技术领域
[0001] 本
发明涉及临床血栓弹力图仪凝血检测项目
质量控制领域，特别涉及一种血栓弹力图仪质控品及其制备方法。
背景技术
[0002] 血栓弹力图仪用于监测血液样品的凝聚状态以辅助患者的临床评估。血栓弹力图仪广泛应用于心脏外科、器官移植、
肿瘤和
放射治疗中或后期的术后出血和(或)血栓形成的情况监测。
[0003] 仪器采用
凝固法，模拟生理血液凝固条件，加入某种
试剂，启动血液凝集反应，使样本中的
纤维蛋白原转化为交联纤维蛋白，使样本发生凝固。仪器内部的
电机驱动承载血标本的样品杯以一定
角度(如4度45分)和周期(如10秒)转动，一旦血栓形成，置于血标本样品杯中的金属探针受到标本的切
应力作用，随之出现左右旋动。金属针的旋动被非
接触式角度旋动
传感器(如电感式角度传感器)感应，转化为电量交给处理器处理，仪器的
软件会自动记录所测血样的动力学变化，便形成凝血曲线。
[0004] 凝血是一个非常复杂的生理生化级联反应，其实质是通过一系列的酶促反应。可分为凝血酶原激活物的形成、凝血酶原的激活和纤维蛋白的生成三个基本步骤。根据凝血酶原激活物形成途径的不同，血液凝固可分为内源性通路凝血、外源性通路凝血和内外源共同通路凝血。其中不同的参数代表的意义如下：
[0005] R值：反应时间，是指血样开始运作至第一
块可检测得到的血
凝块(仪器扫描图上幅度＝2mm)形成所需的时间。R值因抗凝剂及凝血因子缺乏而延长，因血液呈高凝状态而缩短。
[0006] K值：血凝块的形成时间，是指从测量R值终点起(血凝块开始形成)至血凝块硬度达到某一固定
水平(振幅＝20mm)的时间。因此，K值用来评估血凝块强度达到某一水平的速度或动力学特性。K值的缩短受增加的纤维蛋白
原水平的影响，而受到血小板功能的影响则较小。
[0007] Angle值：血凝块逐渐形成的动力学特性，Angle与K时间密切相关，因为两者都是血凝块聚合速度函数。在血液处于低凝状态时，血凝块的最终状况是振幅达不到20mm(此时K无法确定)。因此，Angle比K时间更全面。
[0008] MA值：最大振幅，用来评估已形成的血凝块的最大强度或硬度(最大切应系数)，影响血凝块强度的因素有两个，即纤维蛋白和血小板，其中血小板作用要比纤维蛋白大。
[0009] 随着血栓弹力图仪检测项目不断拓展到
疾病诊断和治疗的各个领域，对检测仪器进行检验室内的质量控制也显得尤为重要。经查询国家食品药品监督管理局
网站，取得血栓弹力图仪质控品注册批文仅有两家单位：一家为进口，市场上限制供应，且价格不菲；一家为国产，没有商品化供应。因此提供一种用猪
血浆制备的血栓弹力图仪质控品方法及制得质控品具有现实意义：一是为本公司研发的血栓弹力图仪临床监测提供质控依据和方法。二是拓宽使用在进口血栓弹力图仪和相关的国产血栓弹力图仪上。
发明内容
[0010] 本发明提供一种对检测仪器变化敏感、检测成本低的血栓弹力图仪质控品。
[0011] 本发明还提供一种所述血栓弹力图仪质控品的制备方法。
[0012] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0013] 一种血栓弹力图仪质控品的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0015] 步骤2，将所述血浆分成2部分，第1部分用于提取纤维蛋白原和凝血因子，第2部分进行适当稀释得到稀释血浆；
[0016] 步骤3，将提取的纤维蛋白原和凝血因子加入稀释血浆中，得到母液，调节R值、K值、Angle值、MA值在L1和L2的范围内，其中L1质控品的范围为R值0-3min、K值0-3min、Angle值77-89deg、MA值44-63mm；L2质控品的范围为R值0-3min、K值0-4min、Angle值68-85deg、MA值24-43mm；
[0017] 步骤4，将步骤3得到的溶液进行分装，冻干即得。本发明所制备的质控品有L1和L 2两种规格，
稳定性好，可满足检验室模拟正常和异常两种血样质控需求。
[0018] 作为优选，步骤2所述的提取纤维蛋白原和凝血因子的方法为：将第1部分血浆置于-20±10℃的环境下24-48小时，然后置于2-8℃的环境下放置12-24小时解冻，再将析出的凝块用丝网过滤，得纤维蛋白原粗品，冲洗溶解冻干备用；
[0019] 上述丝网过滤液离心，收集下部沉淀，得凝血因子粗品，溶解冻干备用。得到的纤维蛋白原粗品的纯度为65-85％。
[0020] 作为优选，第2部分血浆的稀释方法为：取稀释液与血浆以(1-2):(2-3)的体积比混合，控制MA值在40±4mm；稀释液为
柠檬酸钠和
氯化钠的混合溶液，浓度为3.8wt％的柠檬酸钠溶液和浓度为0.9wt％的氯化钠溶液以1:9的体积混合即得。控制MA值在40mm左右的意义在于获得一个适当的体系，为定量加入的纤维蛋白原，确保最终溶液的MA值在55-63mm之间奠定
基础，同时又不至于过多影响后续对R和K的值调节。
[0021] 作为优选，步骤3所述的纤维蛋白原和凝血因子加入方法：将纤维蛋白原的干燥品配制成1g/ml的溶液，按照稀释血浆体积10％加入纤维蛋白原溶液；凝血因子配制成0.3g/ml的溶液，按照稀释血浆体积5％加入凝血因子溶液。
[0022] 作为优选，所配制得母液的R、K、Angle、MA四个参数值在L1的范围内，对母液：稀释液以体积比2:1进行稀释，可制得L2。
[0023] 作为优选，步骤1中的猪全血为生猪屠宰时割破动脉时采集的新鲜血液，抗凝剂为3.8wt％的柠檬酸钠溶液，按血液体积和抗凝剂体积比为9:1轻柔混合均匀。分离血浆的方法可采取离心法或沉降法。离心采用3000rpm/min，10分钟。沉降法可采用4℃环境下沉降
24-48小时。小心吸取上层血浆。
[0024] 作为优选，该方法具体为：
[0025] 步骤1获得猪血浆
[0026] 在生猪屠宰时，割破动脉取得猪全血，将此猪全血和3.8wt％的柠檬酸钠抗凝剂溶液按9:1的体积比例混合，混匀后的全血在2-8℃条件下放置24-48小时分层，吸取上层血浆；或者是将全血通过离心分离血浆，
离心力3000转/分，离心10分钟，得到上层血浆；
[0027] 步骤2提取纤维蛋白原和凝血因子
[0028] 首先取步骤1所得的血浆，置于-20℃冷冻库中24小时，直至冻成
冰块，然后将其置于4-8℃冷藏12-24小时，熔融的血浆中出现白色凝块，用丝网将此白色凝块从血浆中过滤分离，分离的白色凝块即为纤维蛋白原，将此纤维蛋白原冲洗后溶解于生理盐水中，冻干备用；
[0029] 上述丝网过滤液，用冷冻离心机2-4℃9000转/分，离心10分钟收集沉淀物，即得凝血因子粗品，将此沉淀物溶解于生理盐水中，冻干备用；
[0030] 步骤3配制基质血浆
[0031] 取步骤1所得的血浆，首先用血栓弹力图仪复
钙测试R、K、Angle、MA四项参数基础值，该血浆的MA值一般在65-85mm之间，然后根据MA值的大小，用稀释液进行适当稀释，使得稀释血浆的MA值在40-45mm之间，该血浆可作为血栓弹力图仪质控品的基质血浆使用；
[0032] 步骤4配制质控品母液
[0033] 将所得的纤维蛋白冻干粉末用纯化水溶解，配制成浓度为0.5-2g/ml的溶液，即为纤维蛋白溶液；
[0034] 将所得的凝血因子冻干粉末用纯化水溶解，配制成浓度为0.1-0.5g/ml的溶液，即为凝血因子溶液；
[0035] 按照基质血浆使用体积的5-10％加入纤维蛋白溶液，搅匀后得混合溶液1，取样测试，控制混合溶1的MA值控制在55-60mm之间，K值控制在0.5-1.5min之间；
[0036] 将已调制符合要求的混合溶液1，按照基质血浆使用体积的0.5-2％加入凝血因子溶液，搅匀后得混合溶液2。取样测试，控制混合溶2的R值在0.5-1.5min之间，K值控制在0-1.5min之间，Angle值控制在81-89deg之间，MA值控制在55-63mm之间。
[0037] 所得的混合溶液2即为血栓弹力图仪质控品。所得的混合溶液2可以作为质控品母液使用，用于调配L1或L2。
[0038] 作为优选，所得的混合溶液2用稀释液进行适当稀释，混匀后，取样测试，使R值在0-3min之间，K值控制在0-3min之间，Angle值控制在77-89deg之间，MA值控制在44-63mm之间。得到质控品L1。
[0039] 作为优选，所得的混合溶液2用稀释液行适当稀释，混匀后，取样测试，使R值在0-3min之间，K值控制在0-4min之间，Angle值控制在68-85deg之间，MA值控制在24-43mm之间，得到质控品L2。
[0040] 一种根据所述的方法制备获得的血栓弹力图仪血质控品。
[0041] 本发明的有益效果是：
[0042] 1、本发明以猪血为原料制备血栓弹力图仪质控品，主原料猪血为动物产品副产品，来源充足且成本很低。本发明制备工艺简单，所需设备不多，添加剂和调制物少，便于工业化生产；
[0043] 2、制备的质控品有L1和L2两种规格，可模拟正常和异常凝血两种状态。与进口产品相比，产品性能大体一致，对凝血四项参数R、K、Angle、MA均能进行质控监测；
[0044] 3、质控品中的凝血主物料都来自于统一血浆体系，产品相容性好，采取冻干品保存，复溶稳定性好，长期储存稳定性高；
[0045] 4、原料为猪血浆，基本可以排除以人血为基质的可能存在HIV、HBV、HCV
生物危害
风险。本发明采取具有动物检疫合格的生猪血浆，因此其他潜在的生物危害风险也非常小。
[0046] 本发明方法制备的质控品R、Angle、MA四项凝血参数定值区间范围窄，对检测仪器变化敏感，具备校准品的功能。可代替进口质控品用于血栓弹力图仪的检验室控制，方便临床使用，能明显降低检测成本。
具体实施方式
[0047] 本发明公开了一种使用猪血浆制备血栓弹力图仪的质控品的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳
实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用根本发明技术。本发明提供的使用动物血浆制备血栓弹力图仪质控品的方法中使用的原料及试剂均可市场购得。
[0048] 血栓弹力图仪，型号:TEG-5000，厂家:美国Haemoscope公司；
[0049] 血栓弹力图仪，型号:TCA-6000，厂家:浙江盛域医疗技术有限公司。
[0050] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0051] 一、血栓弹力图仪质控品的制备
[0052] 步骤1获得猪血浆
[0053] 在生猪屠宰时，割破动脉取得混合猪全血3L，将3L混合猪全血和3.8wt％柠檬酸钠0.33L(体积比9:1)混合。混匀后的全血在冷藏(2-8℃)条件下放置48小时分层后，小心吸取上层血浆。得总血浆体积约1.4升，下层红细胞舍去不用。
[0054] 注意事项：
[0055] 1、从取得猪全血到和抗凝剂混匀的时间要尽可能的短，因为猪血在见到空气后会快速(1分钟左右)的凝固。混匀时按同一方向搅拌，动作不能过于剧烈，否则血细胞容易破裂，导致后续取得的血浆会带明显的红色。
[0056] 2、如果所得的血浆
颜色偏红，可用少量
活性炭混合后过滤，去除残留在血浆中的少量
破碎红细胞。
[0057] 3、也可采用离心法分离血浆，但此法得到的血浆会存在较多的红细胞，血浆颜
色偏红。
[0058] 步骤2提取纤维蛋白原和凝血因子
[0059] 首先取上述步骤1所得的血浆如1L，置于-20℃冷冻库中24小时，冻成坚硬的冰块，然后将此已结成冰块的血浆置于4-8℃的冷藏库20小时，可看到熔融的血浆中有白色凝块。趁溶液
温度低于10℃时，再轻轻搅拌后用丝网(100目)将此白色凝块从血浆中过滤分离。得到白色凝块(纤维蛋白原)约100克(湿重)，将此纤维蛋白原冲洗后溶解于100ml生理盐水中，分装2ml每瓶，冻干备用。上述丝网过滤液约0.8L用冷冻离心机(2-4℃)9000转/分，离心
10分钟收集沉淀物，即得凝血因子粗品20克(湿重)。将此沉淀物溶解于50ml生理盐水中，分装2ml每瓶，冻干备用。
[0060] 如果使用玻璃瓶做容器，血浆的装量不能过满，防止冷冻时体积膨胀，使玻璃瓶破裂。冻干时分装体积不能过多，一般每瓶高度在1cm左右。
[0061] 步骤3配制基质血浆
[0062] 取上述步骤1所得的血浆0.3L，首先用血栓弹力图仪复钙测试R、K、Angle、MA四项参数基础值，如表1所示。
[0063] 表1
[0064]序号 R(min) K(min) Angle(deg) MA(mm)
1 4.2 1.2 75.1 70.7
2 4.6 1.5 76.8 69.5
[0065] 按照血浆与稀释液1：2的体积比进行稀释混匀后，取样测试，结果如表2所示。稀释液为柠檬酸钠和氯化钠的混合溶液，浓度为3.8wt％的柠檬酸钠溶液和浓度为0.9wt％的氯化钠溶液以1:9的体积混合即得。
[0066] 表2
[0067]序号 R(min) K(min) Angle(deg) MA(mm)
1 2.5 2.6 63.8 41.5
2 2.4 2.5 62.1 42.1
[0068] 由测试结果可知，该血浆的MA值在预设的范围内，可作为血栓弹力图仪质控品的基质血浆使用。
[0069] 步骤4配制质控品母液
[0070] 将步骤2所得的纤维蛋白冻干粉末用纯化水溶解，配制成浓度为1.0g/ml的溶液。
[0071] 将步骤2所得的凝血因子冻干粉末用纯化水溶解，配制成浓度为0.3g/ml的溶液。
[0072] 取基质血浆500ml，加入纤维蛋白溶液50ml(按照基质血浆使用体积10％加入)，搅匀后得混合溶液1，取样测试，混合溶液的测试结果如表3所示。
[0073] 表3
[0074]序号 R(min) K(min) Angle(deg) MA(mm)
1 2.2 1.2 80.3 55.6
2 2.4 1.0 81.2 54.1
[0075] 由测试结果可知，溶液的K、Angle、MA三项参数值在预定的范围内。
[0076] 在混合溶液1中加入凝血因子溶液5ml，(按照基质血浆使用体积的1％加入)，搅匀后得混合溶液2。取样测试，混合溶液的测试结果如表4所示。
[0077] 表4
[0078]序号 R(min) K(min) Angle(deg) MA(mm)
1 0.8 1.0 83.5 57.3
2 1.0 0.9 84.2 56.8
[0079] 由测试结果可知，溶液的R、K、Angle、MA四项参数值在预定的范围内。因此所得的混合溶液2可作为血栓弹力图仪质控品的母液使用。
[0080] 步骤5母液稀释
[0081] L1的制取：由测试参数可知，步骤4所得的质控品母液R、K、Angle、MA四项参数值均在L1要求的范围内，可作直接为L1使用。
[0082] L2的制取：取步骤4所得的质控品母液0.2L，按照母液血浆与稀释液2：1的体积比进行稀释，混匀后取样测试，混合溶液的测试结果如表5所示。
[0083] 表5
[0084]
[0085]
[0086] 由测试结果可知，上述所得的质控品溶液R、K、Angle、MA四项参数值均在L2要求的范围内，可作直接为L2使用。
[0087] 步骤6成品制作
[0088] 将上述所得的L1和L2溶液进行分装，每瓶1ml，半盖瓶塞，用冻干机冻干，
真空状态下压上瓶塞。取出后轧盖，贴上标签，2-8℃冷藏保存。
[0089] 二、血栓弹力图仪质控品的性能检测
[0090] 外观检测：产品为淡黄色至黄色疏松固体。复溶后为均一的溶液，无不溶物。
[0091] 准确度检测：分别取L1和L2冻干产品各1瓶，复温复溶后上机测试，重复测试两次，结果符合表6的范围。
[0092] 表6
[0093]
[0094] 测试结果见表7。
[0095] 表7
[0096]
[0097] 精
密度检测：分别取L1和L2冻干产品各10瓶，复温复溶后上机测试，重复测试10次，要求Angle和MA的CV值≤10％。测试结果见表8和表9：
[0098] 表8 L1精密度测试结果
[0099]
[0100]
[0101] 表9 L2精密度测试结果
[0102]
[0103]
[0104] 由上述测试结果可知：质控品L1和L2的批间差CV值均在规定的范围内。均值±2倍标准差的范围区间范围已经非常狭窄了，可以认为达到“标准品”的范畴了。
[0105] 三、血栓弹力图仪质控品的稳定性检测
[0106] 1、开瓶稳定性检测
[0107] 将实施例中制得的质控品用1ml纯化水准确复溶在室温(15-25℃)条件下保存，定时取样一次，检测四项凝血参数，结果见表10和表11。
[0108] 表10 L1的开瓶稳定性测试数据
[0109] R(min) K(min) Angle(deg) MA(mm)
0小时 0.9 1.0 84.5 57.2
3小时 0.9 1.0 84.6 56.4
6小时 1.0 1.0 83.5 56.0
9小时 1.3 1.4 82.6 53.2
12小时 1.5 1.6 79.2 51.8
24小时 2.0 2.4 75.4 49.5
[0110] 表11 L2的开瓶稳定性测试数据
[0111]
[0112]
[0113] 由上表可知，产品在开瓶9小时以内，产品质量还是较稳定的。24小时以内虽有降解，但还在质控品有效的范围内。因此产品的开瓶稳定性完全符合临床正常检验时限(8小时)的预期要求。
[0114] 2、长期稳定性检测
[0115] 将实施例中制备的质控品冻干品在2-8℃条件下储存，分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24个月时取出复溶测试，检测结果见表12和表13。
[0116] 表12 L1长期稳定性测试数据
[0117] R(min) K(min) Angle(deg) MA(mm)
0个月 0.9 0.9 83.8 57.6
3个月 0.8 1.0 82.6 57.4
6个月 0.9 1.0 83.0 56.8
9个月 1.0 0.9 84.0 54.8
12个月 0.9 1.0 83.5 55.8
15个月 1.0 1.0 82.9 56.8
18个月 1.0 1.0 83.6 54.6
21个月 1.0 0.9 83.0 53.4
24个月 1.0 1.0 82.1 52.6
[0118] 表13 L2长期稳定性测试数据
