性心绞痛的 患者的IL-6血浆浓度升高，在急性心肌梗塞中升高的程度更大(Biasucci，L.M.et al.，Circulaion 94：874-877，1996；Manten，A.et al.，Cardiovasc.Res.40：389-395，1998； Biasucci，L.M.et al.，Circulation 99：2079-2084，1999)。在患有稳定性心绞痛的患者 的血浆中，IL-6不显著地升高(Biasucci，L.M.et al.，Circulaion 94：874-877，1996； Manten，A.et al.，Cardiovasc.Res.40：389-395，1998)。在急性心肌梗塞发作的8-12 小时内，IL-6血浆浓度升高，并且可以接近100pg/ml。在患有不稳定性心绞痛的 患者中，发作72小时后，IL-6血浆浓度升高至最高水平，这可能归因于侵害的严 重程度。
【00221】白介素-8(IL-8)是单核细胞、内皮细胞、肺泡巨噬细胞和纤维原细胞 产生的6.5kDa的趋化因子。IL-8诱导嗜中性粒细胞和T细胞的趋化性和活化。
【00222】肿瘤坏死因子α(TNFα)是17kDa的分泌性促炎细胞因子，其参与急性 期反应并且是许多疾病的发病介质。TNFα是185个氨基酸的蛋白，在73和172 位被糖基化。其被合成为212个氨基酸的前体蛋白。单核细胞表达至少5种不同 形式的TNFα分子，分子量为21.5-28KDa。它们主要通过翻译后修饰如糖基化和磷 酸化而不同。TNFα的正常血浆浓度是＜40pg/ml(2pM)。在患有急性心肌梗塞的 患者中，TNFα的血浆浓度升高，在患有不稳定性心绞痛的患者中，少量升高(Li， D.et al.，Am.Heart J.137：1145-1152，1999；Squadrito，F.et al.，Inflamm.Res. 45：14-19，1996；Latini，R.et al.，J.Cardiovasc.Pharmacol.23：1-6，1994；Carlstedt，F. et al.，J.Intern.Med.242：361-365，1997)。TNFα在急性心肌梗塞患者血浆中的浓度 超过300pg/ml(15pM)(Squadrito，F.et al.，Inflamm.Res.45：14-19，1996)。
【00223】可溶性细胞间粘附分子(sICAM-1)，也称为CD54，是85-110kDa的细 胞表面结合免疫球蛋白样整联蛋白配体，其在白细胞募集和迁移期间，协助白细 胞与抗原呈递细胞和内皮细胞的结合。在患有急性心肌梗塞和不稳定性心绞痛的 患者中，而不在稳定性心绞痛的患者中，sICAM-1的血浆浓度升高(Pellegatta，F.et al.，J.Cardiovasc.Pharmacol.30：455-460，1997；Miwa，K.et al.，Cardiovasc.Res. 36：37-44，1997；Ghaisas，N.K.et al.，Am.J.Cardiol.80：617-619，1997；Ogawa，H.et al.，Am.J.Cardiol.83：38-42，1999)。此外，ICAM-1表达于动脉粥样硬化病灶和有 病灶形成倾向的区域，因此，在斑块破裂时，它可以被释放入血流(Iiyama，K.et al.， Circ.Res.85：199-207，1999；Tenaglia，A.N.et al.，Am.J.Cardiol.79：742-747， 1997)。在本领域中熟知另外的ICAM分子，包括ICAM-2(也被称为CD102)和 ICAM-3(也被称为CD50)，其也可以在血中出现。
【00224】血管细胞粘附分子(VCAM)，也被称为CD106，是100-110kDa的细胞 表面结合免疫球蛋白样整联蛋白配体，它在白细胞募集期间协助B淋巴细胞和发 育T淋巴细胞与抗原递呈细胞的结合。在患有急性心肌梗塞、不稳定性心绞痛和 稳定性心绞痛的患者中，sVCAM-1的血浆浓度少量升高(Mulvihill，N.et al.，Am.J. Cardio.83：1265-7，A9，1999；Ghaisas，N.K.et al.，Am.J Cardiol.80：617-619，1997)。 然而，sVAM-1被表达于动脉粥样硬化病灶处，并且其血浆浓度可以和动脉粥样硬 化的程度范围相联系(Iiyama，K.et al.，Circ.Res.85：199-207，1999；Peter，K.et al.， Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17：505-512，1997)。
【00225】巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是参与细胞介导免疫、免疫调控和炎症 的淋巴因子。类似TNF-α和IL-1β，MIF在宿主对内毒素血症的反应中，起了重要 的作用。重组MIF和LPS的共同注射加剧了LPS的致命性，而中和抗MIF抗体 则可完全保护小鼠免遭内毒素性休克的损害。
【00226】血红蛋白(Hb)是携带氧的含铁球状蛋白，被发现于红细胞中。它是两 个珠蛋白亚基的异二聚体。α2γ2被称为胎儿Hb，α2β2被称为成人HbA，α2δ2被称 为成人HbA2。血红蛋白的90-95％是HbA，α2珠蛋白链发现于所有的Hb类型中， 甚至是镰刀细胞血红蛋白。Hb负责携带氧至全身细胞。Hbα2在血浆中通常检测不 到。
【00227】氧化固醇(Oxysterols，胆固醇的氧化衍生物)和氧化脂蛋白已经在动脉 粥样硬化病灶中被鉴定，并且已表明，它在冠状心脏疾病的发病机理中起作用。 参见，例如，Staprans et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.20：708-14，2000。最近 报道，在患有晚期动脉粥样硬化疾病的对象的血浆中，一种被认为是通过动脉粥 样硬化斑块中胆固醇的臭氧分解而形成的醛醇缩合产物是可检测的。已表明，此 分子可以是动脉粥样硬化时动脉炎症的标志物。Wentworth et al.，Science302： 1053-6，2003。此出版物在此以整体并入作为参考。
【00228】人lipocalin型前列腺素D合成酶(hPDGS)，也被称为β-trace，是30kDa 的糖蛋白，其催化由前列腺素H形成前列腺素D2。在患有不稳定性心绞痛和脑梗 塞的患者的血液中，已经确定hPDGS升高(专利EP0999447A1号)。而且，hPDGS 似乎是缺血期的有用标志物(专利EP0999447A1号)。
【00229】肥大细胞类胰蛋白酶，也被称为α-类胰蛋白酶，是275个氨基酸 (30.7kDa)的蛋白，是肥大细胞中主要的中性蛋白酶。肥大细胞类胰蛋白酶是肥 大细胞活化的特异标志物，并且是哮喘中和对多种过敏原的过敏反应中，过敏性 气道炎症的标志物。参见，例如，Taira et al.，J.Asthma39：315-22(2002)；Schwartz et al.，N.Engl.J.Med.316：1622-26(1987)。一个事件之后1至6小时之间升高的 血清类胰蛋白酶水平(＞1ng/ml)提供了肥大细胞脱颗粒的特异提示。
【00230】嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)是异源性蛋白，分子量在16-24kDa中变 化，pI为pH10.8。可以通过血清ECP的评价来反映支气管哮喘中的肺部炎症。 Koller et al.，Arch.Dis.Childhood 73：413-7(1995)；也参见Sorkness et al.，Clin.Exp. Allergy 32：1355-59(2002)；Badr-elDin et al.，East Mediterr.Health J.5：664-75 (1999)。
【00231】白介素10(“IL-10”)是160个氨基酸(预测分子量18.5kDa)的细胞因 子，是四α螺旋束的细胞因子家族的成员。在溶液中，IL-10形成具有大约39kDa 分子量的同源二聚体。人IL-10基因定位在染色体1上。Viera et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 88：1172-76(1991)；Kim et al.，J.Immunol.148：3618-23(1992)。IL-10的 过多产生已被确定为败血症中的标志物，并且可作为严重程度和死亡率的指示。 Gogos et al.，J.Infect.Dis.181：176-80(2000)。
【00232】(vi)肺部损伤的代表性标志物
【00233】KL-6(也被称为MUCI)是表达在肺细胞上的高分子量(＞300kDa)粘 性(mucinous)糖蛋白。据报道，在间质性肺疾病中，KL-6的血清水平升高，间 质性肺疾病的特征是劳累性呼吸困难。已经显示，KL-6是各种间质性肺疾病，包 括肺纤维化、间质性肺炎、结节病和间质性局限性肺炎的标志物。参见，例如， Kobayashi and Kitamura，Chest 108：311-15(1995)；Kohno，J.Med.Invest.46：151-58 (1999)；Bandoh et al.，Ann.Rheum.Dis.59：257-62(2000)；和Yamane et al.，J. Rheumatol.27：930-4(2000)。
【00234】表面活性蛋白是一个脂蛋白家族，其和磷脂结合在复合物中。存在4种 主要的表面活性蛋白，称为SP-A、B、C和D。各种表面活性蛋白均和肺部疾病 有关。参见，例如，Doyle et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.156：1217-29，1997； Bersten et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.164：648-52，2001；Suwabe，Ribnsho Byori50：1061-66，2002；Cheng et al.，Crit.Care Med.31：311-13，2003；Hastings，J. Clin.Monit.Comput.16：385-92，2000。
【00235】嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，一种蛋白水解酶，很久就已作为肺损伤的标 志物被测定，它们既存在于周身循环中，也存在于支气管肺泡灌洗液中。参见， 例如，Moraes et al，Crit.Care Med.31(4 Suppl)：S 189-94，2003。
【00236】与IV型胶原(基底膜的主要组成成分)的分解相关的产物，如胶原蛋白 的7S蛋白片段，已被用于作为肺损伤的标志物。已显示，在患者经历心肺分流术 之后，增加的7S蛋白水平和患者支气管肺泡灌洗液中高的基质金属蛋白酶(MMP； 蛋白水解酶)浓度以及高的嗜中性粒细胞浓度有关。参见，例如，Owen et al.，Am. J.Respir.Cell Mol.Biol.29：283-94，2003。
【00237】(vii)神经组织损伤的代表性特异标志物
【00238】在血管疾病影响除心肌之外的组织的情形下(例如，在中风时)，除心 肌组织损伤标志物之外的组织损伤的特异标志物可能是特别地有用的。以中风为 例，下面列举了神经组织损伤的代表性特异标志物。此列举不意味着是限制性的。
【00239】腺苷酸激酶(AK)是普遍存在的22kDa胞浆酶，催化ATP和AMP与 ADP的互变。已在哺乳动物组织中鉴定了腺苷酸激酶的4种异构体(Yoneda，T.et al.，Brain Res Mol Brain Res62：187-195，1998)。AK1异构体发现于脑、骨骼肌、心 脏和主动脉。作为神经组织损伤的标志物，在AK的异构体中，血清AK1似乎有 最大的特异性。AK可能最适于作为脑缺血的脑脊液标志物，它的主要来源是神经 组织。
【00240】神经营养素(neurotrophins)是表达于哺乳动物神经系统的一个生长因 子家族。一些例子包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神 经营养素-3(NT-3)和神经营养素-4/5(NT-4/5)。神经营养素主要是作为源于靶的 旁分泌或者自分泌的神经营养因子发挥其作用。神经营养素在神经元的生存、分 化和维持中的作用是熟知的。它们显示了部分重叠但是又有不同的表达模式和细 胞靶标。除了在中枢神经系统中的影响，神经营养素也影响外周的传入和传出神 经元。
【00241】BDNF是潜在的神经营养因子，其支持神经细胞和/或神经胶质细胞的生 长和存活能力。BDNF表达为32kDa的前体“前BDNF”分子，其被切割成成熟 的BDNF形式。Mowla et al.，J.Biol.Chem.276：12660-6(2001)。人BDNF的最丰 富的活性形式是27kDa的同源二聚体，由2个相同的119个氨基酸的亚基形成， 它们通过强的疏水作用维系在一起。然而，前BDNF也在细胞外被释放，并且具 有生物活性。
【00242】NT-3也是27kDa的同源二聚体，其由2个119个氨基酸的亚基组成。 已显示，向原代皮质细胞培养物加入NT-3，加剧了由氧-葡萄糖缺乏引起的神经元 死亡，这可能是通过氧自由基机制引起的(Bates et al.，Neurobiol.Dis.9：24-37， 2002)。NT-3表达为失活的前NT-3分子，其被切割成成熟的生物活性形式。
【00243】钙结合蛋白-D是28 kDa的胞浆维生素D依赖的Ca2+结合蛋白，可能通 过稳定细胞内钙水平而行使细胞保护功能。钙结合蛋白-D被发现于中枢神经系统， 主要是在神经胶质细胞和远端肾小管细胞(Hasegawa，S.et al…J.Urol.149： 1414-1418，1993)。钙结合蛋白-D的正常血清浓度＜20pg/ml(0.7pM)。据报道，心 搏停止之后，血清钙结合蛋白-D浓度被升高，并且此升高被认为是由于脑缺血引 起的中枢神经组织损伤的结果(Usui，A.et al.，J.Neurol.Sci.123：134-139，1994)。 血清钙结合蛋白-D升高，在缺血后的再灌注后不久稳定下来。最大的血清钙结合 蛋白-D浓度可以是达700pg/ml(25pM)。
【00244】肌酸激酶(CK)是胞浆酶，催化ADP和磷酸肌酸由ATP和肌酸的可逆 形成。脑特异性CK异构体(CK-BB)是85kDa的胞浆蛋白，占据了总脑CK活 性的大约95％。它在心脏组织、肠、前列腺、直肠、胃、平滑肌、甲状腺、子宫、 膀胱和静脉中也呈现出显著的量(Johnsson，P.J.，Cardiothorac.Vasc.Anesth.10： 120-126，1996)。血清中CK-BB的升高可以归因于由于缺血导致的神经组织损伤， 并伴随着血脑屏障渗透性的增加。在严重中风时，CK-BB的血清浓度是升高的， 并且在中风发作后不久达到峰值(24小时内)，3-7天后(4)逐渐地回复至正常。
【00245】胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是55kDa的胞浆蛋白，是星形胶质细胞丝 (astroglial filaments)的主要结构成分，并且是星形细胞的主要的中间丝蛋白。 GFAP对星形细胞是特异的，星形细胞是中枢神经系统中的间质细胞并且可以被发 现于接近血脑屏障处。在缺血性中风之后，血清GFAP是升高的(Niebroj-Dobosz， I.，et al.，Folia Neuropathol.32：129-137，1994)。血清GFAP浓度似乎在中风发作后 不久便升高，持续增加并且维持一段时间(数周)，该时间可以和损伤的严重程度 有关。
【00246】乳酸脱氢酶(LDH)是普遍存在的135kDa的胞浆酶。它是A链和B链 的四聚物，催化丙酮酸被NADH还原为乳酸。在哺乳动物组织中已经确定了LDH 的5种异构体，组织特异性的异构体是由A链和B链的不同结合构成的。据报道， 血清LDH活性的升高既发生在缺血性中风后，又发生在出血性中风后，但是需要 血清中的进一步研究，以证实此观察结果并且确定损伤的严重程度和神经学后果 的关联(Aggarwal，S.P.et al.，J.Indian Med.Assoc.93：331-332，1995；Maiuri，F.etal.， Neurol.Res.11：6-8，1989)。
【00247】髓磷脂碱蛋白(MBP)实际上是14-21kDa的一个胞浆蛋白家族，通过 单一的MBP基因的选择性剪接产生，该基因很可能参与了髓鞘形成过程期间轴突 周围的髓磷脂压缩。MBP对中枢神经细胞中的少突细胞和外周神经系统(PNS) 中的许旺式细胞是特异的。在所有类型的严重中风，特别是血栓形成性中风、栓 塞性中风、脑内出血、蛛网膜下出血之后，血清MBP升高，尽管在轻度至中等严 重程度中风个体的血清中，未见MBP浓度升高的报道，轻度至中等严重程度中风 包括腔隙性梗塞或者短暂性缺血发作(Palfreyman，J.W.et al.，Clin.Chim.Acta 92： 403-409，1979)。据报道，MBP的血清浓度和损伤的范围(梗塞体积)有关，并且 它也可以和神经学后果相关。
【00248】神经细胞粘附分子(NCAM)，也被称为CD56，是170kDa的细胞表面 结合免疫球蛋白样整联蛋白配体，其参与神经系统中的神经元和神经胶质细胞的 相互作用的维系，在中枢神经系统中，NCAM表达于星形细胞、少突细胞、许旺 式细胞、神经元和轴突的表面。NCAM也定位于发育的骨骼肌肌管，并且在发育、 去神经(denervation)和神经再造(renervation)期间，其在骨骼肌中的表达被上 调。
【00249】含脂质蛋白(PLP)是30kDa的整合膜蛋白，为中枢神经系统髓磷脂的 主要结构成分。PLP对中枢神经系统中的少突细胞是特异的，并且占据了中央鞘 中中枢神经系统总髓磷脂蛋白的大约50％，尽管在外周神经系统(PNS)髓磷脂中， 极低水平的PLP已被发现(＜1％＝。脑梗塞后的血清PLP浓度是升高的，但是在 短暂性缺血发作后，血清PLP不升高(Trotter，J.L.et al.，Ann.Neurol.14：554-558， 1983)。PLP在血清中的升高可以促进神经组织损伤，这是由于由梗塞或者脑出血 造成的物理损伤或者缺血，同时伴有血脑屏障的渗透性增加。
【00250】S-100β在中风发作后4小时在血清中升高，在发作后2-3天浓度达到最 大。血清浓度达到最大之后，最大值可以接近20ng/ml(1.9mM)，在大约1周期 间，其逐渐地降低至正常。由于损伤的严重程度对S-100β的释放具有直接的影响， 它将通过影响S-100β在血清中升高的时间长度来影响释放动力学。随着损伤的严 重程度增加，S-100β将在血清中存在更长时期。而且，升高的S-100β血清浓度可 以提示有关AMI和心脏手术后神经组织损伤的并发症。
【00251】血栓调节蛋白(TM)是70kDa的单链膜整合糖蛋白，发现于血管内皮 细胞的表面。目前，描述缺血性中风后的血清TM浓度变化的报道是混杂的，报 道为没有变化或者显著增加(Seki，Y.et al.，Blood Coagul.Fibrinolysis 8：391-396， 1997)。TM浓度的血清增加反映了内皮细胞损伤，并且不会提示凝血活化或者纤 溶活化。
【00252】蛋白激酶C的γ异构体(PKCg)对中枢神经系统组织是特异的，并且 正常情况下在循环中是不被发现的。PKCg在脑缺血期间被活化，并且以较对侧组 织高2-24倍的水平，存在于缺血半影区，但是在梗塞组织中不升高(Krupinski，J. et al.，Acta Neurobiol.Exp.(Warz)58：13-21，1998)。PKC的其它的异构体，βI和 βII以增加的水平被发现于患有脑缺血的患者的脑组织的梗塞中心。(Krupinski，J. et al.，Acta Neurobiol.Exp.(Warz)58：13-21，1998)。而且，应用犬科动物的出血模 型，已经表明PKC的α和delta异构体(分别为PKCa和PKCd)牵涉在蛛网膜下 出血后的血管痉挛的发展中。因此，测定PKC的各种异构体，或者是个别地测定， 或者是以其各种组合测定，可以是有益的，可以用于脑损伤的确定、缺血半影存 在的确定，以及蛛网膜下出血后脑血管痉挛的发生和进展的测定。PKC异构体的 比率，如PKCg和PKCbI或PKCbII的比，或者和PKCbI及PKCbII两者的比， 在确定进展性中风中，也可以是有益的，在该处缺血半影转变为不可逆地受损的 梗塞组织。
【00253】(viii)细胞损伤的非特异标志物
【00254】肌红蛋白是小的(17.8kDa)血红素蛋白，在肌细胞中运输氧，并且构成 骨骼肌和心肌的肌肉蛋白的大约2％。由于其低的分子量，肌红蛋白迅速地被释放 入循环中，并且在AMI之后它是显示升高的水平的第一个标志物：在0.5至2小 时后，升高的水平出现在循环中。然而，升高的水平也可以和各种骨骼肌损伤和 肾功能衰竭有关，因此对于心肌损伤不是特异的。
【00255】人血管内皮生长因子(VEGF)是二聚体蛋白，其被报道的活性包括对 内皮细胞生长、血管发生和毛细血管渗透性的刺激。VEGF由各种血管化组织分泌。 在氧缺乏的环境中，血管内皮细胞可能受损并且可能最终不存活。然而，这样的 内皮损伤刺激VEGF通过血管平滑肌细胞产生。在VEGF存在时，血管内皮细胞 可以显示增加的生存，此效应被认为是由Bcl-2的表达介导的。VEGF可以以各种 剪接变异体存在，称为VEGF(189)、VEGF(165)、VEGF(164)、VEGFB(155)、 VEGF(148)、VEGF(145)和VEGF(121)。
【00256】胰岛素样生长因子(IGF-1)是普遍存在的7.5kDa的分泌蛋白，在发育 期间介导生长激素的合成代谢效应和躯体源性效应(1，2)。在循环中，IGF-1通 常结合于调节IGF活性的IGF-结合蛋白。据报道，患有缺血性中风个体的血清 IGF-1浓度是显著地下降的，并且降低的数量似乎和损伤的严重程度有关(Schwab， S.et al.，Stroke28：1744-1748，1997)。血清IGF-1可以是神经组织损伤的敏感的指 示物。然而，IGF-1的普遍存在的表达方式提示，所有的组织都可以潜在地影响 IGF-1的血清浓度。
【00257】参与炎症反应的粘附分子也可以被视为急性期反应物，因为它们的表达 水平会作为侵害的结果而被改变。这样的粘附分子的例子包括E-选择蛋白、细胞 间粘附分子-1、血管细胞粘附分子，和其类似物。
【00258】E-选择蛋白，也被称为ELAM-1和CD62E，是反应于IL-1和TNFα而 表达在内皮细胞上的140kDa的细胞表面C-型凝集素，介导嗜中性粒细胞募集期间 嗜中性粒细胞和内皮细胞间的“滚动(rolling)”相互作用。一些研究报道了缺血 性中风之后血清E-选择蛋白浓度的增加，而其它的研究发现，它是不变的(Bitsch， A.et al.，Stroke29：2129-2135，1998；Kim，J.S.，J.Neurol.Sci.137：69-78，1996；Shyu， K.G.et al.，J.Neurol.244：90-93，1997)。在蛛网膜下出血的个体的CSF中，E-选择 蛋白的浓度是升高的，并且可以预测血管痉挛(Polin，R.S.et al.，J.Neurosurg.89： 559-567，1998)。在患有动脉粥样硬化、各种形式的癌症、先兆子痫、糖尿病、囊 性纤维病、AMI和其它的非特异性炎症状态的个体中，血清E-选择蛋白浓度被升 高(Hwang，S.J.et al.，Circulation 96：4219-4225，1997；Banks，R.E.et al.，Br.J. Cancer68：122-124，1993；Austgulen，R.et al.，Eur.J Obstet.Gynecol.Reprod.Biol. 71：53-58，1997；Steiner，M.et al.，Thromb.Haemost.72：979-984，1994；De Rose，V.et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.157：1234-1239，1998)。
【00259】头激活物(head activator，HA)是11个氨基酸的1.1kDa的神经肽，被发 现于下丘脑和肠。它最初被发现于淡水腔肠动物水螅，在该处它作为头部特异性 生长因子和分化因子起作用。
【00260】糖化(glycated)血红蛋白HbA1c的测定提供了血糖在延伸的时间期间 内被升高的程度的评定，并且因此可以与患者中糖尿病被控制的程度相联系。葡 萄糖缓慢地结合于血红蛋白A，形成A1c亚型。其逆向反应，或者分解反应，进 行得相对缓慢，因此，任何积累持续大约4周。根据正常血糖水平，糖化血红蛋 白被预期为4.5％至6.7％。然而，随着血糖浓度增加，更多的结合发生了。当糖化 血红蛋白测定值超过8.0％时，提示了在这段时间内对血糖的控制差。
【00261】(ix)有关凋亡的标志物
【00262】凋亡是指真核细胞的“程序性细胞死亡”通路。该通路依赖于细胞内蛋 白酶和核酸酶，最终地导致基因组DNA的片段化和细胞死亡。下面的有关凋亡的 标志物的代表性的列举不意味着是限制性的。
【00263】Caspases(半胱氨酸天冬氨酸位点特异性蛋白水解酶)是一类蛋白酶家 族，通过激酶以信号回忆的阶梯方式传播“死亡”信号。Caspases作为潜在的酶存 在于所有的细胞中。它们被募集至受体相关的胞浆复合物，该复合物的形成由受 体寡聚化启动(例如，TNF受体、FAS和TRAIL受体)，并且被募集至其它的胞 浆接头(adaptor)蛋白，如APAF-1。Caspases向寡聚的受体的募集导致了经二聚 化的活化或者伴随着蛋白自水解切割的二聚化的活化。活化的Caspases可以蛋白 水解其它的caspase，产生caspase级联反应，切割对细胞存活至关重要的蛋白。此 信号通路的最终结果是被称为凋亡的调控性细胞死亡形式。
【00264】参与凋亡的caspase的亚群可以称为起始物(initiators)或者效应物 (effectors)。Caspase-8、-9和-10(可能地，-2和-5)可以启动caspase活化级联 反应并且因此被称为起始物。基于原型，caspases-8和-9，起始物可以通过单独地 二聚化而被活化(caspases-9)，或者通过伴有同时的蛋白自水解的二聚化而被活化 (caspase-8)。效应物caspase-3、-6和-7传播级联反应并且被其它的caspase的蛋 白水解切割而激活。尽管起始物caspase可以不对起始caspase级联反应负责，但 它可以被活化并且参与此后的级联反应步骤。因此，在后者的情形下，caspase将 更适当地被称为效应物。
【00265】Caspases-3，也被称为CPP-32、YAMA和apopain，是白介素-1β转换酶 (ICE)样细胞内半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡期间被活化。Caspases-3以失活的 32kDa前体形式存在，其在细胞凋亡诱导期间被蛋白水解地活化，成为20kDa和 11kDa亚基构成的异二聚体(Femandes-Alnemri，T.et al.，J.Biol.Chem.269： 30761-30764，1994)。它的细胞内底物包括聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和固醇调 节元件结合蛋白(SREBPs)(Liu，X.et al.，J Biol.Chem.271：13371-13376，1996)。 Caspases-3的正常血浆浓度是未知的。对于有关ACS的Caspases-3血浆浓度变化， 没有已出版的研究。越来越多数量的证据支持心肌肌细胞的凋亡诱导与缺血和缺 氧有关的假设(Saraste，A.，Herz24：189-195，1999；Ohtsuka，T.et al.，Goron.Artery Dis.10：221-225，1999；James，T.N.，Coron.Artery Dis.9：291-307，1998；Bialik，S.et al.，J.Clin.Invest.100：1363-1372，1997；Long，X.et al.，J.Clin.Invest.99：2635-2643， 1997)。血浆caspase-3浓度的升高可以和涉及凋亡的任何生理事件相关。有证据提 示，在运动期间和运动之后以及在脑缺血时，凋亡在骨骼肌中被诱导(Carraro，U. and Franceschi，C.，Aging(Milano)9：19-34，1997；MacManus，J.P.et al.，J.Cereb. Blood Flow Metab.19：502-510，1999)。
【00266】组织蛋白酶D(E.C.3.4.23.5.)是可溶的溶酶体天冬氨酸蛋白酶。它在 内质网内被合成为前组织蛋白酶原D。由于具有甘露糖-6磷酸标签，前组织蛋白 酶D被甘露糖-6磷酸受体识别。进入酸性的溶酶体后，单链的前组织蛋白酶D (52kDa)被活化为组织蛋白酶D并且随后成为成熟的双链组织蛋白酶D(分别为 31kDa和14kDa)。参与前组织蛋白酶D的溶酶体靶向的两种甘露糖-6-磷酸受体表 达于细胞内和外层细胞膜上。糖基化被认为对正常的细胞内交通是至关重要的。 组织蛋白酶D的基础作用是降解细胞内蛋白质和内化的蛋白质。已暗示，组织蛋 白酶D参与抗原加工和肽激素的酶促生成。组织蛋白酶D的组织特异功能似乎和 催乳素的加工相关。大鼠乳腺应用此酶，用于催乳素的生物活性片段的形成。在 各种组织中，在它们的重塑或者退化期间，以及在凋亡时，组织蛋白酶D都起作 用。
【00267】脑α血影蛋白(也被称为αfodrin)是大约284kDa的细胞骨架蛋白，以 钙依赖方式与钙调蛋白相互作用。类似红细胞系血影蛋白，脑α血影蛋白形成寡 聚物(特别地是二聚体和四聚体)。脑α血影蛋白包含两个EF-臂结构域和23个血 影蛋白重复片段。在凋亡性细胞死亡期间，caspase-3介导的α血影蛋白的切割可 以在改变膜稳定性和凋亡小体形成中起重要的作用。
【00268】下面的表提供了各种优选标志物的列举，相关地，将标志物分类成一群 相关的标志物。如技术人员所理解的和此处所描述的，当与组中的其它标志物共 同考虑时，标志物可以提示不同的状态；选择性地，当考虑到患者的整体临床情 况时，标志物可以提示不同的状态。
标志物                          分类
肌红蛋白                        组织损伤
E-选择蛋白                      组织损伤
VEGF                            组织损伤
肌钙蛋白I和复合物               心肌损伤
肌钙蛋白T和复合物               心肌损伤
钙依赖磷脂结合蛋白(annexin)V    心肌损伤
β-烯醇化酶                     心肌损伤
CK-MB                           心肌损伤
糖原磷酸化酶-BB                 心肌损伤
心型脂肪酸结合蛋白              心肌损伤
磷酸甘油酸变位酶                心肌损伤
S-100ao                         心肌损伤
ANP                             血压调节
CNP                             血压调节
尿紧张素II                      血压调节
BNP                             血压调节
降钙素基因相关肽                血压调节
精氨酸-血管加压素               血压调节
内皮素-1                        血压调节
内皮素-2                        血压调节
内皮素-31                       血压调节
降钙素原                        血压调节
钙磷蛋白(calcyphosine)          血压调节
肾上腺髓质素                    血压调节
醛固酮                          血压调节
血管紧张素1                     血压调节
血管紧张素2                     血压调节
血管紧张素3                     血压调节
缓激肽                          血压调节
降钙素                          血压调节
内皮素-2                        血压调节
内皮素-3                        血压调节
肾素                            血压调节
尿舒张素(urodilatin)            血压调节
纤维蛋白溶酶                    凝血和止血
凝血酶                          凝血和止血
抗凝血酶III                     凝血和止血
纤维蛋白原                      凝血和止血
冯威勒布兰特因子                凝血和止血
D-二聚体                        凝血和止血
PAI-1                                 凝血和止血
蛋白C                                 凝血和止血
TAFI                                  凝血和止血
纤维蛋白肽A                           凝血和止血
纤维蛋白溶酶α2抗纤维蛋白溶酶复合物   凝血和止血
血小板因子4                           凝血和止血
血小板源生长因子                      凝血和止血
P-选择蛋白                            凝血和止血
凝血酶原片段1+2                       凝血和止血
B-凝血球蛋白                          凝血和止血
凝血酶抗凝血酶III复合物               凝血和止血
血栓调节蛋白                          凝血和止血
血栓前体蛋白                          凝血和止血
组织因子                              凝血和止血
碱性钙调蛋白(basic calponin)1         脉管组织
β样1整联蛋白(integrin)               脉管组织
钙调蛋白(calponin)                    脉管组织
CSRP2                                 脉管组织
弹性蛋白                              脉管组织
原纤维蛋白(Fibrillin)1                脉管组织
LTBP4                                 脉管组织
平滑肌肌球蛋白                        脉管组织
transgelin                            脉管组织
I型前胶原羧基末端前肽(PICP)           胶原蛋白合成
胶原蛋白羧基末端尾肽(ICTP)            胶原蛋白降解
谷胱甘肽S转移酶                       炎症
HIF 1 ALPHA                           炎症
IL-10                                 炎症
IL-1-β                                                                炎症
IL-1ra                                炎症
IL-6                                  炎症
IL-8                                  炎症
溶血磷脂酸                            炎症
MDA-修饰的LDL                         炎症
人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶              炎症
C反应蛋白                             炎症
胰岛素样生长因子                      炎症
诱导性一氧化氮合酶                    炎症
细胞内粘附分子                        炎症
乳酸脱氢酶                            炎症
MCP-1                                 炎症
MDA-LDL                               炎症
MMP-1                                 炎症
MMP-2                                 炎症
MMP-3                                 炎症
MMP-9                                炎症
TIMP-1                               炎症
TIMP-2                               炎症
TIMP-3                               炎症
n-乙酰天冬氨酸                       炎症
TNF受体超家族成员1A                  炎症
转化生长因子β                                                炎症
肿瘤坏死因子α                                                炎症
血管细胞粘附分子                     炎症
血管内皮生长因子                     炎症
血半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)C    炎症
物质P(substanceP)                    炎症
髓过氧化物酶(MPO)                    炎症
巨噬细胞抑制因子                     炎症
纤维结合素(fibronectin)              炎症
心脏营养素(cardiotrophin)            炎症
结合珠蛋白(haptoglobin)              炎症
PAPPA                                炎症
s-CD40配体*                         炎症
HMG                                  炎症
IL-1                                 炎症
IL-2                                 炎症
IL-4                                 炎症
IL-6                                 炎症
IL-8                                 炎症
IL-10                                炎症
IL-11                                炎症
IL-13                                炎症
IL-18                                炎症
嗜酸细胞阳离子蛋白                   炎症
肥大细胞类胰蛋白酶                   炎症
VCAM                                 炎症
sICAM-1                              炎症
TNFα                                                                  炎症
护骨素(osteoprotegerin)              炎症
前列腺素D合成酶                      炎症
前列腺素E2                           炎症
PANK配体                             炎症
HSP-60                               炎症
血清淀粉样蛋白A                      炎症
s-iL18受体                           炎症
s-il-1受体                           炎症
s-TNFP55                             炎症
s-TNFP75                             炎症
TGF-β                                                                炎症
MMP-11                   炎症
βNGF                    炎症
CD44                     炎症
EGF                      炎症
E-选择蛋白               炎症
纤维结合素               炎症
嗜中性粒细胞弹性蛋白酶   肺部损伤
KL-6                     肺部损伤
LAMP3                    肺部损伤
LAMP3                    肺部损伤
肺表面活性蛋白A          肺部损伤
肺表面活性蛋白B          肺部损伤
肺表面活性蛋白C          肺部损伤
肺表面活性蛋白D          肺部损伤
磷脂酶D                  肺部损伤
PLA2G5                   肺部损伤
SFTPC                    肺部损伤
MAPK10                   神经组织损伤
KCNK4                    神经组织损伤
KCNK9                    神经组织损伤
KCNQ5                    神经组织损伤
14-3-3                   神经组织损伤
4.1B                     神经组织损伤
APO E4-1                 神经组织损伤
髓磷脂碱蛋白             神经组织损伤
Atrophin1                神经组织损伤
脑源性神经营养因子       神经组织损伤
脑脂肪酸结合蛋白         神经组织损伤
脑微管蛋白               神经组织损伤
CACNA1A                  神经组织损伤
钙结合蛋白(calbindin)D   神经组织损伤
Calbrain                 神经组织损伤
碳酸酐酶XI               神经组织损伤
CBLN1                    神经组织损伤
小脑肽(cerebellin)1      神经组织损伤
Chimerin1                神经组织损伤
Chimerin2                神经组织损伤
CHN1                     神经组织损伤
CHN2                     神经组织损伤
睫状神经营养因子         神经组织损伤
CK-BB                    神经组织损伤
CRHR1                    神经组织损伤
C-tau                    神经组织损伤
DRPLA                    神经组织损伤
GFAP                     神经组织损伤
GPM6B                                 神经组织损伤
GPR7                                  神经组织损伤
GPR8                                  神经组织损伤
GRIN2C                                神经组织损伤
GRM7                                  神经组织损伤
HAPIP                                 神经组织损伤
HIP2                                  神经组织损伤
LDH                                   神经组织损伤
髓磷脂碱蛋白                          神经组织损伤
NCAM                                  神经组织损伤
NT-3                                  神经组织损伤
NDPKA                                 神经组织损伤
神经细胞粘附分子                      神经组织损伤
NEUROD2                               神经组织损伤
NeurofilimentL                        神经组织损伤
神经球蛋白(neuroglobin)               神经组织损伤
神经调节素(neuromodulin)              神经组织损伤
神经元特异烯醇化酶                    神经组织损伤
神经肽Y                               神经组织损伤
神经降压素(neurotensin)               神经组织损伤
神经营养素(neurotrophin)1，2，3，4    神经组织损伤
NRG2                                  神经组织损伤
PACE4                                 神经组织损伤
磷酸甘油酸变位酶                      神经组织损伤
PKCγ                                                                    神经组织损伤
含脂质蛋白(proteolipid protein)       神经组织损伤
PTEN                                  神经组织损伤
PTPRZ1                                神经组织损伤
RGS9                                  神经组织损伤
RNA结合蛋白调节亚基                   神经组织损伤
S-100β                                                                神经组织损伤
SCA7                                  神经组织损伤
Secretagogin                          神经组织损伤
SLC1A3                                神经组织损伤
SORL1                                 神经组织损伤
SREB3                                 神经组织损伤
STAC                                  神经组织损伤
STX1A                                 神经组织损伤
STXBP1                                神经组织损伤
突触前膜蛋白(syntaxin)                神经组织损伤
血栓调节蛋白                          神经组织损伤
转甲状腺蛋白(transthyretin)           神经组织损伤
腺苷酸激酶-1                          神经组织损伤
BDNF*                                神经组织损伤
神经激肽A                             神经组织损伤
s-乙酰谷胱甘肽            凋亡
细胞色素C                 凋亡
Caspase3                  凋亡
组织蛋白酶D               凋亡
α血影蛋白                凋亡
【00269】 标志物的泛素化
【00270】泛素(ubiquitin)介导的蛋白质降解在许多过程的调控中起重要的作用， 如细胞外物质被并入细胞的方式，来自细胞膜的生物化学信号的运动，和细胞功 能如转录开关转换的调节。泛素系统包含在免疫反应和发育中。泛素是76个氨基 酸的多肽，其偶联于被靶向以降解的蛋白。泛素-蛋白偶联物被26S的蛋白水解复 合物识别，其将泛素从蛋白切割下来，蛋白随后被降解。泛素化蛋白的水平通常 地，或者特异的泛素-蛋白偶联物或者其片段的水平，可以作为本发明的额外的标 志物被测定。而且，泛素自身或者其片段在循环中的水平，可以是此处所描述的 方法中的有用的标志物。参见，例如，Hu et al.，J.Cereb.Blood Flow Metab.21： 865-75，2001。
【00271】技术人员将认识到，对泛素的检验分析可以被设计为识别泛素自身、泛 素-蛋白偶联物，或者既识别泛素自身，又识别泛素-蛋白偶联物。例如，在夹心免 疫分析中应用的抗体可以被选出，以便固相抗体和标记抗体均识别泛素的一部分， 该部分在未偶联的泛素和泛素偶联物中，均可以被利用以进行结合。另外，对感 兴趣的标志物的泛素偶联物的特异性检验分析，可以应用一种识别泛素的抗体(位 于固相上或者标记)，和识别标志物蛋白的第二抗体(固相的另一抗体或者标记)。
【00272】本发明包括了对任何此处描述的标志物的泛素偶联物的测定。
【00273】标志物组(marker panels)和“组反应值(panel response value)”的应 用
【00274】如上面所描述，在疾病的诊断和预后中评价标志物水平的传统方法通常 包含对感兴趣的标志物确立一个“阈”。之后，将样品中该标志物的浓度和该阈值 相比较，高于预先确定的阈的量提示一种状态(例如，疾病)，而低于预先确定的 阈的量提示另一种状态(例如，正常)。本领域的技术人员将认识到，可以进行标 志物的单变量(univariate)分析，可以将来自多个标志物的单变量分析的数据联 合起来，形成标志物组，以区分不同的疾病状态。
【00275】然而，随着组中标志物数量的增加，对每一标志物应用分别的阈 (individual thresholds)可能变得难以操作。尽管对组中的一个或者多个标志物应 用分别的阈，是在本发明的范围内，但在下面的部分描述了用以评价多个标志物 的代表性的方法，在该方法中，并不依赖于标志物组中一个或者多个标志物的具 体的阈，来将标志物水平和具体的诊断和/或预后联系起来。相反地，多个标志物 作为单一的整体被考虑。整合标志物以形成单一结果的简单的例子可以是，计算 两个或者多个标志物的比值。在下面的代表性方法中，在样品中测定的每一标志 物的浓度都对“组反应值”有贡献，该“组反应值”可以被比作“阈”组反应， 如同它仅仅是单一标志物的浓度。这是诊断方法的一个例子，在这样的诊断方法 中，一个或者多个标志物的含量不和预先确定的阈水平相比较。
【00276】下列文献详细描述了确定对疾病状态的诊断有用的标志物的合适的方 法：美国临时专利申请60/436,392，题目是METHOD AND SYSTEM FOR DISEASE DETECTION USING MARKER COMBINATIONS(律师案卷编号071949-6801)， 2002年12月24日提交；美国专利申请10/331,127，题目是METHOD AND SYSTEM FOR DISEASE DETECTION USING MARKER COMBINATIONS(律师案卷编号 07194-6802)，2002年12月27日提交；和PCT申请＿＿＿＿号，2003年12月 23日提交(律师案卷编号071949-6805)，每一文献以其整体在此并入作为参考， 包括所有的表、图和权利要求。本领域的技术人员也将认识到，可以进行标志物 的单变量分析，可以将来自多个标志物单变量分析的数据联合起来，形成标志物 组，以鉴别不同的疾病状况。
【00277】在开发在诊断中有用的标志物组时，通过检测某些标志物的存在或者水 平，可以从一群对象中获得许多潜在标志物的数据。对象被分为两组，优选地， 第一组和第二组含有大约相等的对象数目。第一组包含已被确定为患有一种疾病 或者，更普遍得，已被确定为处于第一种状态的对象。例如，第一组患者可以是 那些最近有并发不利后果的ACS患者。在下文，第一组中的患者将被称为“患病 的”。
【00278】第二组对象就是那些不属于第一组的对象。在此第二组中的对象可以是 “非患病的”；即，正常的对象。选择性地，在此第二组中的患者可以被选出，他 们显示出类似于由“患病的”对象所显示的那些症状的一个症状或者一系列症状。 在此后所描述的ACS的例子中，“非患病的”群体可以是那些ACS患者，其经过 相同的时期，并不遭受并发的不利后果。
【00279】从这些组的对象中获得的数据包括多个标志物的水平。优选地，同一组 标志物的数据对于每一患者都是可以利用的。这组标志物可以包括可能被猜测为 和具体疾病或者状态的检测有关的所有的候选标志物。实际上已知的关联是不需 要的。此处所描述的方法和系统的实施方案可以被用于确定，候选标志物中的哪 一些和疾病或者状态的诊断是最相关的。在这两组对象中，每一标志物的水平可 以分布于宽的范围，例如，如高斯分布。然而，分布拟合(distribution fit)是不需 要的。
【00280】如上面所指出，一个标志物常常不能明确地鉴定出患者是患病的或者是 非患病的。例如，如果患者被测定为具有属于重叠区域的标志物水平，该检测的 结果对于诊断该患者将是无用的。人工分界(cutoff)可以被用于区别检测疾病或 者状态时的阳性检测结果和阴性检测结果。不论分界被选在何处，单个标志物作 为诊断工具的效果是不受影响的。改变分界仅仅使由于该单个标志物的应用所产 生的假阳性数目和假阴性数目换位。具有这样重叠的检测分析的效果常常通过 ROC(接受器工作特性)曲线来表示。ROC曲线对本领域的技术人员是熟知的。
【00281】ROC曲线的水平轴代表(1-特异性)，其随着假阳性率而增加。曲线的 垂直轴代表灵敏度，其随着真阳性率而增加。因此，对于选出的具体分界，(1-特 异性)的值可以被确定，相应的灵敏度可以被获得。ROC曲线下面积是被测定的 标志物水平允许对一种疾病或者状态进行正确鉴定的概率的量度。因此，ROC曲 线下的面积可以被用于确定该检测的效用(effectiveness)。
【00282】尽管单个标志物的水平的测定可能具有有限的效用，但额外的标志物的 测定提供了另外的信息。但是，困难在于正确地组合两种潜在地不相关的测定的 水平。在根据本发明实施方案的方法和系统中，有关患病组和非患病组患者的各 种标志物水平的数据，可以被用于开发一套标志物组，以提供有用的组反应(panel response)。该数据可以被提供在数据库中，如Microsoft Access、Oracle、其它的 SQL数据库，或者简单地被提供在一个数据文件中。数据库或者数据文件可以含 有，例如，患者标识符如姓名或者号码，存在的各种标志物的水平，患者是患病 的或者是非患病的。
【00283】下一步，对于每一标志物，一个“窗”区先被选出。窗区的位置可以先 被选出，它们可以包括标志物的任何浓度，但是该选择会影响下面描述的最优化 过程。就此而言，在接近猜测的最佳位点附近进行选择，可以有利于优化者更快 的汇聚结果。在一种优选的方法中，窗区的中心先被集中在两组患者重叠区的中 心附近。在一种实施方案中，窗区可以简单地是分界点或者阈，如此领域中已知 的。在其他实施方案中，窗区可以跨越标志物的一个限定的浓度范围。就此而言， 窗区可以用一个中心值和一个宽度来限定。在实践中，对窗区的界限的最初选择， 可以根据每组对象的预先选定的百分点来确定。例如，一个点可以被用作窗区的 右(上)限，在高于所述点时，预先选定的百分比例的患病患者被测量。
【00284】然后，每一患者的每一标志物值都可以映射于一个指示器(indicator)。 该指示器被分配一个低于窗区的值和另一个高于窗区的值。例如，如果一个标志 物通常在非患病的患者中具有较低的值，在患病的患者中具有较高的值，那么针 对具体的标志物，一个零位指示器(zero indicator)将被指定一个低值，提示阳性 诊断的潜在的低可能性。在其他的实施方案中，指示物可以基于一个多项式被计 算。多项式的系数可以根据标志物值在患病的和非患病的对象中的分布被确定。 在下面详细描述的代表性实施方案中，小于窗区的标志物浓度被指定为值0，大于 窗区的标志物浓度被指定为值1。在窗区内，浓度被线性地加入0和1之间的值。 尽管窗内线性函数的选择被用在下面的实施例中，但原则上，任意的非线性函数 也可以被应用于窗内的标志物浓度，如在下面段落中所描述。
【00285】在许多疾病状态中，与该状态有关的非特异性标志物升高。但是高于某 个阈时，标志物的更高的值可以不与疾病状态的更高的概率相关。低于某个阈时， 更低的标志物值可以不与疾病状态的更低的概率相关。在此情况下，指示器函数 可以不随标志物值线性增加。一个优选的实施方案是这样一种指示器函数，该函 数在阈之间具有高的和单调的变化率，而在其它处有小的变化率。此类函数的例 子是坡形(ramp)函数、阶梯(step)函数或者S形(sigmoid)函数。可以将下 阈联系于重叠区(或者窗区)的起始端，将上阈联系于重叠区的结束端。在该下 阈以下，疾病的概率基本上是0，而高于该上阈时，疾病的概率是1。注意，在指 示器函数是阶梯函数并且每一标志物的权重值是1的情形下，组反应就简单地是 高于窗的标志物的数目。此情形和上面应用的例子相同，在上面的例子中，搜索 具有在大于窗的m个标志物中的n个标志物的最好的组。允许指示器在阈附近持 续地变化，这可以使该组反应对刚刚低于窗的标志物变得敏感。作为n/m标志物 的例子，或者阶梯函数的例子，其中指示器值不是连续的，信息是不丢失的。另 一种M*W加和的常用方法利用M来促成线性联系。但是如上面所描述，最适合 的指示器函数可以不随标志物值线性增加。在进一步优选的实施方案中，坡形函 数被用作升高的指示器函数。窗区内的指示器值可以线性地变化，从一个末端的0 值至另一个末端的1值。在其它的实施方案中，指示器值的非线性变化可以被应 用。坡形函数的好处是简单，并且可以很好地接近此类中的其它函数。在对参数 作出恰当选择的情况下，坡形函数可以和阶梯函数等价，或者可以随标志物值线 性地增加。
在一些疾病状态中，例如不稳定性心绞痛，特异标志物如心脏肌钙蛋白(包括心 脏肌钙蛋白的异构体，包括肌钙蛋白I和T和肌钙蛋白I、T和C的复合物)可以 升高至高于正常人群，但是进一步的升高则提示急性状况，在此情形中便是心肌 梗塞。不稳定性心绞痛是导致心脏组织轻微坏死的缺血状态。在心肌梗塞期间， 便存在明显的心脏组织坏死。特异于心脏坏死的心脏肌钙蛋白，在两种状态下均 升高，但是升高的量和坏死的量有关。心脏肌钙蛋白在诊断不稳定性心绞痛中的 最佳的指示器函数可以不是升高指示器(elevation indicator)函数。在一种优选的 实施方案中，该指示器函数可以是在不稳定性心绞痛的期望值附近达到高峰，当 标志物值高于或者低于期望值时下降的函数。此类函数的例子包括高斯函数、三 角函数、梯形函数或者平方函数。这些函数趋向于在一个具体的值附近定位感兴 趣的标志物值。应用这样的指示器函数的另一个例子是这样的情况，标志物值的 一种型式(pattern)提示了一种疾病状态。例如，当一个或者多个标志物的值在一 定范围内时，一种疾病状态可以被提示。当希望时，此类指示器的应用可以允许 对标志物值的型式进行识别。
【00286】各种标志物的相对重要性可以通过权重因数来表示。权重因数可以先被 指定为每一标志物的系数。如同分界区的情况，权重因数的起初的选择可以选择 为任何可接受的值，但是该选择可能影响最佳化过程。就此而言，选择接近猜测 的最佳位置，可以协助优化者更快的汇聚结果。在一种优选的方法中，可接受的 加权系数可以在0和1之间变化，并且对每一标志物的起初的加权系数可以被指 定为0.5。在一种优选的实施方案中，每一标志物的起初的加权系数可以和该标志 物本身的有效性相关。例如，对单个的标志物，ROC曲线可以被产生，而ROC下 的面积就可以被用作该标志物的最初的加权系数。
【00287】然后，对于这两组中的每一组中的每一对象，组反应可以被计算。组反 应是每一标志物水平被映射到的指示器和每一标志物的加权系数的函数。在一种 优选的实施方案中，每一对象(j)的组反应(R)被表示为：
                       Ri＝∑WiIi，j，
其中i是标志物标识，j是对象标识，wi是标志物i的加权系数，I是指示器值，对 象j的标志物i的标志物水平被映射于该值，∑是所有候选标志物i的总和。
【00288】应用指示器值而不是标志物值的一个优势是，特别高或者特别低的标志 物水平不改变该特定标志物对患病或者非患病的诊断的概率。典型地，高于一定 水平的标志物值提示相同确定性的状态。因此，特别高的标志物值可能不提示该 状态的特别高的概率。应用在分界区的一侧为固定值的指示器便消除了此顾虑。
【00289】组反应也可以是几个参数的综合函数，所述参数包括标志物水平和其它 的因子，包括，例如，患者的种族和性别。对组反应有贡献的其他因子可以包括 经一段时间的具体标志物值的斜率。例如，当患者首次到达医院时，特定的标志 物可以被测定。1小时后，相同的标志物可以再次被测定，并且变化的水平可以在 组反应中得以反映。进一步地，另外的标志物可以衍生于其它标志物，并且对组 反应的值有贡献。例如，两种标志物值的比值可以是计算组反应的一个因子。
【00290】获得了每组对象中每一对象的组反应后，每组的组反应的分布现在可以 被分析。一个目标函数可以被定义，以有利于选择有效的组。目标函数通常应该 是组的有效性的表示，如可以被表示为，例如，患病组的对象的组反应和非患病 组的对象的组反应的重叠。在此方式中，通过，例如，使重叠最小化，目标函数 可以被最优化，以使组的有效性最大化。
【00291】在一种优选的实施方案中，代表两组对象的组反应的ROC曲线可以被 用于定义目标函数。例如，目标函数可以反映ROC曲线下的面积。通过最大化曲 线下面积，可以最大化标志物组的有效性。在其它的实施分方案中，ROC曲线的 其它特征可以被用来定义目标函数。例如，ROC曲线的斜率等于1的点可以是有 用的特征。在其他实施方案中，灵敏度和特异性的乘积为最大时的点，有时被称 为“拐点”，可以被应用。在一种实施方案中，拐点处的灵敏度可以被最大化。在 进一步的实施方案中，预先确定的特异性水平处的灵敏度可被用于定义目标函数。 其它的实施方案可以应用预先确定的灵敏度水平处的特异性。在其他的实施方案 中，可以应用这些ROC曲线特征中的两种或者更多种的联合。
【00292】组中的标志物中的一个对被诊断的疾病或者状态是特异的，这是可能 的。当这样的标志物高于或者低于一定的阈而存在时，可以设置组反应，以使其 回到“阳性的”检测结果。然而，当该阈不被满足时，标志物的水平仍然可以被 用作目标函数的可能的贡献者。
【00293】可以应用最优化运算法来最大化或者最小化目标函数。最优化运算法对 本领域的技术人员是熟知的，包括几个通常可被利用的最小化函数或者最大化函 数，包括单形法(Simplex method)和其它限定的最优化技术。本领域的技术人员 理解，在搜索总体最小值(global minimums)，而不是局部最小值上，一些最小化 函数比其它好。在最优化过程中，每一标志物的分界区(cutoff region)的定位和 面积可以被允许变化，以提供每个标志物的至少两个自由度(degrees of freedom)。 这样的变量参数在此被称为独立变量。在一种优选的实施方案中，在优化算法的 迭代过程中，每一标志物的加权系数也被允许变化。在各种实施方案中，这些参 数的任何排列可以被用作独立变量。
【00294】除了上面所描述的参数，每一标志物的指向(sense)也可以被用作独立 变量。例如，在许多情形下，可能不知道，通常一些标志物的更高水平是否提示 疾病状态或者非疾病状态。在这样的情形下，使最佳化过程在两侧进行搜索可能 是有用的。实际上，这可以通过几个方法来实现。例如，在一种实施方案中，指 向可以是真正分离的独立变量，通过最佳化过程在阴性和阳性之间跳动。或者， 可以使加权系数为负数而实施指向。
【00295】在此文的教导中，为了简化，通常假设在患有疾病或者带有“正指向 (positive sense)”标志物的患者中，标志物被升高，然而并不总是这种情况，并 且，通常地，特别是在少的单变量标志物的情况中，从单变量分析，不能清楚地 确定，当该标志物和其它组中的标志物联合时，在正指向或者负指向中是否是被 最佳地应用。如果标志物的指向被倒转，那么将明显地倒转那个标志物的指示器 函数。如果指向是未知的，那么搜索引擎可以将其含入作为一个自由度。例如， 在一种实施方案中，指向可以是真正的分离的独立变量，其可以通过最佳化过程 在正和负之间跳越。对于最佳的实施，指向应该从不正确向正确平滑地发生映射， 并且应该存在使该搜索引擎向正确的指向移动的压力。在一种优选的实施方案中， 通过使被分析物的加权系数变为负数，指向被转变。如果选择了错误的指向，加 权系数将被拉向零，原因是组反应中标志物的加入负面地影响了目标函数。搜索 引擎将能够引导加权系数跨过零到达正确的指向。
【00296】最佳化运算法则也可以带有一定的限制而被提供。例如，形成的ROC 曲线可以被限制，以保证高于一个特定数值的曲线下面积。曲线下面积为0.5的 ROC曲线提示完全随机，而曲线下面积为1.0反映了两组的全然分开。因此，最 小的可接受值，如0.75，可以被用作一个限制，特别是如果目标函数不整合曲线 下面积的时候。其它的限制可以包括对具体标志物的加权系数的限制。另外的限 制可以将所有加权系数的和限制为一个具体的值，如1.0。
【00297】当最小化或者最大化目标函数时，最佳化运算法则的迭代通常变化独立 参数，以满足所述限制。在最佳化过程中，迭代的数目可以被限制。进一步地， 在两个连续的迭代之间目标函数的差异低于预先确定的阈时，最佳化过程可以被 停止，从而提示最佳化运算法则已经获得了局部最小或者最大的区域。
在实践中，由多个标志物对疾病状态进行诊断可能是令人糊涂的。经常地，各个 标志物值可能似乎相互矛盾。在各个标志物不是十分有效的组中，理解它们的意 义是极其困难的。在一种优选的实施方案中，定义了一种函数，其将标志物值组 合为一个标量值，该标量值随着疾病概率的增加而增加。在此方式中，源自多个 标志物的信息可以以可用的形式出现。这个被定义的函数在此被称为组反应(PR)， 是标志物值(M0-n)的函数，被写为PR＝f(M0-n)。组反应可以被加以标度(scaled)， 这样所有的值都在0和1之间。由于检测的有效性可以不依赖于组反应的标度 (scaling)，所以标度可以不影响该方法的结果。然而，迫使组反应在一个指定的 标度范围内，可以去除不需要的冗余，因为差别仅仅在于标度因子的组反应函数 可以实际上代表相同的方案。组反应也可以是几个参数的综合函数，所述参数包 括标志物水平和其它因子，包括，例如，患者的病史、年龄、种族和性别。 在一种优选的实施方案中，每一对象的组反应(PR)被表示为：

其中i是标志物标识，Wi是标志物i的加权系数，Mi是标志物i的标志物值，I是 标志物i的指示器函数，∑是所有候选标志物的总和。加权系数权衡指示器函数并 且允许更重要的或者更特异的标志物对最终的组反应具有更大的影响。指示器函 数将标志物值映射为一个适合标志物的病理的函数形式。指示器函数可以是复杂 的，应该被选择以匹配标志物。这在下面描述的实施方案中将被阐释。对于每一 标志物，指示器函数可以是不同的函数形式。在一个实施例中，指示器函数可以 将标志物值映射为疾病状态的概率。此映射可以不仅仅是标志物值的函数。在此 实施例中，所述的源自每一标志物的指示器可以被加和以确定相对的指示值，其 和患者患有疾病的概率有关。在一种优选的实施方案中，所有加权系数的总和被 限制为一个具体的值，如1.0。在一种优选的实施方案中，指示器函数被限制为0 和1之间的值。在进一步优选的实施方案中，上面的两种限制均被满足，因此， 组反应也被限制为0至1的值。
【00298】因此，最佳化过程可以提供标志物组，包括每一标志物的加权系数和分 界区，其是为了标志物值向指示器的映射。为了开发需要测定更少标志物水平的 更低花费的组，一些标志物可以从组中除去。在这点上，每一标志物在组中的有 效贡献可以被确定，以鉴定标志物的相对重要性。在一种实施方案中，由最佳化 过程得来的加权系数可以被用于确定每一标志物的相对重要性。具有最低系数的 标志物可以被去除。
【00299】为了确定合适的组，其由于实用的原因通常可以意味着10个或者更少 的标志物，必须找到系统地去除不显著有助于总结果的标志物的方法。这通过计 算每一标志物的贡献而完成。完成此任务的方法是从组中去除被分析物，并重新 计算目标函数。目标函数的变化和标志物的贡献相关。而后，可以按照贡献降低 的顺序排列标志物。在加权系数被应用于每一被分析物的实施方案中，被分析物 的权可以被设置为零，以从组中去除被分析物。在加权系数被应用于每一被分析 物的实施方案中，不能简单地应用权数作为贡献。这为什么没有给出正确结果的 例子是，标志物对检测具有零影响(zero impact)的情形。在此情形下，通过搜索 程序被给出的权数可以是任何值，因此其权数可能是最高的。
【00300】在一些情形中，较低的加权系数可以不提示低的重要性。相似地，较高 的加权系数可以不提示高的重要性。例如，如果相关的标志物与诊断无关，最佳 化过程可以给出高的系数。在此情况下，可能没有任何会驱使系数降低的优势。 变化此系数可以不影响目标函数的值。
【00301】在此处描述的方法中，组反应值本身也可以被用作标志物。例如，组可 以由多个标志物来构建，并且组的每一标志物可以通过被应用于该标志物的函数 和权重因数来描述(如由上面所描述的方法确定的)。对于要被检测的样品，每一 单独的标志物水平被确定，并且该水平被应用于预先确定的用于该特定标志物的 函数和权重因数，以获得该标志物的样品值(sample value)。每一标志物的样品值 被相加在一起，以得到被检测的特定样品的组反应。对于“患病的”和“非患病 的”组，得到的组反应都可以被视为，如同它们仅是另一疾病标志物的水平。
【00302】可以应用这样的方法来定义基于组反应的新的“标志物”，甚至可以确 定“组反应的组反应”，例如，可以如下地划分ACS对象和非ACS对象：(1)ACS +不利后果；(2)ACS-不利后果；(3)正常。如上所描述，可以限定由多个标 志物构成的第一个组，并且获得所有对象的这第一个组的组反应。然后，可以将 这三群中的任何一群中的成员与这些群中任何其它群的成员的组反应相比较，以 定义函数和权重因数，所述的函数和权重因数基于组反应，可以最佳地区分这两 群。这可以被重复，所有三个群作配对比较。用于定义第二个组的“标志物”可 以包括下列中任何或者全部作为新的“标志物”：(1)比(2)作为标志物1；(1) 比(3)作为标志物2；(2)比(3)作为标志物3。
【00303】如在Fischer et al.Intensive Care Med.29：1043-51，2003；Zhou et al。 Statistical Methods in Diagnostic Medicine，John Wiley & Sons，2002；和Motulsky， Intuitive Biostatistics，Oxford University Press，1995；以及本领域的技术人员熟知的 其它出版物中所描述，检测准确性(test accuracy)的量度可以被得到，并且可以 用于确定给定的标志物或者标志物组的有效性。这些量度包括灵敏度和特异性、 预测值(predictive values)、似然比(likelihood ratio)、诊断优势比(diagnostic odds ratios)、危险性比(hazard ratios)和ROC曲线面积。如上面所描述，合适的检测 可以具有这些各种量度的下列结果中的一个或者多个：
【00304】大于大约0.5的ROC曲线面积，更优选地，大于大约0.7，进一步更优 选地，大于大约0.8，甚至更优选地，大于大约0.85，最优选地，大于大约0.9；
【00305】至少大约1.1或更多或者大约0.91或更少的阳性似然比或者阴性似然 比，更优选地，至少大约1.25或更多或者大约0.8或更少，进一步更优选地，至 少大约1.5或更多或者大约0.67或更少，甚至更优选地，至少大约2或更多或者 大约0.5或更少，最优选地，至少大约2.5或更多或者大约0.4或更少；
【00306】至少大约2或更多或者大约0.5或更少的优势比，更优选地，至少大约 3或更多或者大约0.33或更少，进一步更优选地，至少大约4或更多或者大约0.25 或更少，甚至更优选地，至少大约5或更多或者大约0.2或更少，最优选地，至少 大约10或更多或者大约0.1或更少；和/或
【00307】至少大约1.1或更多或者大约0.91或更少的危险性比，更优选地，至少 大约1.25或更多或者大约0.8或更少，进一步更优选地，至少大约1.5或更多或者 大约0.67或更少，甚至更优选地，至少大约2或更多或者大约0.5或更少，最优 选地，至少大约2.5或更多或者大约0.4或更少。
【00308】诊断准确性的量度，如上面所描述的那些，常常和可信区间或者p值共 同被报道。这些可以通过本领域中熟知的方法来计算。参见，例如，Dowdy and Wearden，Statistics for Research，John Wiley & Sons，New York，1983。本发明的优选 的可信区间是90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选 的p值是0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
【00309】 检验测定策略
【00310】用于当前发明的标志物的检测和分析的许多方法和设备，对于技术人员 是熟知的。至于病人检测样品中的多肽或者蛋白质，免疫分析设备和方法常常被 应用。参见，例如，美国专利6,143,576、6,113,855、6,019,944、5,985,579、5,947,124、 5,939,272、5,922,615、5,885,527、5,851,776、5,824,799、5,679,526、5,525,524和 5,480,792号，其中的每一个以其整体在此并入作为参考，包括所有的表、图和权 利要求。这些设备和方法可以在各种夹心、竞争、或者非竞争分析形式中应用标 记的分子，以产生与感兴趣的被分析物的存在或者含量相关的信号。另外地，一 些方法和设备，如生物传感器和光学免疫分析，可以被应用以确定被分析物的存 在或者含量，而不需要标记分子。参见，例如，美国专利5,631,171号；和5,955,377 号，其中的每一个以其整体在此并入，作为参考，包括所有的表、图和权利要求。 本领域的技术人员也认识到，包括但不限于Beckman Access，AbbottAxSym，Roche ElecSys，Dade Behring Stratus systems的自动设备，包含在能够进行此处教导的免 疫分析的免疫分析仪器中。
【00311】优选地，标志物应用免疫分析被分析，尽管对于本领域的技术人员，其 它的方法是熟知的(例如，标志物RNA水平的测定)。标志物的存在或者含量通 常应用特异于每一标志物的抗体和检测特异性的结合来确定。可以应用任意合适 的免疫分析方法，例如，酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIAs)、竞争 性结合分析，和类似方法。抗体对标志物的特异的免疫结合可以被直接地或者间 接地检测到。直接的标记包括结合于抗体的荧光标签或者发光标签、金属、染料、 放射性核素和类似物质。间接的标记包括本领域中熟知的各种酶，如碱性磷酸酶、 辣根过氧化物酶和类似物质。
【00312】特异于标志物的固定化抗体也被预期在本发明中。抗体可以被固定在各 种固相支持物上，如磁基质颗粒或者层析基质颗粒、分析场所(如微量滴定孔) 的表面、固相基材物质或者膜(如塑料，尼龙、纸)，和类似物质。通过在固相支 持物上包被抗体或者多个抗体成为阵列，试验条(assay trip)可以被制备出来。然 后，此试验条可以被蘸入检测样品，然后通过清洗和检测步骤被快速处理，以产 生可测定的信号，如有色的点。
【00313】对多个标志物的分析可以被独立进行，或者在一个样品中同时进行。对 于标志物的独立的或者连续的分析，合适的设备包括临床实验分析仪如ElecSys (Roche)，the AxSym(Abbott)，the Access(Beckman)，the ADVIACENTAUR (Bayer)免疫分析系统，the NICHOLS ADVANTAGES(Nichols Institute)免疫 分析系统等等，优选的设备或者蛋白芯片在单一的表面上对多个标志物进行同时 检验。特别有用的物理形式包括具有多个不连续的可寻址位置的表面，用于多个 不同的被分析物的检测。这种形式包括蛋白微阵列、或者“蛋白质芯片”(参见， 例如，Ng and Ilag，J.Cell Mol.Med.6：329-340(2002))和一些毛细管装置(参见， 例如，美国专利6,019,944号)。在这些实施方案中，每一不连续的表面位置可以 含有抗体，以固定一个或者多个被分析物(例如，标志物)，从而在每一位置进行 检测。表面可以选择性地含有一个或者多个不连续的颗粒(例如，微颗粒或者纳 米颗粒)，其定位在表面的不连续位置上，其中，微颗粒含有抗体以固定分析物(例 如，标志物)，从而进行检测。
【00314】为了对多份样品进行有效率的处理，儿个标志物可以被合并入一个试验 中。此外，本领域的技术人员将认识到，对来自相同的个体的多份样品进行检测 (例如，在连续的时间点)的价值。这样的系列样品的检测将允许鉴定出标志物 水平随时间的变化。标志物水平的增加或者降低，以及标志物水平变化的存在， 将提供有关疾病状态的有用信息，包括但不限于，确定事件发生的大致时间、可 抢救的组织的存在或者含量、药物治疗的正确性、由再灌注或者症状的解决所提 示的各种治疗的有效性、各种类型的ACS的区分、对事件严重程度的鉴定、对疾 病严重程度的鉴定，以及对患者的后果的鉴定，包括未来事件的风险的鉴定。
【00315】由上面提及的标志物组成的组可以被构建，以提供有关区分性诊断和/ 或预后的相关信息。这样的组可以应用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、 8个、9个、10个、15个、20个或者更多的或单独的标志物来构建。对单个标志 物或者包括更大的一组标志物的标志物亚群的分析，可以由本领域的技术人员施 行，以最优化在各种临床环境中的灵敏度和特异性。这些包括但不限于流动、急 救、重症监护、加强监护、监护系统、住院病人、门诊病人、医生办公室、医疗 诊所和健康普查环境。而且，本领域的技术人员可以应用单个标志物或者含有更 大的一组标志物的标志物亚群，与对前述环境的每一个中的诊断阈的调整相结合， 以最优化灵敏度和特异性。检验的临床灵敏度被定义为该检验正确预测的那些患 有疾病的人群的百分率，检验的特异性被定义为该检验正确预测的不患有疾病的 人群的百分率(Tietz Textbook of Clinical Chemistry，2nd edition，Carl Burtis and Edward Ashwood eds.，W.B.Saunders and Company，p.496)。
【00316】对标志物的分析也可以以各种物理形式被进行。例如，应用微量滴定板 或者自动化操作可以协助对大量检测样品的处理。或者，单样品形式可以被开发， 以协助以及时的方式进行即刻的治疗和诊断，例如，在流动运送或者急诊室环境 中。
【00317】在另一种实施方案中，本发明提供了用于标志物分析的试剂盒。这样的 试剂盒优选地含有用于至少一个检测样品的分析的装置和试剂，和用于进行分析 的说明书。任选地，试剂盒可以含有利用由免疫分析获得的信息的一个或者多个 方法，所述免疫分析是对标志物组施行的，以纳入或者排除某些诊断。
【00318】 抗体的选择
【00319】抗原的生成和选择可以通过几种方法被完成。例如，一个方法是纯化感 兴趣的多肽或者合成感兴趣的多肽，应用例如，本领域中熟知的固相肽合成方法。 参见，例如，Guide to Protein Purification，Murray P.Deutcher，ed.，Meth.Enzymol.Vol 182(1990)；Solid Phase Peptide Synthesis，Greg B.Fields ed.，Meth.Enzymol.Vol 289 (1997)；Kiso et al.，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)38：1192-99，1990；Mostafavi et al.， Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids1：255-60，1995；Fujiwara et al.，Chem.Phare. Bull.(Tokyo)44：1326-31，1996。然后，可以将选择出的肽注射入，例如，小鼠或者 兔，以生成多克隆抗体或者单克隆抗体，例如，如在Antibodies，A Laboratory Manual， Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)，Cold Spring Harbor，N.Y.中所描述。本领域的技术人员也将理解，模拟抗体的结合片段或者Fab 片段也可以通过各种方法，利用遗传信息制备出来。(Antibody Engineering：A Practical Approach(Borrebaeck，C.，ed.)，1995，Oxford University Press，Oxford；J. Immunol.149，3914-3920(1992))。
【00320】此外，许多出版物已经报道了噬菌体呈现技术的应用，可以产生和筛选 用于结合选择出的靶的多肽库。参见，例如，Cwirla et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6378-82，1990；Devlin et al.，Science 249，404-6，1990，Scott and Smith，Science 249，386-88，1990；and Ladner et al.，美国专利5,571,698。噬菌体呈现方法的基本概 念是在编码将被筛选的多肽的DNA和多肽之间确立物理联系。此物理联系由噬菌 体颗粒提供，其将多肽显示为包装编码多肽的噬菌体基因组的衣壳的一部分。在 多肽和它们的遗传物质之间的物理联系的确立，允许对携带不同多肽的非常大量 的噬菌体同时进行大规模筛选。呈现出对靶具有亲和性的多肽的噬菌体，结合在 靶上，这些噬菌体通过靶的亲和筛选被富集。这些噬菌体所呈现的多肽的身份， 可以从它们各自的基因组来确定。应用这些方法，确定为对希望的靶具有结合亲 和性的多肽，就可以用传统的方法被大量合成。参见，例如，美国专利6,057,098， 其以整体在此并入作为参考，包括所有的表、图和权利要求。
【00321】通过应用感兴趣的纯化多肽对亲和性和特异性进行第一轮筛选，由这些 方法生成的抗体可以被再加以选择，并且，如果需要，可以将该结果与抗体同希 望不结合的多肽的亲和性和特异性相比较。筛选方法可以涉及，在微量滴定板的 各个孔中将纯化的多肽固定化。然后，将含有潜在的抗体或者抗体组的溶液放入 各个微量滴定孔中并且温育大约30分钟至2小时。然后，清洗微量滴定孔并且将 标记的二抗(例如，连接于碱性磷酸酶的抗小鼠抗体，如果被培育出的抗体是小 鼠抗体)加入孔中，并温育大约30分钟，然后清洗。将底物加入孔中，显色反应 将在存在固定化多肽(或多个多肽)的抗体的位置出现。
【00322】然后，可以在所选择的检验设计中，进一步分析这样鉴定出的抗体的亲 和性和特异性。在针对靶蛋白的免疫分析的开发中，纯化的靶蛋白作为判断免疫 分析的灵敏度和特异性的标准，所述免疫分析应用已被选出的抗体。由于各种抗 体的结合亲和性可以不同，某些抗体对(例如，在夹心试验中)可以在空间上互 相干扰，等等，与抗体的绝对亲和性和特异性相比，抗体的分析性能可能是更重 要的量度。
【00323】本领域的技术人员将认识到，在生产抗体或者结合片段，以及就对各种 多肽的亲和性和特异性进行筛选和选择时，可以采用许多方法，但是这些方法不 改变本发明的范围。
【00324】 选择治疗方案
【00325】针对各种类型的血管疾病的恰当的治疗方法可能是大量的和多种的。然 而，一旦一个诊断被获得，医生可以容易地选择一种和该诊断匹配的治疗方案。 因此，本发明提供了早期区分性诊断的方法，以允许在急性时间区(acute time windows)内进行恰当的干预。技术人员明白对被讨论的大量疾病的正确治疗，它 们与此处描述的诊断方法有关。参见，例如，Merck Manual of Diagnosis and Therapy， 17th Ed.Merck Research Laboratories，Whitehouse Station，NJ，1999。
【00326】下面提供了对另外的代表性标志物的简短的讨论，它们用于通过此处描 述的方法来确定合适的标志物组。
【00327】 实施例
【00328】下面的实施例是为了阐释本发明。这些实施例决不是意图为限制本发明 的范围。
【00329】 实施例1，血液取样
【00330】由训练过的研究人员应用EDTA作为抗凝剂，离心大于或者等于1小时， 获得血液样本。血浆成分被转移至无菌冷冻管中，在-20℃或者更冷地冷冻。收集 源自下列患者群和正常健康供体群的样本(表1)。每一个患者的临床病史是可以 得到的，以协助试验数据的统计学分析。
【00331】 实施例2，生物化学分析
【00332】应用标准的免疫分析技术，测定标志物。这些技术涉及应用抗体特异性 地结合蛋白靶。应用N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHS-生物素)，以大约每个抗体5 个NHS-生物素部分的比例，将直接抗所选择的标志物的单克隆抗体生物素化。然 后，将抗体-生物素连接物加入标准的抗生物素蛋白384孔微量滴定板的孔中，并 且将不结合于板的抗体连接物去除。这便在微量滴定板中形成了“抗-标志物”。应 用琥珀酰亚胺-4-[N-甲基马来酰亚胺]环己烷-1-碳酸酯(SMCC)和3-[2-吡啶二巯 基]丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(Pierce，Rockford，IL)，将直接抗同样标志物的 另一个单克隆抗体连接于碱性磷酸酶。
【00333】在工作站TECAN Genesis RSP 200/8 Workstation上进行免疫分析。将生 物素化的抗体吸入预先用抗生物素蛋白包被的微量滴定板孔，温育60分钟。将含 有未结合抗体的溶液去除，用洗涤缓冲液清洗板，缓冲液由含有150mM NaCl、0. 1％叠氮钠和0.02％吐温-20的20mM硼酸盐(pH 7.42)组成。将血浆样品(10μl) 吸入微量滴定板孔，温育60分钟。然后将样品去除并且用洗涤缓冲液清洗孔。而 后，将抗体-碱性磷酸酶连接物加入孔，再温育60分钟，此后，将抗体连接物去除 并用洗涤缓冲液清洗孔。将底物(AttoPhost，Promega，Madison，WI)加入孔，荧 光产物形成的速度与患者样品中标志物的浓度有关。
【00334】 实施例3，呼吸困难分析
【00335】下面的表比较了在表现临床呼吸困难的个别患者和正常个体中，肺表面 活性蛋白D(“SP-D”)、D-二聚体、BNP、总心脏肌钙蛋白I(“TnI”)的水平，以 及BNP：D-二聚体的比(“比值”)。呼吸困难的患者被细分为接受充血性心力衰竭 临床诊断的患者(“CFH”)，和接受肺梗塞临床诊断的那些患者(“PE”)。除了BNP (pg/ml)和比值，所有的单位是ng/ml。
                         多中心(Multi-Center)CHF患者     患者ID      SP-D    D-二聚体      BNP     TnI      比值     16      35.4     88      889     2.1      10.1     012      8.7     113      1228     2.2      10.9     003      6.9     62      552     0.0      8.9     11      11.7     160      987     0.5      6.2     010      13.3     145      466     0.0      3.2     18      7.9     39      330     0.0      8.6     131-2      7.2     125      1031     0.0      8.3     125-1      3.7     49      314     0.0      6.4     115      8.1     203      185     0.0      0.9     128-1      7.5     141      228     0.0      1.6     143-1      5.1     169      402     0.0      2.4     134-1      1.9     142      251     0.0      1.8     138-1      2.4     40      521     0.0      13.0     157-1      4.1     107      231     0.0      2.2     176-1      2.6     70      234     0.0      3.4     175-1      4.6     154      498     0.0      3.2     22      6.7     36      650     0.0      18.3     21      3.9     149      453     0.0      3.0     23      11.5     147      1024     0.0      7.0     103-2      3.3     70      640     0.0      9.2     20      2.9     78      858     0.0      11.0     148-2      6.2     79      1614     0.0      20.4     173-2      2.7     68      236     0.0      3.5     166-1      5.5     53      681     0.0      12.9     178-1      4.3     89      250     0.0      2.8     183-2      9.3     109      1199     0.0      11.0     189-2      2.2     270      335     0.0      1.2     42      3.5     143      846     0.0      5.9     43      4.2     63      287     0.0      4.5     54      3.5     51      302     0.0      5.9     25      4.6     61      768     0.0      12.5     53      4.5     77      1813     0.0      23.5     59      20.8     77      288     0.0      3.7     55      2.4     53      237     0.0      4.5     158-1      2.3     53      1030     0.0      19.6     均数      6.7     100.9      624.5     0.1      7.8     中位数      4.6     79.3      498.0     0.0      6.2     标准差      6.3     53.1      415.8     0.5      5.9
                               患有PE的多中心患者     患者ID      SP-D   D-二聚体     BNP     TnI     比值     81      4.9   145     314.7     0.0     2.2     110      4.3   87     24.3     0.0     0.3     112      6.9   105     15.9     0.0     0.2     119      10.1   104     175.7     0.0     1.7     142      7.0   106     6.2     0.0     0.1     196      8.2   127     5.0     0.1     0.0     801-2      5.2   113     19.7     0.0     0.2     377-2      1.4   97     57.2     0.0     0.6     008264      1.3   258     121.3     0.0     0.5     008557      17.5   126     51.3     0.0     0.4     010647      3.8   106     355.3     0.0     3.4     10640      0.7   43     9.2     0.0     0.2     7329      3.4   191     287.3     0.0     1.5     008605      6.0   82     733.5     0.0     9.0     均数      5.8   120.7     155.5     0.0     1.4     中位数      5.0   105.7     54.3     0.0     0.4     标准差      4.3   51.7     207.6     0.0     2.4
                                    正常对象     患者ID     SP-D   D-二聚体     BNP     TnI     比值     001511     5.1   90     20.4     0.0     0.2     001515     1.9   36     8.9     0.0     0.2     001520     1.0   61     6.5     0.0     0.1     001521     4.6   72     3.8     0.0     0.1     001524     2.3   69     11.1     0.0     0.2     001607     3.6   72     23.4     0.0     0.3     001610     1.1   52     18.3     0.0     0.4     001613     0.2   40     0.0     0.0     0.0     001616     2.6   28     0.0     0.0     0.0     001619     0.3   44     0.0     0.0     0.0     001622     1.4   25     0.0     0.0     0.0     001625     4.6   142     0.0     0.0     0.0     001628     1.6   40     0.0     0.0     0.0     001631     4.6   57     0.0     0.0     0.0     001634     7.2   60     6.6     0.0     0.1     001637     5.5   55     0.0     0.0     0.0     001640     0.0   260     19.1     0.0     0.1     001643     2.5   50     7.7     0.0     0.2     001646     0.0   56     4.7     0.0     0.1     002202     1.0   59     27.4     0.0     0.5     002205     1.7   39     23.4     0.0     0.6     002208     1.1   25     25.9     0.0     1.0
                                   正常对象   患者ID     SP-D     D-二聚体     BNP     TnI     比值   002211     0.9     55     45.9     0.0     0.8   002214     0.0     97     23.4     0.0     0.2   002217     2.8     117     15.3     0.0     0.1   002220     0.3     55     11.3     0.0     0.2   002223     2.5     47     8.1     0.0     0.2   002228     2.2     44     24.3     0.0     0.5   002229     2.6     61     11.2     0.0     0.2   002232     0.7     69     10.5     0.0     0.2   002235     0.0     54     4.0     0.0     0.1   002238     1.5     53     9.6     0.0     0.2   002241     7.5     16     10.8     0.0     0.7   002244     8.6     44     10.7     0.0     0.2   002247     3.7     68     33.1     0.0     0.5   均数     2.5     63.3     12.2     0.0     0.2   中位数     1.9     55.0     10.5     0.0     0.2   标准差     2.3     42.3     11.1     0.0     0.3
【00336】这些数据提示，被诊断为肺栓塞患者的D-二聚体中位数水平高于CHF 患者，CHF患者本身高于正常对象。相比于正常对象，两个疾病组的肺表面活性 蛋白D水平似乎均被升高，较正常所高出的程度几乎相同。应用＜82μg/ml D-二聚 体作为对肺栓塞诊断的排除分界，将导致一个假阴性诊断，并且会正确地排除35 个CHF患者中的18个和35个正常患者中的30个。对于此患者群体，应用＞3.4 的D-二聚体/BNP作为排除分界会导致一个假阴性结果，但是会正确地排除35个 CHF患者中的25个。所有患病和正常对象中的低心脏肌钙蛋白I水平正确地排除 了整个受测群体中心肌梗塞的发生。此实施例说明，对呼吸困难原因的区分性诊 断可以通过D-二聚体、BNP和心脏肌钙蛋白的测定得以完成。另外地，当BNP、 D-二聚体和肺表面活性蛋白D水平被升高到正常水平以上并且肌钙蛋白水平正常 时，可以将肺栓塞纳入。当D-二聚体水平在正常范围时，可以将肺栓塞排除。当 BNP水平高于正常时，可以纳入充血性心力衰竭。当心脏肌钙蛋白水平高于正常 时，心脏缺血或者心脏坏死可以被纳入。
【00337】 实施例4，心脏舒张功能障碍的鉴定
【00338】下面的表比较了心脏疾病患者和正常对象中BNP、血管加压素、内皮素 -2、降钙素基因相关肽、尿紧张素2、ANP、血管紧张素II的水平、BNP∶CGRP的 比值、BNP∶ANP的比值、BNP∶尿紧张素2的比值，和降钙素。根据美国心脏协会 对功能容量(functional capacity)和客观评价(objective assessment)的分类，心 脏疾病患者被细分。参见，Nomenclature and Criteria for Diagnosis of Diseases of the Heart and Great Vessels.9th ed.Boston，Mass：Little，Brown & Co；1994，pp.253-256。
分类如下形成：
类别   功能容量                           客观评价
NYHA1  患有心脏疾病但是不导致体力活动受    没有心血管疾病的客观
       限的患者。普通的体力活动不引起过度  迹象
       疲劳、心悸、呼吸困难或者心绞痛疼痛。
NYHA2  患有导致体力活动轻微受限的心脏疾    轻度的心血管疾病的客
       病的患者。普通的体力活动引起疲劳、  观迹象
       心悸、呼吸困难或者心绞痛疼痛。
NYHA3  患有导致体力活动明显受限的心脏疾    中度严重的心血管疾病
       病的患者。少于普通的活动便引起疲    的客观迹象
       劳、心悸、呼吸困难或者心绞痛疼痛。
NYHA4  患有心脏疾病的患者，任何体力活动均  严重的心血管疾病的客
       引起不适。甚至在休息时，都可能存在  观证据
       心力衰竭症状或者心绞痛综合症的症
       状。如果进行任何体力活动，不适感便
       增加。
【00339】DD指示了临床诊断为患有心脏舒张功能障碍的患者，并且显示出＞50％ 的射血分数。低射血分数(EF)患者是那些显示出＜50％的射血分数的患者，以 及认为显示了收缩功能障碍而不是舒张功能障碍的NYHA4类患者。除了BNP (pg/ml)和比值，所有的单位是ng/ml，N是每组中对象的数目。
         BNP       血管加压素  内皮素2   CGRP      BNP/CGRP      降钙素
 正常    0         0.98        3.60      0.94      0             0.14
 DD      142       1.13        4.63      1.06      247           0.20
 NYHA1
 DD      152       0.89        3.70      0.77      289           0.19
 NYHA2
 DD      325       0.84        3.72      1.02      309           0.16
 DYHA3
 DD      600       0.99        4.38      0.66      853           0.17
 NYHA4
 DD所有  262       0.89        3.91      0.77      366           0.19
 低EF    839       1.10        4.38      0.97      957           0.19
        尿紧张素2  BNP/U2      ANP       BNP/ANP   血管紧张素2   N
 正常   14.6       0           1.84      0         0.09          20
 DD     18.9       11          2.11      162       0.09          2
 NYHA1
 DD     18.4       9           1.48      113       0.08          6
 NYHA2
 DD     18.8       16          1.95      149       0.09          6
 DYHA3
 DD     19.8       30          1.07      297       0.06          6
 NYHA4
 DD所有 19.0       14          1.50      177       0.08
 低EF   28.0       41          2.17      413       0.07          20
【00340】这些数据提示，尿紧张素-2和ANP可以区分舒张功能障碍和收缩功能 障碍。在两种情形下，收缩功能障碍中的水平均高于舒张功能障碍中的水平。而 且，随着BNP的加入，将收缩功能障碍与舒张功能障碍区分开的能力增加，原因 是BNP和ANP的升高似乎提示了收缩功能障碍，而BNP升高、ANP处于正常水 平或者低于正常水平似乎提示了舒张功能障碍。尿紧张素-2显示了相似的型式。 当表示为与BNP的比值时，CGRP有助于将收缩功能障碍与舒张功能障碍区分开 的能力，其中，相对于舒张功能障碍，在收缩功能障碍情形下的比值较大。
【00341】Hammer-Lercher讨论了在对照组和患有舒张功能障碍的患者中，NT-前 BNP水平的显著性，或者显著性的缺乏(Hammer-Lercher et al.，Clin.Chim.Acta 310(2)：193-7(2001))。在一种优选的实施方案中，由BNP和NT-前BNP组成的组 可以区分带有舒张功能障碍的心力衰竭患者。当NT-前BNP和BNP均被升高至高 于分界时，患者有收缩功能障碍。当NT-前BNP不升高，但是BNP升高至高于分 界时，这将意味着患者患有舒张功能障碍。
【00342】 实施例5，用于心脏区分性诊断的标志物组
【00343】为了开发用于诊断和/或区分充血性心力衰竭、急性冠脉综合症和心肌梗 塞，以及用于针对检验分析结果而指导治疗的组，含有有关血压调节的一个标志 物和有关心脏损伤的多个标志物的代表性标志物组先被选出。为了此目的，BNP、 心脏肌钙蛋白I(游离的和复合的)、肌酸激酶-MB和肌红蛋白被选出。在本实施 例中，应用CKMB正常值的上限(4.3ng/ml)、肌红蛋白正常值的上限(107ng/ml) 和肌钙蛋白I正常值的上限(0.4ng/ml)，确立用于比较测定的标志物浓度的阈水平。 伴随至少20分钟的胸痛，这三种标志物的升高和/或随时间的变化，高度地提示了 心肌梗塞。此外，超过80pg/ml BNP的BNP浓度可以提供这些患者的其它风险分 级，原因是和具有低于此阈值的BNP水平的患者相比，BNP的这种水平与死亡、 心肌梗塞和充血性心力衰竭的增加的机率有关。而且，甚至在没有经历疾病临床 症状的对象中，超过100pg/ml BNP的BNP水平与充血性心力衰竭的实质上更高 的发生率也是有关的。因此，与单独的标志物相比，此多标志物策略可以提供实 质上更加临床相关的信息。
【00344】向多标志物组加入其它标志物，可以为风险分级和区分性诊断提供另外 的临床信息。例如，可以将D-二聚体加入该组，作为凝血和止血的标志物。尽管 事实是，对象可以以基本上相似的症状出现在医生面前，但如上面所讨论，D-二 聚体的加入可以允许从心肌梗塞和充血性心力衰竭中区分出肺栓塞和/或深静脉血 栓。在此情形下，大约1μg/ml的阈水平可以被确立。除了D-二聚体、C-反应蛋白 之外，或者作为它们的替代，炎症的相对非特异的指示物，可以提供给组另外的 风险分级。尽管此处没有呈现出数据，CK-BB和肌红蛋白也可以用于区分ST-升 高和非ST-升高ACS。
【00345】随着组中标志物数量的增加，根据在此描述的方法，单个组反应(single panel response)以及它与各种疾病状态关联性的确定，可以是有益的。这样的组的 例子可以包括心脏损伤的特异性标志物(例如，心脏肌钙蛋白I和/或T(游离的 和复合的)、肌酸激酶-MB，等)和组织损伤的非特异性标志物(例如，肌红蛋白)， 其中没有一种标志物是与预先确定的阈相比较。以大量潜在的标志物起始，应用 迭代方法。在此方法中，标志物的个别的阈浓度本身不用作分界。相反地，介于 最小标志物浓度和最大标志物浓度之间的检测值的“窗”被确定。高于该最大值 的测定到的标志物浓度被指定为值1，低于该最小值的测定到的标志物浓度被指定 为值0；在窗内的测定到的标志物浓度线性地插入0和1之间的值。然后，用权重 因数乘以对给定的标志物浓度所赋予的值。用于组中的所有的各个标志物的权数 的绝对值合计至1。标志物的负权数意味着对照组的检测值高于疾病组的检测值。 “组反应”通过将组中每一标志物的经加权的值相加而被计算出来。“患病组”和 “对照组”的整个群体的组反应进行ROC分析，组反应阈被选出以获得所希望的 组灵敏度和特异性。在每轮迭代之后，可以将对等式最微弱的贡献者去除，用数 量减少的标志物再次开始迭代过程。
【00346】下面的组表示了这样的标志物组，它们被鉴定出以便能够区分患有急性 心肌梗塞(标记为“患病组”)的对象和“对照”对象。组1显示了临床表现(clinical presentation)时“第一次抽血”获得的结果，而组2-4分别代表了60分钟、90分 钟和180分钟抽血得到的结果。单独地应用心脏肌钙蛋白的“黄金标准(gold standard)”，首次、60分钟、90分钟和180分钟抽血分别提供了25.9％、28.7％、 55.6％和100％的特异性，灵敏度为92.5％。     组#     1    2   3   4     组中的标志物     cTnI，     CK-MB，     肌红蛋白    cTnI，    CK-MB，    肌红蛋白   cTnI，   CK-MB，   肌红蛋白   cTnI，   CK-MB，   肌红蛋白     对照组n     474    184   186   74     疾病组n     67    46   50   48     平均ROC面积     0.939    0.984   0.992   0.980     SD(％)     0.008    0.002   0.001   0.098     平均灵敏度@     92.5％特异性     81.6％    95.0％   97.6％   96.9％     SD(％)     2.1    1.1   0.80   9.80     平均特异性@     92.5％灵敏度     76.9    93.3   96.5％   99.0％     SD(％)     2.6    0.6   0.60   10.00
【00347】与单独从心脏肌钙蛋白I获得的结果比较，上面描述的组在早期时间点 提供了改善的特异性。在这些时间点，肌红蛋白和CK-MB以增加的权重被包括。 不令人惊讶地，在最后的时间点(在该处，单独的心脏肌钙蛋白I达到100％的特 异性)，心脏肌钙蛋白I控制了组反应。另外的组可以含有如此处描述的其它标志 物，具体地包括有关血压调节的标志物(例如，BNP)、有关凝血和止血的标志物 (例如，D-二聚体、TpP)、有关凋亡的标志物(例如，caspase-3、细胞色素c)、 有关炎症的标志物(例如，MMP-9、CRP、髓过氧化物酶、IL-1ra、MCP-1)。此 外，前述标志物中的一个或者多个随时间的变化可以作为这样的组中的另外标志 物被优选地包含。
【00348】应用相同的方法学，为了区分急性心肌梗塞和相似的状态如非心脏性胸 痛和不稳定性心绞痛，相似的标志物组可以被限定。下面的表比较了从患有这些 相似状态的对象中获得的样品，和从患有急性心肌梗塞的对象在出现(presentation) 的10小时之内获得的样品。
  组#  1  2  3   组中的标志物  cTnI，CK-MB，肌  红蛋白，BNP  cTnI，CK-MB，肌  红蛋白，BNP  cTnI，CK-MB，肌  红蛋白.BNP  “对照组”对象  非心脏性胸痛 不稳定性心绞痛  非心脏性胸痛   对照组n  210  210  210  “疾病组”对象  急性心肌梗塞  急性心肌梗塞  不稳定性心绞痛   疾病组n  92  92  210   平均ROC面积  0.984  0.944  0.792   SD(％)  0.002  0.093  0.014   平均灵敏度@   92.5％特异性  97.1％  86.3％  34.6％   SD(％)  0.90  8.7  1.7   平均特异性@   92.5％灵敏度  96.1％  81.7％  49.9％   SD(％)  0.60％  8.4  3.2
【00349】下面的组代表了用于分析检测样品的预后标志物组，所述样品从在30 天内具有不利后果(死亡、急性心肌梗塞、充血性心力衰竭，标记为“疾病组”) 的ACS患者获得，“对照”组代表没有这样后果的ACS患者。根据这些结果，优 势比被计算出来，用以评价每一组预测这样的不利事件的能力。   组#   1   2   3   4   组中的标志物   cTnI，   CRP.BNP   cTnI，CRP，   BNP，CK-MB   cTnI，CRP，BNP，   Caspase-3，   MMP-9   cTnI，CRP，   BNP，MMP-9，   TpP   对照组n   1936   977   1781   1762   疾病组n   104   52   91   92   平均ROC面积   0.679   0.733   0.708   0.733   SD(％)   0.006   0.011   0.013   0.067   平均灵敏度@   92.5％特异性   29.0％   34.5％   30.8％   30.5％   SD(％)   1.70   2.40   2.00   3.80   平均特异性@   92.5％灵敏度   23.5％   37.9％   32.1％   30.2％   SD(％)   2.20   2.00   2.90   4.60   优势比   5.038   6.496   5.489   5.412
组#   5 组中的标志物   CTnI，CRP，BNP，MMP-9，   肌红蛋白，MCP-1，TpP 对照组n   1710 疾病组n   90 平均ROC面积   0.715 SD(％)   0.012 平均灵敏度@92.5％特异性   37.7％ SD(％)   2.60 平均特异性@92.5％灵敏度   33.4％ SD(％)   3.10 优势比   7.463
【00350】下面的组将180天内的死亡单独地考虑为不利事件。 组#  1   2   3   4 组中的标志物  cTnI，CRP，  BNP   肌红蛋白，   CRP，BNP   BNP，肌红   蛋白   CRP，BNP 对照组n  768   768   776   768 疾病组n  63   63   63   63 平均ROC面积  0.801   0.804   0.803   0.799 SD(％)  0.011   0.006   0.004   0.005 平均灵敏度@ 92.5％特异性  42.1％   42.7％   44.0％   42.6％ SD(％)  2.80％   2.20％   2.30％   1.10％ 平均特异性@ 92.5％灵敏度  51.4％   51.5％   51.1％   46.3％ SD(％)  3.00％   2.30％   3.20％   2.80％ 优势比  9.0   9.2   9.7   9.2
  组#   5   6  7  8   组中的标志物   单独的   BNP   BNP，cTnI，   CK-MB，CRP，   肌红蛋白  肌红蛋白，  cTnI，BNP，  CK-MB  CK-MB，  cTnI，BNP，  CRP   对照组n   776   768  776  768   疾病组n   63   63  63  63   平均ROC面积   0.799   0.802  0.801  0.796   SD(％)   0.001   0.020  0.009  0.015   平均灵敏度@   92.5％特异性   42.9％   42.4％  45.0％  41.7％   SD(％)   0.10％   3.40％  4.00％  3.70％   平均特异性@   92.5％灵敏度   38.8％   54.3％  54.3％  53.4％   SD(％)   0.10％   4.60％  3.40％  4.40％   优势比   9.3   9.1  10.1  8.8   组#   9   组中的标志物   CRP，CK-MB，肌   红蛋白，cTnI   对照组n   768   疾病组n   63   平均ROC面积   0.701   SD(％)   0.034   平均灵敏度@92.5％   特异性   32.7％   SD(％)   3.90％   平均特异性@92.5％   灵敏度   34.8％   SD(％)   6.80％   优势比   6.0
【00351】下面的组分别将90、180、365和740天内的死亡单独地考虑为不利事 件。
  组#   1   2   3   4   组中的标志物   cTnI，CRP，   BNP，髓过氧   化物酶，肌红   蛋白，CK-MB   cTnI，CRP，   BNP，髓过氧   化物酶，肌红   蛋白，CK-MB   cTnI，CRP，   BNP，髓过氧   化物酶，肌红   蛋白，CK-MB   cTnI，CRP，   BNP，髓过氧   化物酶，肌红   蛋白，CK-MB   对照组n   760   760   760   760   疾病组n   42   60   70   94   平均ROC面积   0.781   0.784   0.792   0.767   SD(％)   0.015   0.080   0.015   0.077   平均灵敏度@   92.5％特异性   37.0％   38.7％   39.3％   34.4％   SD(％)   3.10％   4.90％   3.30％   4.60％   平均特异性@   92.5％灵敏度   57.9％   54.6％   54.0％   50.1％   SD(％)   4.30％   6.70％   3.00％   5.60％   优势比   7.2   7.8   8.0   6.5
【00352】技术人员将理解，另外的标志物可以包含或者替代入前述组。另外的标 志物可以包含标志物的单独浓度，或者可以包含标志物“斜率”(即，标志物经时 间的相对变化)、两种标志物的比，等等。技术人员也会理解，相同的组既可以提 供诊断信息又可以提供预后信息。用于诊断的标志物可以和那些用于预后的标志 物可以相同，或者可以不同，不同之处在于，用于这些目的中的一个的一个或者 多个标志物不可以用于另一目的。
【00353】 实施例6，应用MCP-1诊断亚临床动脉粥样硬化
【00354】MCP-1已被确定为ACS中的独立的风险预测物。参见，例如，de Lemos etal.，Circulation 107：690-95(2003)，其以其整体在此并入作为参考。下面的数据说 明了MCP-1在亚临床动脉粥样硬化的诊断中的用途。基线MCP-1水平在3499个 不显示动脉粥样硬化症状的病人(基于临床表现)中被测定。2733个患者的亚群 被施予电子束计算机体层摄影术(EBCT)扫描。EBCT是使用CT扫描仪测定发 现于心脏动脉中的钙含量的成像方法。亚临床冠状动脉疾病可以通过测定冠状动 脉钙(“cac”)被检测，而不需要手术或者示踪液(tracking fluids)的注射。参见， 例如，Khaleeli et al.，Am.Heart J.141：637-44，2001。
【00355】MCP-1的分布，其在3499个病人中测定得到：   四分位数(Quartile)  N   中位数   1(≤123pg/ml)  875   100.3[83，112]   2(＞123.1-167.9pg/ml)  877   146[134，157]   3(168-226pg/ml)  874   194[180，208]   4(＞226.1pg/ml)  873   285[248，356]
【00356】MCP-1水平和心血管风险因子
MCP-1四分位数   变量   四分位数1   四分位数2   四分位数3   四分位数4  P值   中位数年龄   (年)   40[34，48]   43[36，51]   44[36，52]   47[39，54]  ＜0.001   患有高血压   的患者％   21.04   23.21   25.66   30.09  ＜0.001   患有糖尿病   的患者％   18.16   24.13   26.87   30.85  0.001   总胆固醇   中位数   172   [150，198]   175   [154，201]   180   [156，204]   180   [155，207]  ＜0.001   目前是吸烟   者的患者％   21.52   22.90   27.64   27.94  ＜0.001   患有家族性   hx CAD的患   者％   22.65   24.41   25.11   27.83  0.022   LDL中位数   101[81，124]   102[82，123]   106[84，182]   107[82，129]  0.0188
这些关联存在于所有的3499个患者中。
LDL：各四分位数包括大约875个患者；HTN：1060个患者患有高血压；吸烟： 1013个患者目前是吸烟者；家族hx：1139个患者有家族t/o cad；DM：402个患 者患有DM。
基线变量(baseline variables)和MCP-1水平之间的关联(未显示)也在进行了 EBCT扫描的患者亚群(n＝2733)中进行。
【00357】图2显示了在接受EBCT扫描的2733个患者中，MCP-1和亚临床动脉 粥样硬化的关联。在这些患者中，581个患者有亚临床动脉粥样硬化的迹象，这里 的亚临床动脉粥样硬化被定义为冠脉钙化评分≥10。另外的迹象提示了cac程度(绝 对的)和MCP-1水平(连续的)之间的显著联系。
【00358】多变量分析(排除了年龄)中亚临床动脉粥样硬化(CAC≥10)的相对 风险   变量   优势比  P值   MCP四分位数2   1.339  0.059   MCP四分位数3   1.445  0.016   MCP四分位数4   1.716  ＜0.001   性别   2.548  ＜0.001   糖尿病   2.391  ＜0.001   高血压   3.425  ＜0.001   吸烟   1.781  ＜0.001   总胆固醇   1.521  0.009
【00359】亚临床动脉粥样硬化的多变量模型，通过中间的或者最高的年龄四分位 数来分级(＞＝40岁；n＝1831)   变量   优势比  P值   MCP四分位数2   1.382  0.051   MCP四分位数3   1.501  0.013   MCP四分位数4   1.604  0.003   性别   2.561  ＜0.001   糖尿病   2.164  ＜0.001   高血压   2.424  ＜0.001   吸烟   1.764  ＜0.001   总胆固醇   1.322  0.099   CAD家族史   1.409  0.002
【00360】在急性心肌梗塞的情形下，组(panels)、窗值(window values)和权重 因数(weighting factors)被选出，应用组反应值，优选地提供了在大于90％特异 性时至少80％的灵敏度。
【00361】 实施例7，用于脑血管区分性诊断的标志物组
【00362】在脑血管区分性诊断的情形中，为了开发出用于诊断中风和/或将此处 称为“中风类似(stroke mimics)”的患者与中风区别开的组，含有有关血压调节 的标志物和有关神经组织损伤的多个标志物的标志物组被选出。被检测以增加标 志物组反应的另外种类的标志物包括凋亡的标志物、炎症的标志物和/或急性期反 应物。最终的代表性组被确定，其提供了在大于90％特异性时至少80％的灵敏度。 以许多潜在的标志物起始，迭代方法被应用。在此方法中，标志物的个别的阈浓 度本身不用作分界。相反地，介于最小和最大标志物浓度之间的检验值“窗”被 确定。将高于最大值的被测标志物浓度指定为值1，将低于最小值的被测标志物浓 度指定为值0；窗内的被测标志物浓度线性地插入0和1之间的值。然后，用权重 因子乘以对于指定的标志物浓度所得到的值。在组中所使用的全部的单独标志物 的权数的绝对值总计达1。标志物的负权数意味着，对照组的检验值较患病组的检 验值大。此外，没有一个标志物与预先确定的阈相比较。替代的，通过将组中每 一标志物的加权后的值相加，“组反应”被计算出。“患病组”和“对照组”的整 个群体的组反应接受ROC分析，组反应阈被选出，以产生所希望的组灵敏度和特 异性。在每轮迭代重复之后，对等式贡献最小的标志物被去除，使用数量减少的 标志物重新开始迭代过程。
  组中的标志物  NACM，Caspase-3，IL-8，CK-BB，CRP，S100β，BNP，MMP-9   中风类型  所有的中风   缺血性中风   出血性中风   “对照组”n  49   49   49   “疾病组”n  48   41   7   平均ROC面积  0.927   0.935   0.881   SD  0.018   0.024   0.039   平均灵敏度@   92.5％特异性  85.6％   86.8％   78.7％   SD  6.50％   7.20％   9.60％   平均特异性@   92.5％灵敏度  83.2％   84.4％   39.8％   SD  8.10％   8.90％   27.80％
【00363】此外，对组(panels)的鉴定中风患者神经学缺陷严重程度的能力进行 评价。在这些组中，对照是显示＜5的NIH中风等级(“NIHSS”)评分的对象，而 患病对象显示≥5的NLHSS评分。如下表所显示，当应用上面描述的用于中风的 相同的8个标志物时，仅仅改变组参数(例如，窗的宽度和位置和/或权)，就可以 提供关于神经学缺陷严重程度的重要信息。
                              组(Panel)1                                  组(Panel)2   组中的标志物  NACM，Caspase-3，IL-8，CK-BB，CRP，S100β，BNP，MMP-9   “对照组”n  66   66   “疾病组”n  24   24   平均ROC面积  0.928   0.929   SD  0.021   0.018   平均灵敏度@   92.5％特异性  79.6％   80.2％   SD  12.70％   13.30％   平均特异性@   92.5％灵敏度  86.9％   87.7％   SD  6.80％   6.10％
【00364】有趣的是，MMP-9显示了与神经学缺陷的负相关关系，这提示，虽然相 对于类似患者(mimics)，MMP-9在中风患者中是升高的，但是，相对于带有较不 严重的神经学缺陷的对象，在显示增加的神经学缺陷的中风患者中，MMP-9实际 上是降低的。高的MMP-9可以提示血管再形成的增加，因而可以是中风患者的阳 性预后的标志物。此外，在具有高的MMP-9的患者中，溶栓治疗可以是益处较少 的，原因是血管的再形成提供了病灶的额外的灌注。这样的组可以提供有关神经 缺陷风险的疾病和处理方法的预后信息。这些处理方法包括颈动脉内膜切除术、 低温循环停止、主动脉瓣置换术、二尖瓣置换术、冠状动脉手术、动脉瘤内支架 修复、冠状动脉旁路移植术、喉罩插入和先天性心脏缺陷的修复。
【00365】另外的组可以被提供，其利用了更少的标志物，但敏感性和特异性不丢 失或中度丢失，如下显示：   组#   3   4   5   6   组中的标志物   CRP，BNP，   MMP-9，   CK-BB，   Caspase-3，   IL-8，S-100β   CRP，BNP，   MMP-9，   CK-BB，   Caspase-3，   IL-8   CRP，BNP，   MMP-9，   CK-BB，   Caspase-3   CRP，BNP，   CK-BB，   Caspase-3   对照组n   81   86   86   86   疾病组n   26   27   27   27   平均ROC面积   0.913   0.910   0.895   0.878   SD(％)   0.021   0.019   0.014   0.016   平均灵敏度@   92.5％特异性   74.8％   73.4％   65.3％   61.0％   SD(％)   12.60％   10.50％   7.90％   6.00％   平均特异性@   92.5％灵敏度   83.6％   83.7％   80.9％   76.1％   SD(％)   6.80％   5.50％   5.10％   7.40％
【00366】根据前述的原则被定义的组得以选出，以从年龄匹配的正常对象中鉴别 出遭受(缺血性的或出血性的)中风的对象。这样的组可以被用来在中风类似群 体中鉴别出那些对象，所述群体患有未升高至中风诊断水平的急性缺血。例如， 应用这样的组筛选类似群体(例如，患有TIA、昏厥、外周血管疾病，等等)，可 以鉴定出显示了可被认为是“假阳性”中风诊断的组反应的亚群。此亚群可以遭 受明显的中风样征状，但是由于病灶的位置，他们可能并不显示出可落入中风的 临床诊断的充分的神经学缺陷。根据组反应，与看起来“正常”的类似对象相比， 这样的对象可以从更加积极的治疗中受益。此类似群体在此被称为患有“亚临床 中风”或者“亚临床缺血”，并且此处描述的方法可以被用于这样的亚临床状态的 诊断和/或预后。
【00367】 实施例8，中风的诊断
【00368】包括上面提及的标志物的任何组合的组，可以被构成，以提供有关中风 的诊断和对患有中风和TIAs的患者的处理的相关信息。此外，来自这个更大的组 的标志物子集可以被用于优化中风和该疾病各方面的灵敏度和特异性。此处呈现 的实施例描述了数据的统计学分析，所述数据是由被用作6-标志物组的特异于 BNP、IL-6、S-100β、MMP-9、TAT复合物以及vWF的A1和整联蛋白结构域(vWF A1-整联蛋白)的免疫分析产生的。这些分析所使用的域是BNP 55pg/ml、IL-6是 27pg/ml、S-100β是12pg/ml、MMP-9是200ng/ml、TAT复合物是63ng/ml、vWFA1- 整联蛋白是1200ng/ml。为了确定标志物组在鉴定患有缺血性中风、蛛网膜下出血、 脑内出血、所有出血性中风(颅内出血)、所有中风类型和TIAs的患者中的有效 性，应用这些阈进行了临床灵敏度和特异性的统计学分析。而且，通过临床灵敏 度和特异性的分析，将标志物组的有效性和目前的诊断方法，计算机X线断层摄 影术(CT)扫描相比较。
【00369】计算机X线断层摄影术(CT)扫描常常被用在中风的诊断中。由于成 像是在脑上被进行的，CT扫描对中风是高度特异的。在患有发作不久的出血性中 风的患者中，CT扫描的灵敏度是非常高的。相反，在缺血性中风后的头几个小时， CT扫描的灵敏度是低的，在入院时，患者中的大约1/3具有阴性的CT扫描结果。 而且，在发作后24小时内，50％的患者可能具有阴性的CT扫描结果。此处呈现 的数据表明，对入院时24个患者的CT扫描的灵敏度，与缺血性中风患者仅1/3 具有阳性的CT扫描结果的预期一致。应用6-标志物组，在其中，如果至少两个标 志物升高，患者便被确定为中风阳性，这样可产生79％的灵敏度，几乎比CT扫描 高2.5倍，并具有高的特异性(92％)。将此研究群体中的CT扫描特异性假定为接 近100％。此假设的一个限定是，CT扫描不是从含有正常群体的个体中获得的。 因此，此分析中的CT扫描的特异性是通过考虑可能产生阳性CT扫描结果的其它 疾病或者状态而被计算的。对于患有非中风状况，包括颅内肿瘤、动静脉畸形、 多发性硬化或者脑炎的个体，CT扫描可以是阳性的。这些非中风状况中的每一个 在整个美国人群中有1％的估计发生率。由于可归咎于多发性硬化和脑炎的阳性 CT扫描结果通常可以与中风区分开来，所以中风诊断的CT扫描特异性被认为大 于98％。下面的表中所呈现的数据表明，标志物组的应用可允许对患有缺血性中 风的患者作出早期鉴定，同时具有高的特异性和比CT扫描更好的灵敏度。     灵敏度     特异性     CT扫描     33％     ＞98％     标志物     92％     92％
【00370】针对缺血性中风、蛛网膜下出血、脑内出血、所有出血性中风(颅内出 血)和在发作后各种时间联合的所有中风类型，评价了6-标志物组的灵敏度和特 异性。6-标志物组的特异性被设置为92％，如果两个标志物升高，患者就被归类为 患有该疾病。此外，由BNP、S-100β、MMP-9和vWFA1-整联蛋白组成的4-标志 物组，通过与6-标志物组相同的方式被评价，应用相同的阈水平将特异性设置为 97％。如前面所描述，所述4-标志物组被用作从更大组的标志物中选择标志物子集 以改善对疾病的灵敏度和特异性的模型。表3-7中呈现的数据提示，在所有中风类 型的诊断中，两个组均是有用的，特别是在发作后较早的时间。从发作起的开始 48小时内，4-标志物组比6-标志物组的特异性高，对出血性中风具有同样的灵敏 度。在所有的时间点，6-标志物组与4-标志物组相比，显示出对缺血性中风具有更 高的灵敏度，表明6-标志物组方法对获得高灵敏度是有用的(即，较低的假阴性)， 4-标志物组对获得高特异性是有用的(即，较低的假阳性)。
灵敏度分析—缺血性中风   自症状发作起的   时间(小时)   样品的数目   灵敏度   特异性为92％   灵敏度   特异性为97％   3   6   100   83.3   6   19   100   94.7   12   36   91.7   88.9   24   60   88.3   86.4   48   96   88.5   84.4   全部   175   89.7   84.0
灵敏度分析—蛛网膜下出血   自症状发作起的   时间(小时)   样品的数目   灵敏度   特异性为92％   灵敏度   特异性为97％   3   3   100.0   100.0   6   5   100.0   100.0   12   6   100.0   100.0   24   14   96.3   92.0   48   32   95.2   86.8   全部   283   91.3   83.0
灵敏度分析—脑内出血   自症状发作起的   时间(小时)   样品的数目   灵敏度   特异性为92％   灵敏度   特异性为97％   3   3   100.0   100.0   6   5   100.0   100.0   12   6   100.0   100.0   24   13   96.3   92.0   48   24   89.9   78.3   全部   60   87.2   86.4
灵敏度分析—所有出血性中风   自症状发作起的   时间(小时)   样品的数目   灵敏度   特异性为92％   灵敏度   特异性为97％   3   6   100.0   100.0   6   10   100.0   100.0   12   12   100.0   100.0   24   27   96.3   92.0   48   56   92.9   84.6   全部   343   90.7   83.6
灵敏度分析—所有的中风   自症状发作起的   时间(小时)   样品的数目   灵敏度   特异性为92％   灵敏度   特异性为97％   3   12   100.0   91.7   6   29   100.0   96.6   12   48   93.8   91.7   24   87   90.8   88.5   48   152   90.1   84.2   全部   518   90.4   83.8
【00371】也评价了6-标志物组和4-标志物组鉴定患有短暂性缺血发作(TIAs)的 患者的能力。从本质上说，TIAs是短持续时间的缺血事件，不引起永久的神经学 缺陷。TIAs可以通过标志物局部释放进入血流来表征，该释放会随着事件的解决 而中断。因此，料到标志物组的灵敏度会随时间降低。6-标志物组，具有设置为 92％的特异性，和4-标志物组，具有设置为97％的特异性，在事件的最初24小时 内，均显示了灵敏度的明显降低，如表8所描述。这些降低在表3-7所描述的任何 中风群体中均没有被观察到。数据表明，在连续时间点从患者得到的数据的集合， 可以允许将患有其它中风类型的患者与患有TIAs的患者区分开。患有TIAs的患 者的鉴定是有益的，因为这些患者未来中风的风险是增加的。
灵敏度分析-TIA   自症状发作起的   时间(小时)   样品的数目   灵敏度   特异性为92％   灵敏度   特异性为97％   0-6   9   100.0   88.9   6-12   7   57.1   57.1   12-24   8   37.5   37.5
【00372】 实施例9，在表现出蛛网膜下腔出血的患者中，脑血管痉挛的标志物
【00373】本研究中包括了45名相继的患者，其中38名以动脉瘤蛛网膜下腔出血 (SAH)入院，7名对照患者被确认选择性动脉瘤夹闭(elective aneurysm clipping)。 所有患SAH的患者中，在准许入院时和其后每日通过静脉穿刺获得静脉血样品， 进行连续12天或者直至血管痉挛发作。脑血管痉挛的发展被定义为SAH后4-12 天时局灶性(focal)神经学缺陷的发生或者经颅多普勒超声(TCD)流速＞190cm/s。 在经历选择性动脉瘤夹闭的患者中，在手术后13天的中位数(a median of 13days) 的期间，每个患者的3±1份静脉血样品被获得。将收集的血离心(10,000g)，将得 到的上清液立即地冷冻于-70℃，直至分析被完成。应用免疫测量酶免疫分析，vWF、 VEGF和MMP-9的测定被进行。
【00374】为了确定在前-血管痉挛(pro-vasospasm)人群中观察到的血浆vWF、 VEGF和MMP-9的变化是否是前-临床缺血(pre-clinical ischemia)的结果或者对 脑血管痉挛的发展是特异的，这些标志物也在栓塞性局灶脑缺血或者血栓性局灶 脑缺血的情形中被测定。有症状的局灶性脑缺血发作的24小时内入院的59名连 续的患者，通过静脉穿刺得到单份静脉血栓样品。42位被确认患有有症状的局灶 性脑缺血的患者随后显示了脑梗塞的MRI证据。17位患者没有显示脑梗塞的放射 线学证据，经历了症状的恢复，被归类为短暂性缺血发作，因此不包括在分析中。
【00375】人群被分类为三类，非-血管痉挛(被承认患有SAH并且没有发生脑血 管痉挛的患者)、前-血管痉挛(被承认患有SAH并且随后发生脑血管痉挛的患者)、 和局灶性缺血(被承认患有有症状的局灶性脑缺血的患者，所述的脑缺血随后由 MRI定义为脑梗塞)。血浆vWF、VEGF和MMP-9水平的平均峰值在人群之间通 过双向方差分析模型(two-way ANOVA)来比较。将α误差设置为0.05。当分布 具有峰度、显著的偏斜或者方差显著不同时，用于组间比较的非参数型曼-惠特尼 U统计被应用。用斯皮尔曼等级相关系数评价费希尔分级(Fisher grade)和血浆 标志物之间的关联。用于校正患者的年龄、性别、种族、Hunt和Hess分级以及费 希尔分级的逻辑斯蒂回归(logistic regression)分析被用于计算每个血浆标志物阈 发生血管痉挛的优势比。
【00376】在SAH后1±1天，38位患者入院并且产生了他们的第一份血浆样品。 在这些当中，22位(57％)在SAH后的中间7天(范围为4-11天)发生脑血管痉 挛。18位(47％)发生局灶神经缺陷，4位(10％)仅表现出血管痉挛的TCD证 据。在SAH、非血管痉挛人群中的3位患者是属于费希尔分级1，它们不被包含 在人群间血浆标志物的比较中。非血管痉挛和前血管痉挛人群的患者人口统计、 临床特征和费希尔分级在下面的表中被给出。
38名被确认患有SAH的患者的人口统计、临床表现和X线照相术特征
              SAH，非血管痉挛(n＝16)  SAH，前-血管痉挛(n＝22)
年龄*        56±10岁                 54±13岁
女性          12(75％)                 18(82％)
确认GCS**    14(11-15)                12(9-14)
确认HH**     2(1-3)                   3(2-4)
费希尔分级** 3(2-3)                   3(2-4)
*数值给作为均值±标准差，**数值以中位数(四分位数间范围)给出 GCS，Glasgow昏迷等级HH，Hunt和Hess等级
【00377】在非血管痉挛人群中，血浆vWF平均峰值(p＝0.974)、血浆VEGF平均 峰值(p＝0.357)和血浆MMP-9平均峰值(p＝0.763)相对于对照是不变的(表10)。 与非血管痉挛人群相比，前血管痉挛人群的血浆vWF、VEGF和MMP-9是增加的 (表10)。增加的费希尔分级与更高的血浆vWF(p＜0.05)、VEGF(p＜0.01)和 MMP-9(p＜0.05)相关。
【00378】此外，20名男性和22名女性(年龄：59±15岁)在有症状的局灶性缺 血的24小时内，平均NIH中风程度评分是6.7±6.6。在局灶性缺血人群中，血浆 vWF平均峰值(p＝0.864)、血浆VEGF平均峰值(p＝0.469)和血浆MMP-9平均 峰值(p＝0.623)是不变的，相对于对照(表10)。与局灶性缺血人群相比，前血 管痉挛人群的血浆vWF、VEGF和MMP-9是显著增加的(表10)，如在下面的表 中所示。
非血管痉挛、前血管痉挛和局灶性缺血人群中的血浆标志物平均峰值，对照组被 给出作为参考。   局灶性缺血   (n＝87)     P值     对     SAH前  SAH，非  血管痉挛  (n＝16)   P值   对   SAH前   SAH，前   血管痉挛   (n＝22)   对照组   (n＝7)  vWF   4645±875     0.010  4934±599   0.025    5526±929   4865±868  VEGF   0.03±0.04     0.001  0.06±0.06   0.023    0.1 2±0.06   0.04±0.06  MMP-9   250±308     0.001  438±154   0.006    705±338   408±348
【00379】随着SAH，升高的血浆vWF、VEGF和MMP-9独立地增加随后的血管 痉挛的几率17至25倍，同时阳性预测值的范围为72％至92％，如在下面的表中 所显示。
与血浆vWF、VEGF和MMP-9的各种水平相关的随后发生血管痉挛的阳性/阴性 预测值和优势比，通过逻辑回归分析获得。
血浆标志物   P值    优势比    PPV    NPV
VWF(ng/ml)
＞5800       0.101     9.2       88％     57％
＞5500       0.033    17.6       92％     67％
＞5200       0.144     4.2       71％     63％
VEGF(ng/ml)
＞0.12       0.050     20.7      75％     58％
＞0.08       0.023     16.8
                                 60％     75％
＞0.06       0.064      7.3      64％     73％
MMP-9(ng/ml)
＞700        0.045     25.4      91％     64％
＞600        0.105      5.7      77％     61％
＞500        0.111      4.9      68％     65％
【00380】 实施例10，用于诊断中风的代表性组
【00381】下面的表说明了本发明的方法在中风的诊断中的应用。“被分析物组”表示标志物的组合，所述标志物是用于分 析从中风患者和非中风供者中获得的检验样品的(NHD表示正常健康的供者，NSD表示非特异疾病供者)。时间(如果被提 到)代表症状发作和样品收集之间的时间间隔。ROC曲线被计算，显示了在不同分界(cutoffs)处特定标志物组的灵敏度和 该组的(1-特异性)，并且曲线下的面积被确定。特异性(Spec)为92.5％时的诊断灵敏度(Sens)被确定；灵敏度为92.5％ 时的诊断特异性也被确定。
3-标志物组—被分析物：Caspase-3，MMP-9，GFAP。 样品 中风对NHD+NSD 中风对NHD 中风对NSD 时间间隔 所有时间 所有时间 所有时间 中风(n) 448  448  448 非中风(n) 338  236  102 参数 面积 灵敏度@ 92.5％特 异性 特异性@ 92.5％灵 敏度 面积 灵敏度@ 92.5％特 异性 特异性@ 92.5％灵 敏度 面积 灵敏度 @92.5％ 特异性 特异性@ 92.5％灵 敏度 数值 .944  85.7％ 85.2％ .955  86.6％ 89.0％ .919  75.0％ 76.5％
样品 中风对NHD 中风对NSD 中风对NHD 中风对NSD 时间间隔 0-6小时 0-6小时 6-48小时 6-48小时 中风(n) 16 16 89 89 非中风(n) 236 102 236 102 参数 面积 灵敏度 @ 92.5％特 异性 特异性 @ 92.5％灵 敏度 面积 灵敏度 @ 92.5％特 异性 特异性 @ 92.5％ 灵敏度 面积 灵敏度 @ 92.5％特 异性 特异性 @ 92.5％灵 敏度 面积 灵敏度 @ 92.5％特 异性 特异性 @ 92.5％灵 敏度 数值 .958  93.8％ 95.8％ .931  87.5％ 92.2％ .963  86.5％ 90.3％ .920  71.9％ 76.5％
4-标志物组—被分析物：Caspase-3，MMP-9，vWF-A1，和BNP。 样品 中风对NHD+NSD 中风对NHD 中风对NSD 时间间隔 所有时间 所有时间 所有时间 中风(n) 482 482 482 非中风(n) 331 234 97 参数 面积 灵敏度@ 92.5％特 异性 特异性@ 92.5％灵 敏度 面积 灵敏度@ 92.5％特 异性 特异性@ 92.5％灵敏 度 面积 灵敏度@ 92.5％特 异性 特异性@ 92.5％灵敏 度 数值 .963  92.9％ 92.7％ .980  94.6％ 96.6％ .923  74.7％ 83.5％
样品 中风对NHD 中风对NSD 中风对NHD 中风对NSD 时间间隔 0-6小时 0-6小时 6-48小时 6-48小时 中风(n) 18 18 101 101 非中风(n) 234 97 234 97 参数 面积 灵敏度 @ 92.5％特 异性 特异性 @ 92.5％灵 敏度 面积 灵敏度 @ 92.5％ 特异性 特异性 @ 92.5％灵 敏度 面积 灵敏度 @ 92.5％特 异性 特异性 @ 92.5％灵 敏度 面积 灵敏度 @ 92.5％特 异性 特异性 @ 92.5％灵 敏度 数值 .968  94.4％ 96.6％ .912  77.8％ 83.5％ .987  98.0％ 97.0％ .937  76.2％ 85.6％
6-标志物组：被分析物如所显示的。   组1   组2   组3   组4     NCAM   √   √   √   √     BDNF   √   √   √   √     Caspase-3   √   √   √   √     MMP-9   √   √   √   √     vWF-A1   √   √   √     VEGF   √   √     S100   √     vWF-整联蛋白   √     MCP1   √     GFAP
            组1              组2             组3               组4             时间              时间             时间               时间 全部 0-6 6-48 全部 0-6 6-48 全部 0-6 6-48 全部 0-6 6-48 中风(n) 372 25 106 372 25 106 372 25 106 372 25 106 非中风(n) 109 109 109 109 109 109 109 109 109 109 109 109 ROC面积 0.940 0.985 0.946 0.955 0.988 0.952 0.948 0.986 0.944 0.952 0.985 0.948 灵敏度@92.5％特异性 94.6％ 100.0％ 90.6％ 95.2％ 100.0％ 96.2％ 95.3％ 100.0％ 93.4％ 93.6％ 100.0％ 95.3％ 特异性@92.5％灵敏度 92.7％ 98.2％ 90.8％ 93.6％ 98.2％ 92.7％ 92.7％ 98.2％ 93.6％ 92.7％ 92.7％ 92.7％   组5   组6   组8   组10     NCAM    √    √     BDNF    √    √    √    √     Caspase-3    √    √     MMP-9    √    √    √    √     vWF-A1    √    √     VEGF     S100    √    √    √    √     vWF-整联蛋白    √     MCP1    √     GFAP    √    √    √    √
             组5               组6              组8              组10   时间   时间   时间   时间   全部   0-6   6-48   全部   0-6   6-48   全部   0-6   6-48   全部   0-6   6-48   中风(n)   109   109   109   109   109   109   109   109   109   109   109   109   非中风(n)   360   25   105   367   25   106   367   25   106   367   25   106   ROC面积   0.940   0.984   0.944   0.937   0.963   0.937   0.953   0.982   0.941   0.947   0.979   0.948   灵敏度@92.5％特异性   94.6％   100.0％   86.7％   94.6％   100.0％   94.3％   92.9％   100.0％   94.3％   94.0％   100.0％   93.4％   特异性@92.5％灵敏度   92.7％   97.2％   90.8％   92.7％   93.6％   92.7％   92.7％   96.3％   92.7％   92.7％   95.4％   92.7％
7-标志物组—被分析物：Caspase-3，NCAM，MCP-1，S100-β，MMP-9，vWF-整联蛋白和BNP。  样品          中风对NHD+NSD            中风对NHD           中风对NSD  时间间隔    所有时间    所有时间     所有时间  中风(n)   419   419   419  非中风(n)   324   207   117  参数   面积   灵敏度@   92.5％特   异性   特异性@   92.5％灵   敏度   面积   灵敏度@   92.5％特   异性   特异性@   92.5％灵   敏度   面积   灵敏度@   92.5％特   异性   特异性@   92.5％灵   敏度  数值   .953   88.3％   89.5％   .962   92.6％   92.8％   .937   79.5％   83.8％
  样品         中风对NHD   中风对NSD   中风对NHD   中风对NSD   时间间隔     0-6小时   0-6小时   6-48小时   6-48小时   中风(n)      21   21   86   86   非中风(n)    207   117   207   117   参数   面积   灵敏度   @   92.5％   特异性   特异性   @   92.5％   灵敏度   面积   灵敏度   @   92.5％特   异性   特异性   @   92.5％   灵敏度   面积   灵敏度   @   92.5％特   异性   特异性   @   92.5％灵   敏度   面积   灵敏度   @   92.5％特   异性   特异性   @   92.5％灵   敏度   数值   .930   85.7％   77.8％   .900   81.0％   62.4％   .972   96.5％   92.8％   .948   82.6％   83.8％
7-标志物组—被分析物：Caspase-3，NCAM，MCP-1，S100-β，MMP-9，vWF-整联蛋白和BNP。   被分析物   中风   对   NDH   中风   对   NDH+NSD   中风   对   NDH   中风   对   NDH   中风   对   NDH   中风   对   NDH   中风   对   NDH   Caspase   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   NCAM   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   MCP-1   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   S-100b   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   MMP-9(omni)*   ×   MMP-9(18/16)**   ×   ×   MMP-9(18/17)***   ×   MMP-9(omni+18/16)   ×   MMP-9(omni+18/17)   ×
                                     MMP-9(18/16+18/17)   X  vWF-整联蛋白   X   X   X   X   X   X   X  BNP   X   X   X   X   X   X   X   所有   时间  中风(n)   419   419   500   427   417   425   418  非中风(n)   207   324   248   208   207   208   207  ROC面积   0.991   0.953   0.987   0.990   0.993   0.995   0.990  灵敏度@92.5％特  异性   97.4％   88.3％   97.2％   97.9％   99.0％   98.4％   97.4％  特异性@92.5％灵  敏度   99.9％   89.5％   97.6％   99.0％   99.5％   99.5％   99.0％   0-6   小时  中风(n)   21   21   24   21   21   21   21  非中风(n)   207   324   248   208   207   208   207  ROC面积   1.000   0.939   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000  灵敏度@92.5％特  异性   100％   95.2％   100％   100％   100％   100％   100％  特异性@92.5％灵  敏度   100％   96.0％   100％   100％   100％   100％   100％   6-48   小时  中风(n)   86   86   102   90   85   89   86  非中风(n)   207   324   248   208   207   208   207
  ROC面积   0.996   0.969   0.986   0.998   0.999   0.999   0.999   灵敏度@92.5％特   异性   100％   96.5％   98.0％   100％   100％   100％   100％   特异性@92.5％灵   敏度   98.1％   94.1％   98.4％   99.5％   100％   100％   99.0％
*-识别MMP-9的所有形式
*-识别MMP-9的所有形式，除了活性MMP-9以外
*-识别MMP-9的所有形式，除了MMP-9/TIMP复合物
8-标志物组—被分析物：Caspase-3，NCAM，MCP-1，S100-β，MMP-9，vWF-A1，BNP和GFAP。  样品   中风对NHD+NSD   中风对NHD   中风对NSD  时间间隔   所有时间   所有时间   所有时间  中风(n)   368   380   380  非中风(n)   298   214   93  参数   面积   灵敏度@   92.5％特   异性   特异性@   92.5％灵   敏度   面积   灵敏度@   92.5％特   异性   特异性@   92.5％灵   敏度   面积   灵敏度@   92.5％特   异性   特异性@   92.5％灵敏   度  数值   .970   93.9％   94.5％   .980   94.2％   96.3％   .947   80.3％   90.3％
  样品中风对NHD   中风对NSD   中风对NHD   中风对NSD   时间间隔0-6小时   0-6小时   6-48小时   6-48小时   中风(n)15   15   76   76   非中风(n)214   93   214   93   参数   面积   灵敏度   @   92.5％   特异性   特异性   @   92.5％   灵敏度   面积   灵敏度   @   92.5％   特异性   特异性   @   92.5％   灵敏度   面积   灵敏度   @   92.5％   特异性   特异性   @   92.5％   灵敏度   面积   灵敏度   @   92.5％   特异性   特异性   @   92.5％   灵敏度   数值   .961   93.3％   96.7％   .927   86.7％   92.5％   .989   98.7％   96.3％   .960   80.3％   90.3％
【00382】另外的中风组可以应用选自下列集合的3个、4个、5个、6个、7个、 8个或者更多个标志物而被提供：IL-1ra、C-反应蛋白、冯威勒布兰特因子(vWF)、 Tweak、肌酸激酶-BB、c-Tau、D-二聚体、血栓前体蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、 基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、神经细胞粘附分子(NCAM)、BNP、S100β和 caspase-3。下面的代表性组被提供以用于缺血性中风的诊断，应用正常健康供者样 品作为“对照”组。
【00383】   组#   1   2  3   组中的标志物   CRP，NCAM，D-二   聚体，BNP，   CK-BB，Caspase-3，   c-Tau，S-100β   CRP，NCAM，D-   二聚体，BNP，   CK-BB，VEGF，   MMP-9，S-100β  CRP，D-二聚  体，BNP，  CK-BB，  S-100β   对照组n   76   76  76   疾病组n   40   40  43   平均ROC面积   0.976   0.968  0.960   SD(％)   0.008   0.007  0.006   平均灵敏度@92.5％   特异性   94.1   93.6  93.4   SD(％)   1.40   1.30  0.90   平均特异性@92.5％   灵敏度   98.7   99.5  96.0   SD(％)   1.40   0.80  1.30   组#  4   5   6   组中的标志物  CRP，IR-1ra，D-二  聚体，CK-BB，  MMP-9，S-100β   CRP，D-二聚体，   Caspase-3，   CK-BB，VEGF，   MMP-9，S-100β   CRP，D-二聚   体，MMP-9，   CK-BB，   S-100β   对照组n  76   76   76   疾病组n  43   43   43   平均ROC面积  0.947   0.957   0.954   SD(％)  0.096   0.007   0.007   平均灵敏度@92.5％   特异性  92.1   94.5   93.0   SD(％)  9.50   1.90   2.30   平均特异性@92.5％   灵敏度  93.1   94.8   93.9   SD(％)  9.60   1.70   1.60
  组# 7   8 9   组中的标志物 CRP，BNP，D-二聚 体，CK-BB， MMP-9，S-100β   CRP，D-二聚体，   IR-1ra，CK-BB，   MMP-9，S-100β CRP，D-二聚 体，NCAM， BNP，S-100β   对照组n 76   76 76   疾病组n 40   43 41   平均ROC面积 0.960   0.947 0.960   SD(％) 0.006   0.096 0.005   平均灵敏度@92.5％   特异性 93.4   92.1 92.5   SD(％) 0.90   9.50 0.60   平均特异性@92.5％   灵敏度 96.0   93.1 96.6   SD(％) 1.30   9.60 2.40   组#   10   组中的标志物   CRP，D-二聚体，   CK-BB，Caspase-3，   MMP-9，S-100β   对照组n   76   疾病组n   43   平均ROC面积   0.957   SD(％)   0.007   平均灵敏度@92.5％   特异性   94.5   SD(％)   1.90   平均特异性@92.5％   灵敏度   94.8   SD(％)   1.70
【00384】 实施例11，用于区分缺血性中风和出血性中风的代表性组
【00385】下表说明了本发明的方法用于区分不同类型的中分的用途，在本实施例 中是缺血性中风对出血性中风。“被分析物组”表示标志物的组合，所述标志物用 于分析从缺血性中风患者和出血性中风患者获得的检测样品。特异性(Spec)为 92.5％时的诊断灵敏度(Sens)被确定；灵敏度为92.5％时的诊断的特异性也被确 定。
【00386】
            缺血性中风对出血性中风   操作组   1   操作组   2   操作组   3   操作组   4   被分析物   组：   CRP   X   X   X   X   NT-3   X   X   总v-WF   X   MMP-9   X   X   X   X   VEGF   X   X   X   X   CKBB   X   X   X   X   MCP-1   X   X   X   钙结合蛋白(calbindin)   X   v-WF-VP 1   X   v-WFA3   X   v-WF A1-A3   X   凝血酶-抗凝血酶III复合物   X   含脂质蛋白(proteolipid protein)   X   IL-6   X   IL-8   X   髓磷脂碱蛋白   X   S-100β   X   组织因子   X   GFAP   X   v-WF A1-整联蛋白   X   CNP   X   NCAM   X   所有   时   间  N   出血性中风   209   196   182   197   缺血性中风   114   110   122   109   ROC面积   0.898   0.867   0.920   0.882   灵敏度@92.5％特异性   75.1％   62.2％   77.9％   64.0％   特异性@92.5％灵敏度   77.2％   71.8％   85.7％   72.5％
【00387】 实施例12，用于诊断急性中风的示范性标志物
【00388】本研究中的主要终点(primary endpoint)是临床中风的存在，如持续了 超过24小时的病灶性神经学体征或感觉为血管起源的症状所定义的。根据从症状 发作至抽血的潜伏期，中风患者的血液样品被分级为两类：少于6小时(16个样 品)和6-24小时(38个样品)。最初被怀疑患有中风但是不符合临床标准的对照 患者用作对照。这21位患者包括患有TIA(13名患者)、昏厥(n＝1)、和其它(n＝7) 患者。该对照组聚集了没有血管疾病的患者(n＝157)。
【00389】在征得同意之后，进行静脉切开放血术，将收集的血液离心(10,000g)， 将得到的上清液在-70℃冷冻直至分析完成，如前所述(Grocott et al.，2001，McGirt etal.，2002)。生物化学标志物的测定通过Biosite Diagnostics(San Diego，CA)来 进行，其中应用Genesis Robotic Sample Processor 200/8(Tecan；Research Triangle park，NC)。所有的检验分析是在384孔微量滴定板中按10μL的反应体积来进行 的，结合抗原的量借助碱性磷酸酶连接的二抗和AttoPhos底物来检测(JBL Scientific，San Luis Obispo，CA)。
【00390】对于所有的人口统计和样品分析数据，描述性的统计，包括分类数据的 频数和百分数，以及连续变量的均数和标准差、中位数、第一和第三四分位数， 以及最小值和最大值被计算。对于分类变量，人口统计变量通过Wilcoxon检验(年 龄)或者卡方检验来比较。局外者和非常态的标志物值分布被检测。为了最小化 过检验(overtesting)，在指定的取样期间标志物水平区分中风的能力，在本探索 性研究的阶段中被测试。首先，每一标志物作为单一的预测物用单变量逻辑斯蒂 回归来测试。基于这些结果，根据标志物的临床特征以及与其它标志物的相关性， 3个标志物的组被选出，用多变量逻辑斯蒂模型来测试。将不显著的标志物从该模 型中去除，可多达2个的更多标志物被另外地测试，以获得提供在估计和预测效 用中具有最大稳定性的最终模型。被包含的标志物之间的关联被检查以避免共线 性，影响统计(卡方中的变化)被检测以预防任一观测结果的不适当的影响。最 后，该模型的有效性通过步步为营法(“bootstrapping”)来检查。利用分析数据集 的替代，通过随机选择，获得作为分析数据集的相同大小的50个测试数据集。然 后，将该模型在每一“步步为营”数据集上拟合，并检查结果的一致性。以此种 方式，针对两个可以获得足够数量中风样品的标志物取样的时间期间，0-6小时和 6-24小时，分别开发出模型。来自相同患者的多个样品不在同一分析中被使用， 其在每一分析中保持独立。在相同的时间期间内，从相同的患者可以得到多个样 品，仅仅最接近该时间期间起点的样品被用于本分析。为了研究症状发作后时间 和血清标志物水平的相关性，对于所有患有中风的患者，包括自发作后0-24小时 的所有样品的数据集被制备。应用斯皮尔曼等级相关，针对每一标志物，先检查 了时间相关性；然后，应用重复测量多变量回归方法，p＜0.10时的相关性被检测， 以解释一些样品的非独立性。
【00391】急性(从症状发作至血液收集为0-6小时)和亚急性(从症状发作至血 液收集为6-24小时)的患者人口统计可以被比较。在两个数据组中，男性患者较 少可能被诊断为临床中风，而心肌梗塞的过去史和非洲籍美国人与中风发生率的 增加有关。血液被急性收集(在症状发作的6个小时内)和亚急性收集(在症状 发作后6小时和24小时之间)，获得患者人口统计的数据组。在每一数据组中， 患有临床中风的患者的年龄和不患有中风的患者的年龄没有显著的不同(年龄表 示为均数±标准差)。在不患有中风的急性和亚急性患者中，男性患者的比例增加。 在两个数据组中，比例增加的中风患者均为非洲籍美国人，并且具有心肌梗塞的 预先发生。              (0-6小时)               (6-24小时)   中风   (n＝16)   非中风   (n＝165)   p   中风   (n＝38)   非中风   (n＝176)   p   年龄   62±15   63.3±8   NS   63±5   62±9   NS   男性(％)   37.5   67.7   0.026   42.1   68   0.005   MI病史(％)   30.8   1.2   ＜0.001   37.1   2.3   ＜0.001   种族(％)   ＜0.001   白种人   37.5   91.9   44.7   89.5   ＜0.001   非洲籍美国人   62.5   3.8   52.6   6.4   其它   0   4.4   2.6   4.1
【00392】涉及中风和神经元损伤的发病机理的26个生物化学标志物被预期地限 定，并且被分为6种中的1种：神经胶质细胞活化的标志物、炎症的非特异性介 质、血栓形成或者受损的止血功能的标志物、细胞损伤的标志物、过氧化脂质/髓 磷脂分解的标志物、凋亡/其它(miscellaneous)的标志物。单变量逻辑斯蒂分析 证明了在两个时间期间均与中风高度相关(p＜0.001)的4个标志物。这些包括神 经胶质细胞活化的一个标志物(S100β)、炎症的两个标志物(血管细胞粘附分子， IL-6)，和冯威勒布兰特因子(vWF)。此外，几个标志物作为时间函数被有差别地 上调。具体地，caspase3，凋亡的一个标志物，作为时间的函数而增加(自症状发 作至抽血的24小时期间内)，提示了不可逆损伤组织的体积的逐渐增加。
【00393】创建2个数据组，代表从表现急性中风(血液在6小时内被抽取)和亚 急性中风(血液在6至24小时之间被抽取)的患者收集的血清。呈现可疑的脑缺 血的患者血液中的神经胶质细胞活化标志物和炎症标志物被分析，对于每一标志 物，单变量逻辑斯蒂回归被进行。假定许多检验分析是非正态分布时，数据被显 示为中位数±四分位数间范围；显著性表示为每一单变量逻辑斯蒂模型的未校正的 p值。P＞0.05被认定为是没有意义的(NS)。        (0-6小时) 中风    非中风p   (n＝         中位数   (25th，75th百分位数)             (6-24小时)   中风   (n＝16)   非中风   (n＝165)   p          中位数   (25th，75th百分位数)   神经胶质细胞标   志物(单位)
  S100β(pg/ml)   42.9   (9.0，48.7)   0   (0，0)   ＜0.001   27.3   (9，88)   0   (0，0)   ＜0.001   神经胶质纤维酸   性蛋白(pg/ml)   488.9   (0，1729)   110.2   (0，395.1)   0.025   666.9   (188，1327)   96.8   (0，398)   0.002   炎症介质(单位)   基质金属蛋白酶   9   (MMP-9；ng/ml)   253.0   (138，524)   70.0   (26，109)   ＜0.001   176.8   (111，327)   74   (27，113.7)   ＜0.001   血管细胞粘附分   子   (VCAM；μg/ml)   2.2   (1.8，2.3)   1.3   (1，1.56)   ＜0.001   2.0   (1.6，2.4)   1.3   (1.0，1.7)   ＜0.001   白介素6(IL-6；   pg/ml)   20.4   (11.4，56)   0.1   (0.1，9.4)   0.039   33.1   (6.8，73.2)   0.1   (0.1，11.4)   0.008   肿瘤坏死因子   (TNFαt；pg/ml)   31.2   (5.7，54.1)   0.1   (0.1，15.5)   0.016   29.8   (3.3，55)   0.1   (0.1，17.7)   0.039   神经细胞粘附分   子   (NCAM，ng/ml)   51.4   (45.6，60)   52.0   (51.1，53)   NS   49.3   (46，57)   51.9   (51，52.9)   NS   白介素1受体拮   抗剂   (IL-1ra，pg/ml)   0   (0，1281)   221.9   (0，693.7)   NS   88.2   (0，927)   180.8   (0，699)   NS   白介素1β   (IL-1β；pg/ml)   1.9   (0.2，5)   0.1   (0.1，3.6)   NS   0.1   (0.1，4.9)   0.1   (0.1，4.2)   NS   白介素8   (IL8；pg/ml)   30.1   (10.1，39)   2.0   (0.1，18.4)   NS   18.2   (6.7，46)   1.4   (0.1，17.8)   NS   单核细胞化学引   诱蛋白-1   (MCP-1；pg/ml)   203.7   (133，255)   115.1   (79，164)   NS   144.9   (104，222)   114.4   (79，162)   NS   血管内皮生长因   子   (VEGF；ng/ml)   0   (0，0)   0.1   (0，0.2)   0.008   0   (0，0)   0.1   (0，0.1)   0.002
【00394】创建2个数据组，代表从表现急性中风(血液在6小时内被抽取)和亚 急性中风(血液在6至24小时之间被抽取)的患者收集的血清。呈现可疑的脑缺 血的患者的血液中的急性脑缺血的标志物，包括凋亡、髓磷脂分解和过氧化、血 栓形成和细胞标志物被分析，对于每一标志物，单变量逻辑斯蒂回归被进行。假 定许多检验分析是非正态分布的，数据被显示为中位数±四分位数间范围；显著性 表示为每一单变量逻辑斯蒂模型的未校正的p值。P＞0.05被认为为是没有意义的 (NS)。
【00395】
                             (0-6小时)   中风                        非中风                 p                               中位数                            (25th，75th百分位数)                     (6-24小时)   中风   (n＝16)   非中风   (n＝165)   p                  中位数           (25th，75th百分位数)   血栓的标   志物(单   位)   冯威勒布   兰特因子   (vWFa1；   ng/ml)   7991   (6964，9059)   5462   (4794，6332)   ＜   0.001   7720.7   (7036，8986)   5498.8   (4815，6404)   ＜   0.001   凝血酶-抗   凝血酶III   (ng/ml)   95   (33，151)   15   (0.3，38)   NS   69.2   (39，89)   16.5   (0.9，40.7)   NS   D-二聚体   (ng/ml)   2840   (2323，3452)   3108   (2621，4037)   NS   2684.3   (2296，3421)   3112.7   (2633，3955)   NS   细胞损伤   和髓磷脂   分解的标   志物(单   位)   肌酐磷酸   激酶；脑   带   (CKBB；ng   /ml)   3.5   (1.3，4.4)   0.5   (0.1，107)   0.03   1.7   (0.2，3.8)   0.5   (0.1，1.6)   0.04   组织因子   (pg/ml)   5766   (2828，10596)   9497   (5309，19536)   NS   4142.8   (2894，6333)   9085.5   (4572，17264)   0.013   髓磷脂碱   性蛋白   (ng/ml)   3.1   (0.3，6.4)   0   (0，2.8)   NS   2.9   (0，5.5)   0   (0，2.8)   NS   含脂质蛋   白(RU)   0.1   (0.1，0.2)   0.2   (0.1，0.6)   NS   0.1   (0.1，0.3)   0.2   (0.1，0.6)   NS   Malendial   -dehyde   (μg/ml)   28   (20，35)   23   (20，26)   0.02   27.7   (24.8，31.3)   23.8   (20.1，27.2)   0.02   凋亡标志   物、生长   因子、多   种混杂标   志物(单   位)
  脑型利钠   肽   (BNP；   pg/ml)   53   (24，227)   28   (21，39)   0.019   120.4   (33.9，306)   27.4   (21.1，39.2)   ＜   0.001   Caspase3   (ng/ml)   7.7   (4.4，16.7)   4.5   (3.0，7.0)   NS   8.1   (4.9，35.4)   4.7   (3.0，7.4)   0.002   钙结合蛋   白(pg/ml)   2493   (1406，4298)   3003   (2287，4276)   NS   3080.8   (1645，3950)   2982   (2312，4186)   NS   热休克蛋   白60   (HSP60；   ng/ml)   0.1   (0，13.3)   0   (0，0)   NS   0   (0，15.9)   0   (0，0)   NS   细胞色素   C(ng/ml)   0   (0，0.1)   0   (0，0)   NS   0   (0，0.2)   0   (0，0)   NS
【00396】为了使应用这些标志物的诊断检测的灵敏度和特异性最大化，我们接着 应用如上面描述的多变量逻辑斯蒂回归，创建了中风生物标志物的3-变量组。对 于急性患者(从症状发作至抽血的时间少于6小时或者等于6小时)，应用变量 MMP-9、vWF和VCAM，将灵敏度和特异性最优化；其中标志物的浓度与预测的 中风概率成正相关。这些变量中的每一个都显著地和独立地对该模型有所贡献(表 21)。对于此逻辑模型，全部模型似然比卡方(overall model Likelihood ratio chi-square)是71.4(p＜0.0001)，适合度在p＝0.9317被证实(Hosmer & Lemeshow 检验)，和谐性(concordance)是将近98％(c＝0.979)。当后果概率水平被设定在 0.1的分界时，此模型在预测中风时提供了87.5％的灵敏度和91.5％的特异性，所 述中风如被临床定义的那样(由脑缺血导致的病灶性神经学症状，持续大于24小 时)。步步为营的确证方法显示了所有50个试验模型p＜0.0001并且所有50个和谐 系数＞94％。MMP-9在50个样品中的43个中是有显著意义的(p＜0.05)，VCAM 在50个样品中的43个中，vWFa1在50个样品中的35个中有显著意义。
【00397】优势比的可信区间，单位是预测值的1个标准差。由所有患者的数据集 创建出逻辑斯蒂回归模型，在所述患者中，血液在症状发作的6小时内被抽取。 三个共变量(covariates)(MMP9，vWF和VCAM)中的每一个的优势比被呈现为 一个标准差每单位。   效应   单位(1sd)   优势比   低CL   高CL   P值   MMP9   137.0   13.202   3.805   98.035   0.0026   VCAM   0.5900   4.104   1.793   12.721   0.0045   vWFa1   1462.0   3.581   1.590   9.450   0.0036
【00398】以相似的方式，逻辑斯蒂回归模型被开发，用于具有亚急性症状的患者 (从症状发作至抽血，经过6-24小时)。对于此时间期间，应用变量S100b、VCAM 和vWFal，将灵敏度和特异性最优化。上述变量的每一个都显著地和独立地对该 模型有所贡献(表22)。对于该逻辑模型，全部模型似然比卡方是95.1(p＜0.0001)， 适合度在p＝0.2134(Hosmer & Lemeshow检验)被证实，和谐性是95％(c＝0.953)。 当后果概率水平被设定在0.1的分界时，此模型在区分中风时提供了97.1％的灵敏 度和87.4％的特异性。步步为营的确证方法显示，全部50个试验的模型p＜0.0001 并且全部50个和谐系数＞89％。S100β在50个样品中的47个中是有显著意义的 (p＜0.05)，VCAM在50个样品中的45个中，vWFal在在50个样品中的49个中 有显著意义。
【00399】优势比的可信区间，单位是预测值的1个标准差。由所有患者的数据集 创建出逻辑斯蒂回归模型，在所述患者中，血液在症状发作的6小时至24小时之 间被抽取。三个共变量(covariates)(S100β，vWF和VCAM)中的每一个的优势 比被呈现为一个标准差每单位(per unit of one standard deviation)。   效应   单位(1sd)   优势比   低CL   高CL   P值   S100β   65.0   6.371   2.225   26.246   0.0024   VCAM   0.660   2.423   1.417   4.380   0.0020   vWFa1   1621.0   3.180   1.934   5.674   ＜.0001
【00400】 实施例13，用于区分急性中风和非急性中风的代表性组
【00401】应用2002年12月27日提交的题目是METHOD AND SYSTEM FOR DISEASE DETECTION USING MARKER COMBINATIONS的美国专利申请 10/331,127(律师案卷编号071949-6802)中描述的方法，用于区分急性中风和非 急性中风的代表性组被予以确定。以大数目的潜在标志物开始(例如，19个不同 的标志物)，迭代方法被应用。在此方法中，标志物的个别的阈浓度本身不被用作 分界，但是被用作每一患者的检验值与之比较和进行标准化所用的值。窗因子 (window factor)被用于计算高于分界和低于分界的最小值和最大值。高于最大值 的检验值被设定为最大值，低于最小值的检验值被设定为最小值。各个标志物权 数的绝对值合计达1。标志物的负权数意味着，对照组的检验值高于患病组的检验 值。“组反应”应用分界、窗和权重因数被计算出。整个患者人群和对照人群的组 反应被ROC分析，组反应分界被选出以产生所希望的组灵敏度和特异性。每轮迭 代之后，将对等式最弱的贡献者去除，并且随着标志物数量减少，迭代方法重新 开始。此方法被持续，直至具有最小数量的其组灵敏度和特异性仍可接受的标志 物被获得。
【00402】用于确定急性中风(0-12小时)的组组合物包括下列标志物：BNP、GFAP、 IL-8、β-NGF、vWF-A1和CRP，而用于确定非急性中风(12-24小时)的组组合物 包括下列标志物：BNP、GFAP、IL-8、CK-BB、MCP-1和IL-1ra。阳性结果被鉴 定，94.4％的特异性时有至少90％的灵敏度。如下面所显示，应用的标志物可以提 供组以鉴定急性中风、鉴定非急性中风和/或者区分急性中风和非急性中风。
【00403】0-12小时组结果   所有   中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   54   6   100.0％   0-6小时   54   13   100.0％   0-12小时   54   24   95.8％   12-24小时   54   19   68.4％   缺血性中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   54   5   100.0％   0-6小时   54   11   100.0％   0-12小时   54   20   95.0％   12-24小时   54   17   64.7％   出血性中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   54   1   100.0％   0-6小时   54   2   100.0％   0-12小时   54   4   100.0％   12-24小时   54   2   100.0％   0-12小时组系数   标志物   分界   窗   权数   BNP   97.13   0.07   0.15   vWF-A1   29.35   0.25   -0.07   GFAP   2.64   0.22   0.07   BNGF   0.13   0.88   -0.20   IL-8   140.32   0.00   0.21   CRP   43.68   0.92   0.30
【00404】12-24小时组结果
  所有   中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   20   6   83.3％   0-6小时   20   13   69.2％   0-12小时   20   25   76.0％   12-24小时   20   19   100.0％   缺血性中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   20   5   100.0％   0-6小时   20   11   72.7％   0-12小时   20   21   76.2％   12-24小时   20   17   100.0％   出血性中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   20   1   0.0％   0-6小时   20   2   50.0％   0-12小时   20   4   75.0％   12-24小时   20   2   100.0％   12-24小时组系数   标志物   分界   窗   权数   MCP-1   67.93   0.69   -0.04   BNP   203.00   0.79   0.21   GFAP   1.71   0.79   0.27   IL-8   97.51   0.07   0.08   CK-BB   0.48   0.14   -0.14   IL-1ra   367.11   0.68   -0.26
【00405】也确定了用于区分0-6小时间的中风发作和6小时后的中风发作的可供 选择的代表性组。用于鉴定急性中风(0-6小时)的组组合物包括下列标志物：BNP、 GFAP、CRP、CK-BB、MMP-9、IL-8和β-NGF，而用于鉴定非急性中风(6-24小 时)的组组合物包括下列标志物：BNP、GFAP、CRP、CK-BB、Caspase-3、MCP-1 和vWF-整联蛋白。阳性结果被鉴定，在94.4％的特异性时为至少90％的灵敏度。 如下面的表25和26中所显示，应用的标志物可以提供组以鉴定0-6小时窗内的急 性中风、鉴定此窗以外的中风，和/或在发作时间窗之间进行区分。
【00406】0-6小时组结果
  所有中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   55   13   92.3％   0-6小时   55   33   97.0％   6-24小时   55   76   65.8％   缺血性中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   55   11   90.9％   0-6小时   55   25   96.0％   6-24小时   55   51   64.7％   出血性中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   55   2   100.0％   0-6小时   55   8   100.0％   6-24小时   55   25   68.0％   0-6小时组系数   标志物   分界   窗   权数   BNP   119.16   0.51   0.09   MMP-9   203.57   0.12   -0.08   GFAP   7.22   0.00   0.18   BNGF   0.05   0.00   -0.14   IL-8   32.41   0.00   0.12   CK-BB   1.69   0.90   0.16   CRP   34.86   0.00   0.24
【00407】6-24小时组结果   所有中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   55   11   63.6％   0-6小时   55   29   62.1％   6-24小时   55   66   93.9％   缺血性中风   从发作起的时间   模拟对象#   中风对象#   灵敏度@94.4％   特异性
  0-3小时   55   9   55.6％   0-6小时   55   22   77.3％   6-24小时   55   44   93.2％   出血性中风   从发作起的时间   模拟对象的#  中风对象的#   灵敏度@94.4％   特异性   0-3小时   55   2   100.0％   0-6小时   55   7   71.4％   6-24小时   55   22   94.5％   6-24小时组系数   标志物   分界   窗   权数   Caspase-3   1.15   0.90   0.19   MCP-1   1242.63   0.87   -0.21   vWF-整联蛋白   5.37   0.90   0.11   BNP   738.69   0.97   0.15   GFAP   3.22   0.18   0.11   CK-BB   3.52   0.99   -0.01   CRP   114.31   0.99   0.22
【00408】 实施例14，用于预测蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的标志物和标志物组
【00409】由脑血管痉挛导致的迟发性缺血性神经功能缺损(DIND)是动脉瘤蛛 网膜下出血(SAH)之后病态和死亡的主要原因。尽管为揭示其发病机理进行了 深度的研究，但作为DIND基础的生物学过程仍然是不清楚的。
【00410】为了确定可预测脑血管痉挛的标志物和标志物组，52位表现动脉瘤蛛网 膜下出血的患者的每日血液样品在症状发作后48小时被抽取。23位患者(45％) 发展为临床脑血管痉挛，仅仅在脑血管痉挛的临床表现发作之前被抽取的血液样 品被考虑。应用标志物峰水平，进行单变量逻辑斯蒂回归，最具显著意义的变量 加入多逻辑斯蒂回归模型。
【00411】最终的逻辑模型包括VEGF(p＝0.002)、NCAM(p＝0.004)和caspase-3 (p＝0.009)，总p值＜0.0001。该模型具有94％的灵敏度(阴性预测值是95％)和 91％的特异性(阳性预测值是88％)。
【00412】最近，Sviri等(Stroke31：118-122，2000)确定了血清BNP水平和DIND 之间的相关性。Sviri证明，仅仅在发展有症状的脑血管痉挛的患者中，血清BNP 在SAH后7-9天升高6倍，而在没有有症状的血管痉挛的患者中，血清BNP不发 生升高[18]。然而，升高的BNP和DIND出现之间的时间关系未被报道，这提出 了一个问题，即，血清BNP是否可以促成DIND起始，起到预测迫近的DIND的 血清标志物的作用。
【00413】因此，在第二个研究中，40名认为患有动脉瘤SAH的连续患者被登记。 根据Hunt和Hess分类，对患者入院时的临床状况进行分类。SAH的严重程度由 最初的CT表现来分类。在入院后头24小时期间，诊断性脑血管造影术被进行。 所有的患者在SAH后＜48小时经历颅骨切开术和动脉瘤切除(aneurysm clipping)。 地塞米松在手术前被给予并且在手术后立即被减少。尼莫地平、苯妥英和胃肠预 防(gastrointestinal prophylaxis)(H2-阻断剂或者质子泵抑制剂)在入院当天被给 予并在患者的重症监护室停留期间被持续。血清BNP和钠样品通过静脉穿刺被获 得，在入院时进行，并且每12小时重复一次，连续12天。所有的患者经历经颅 多普勒超声(TCD)测定，在每周5次之间和在可疑的DIND起始时。连续变量 的差异显著性应用“学生”t检验被确定。非参数数据应用Mann Whitney检验被 比较。百分率应用卡方检验被比较。根据Hunt和Hess分级以及Fisher分级作了 调整的多变量逻辑斯蒂回归分析被用于评价BNP和DIND发作之间的独立联系。
【00414】16(40％)名患者在SAH之后发生有症状的脑血管痉挛。血清BNP大 于3倍的增加和低钠血症的发生相关(p＜0.05)。在SAH后小于3天，平均BNP 水平在血管痉挛和非血管痉挛患者之间是相似的(126+/-39对154+/-40，p＝0.61)， 但是在SAH后4-6天(285+/-67对116+/-30，p＜0.01)、7-9天(278+/-72对166+/-45， p＜0.01)和9-12天(297+/-83对106+/-30，p＜0.01)，血管痉挛人群中是升高的。 BNP水平仍独立地和血管痉挛相关，针对Fisher以及Hunt和Hess分级作调整(OR， 1.28；95％CI，1.1-1.6)。在发生血管痉挛的患者中，平均血清BNP在血管痉挛发生 后的24小时内增加5.4倍，在血管痉挛发生后的头3天增加11.2倍。在SAH后2 周，与入院相比具有增加的BNP水平的患者的Glascow昏迷等级(GCS)没有显 示出改变(0+/-3)，与之相对，在血清BNP没有增加的患者中，GCS有3.0+/-2的 变化(p＜0.05)。
【00415】增加的血清BNP水平独立地和低钠血症相关，它并不显著增加直至 DIND发生后的头24小时，并且它预测2周GCS。增加的BNP可以加剧由于脑血 管痉挛引起的血流减少，并且作为标志物，可以确定诊断手段和治疗手段的逐步 有效性。
【00416】尽管本发明已经以充分的细节被描述和示例，使得本领域的技术人员可 以制造并应用它，但是各种替代、修改和改进应该是显而易见的，而且不背离本 发明的精神和范围。
【00417】 实施例15，用于区分缺血性中风和颅内出血的标志物和标志物组
【00418】对急性缺血性中风的早期处理涉及排除颅内出血(ICH)的存在。血液 从113名被诊断为缺血性中风或者ICH的患者中抽取。所有的患者在症状发生起 的48小时内出现。主要的临床结果是被CT验证的ICH的存在或者缺血性中风的 临床诊断，其被定义为血管起源的病灶性神经学症状，持续大于24小时，带有相 一致的X线照相术结果。在每一变量上，进行单变量逻辑斯蒂回归分析，最显著 的变量被加入多变量逻辑斯蒂回归模型。共线性被检查，产生了具有3个变量的 最终模型。
【00419】34位患者(30％)被诊断为ICH，79位患者(70％)被诊断为缺血性中 风。最终的逻辑斯蒂模型包括C-反应蛋白(P＝0.013)、血管内皮生长因子(P＝0.045) 和BNP(P＝0.030)，总P值＜0.01。应用0.215的概率分界，此模型具有94％的灵 敏度、93％的阴性预测值和40％的特异性。同样的3-变量模型是有显著意义的， 当仅包括在症状发生的24小时内出现的患者时(n＝83，P＜0.05)，具有94％的灵敏 度、96％的阴性预测值和48％的特异性。三个生物标志物的组能够在表现中风的 患者中以高的灵敏度排除ICH。这样的组被证明可用于现场检测，以便在治疗干 预之前从具有可疑的缺血性中风的患者中排除ICH。
【00420】 实施例16，用于预测蛛网膜下出血后脑血管痉挛的标志物和标志物组
【00421】由脑血管痉挛导致的迟发性缺血性神经功能缺损(DIND)是动脉瘤蛛 网膜下出血(SAH)之后病态和死亡的主要原因。尽管为揭示其发病机理进行了 深度的研究，但作为DIND基础的生物学过程仍然是不清楚的。
【00422】为了确定可预测脑血管痉挛的标志物和标志物组，52位表现动脉瘤蛛网 膜下出血的患者的每日血液样品在症状发作后48小时被抽取。23位患者(45％) 发展为临床脑血管痉挛，仅仅在脑血管痉挛的临床表现发作之前被抽取的血液样 品被考虑。应用标志物峰水平，进行单变量逻辑斯蒂回归，最具显著意义的变量 加入多逻辑斯蒂回归模型。
【00423】最终的逻辑模型包括VEGF(p＝0.002)、NCAM(p＝0.004)和caspase-3 (p＝0.009)，总p值＜0.0001。该模型具有94％的灵敏度(阴性预测值是95％)和 91％的特异性(阳性预测值是88％)。
【00424】最近，Sviri等(Stroke31：118-122，2000)确定了血清BNP水平和DIND 之间的相关性。Sviri证明，仅仅在发展有症状的脑血管痉挛的患者中，血清BNP 在SAH后7-9天升高6倍，而在没有有症状的血管痉挛的患者中，血清BNP不发 生升高[18]。然而，升高的BNP和DIND出现之间的时间关系未被报道，这提出 了一个问题，即，血清BNP是否可以促成DIND，起到预测迫近的DIND的血清 标志物的作用。
【00425】因此，在第二个研究中，40名被接受患有动脉瘤SAH的连续患者被登 记。根据Hunt和Hess分类，对患者入院时的临床状况进行分类。SAH的严重程 度由最初的CT表现来分类。在入院后头24小时期间，诊断性脑血管造影术被进 行。所有的患者在SAH后＜48小时经历颅骨切开术和动脉瘤切除。地塞米松在手 术前被给予并且在手术后立即被减少。尼莫地平、苯妥英和胃肠预防 (gastrointestinal prophylaxis)(H2-阻断剂或者质子泵抑制剂)在入院当天被给予 并在患者的重症监护室停留期间被持续。血清BNP和钠样品通过静脉穿刺被获得， 在入院时进行，并且每12小时重复一次，连续12天。所有的患者经历穿颅多普 勒超声(TCD)测定，每周5次和在可疑的DIND起始时。连续变量的差异显著 性应用“学生”t检验被确定。非参数数据应用Mann Whitney检验被比较。百分 数应用卡方检验被比较。根据Hunt和Hess分级以及Fisher分级作了调整的多变 量逻辑斯蒂回归分析被用于评价BNP和DIND发作的独立联系。
【00426】16(40％)名患者在SAH之后发生有症状的脑血管痉挛。血清BNP大 于3倍的增加和低钠血症的发生相关(p＜0.05)。在SAH后小于3天，平均BNP 水平在血管痉挛和非血管痉挛患者之间是相似的(126+/-39对154+/-40，p＝0.61)， 但是在SAH后4-6天(285+/-67对116+/-30，p＜0.01)、7-9天(278+/-72对166+/-45， p＜0.01)和9-12天(297+/-83对106+/-30，p＜0.01)，血管痉挛人群中是升高的。 BNP水平仍独立地和血管痉挛相关，针对Fisher以及Hunt和Hess分级作调整(OR， 1.28；95％CI，1.1-1.6)。在发生血管痉挛的患者中，平均血清BNP在血管痉挛发生 后的24小时内增加5.4倍，在血管痉挛发生后的头3天增加11.2倍。在SAH后2 周，与入院相比具有增加的BNP水平的患者的Glascow昏迷等级(GCS)没有显 示出改变(0+/-3)，与之相对，在血清BNP没有增加的患者中，GCS有3.0+/-2的 变化(p＜0.05)。
【00427】增加的血清BNP水平独立地和低钠血症相关，它并不显著增加，直至 DIND发生后的头24小时，并且它预测2周的GCS。增加的BNP可以加剧由于脑 血管痉挛引起的血流减少，并且作为标志物，可以确定诊断手段和治疗手段的逐 步有效性。
【00428】尽管本发明已经以充分的细节被描述和示例，使得本领域的技术人员可 以制造并应用它，但是各种替代、修改和改进应该是显而易见的，而且不背离本 发明的精神和范围。
【00429】 实施例17，用于从缺血性中风区分颅内出血的标志物和标志物组
【00430】对急性缺血性中风的早期处理涉及排除颅内出血(ICH)的存在。血液 从113名被诊断为缺血性中风或者ICH的患者中抽取。所有的患者在症状发生起 的48小时内出现。主要的临床结果是被CT验证的ICH的存在或者缺血性中风的 临床诊断，其被定义为血管起源的病灶性神经学症状，持续大于24小时，带有相 一致的X线照相术结果。在每一变量上，进行单变量逻辑斯蒂回归分析，最显著 的变量被加入多变量逻辑斯蒂回归模型。共线性被检查，产生了具有3个变量的 最终模型。
【00431】34位患者(30％)被诊断为ICH，79位患者(70％)被诊断为缺血性中 风。最终的逻辑斯蒂模型包括C-反应蛋白(P＝0.013)、血管内皮生长因子(P＝0.045) 和BNP(P＝0.030)，总P值＜0.01。应用0.215的概率分界，此模型具有94％的灵 敏度、93％的阴性预测值和40％的特异性。当仅包括在症状发生的24小时内出现 的患者时(n＝83，P＜0.05)，同样的3-变量模型是有显著意义的，具有94％的灵敏 度、96％的阴性预测值和48％的特异性。三个生物标志物的组能够在表现中风的 患者中以高的灵敏度排除ICH。这样的组被证明可用于现场检测，以便在治疗干 预之前从具有可疑的缺血性中风的患者中排除ICH。
【00432】尽管本发明已经以充分的细节被描述和示例，使得本领域的技术人员可 以制造并应用它，但是各种替代、修改和改进应该是显而易见的，而且不背离本 发明的精神和范围。
【00433】本领域的技术人员容易地认识到，本发明充分适合于被实施并获得提到 的以及其固有的结果和益处。此处所提供的实施例代表了优选的实施方案，是示 例性的，并不是意图作为本发明范围的限制。对于本领域的技术人员，其修改和 其它用途将会发生。这些修改包括在本发明的精神之内，并且被权利要求的范围 所限定。
【00434】本领域的技术人员将容易地认识到，对于此处所公开的本发明，各种替 代和修改可以被做出，而不背离本发明的范围和精神。
【00435】所有在说明书中提及的专利和出版物提示了本发明所属领域的普通技 术人员的水平。所有的专利和出版物均以相同的程度在此并入作为参考，如同每 一分别的出版物被特定地和分别地指出以并入作为参考。
【00436】此处被阐释性地描述的本发明，可以在缺乏此处未具体公开的任一因素 或多个因素、限制或多个限制的情况下被恰当地实践。因此，例如，在此处的每 一情况下，术语“包括”、“基本上由…组成”和“由…组成”中的任一个可以用 其它两个术语中的任何一个来替代。所应用的术语和表达是描述性的而不是限制 性的，并且这样的术语和表达的应用不是意图于排除任何被显示的和描述的特征 或其部分的等价物，而是应认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改 是可能的。因此，应该理解，虽然已经通过优选的实施方式和任选的特征，具体 公开了本发明，但此处公开的概念的修改和变化可以被本领域的技术人员所采用， 并且，这样的修改和变化在本发明的范围内，如权利要求所限定。
【00437】其它的实施方案在权利要求中提出。
相关专利内容
标题 发布/更新时间 阅读量
用于移除多余的脑脊液的分流系统 2020-05-13 634
一次性脑脊液采集容器套装 2020-05-14 312
脑脊液感染细菌基因检测试剂盒 2020-05-14 89
一种脑脊液穿刺引流器 2020-05-12 513
一种脑脊液抽取工具 2020-05-12 109
脑脊液漏堵塞 2020-05-11 33
一种脑脊液抽取装置 2020-05-12 626
跨越血‑脑脊液屏障的肽 2020-05-15 787
脑脊液抽取器 2020-05-11 662
一种医用脑脊液质控品的制备方法 2020-05-15 994
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。

申请试用

脑脊液热门专利
热门分类
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈
提交反馈
使用该功能遇到问题

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：

购买VIP 申请VIP试用
您也可以联系官方QQ: 2157717237     电话: 13264338900
关于PatentHub
关于我们 使命宗旨 加入我们 联系我们 帮助中心
PatentHub产品
专利百科 专利交易 业务平台 专利交易大厅 专利需求大厅
 
API接口 数据定制 专利资讯 最新中国发明专利 最新美国发明专利 看视频学检索 技术领域 专利库 专利分类库 国际专利分类库
 
历年真题 模拟考试 资料库 问答专区 专栏文章 知识分享 求职 招聘 代理所排行榜 代理人排行榜 代理所地域排行榜 找代理所 找代理人
PatentHub联系方式
官方Q群：924368187 官方Q群：931673531 官方Q群：529775260 商务QQ：2157717237 运营QQ：3307693423 电话：13264338900