一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法及检测非洲猪瘟病毒的试剂盒
阅读：136发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法及检测非洲猪瘟病毒的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及病毒分析检测领域，具体涉及一种消除非洲 猪瘟 病毒检测 假阳性 的方法，是在提取待测样品DNA进行病毒粒子DNA检测之前，加入DNase I与待测样品共孵育。本发明利用Dnase I对样品进行预处理，有效区分了游离ASFV核酸和ASFV粒子，避免了实际检测中出现假阳性的现象，提高了检测的准确性。另外，本发明改善了PCR和qPCR的引物，进一步提高了对ASFV粒子的 检测限 。最后，本发明得到的PCR和qPCR 试剂 盒 ，能够快速 采样 检测，特异性灵敏，价格低廉，具有良好的应用前景。，下面是一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法及检测非洲猪瘟病毒的试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种消除非洲猪瘟病毒粒子检测假阳性的方法，其特征在于，是在提取待测样品DNA进行病毒粒子DNA检测之前，加入DNase I与待测样品共孵育。
2.根据权利要求1所述的消除非洲猪瘟病毒粒子检测假阳性的方法，其特征在于，完成共孵育后再进行DNase I的灭活操作。
3.一种用于检测非洲猪瘟病毒活粒子的引物，其特征在于，所述引物包括ASFV-F和ASFV-R，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.一种用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物。
5.根据权利要求4所述的用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒，其特征在于，所述ASFV-F和ASFV-R的浓度为10μM。
6.根据权利要求5所述的用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNase I。
7.根据权利要求6所述的用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR mix。
8.根据权利要求7所述的用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒，其特征在于，所示试剂盒的反应体系20ul包括：2×Taq Master Mix 10ul，ASFV-F 0.5ul，ASFV-R 0.5ul，dd水7ul，模板2ul。
9.根据权利要求6所述的用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光PCR mix。
10.根据权利要求9所述的用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的的反应体系20ul包括：2×病毒荧光PCR mix 10μL，ASFV-F 0.4ul，ASFV-R0.4ul，dd水7.2μL，病毒DNA模板2μL。
一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法及检测非洲猪瘟病
毒的试剂盒
技术领域
[0002] 非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是被世界动物卫生组织(Office international des epizooties，OIE)列为实时通报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASF是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病。ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)的唯一成员，也是虫媒病毒中唯一的DNA病毒，其基因组为双链DNA，大小为170kb～190kb之间，病毒粒子的外形近似六边形，直径约200nm。ASFV引起家猪和野猪特征性出血和发热，临床症状表现为发烧、皮肤发绀和多脏器广泛性出血，强毒株感染时死亡率高达100％。
[0003] 自1921年在肯尼亚首次报道ASF后，该病主要在非洲地区流行(多次出现跨洲际流行，但均已基本扑灭)；然而，2007年格鲁吉亚暴发ASF，随后该病迅速蔓延至整个高加索地区和俄罗斯；随后，ASF传入东欧多国；2018年8月，ASF传入我国，并迅速蔓延至全国各地，给我国的生猪养殖产业产生了重创，导致了巨大的经济损失和社会影响。
[0004] 当前，针对非洲猪瘟的实验室检测手段存在一定的局限性。主要有抗原检测以及核酸检测，抗原检测包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体试验、免疫层析试纸条等技术。但是抗原检测的灵敏性低于聚合酶链式反应(PCR)等手段，且结果易出现假阳性，准确性不高。
[0005] 核酸检测包括PCR、实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)等，qPCR因其特异性高、敏感性好是目前应用最广泛的检测技术。经相关研究，无病毒活性的核酸阳性的样品饲喂仔猪，并不会引起其感染ASFV。但是，大家对ASFV核酸阳性产品避之不及，唯恐产品中含ASFV，核酸阳性结果势必造成一定的恐慌，尤其是饲料企业饱受打击，饲料产品的销售难以保障。
[0006] 因此，活病毒的检测显得十分重要。
[0007] 现阶段，活病毒检测通常包括病毒分离和红细胞吸附试验(Hemoadsorption test，HAD)。但是目前国内仅有少数机构实验室具有开展ASFV活病毒实验的资质，多数实验室无法进行，这使得活病毒检测实施困难。病毒分离和HAD测定需要消耗珍贵的仔猪原代骨髓细胞或肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophage，PAM)，但也只能检测到具有红细胞吸附特性的ASFV毒株，红细胞吸附试验一般需要7-15天，耗时较长。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术中非洲猪瘟病毒检测过程中核酸阳性和病毒阳性区分困难的问题，提供了一种消除非洲猪瘟病毒粒子检测假阳性的方法。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种用于检测非洲猪瘟病毒活粒子的引物。
[0010] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒。
[0011] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0012] 一种消除非洲猪瘟病毒粒子检测假阳性的方法，是在提取待测样品DNA进行病毒粒子DNA检测之前，加入DNase I与待测样品共孵育。
[0013] 在血液、粪便、土壤、饲料或动物肉制品等样品中，可能只含有游离的ASFV核酸，并不存在ASFV病毒活粒子。如果直接对样品中DNA进行检测，那么只含有游离ASFV核酸的样品也会显示为阳性。因此，本发明通过用DNase I(Deoxyribonuclease I，脱氧核糖核酸酶Ⅰ)对样品进行预处理，使得样品中游离的ASFV核酸水解。然后再通过抽提DNA进行DNA检测，即可以达到准确检测ASFV病毒活粒子的效果，从而消除以往检测非洲猪瘟活病毒粒子存在假阳性的问题。
[0014] 具体的，上述非洲猪瘟病毒粒子检测假阳性的方法中，是加入活性单位大于20U的DNase I，在37℃孵育1h。
[0015] 上述活性单位的定义为：37℃，10分钟内，将能够完全降解1μg DNA所需的酶量定义为1个活性单位。
[0016] 在此基础上，本发明还提供一种用于检测非洲猪瘟病毒活粒子的引物，其特征在于，所述引物包括ASFV-F和ASFV-R，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0017] 本发明以非洲猪瘟病毒DNA pp220(CP2475L)为目标片段，通过引物设计和筛选，获得一对能特异性扩增该目标片段的引物，从而能够特异性检测病毒活粒子。
[0018] 所述ASFV-F和ASFV-R对非洲猪瘟病毒DNA pp220(CP2475L)特异性扩增出255bp的产物。
[0019] SEQ ID NO.1：5’-AGTCCCACGGAAAGCG-3’
[0020] SEQ ID NO.2：5’-GCGGCTGAAATCCAACAA-3’。
[0021] 本发明还提供一种用于检测检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物ASFV-F和ASFV-R。
[0022] 优选的，所述ASFV-F和ASFV-R的浓度为10μM。
[0023] 优选的，该试剂盒还包括DNase I，DNase I的存在可以用于对样品进行预处理，使得样品中游离的ASFV核酸水解。然后再进行DNA检测，即可以达到准确检测ASFV病毒活粒子的效果，从而消除以往检测非洲猪瘟活病毒粒子存在假阳性的问题。
[0024] 优选的，该试剂盒还包括真阳性对照、假阳性对照和阴性对照，所述真阳性对照是含有255bp阳性片段的甘油菌，假阳性对照为非洲猪瘟病毒核酸、阴性对照为dd水。
[0025] 本发明上述试剂盒可以用常规的扩增手段检测得到，例如可以用于PCR检测，也可以灵敏度和检测效率更高的qPCR来检测。
[0026] 当该试剂盒用于PCR检测时，所述试剂盒还包括PCR mix。优选的，所示试剂盒的反应体系20ul包括：2×Taq Master Mix 10ul，ASFV-F 0.5ul，ASFV-R 0.5ul，dd水(无菌超纯水)7ul，模板2ul。PCR扩增程序为：预变性98℃，3min；变性98℃，10s；退火52～65℃，15s；延伸72℃，30s；37个循环；终延伸72℃，3min；4℃保存。
[0027] 利用上述试剂盒进行PCR检测非洲猪瘟病毒活粒子的过程如下：
[0028] S1.样品处理：将待测样品混匀，离心；
[0029] S2.取上清液，加入活性单位大于20U的DNase I，在37℃孵育1h；
[0030] S3.将经由步骤S2处理样品进行DNase I灭活处理；
[0031] S4.提取经由步骤S3处理之后样品中的DNA；
[0032] S5.以ASFV-F和ASFV-R为引物进行PCR扩增；
[0033] S6.结果判读：当特异性扩增出255bp的片段时，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒活粒子；反之，则待测样品中不含非洲猪瘟病毒活粒子。
[0034] 当该试剂盒用于qPCR来检测时，所述试剂盒还包括荧光PCR mix。优选的，所述试剂盒的的反应体系20ul包括：2×病毒荧光PCR mix 10μL，ASFV-F 0.4ul，ASFV-R 0.4ul，dd水7.2μL，病毒DNA模板2μL。qPCR的扩增条件：预变性95℃，5min；变性95℃，15s，退火58℃，20s，延伸70℃，30s；循环40次，每次循环于70℃时收集荧光信号。
[0035] 利用上述试剂盒进行qPCR检测非洲猪瘟病毒活粒子的过程如下：
[0036] S1.样品处理：将待测样品混匀，离心；
[0037] S2.取上清液，加入活性单位大于20U的DNase I，在37℃孵育1h；
[0038] S3.将经由步骤S2处理样品进行DNase I灭活处理；
[0039] S4.提取经由步骤S3处理之后样品中的DNA；
[0040] S5.以ASFV-F和ASFV-R为引物进行qPCR扩增；
[0041] S6.结果判读：当样品的ct值<35时，可判断待测样品中含有病毒活粒子，当样品的ct值大于35小于37被判为可疑，可疑样品应当重新处理，提取核酸再次检测，若仍为可疑，且有典型熔解峰(Tm约等于86℃)，可判为阳性；阴性对照应无扩增曲线，没有ct值或ct值≥37；若有熔解曲线，熔解峰偏离86℃。
[0042] 本发明上述非洲猪瘟病毒活病毒粒子检测试剂盒可用于检测液、粪便、土壤、饲料或动物肉制品中非洲猪瘟病毒。
[0043] 与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
[0044] 本发明提供的一种检测非洲猪瘟病毒粒子的方法，利用Dnase I对样品进行预处理，有效区分了游离ASFV核酸和ASFV病毒粒子，避免了实际检测中出现假阳性的现象，提高了检测的准确性。另外，本发明改善了PCR和qPCR的引物，进一步提高了对ASFV粒子的检测限。最后，本发明得到的PCR和qPCR试剂盒，能够快速采样检测，特异性灵敏，价格低廉，具有良好的应用前景。附图说明
[0046] 图2为实施例1检测方法对不同拷贝数猪瘟病毒粒子的电泳检测图；
[0047] 图3为PCR不同退火温度得到的扩增产物的电泳检测图；
[0048] 图4为实施例1检测方法对仔猪血清检测的电泳检测图；
[0049] 图5为实施例1检测方法对粪便、土壤、香肠实际样品检测的电泳检测图；
[0050] 图6为实施例2染料qPCR的扩增曲线图；
[0051] 图7为实施例2染料qPCR的标准曲线图；
[0052] 图8为实施例2染料qPCR扩增产物熔解曲线图；
[0053] 图9为Taqman探针qPCR的扩增曲线图；
[0054] 图10为Taqman探针qPCR的标准曲线图。
具体实施方式
[0055] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和说明书附图将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0056] 除特殊说明，本实施例以及实验例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂无特殊说明均为市售得到。
[0057] 病毒为“中国非洲猪瘟区域实验室(广州)”保存毒株ASFV/China/GZ201801，以PAM细胞繁殖。所有活病毒相关实验均在动物P3生物安全实验室进行。2×Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。PCR Mix购自哈尔滨元亨生物药业有限公司。2×病毒荧光PCR mix购自北京康润诚业生物科技有限公司。检测引物由InvitrogenTM公司合成。
[0058] 实施例1
[0059] 一种消除非洲猪瘟活病毒粒子检测假阳性的PCR方法，包括以下步骤：
[0060] S1.样品处理；
[0061] 猪血液样品采用3000转离心5分钟收集上层血清备用。
[0063] S2.在步骤S1中加入25U的DNase I，在37℃孵育1h；
[0064] S3.在75℃条件下将DNase I灭活10min；
[0065] S4.提取步骤S3活病毒粒子的DNA；提取DNA的方法采用常规提取法；
[0066] S5.以步骤S4提取的DNA作为模板，以ASFV-F和ASFV-R为引物进行PCR检测。
[0067] 以ASFV-F和ASFV-R为引物的序列如下：
[0068] ASFV-F：5’-AGTCCCACGGAAAGCG-3’(SEQ ID NO.1)。
[0069] ASFV-R：5’-GCGGCTGAAATCCAACAA-3’(SEQ ID NO.2)。
[0070] 以2×Taq Master Mix配置20ul体系：2×Taq Master Mix 10ul，ASFV-F 0.5ul(10uM)，ASFV-R 0.5ul(10uM)，dd水7ul，模板2ul。扩增程序:预变性98℃，3min；变性98℃，10s；退火57℃，15s；延伸72℃，30s，37个循环；终延伸72℃，3min；4℃保存。取8μL PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据DNA条带的有无及大小判断是否含有ASFV粒子。
[0071] 以ASFV-DNA为模板，ASFV-F和ASFV-R为引物扩增目的基因，连接至pMD-19T simple(TaKaRa,Japan)质粒，从而构建阳性标准对照质粒pMD-19T-pp220(PC)。以dd水为阴性对照组(NC)。参照泳道为DNA Maker DL2000(M)。
[0072] 一、对ASFV病毒粒子的区分
[0073] 采集健康、非洲猪瘟阴性仔猪新鲜血液，3000转离心5分钟收集上层血清备用。取三份血清，一份加入游离ASFV-DNA、第二份加入ASFV-Virion(非洲猪瘟病毒粒子)、第三份加入ASFV-DNA和ASFV-Virion，并按照表1的处理方法进行处理，再进行实施例1的PCR测试，结果如表1、图1所示。
[0074] 表1 PCR检测方法辨别非洲猪瘟病毒核酸和病毒粒子
[0075]
[0076] 从表1、图1可以看出游离ASFV-DNA没有经过DNase I处理PCR为阳性，而经过DNase I处理之后PCR测定结果为阴性。不管是否经过DNase I处理，ASFV-Virion的PCR检测结果为阳性，ASFV-DNA和ASFV-Virion混合物的PCR检测结果也为阳性。进一步，从图1可以看出ASFV-DNA和ASFV-Virion混合物未经DNase I处理的条带的颜色深于经过DNase I处理的条带颜色。说明游离ASFV-DNA可以产生假阳性，并且采用本发明的方法可以区别游离ASFV-DNA和ASFV-Virion。
[0077] 二、PCR灵敏性试验
[0078] 10倍倍比稀释对照质粒pMD-19T-pp220(泳道1至9分别对应3.0×108、3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101、3.0×100单位：copies/μl)，以1ul此系列质粒作为模板，进行PCR扩增，用1.5％琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，测试结果如图2所示。
[0079] 从图2可以看出当模板拷贝数为3.0×102时，出现明显DNA带，因此本发明建立的检测方法灵敏，检测限为3.0×102copies。
[0080] 三、PCR检测方法的退火温度选择
[0081] 改变实施例1中PCR退火温度，泳道1至12的退火温度依次为：52℃、52.6℃、53.3℃、54.6℃、56.1℃、57℃、59.2℃、60.8℃、62.4℃、63.7℃、64.3℃、65℃。用1.5％琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，测试结果如图3所示。
[0082] 如图3所示，实验验证52～65℃均可扩增出阳性目的片段，但在63.7～65℃范围出现大于目的片段的非特异性扩增。因此，选取最佳扩增温度为57℃。
[0083] 四、抗干扰实验
[0084] 用实际猪血清进行实施例1的PCR检测方法的抗干扰性实验，PCR扩增之后用1.5％琼脂糖电泳检测。电泳中不同泳道样品的处理方法如下：1、健康、阴性仔猪血清；2、经过DNase I处理的病毒核酸与dd水混合物；3、病毒核酸与dd水混合物；4、经过DNase I处理的病毒核酸与仔猪血清混合物；5、病毒核酸与仔猪血清混合物；6、经过DNase I处理的病毒粒子与仔猪血清混合物；7、病毒粒子与仔猪血清混合物。将上述各组样品按照各组的处理方法处理，然后通过实施例1的PCR方法扩增，然后用1.5％琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，测试结果如图4所示。
[0085] 从图4可知，泳道2和泳道4对比，经过实施例1的方法，游离的病毒核酸在dd水和仔猪血清中都不会产生阳性检测。泳道4和泳道5对比，游离的核酸不经DNase I处理会产生假阳性的结果。泳道6和泳道7对比，说明在实际血清样品中实施例1的方法仍可以准确检测。
[0086] 用实际粪便浸出液进行实施例1的PCR检测方法的抗干扰性实验，PCR扩增之后用1.5％琼脂糖电泳检测。电泳中不同泳道样品的处理方法如下：1、阴性粪便浸出液；2、含有病毒核酸的粪便浸出液；3、经过DNase I处理的病毒核酸粪便浸出液混合物；4、阴性土壤浸出液；5、含有病毒核酸的土壤浸出液；6、经过DNase I处理的病毒核酸土壤浸出液混合物；
7、阴性香肠浸出液；8、含有病毒核酸的香肠浸出液；9、经过DNase I处理的病毒核酸香肠浸出液混合物。将上述各组样品按照各组的处理方法处理，然后通过实施例1的PCR方法扩增，然后用1.5％琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，测试结果如图5所示。
7、阴性香肠浸出液；8、含有病毒核酸的香肠浸出液；9、经过DNase I处理的病毒核酸香肠浸出液混合物。将上述各组样品按照各组的处理方法处理，然后通过实施例1的PCR方法扩增，然后用1.5％琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，测试结果如图5所示。
[0087] 从图5可以看出，泳道1和泳道3为阴性，泳道2为阳性，说明实施例1的方法对粪便浸出液中游离核酸的检测为阴性。泳道4和泳道6为阴性，泳道5为阳性，说明实施例1的方法对土壤浸出液中游离核酸的检测为阴性。泳道7和泳道9为阴性，泳道8为阳性说明实施例1的方法对香肠样品浸出液中游离核酸检测为阴性。
[0088] 综上，实施例1的方法可以应用到实际样品中区分游离核酸和病毒粒子，防止检测中出现假阳性的问题，同时还能特异性检测出病毒粒子。
[0089] 实施例2
[0090] 一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的qPCR方法，包括以下步骤：
[0091] S1.样品处理：
[0092] 猪血液样品采用3000转离心5分钟收集上层血清备用。
[0093] 粪便、土壤、饲料、香肠等样品的处理具体包括：取样品研磨后加入水，制成质量分数为8～12％的悬浮液，充分振动涡旋，12000～15000转离心10～15min之后过滤保留滤液备用。
[0094] S2.在步骤S1中加入25U的DNase I，在37℃孵育1h；
[0095] S3.在75℃条件下将DNase I灭活10min；
[0096] S4.提取步骤S3的病毒粒子的DNA；提取DNA的方法采用常规提取法；
[0097] S5.以步骤S4提取的DNA作为模板，以ASFV-F和ASFV-R为引物进行qPCR检测。
[0098] 以ASFV-F和ASFV-R为引物的序列如下：
[0099] ASFV-F：5’-AGTCCCACGGAAAGCG-3’(SEQ ID NO.1)。
[0100] ASFV-R：5’-GCGGCTGAAATCCAACAA-3’(SEQ ID NO.2)。
[0101] qPCR体系20μL，包括2×病毒荧光PCR mix 10μL，10μM的引物ASFV-F和ASFV-R各0.4μL，dd水7.2μL，非洲猪瘟病毒DNA模板2μL。qPCR扩增程序为：预变性95℃，10min；变性95℃，15s，退火57℃,1min并收集荧光信号，进行40个循环。2×病毒荧光PCR mix包含SYBR Green I染料。
[0102] qPCR检测方法标准曲线绘制
[0103] 根据RaPure Viral RNA/DNA Kits(广州美基生物科技有限公司)的说明提取ASFV-DNA。以ASFV-DNA为模板，加入2×病毒荧光PCR mix，以ASFV-F和ASFV-R为引物扩增目的基因，将扩增基因连接至pMD-19T simple(TaKaRa,Japan)质粒，从而构建质粒pMD-19T-pp220。10倍倍比稀释pMD-19T-pp220质粒(3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101、3.0×100；单位为：copies/μl)，进行实施例2的qPCR试验。qPCR的扩增曲线如图6所示(图中曲线由左向右对应的浓度依次为(3.0×107、3.0×106、3.0×105、
3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101、3.0×100；单位为：copies/μl))。根据获得对应的Ct值，从而绘制标准曲线，如图7所示。根据标准曲线得到的标准方程为：y＝-3.392X+41.1。
并对扩增产物熔解测试，结果如图8所示。
3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101、3.0×100；单位为：copies/μl))。根据获得对应的Ct值，从而绘制标准曲线，如图7所示。根据标准曲线得到的标准方程为：y＝-3.392X+41.1。
并对扩增产物熔解测试，结果如图8所示。
[0104] 从图6、图7看出当模板质粒小于3.0×101拷贝数时，数据结果分析，Ct值≥35，与7 6
标准曲线拟合度不好，脱离线性范围。当阳性模板质粒拷贝数依次为3.0×10 、3.0×10 、
3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101时，线性关系较好。如图8，以ASFV的SYBR Green I实时PCR扩增产物Tm值约为86℃，结合熔解峰可以判断扩增产物为目的基因。
标准曲线拟合度不好，脱离线性范围。当阳性模板质粒拷贝数依次为3.0×10 、3.0×10 、
3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101时，线性关系较好。如图8，以ASFV的SYBR Green I实时PCR扩增产物Tm值约为86℃，结合熔解峰可以判断扩增产物为目的基因。
[0105] 一、qPCR灵敏性
[0106] 根据RaPure Viral RNA/DNA Kits(广州美基生物科技有限公司)的说明，提取ASFV-DNA。以ASFV-DNA为模板，以SEQ ID NO.5为荧光探针(SEQ ID NO.5：5'FAM-TTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTT-TAMRA3')，以上游引物SEQ ID NO.3(5’-TGCTCATGGTATCAATCTTATCG-3’)和下游引物SEQ ID NO.4(5’-CCACTGGGTTGGTATTCCTC-3’)为引物扩增目的基因，将扩增基因连接至pMD-19T simple(TaKaRa,Japan)质粒，从而构建阳性质粒pMD-19T-Taq。10倍倍比稀释pMD-19T-Taq质粒(3.0×106、3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101、3.0×100copies/μl)，进行探针qPCR试验，探针qPCR的扩增曲线如图9所示。根据获得对应的Ct值，从而绘制标准曲线，如图10所示。根据标准曲线得到的标准方程为：y＝-3.157X+41.98。
[0107] 如图9和图10可知，当模板质粒小于3.0×102拷贝数时，数据结果分散，Ct值≥35，与标准曲线拟合度不好，脱离线性范围。如图9(图中从做向右的曲线对应浓度依次为3.0×106、3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101)当阳性模板质粒拷贝数依次为3.0×106、3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101时，线性关系较好：因此，检测方法最佳检测范围为起始浓度≥3.0×101copies/μl。
[0108] 与上述国家标准检测非洲猪瘟的探针荧光PCR法的检测结果对比可以看出，实施例1的PCR检测限为3.0×102copies/μl，实施例2的新建的染料qPCR的检测限为3.0×101copies/μl；而国家标准的检测限为3.0×102copies/μl。说明本发明构建的PCR以及qPCR的检测方法的灵敏度符合国家标准的检测方法，适合用于非洲猪瘟病毒的检测。
[0109] 实施例3用于检测非洲猪瘟病毒活粒子的试剂盒
[0110] 一、适应于PCR的试剂盒
[0111] PCR试剂盒组成如表2所示。
[0112] 表2 PCR试剂盒组成
[0113]
[0114]
[0115] 其中，校准样品V为含有255bp阳性片段的甘油菌；校准样品D为非洲猪瘟病毒核酸。
[0116] PCR试剂和校准操作如表3所示。
[0117] 表3 PCR试剂和校准
[0118]
[0119] 注：DNase I行中“+”表示添加DNase I，“-”表示未添加DNase I。PCR行中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR结果如表3所示，即校准成功。
[0120] 二、适用于qPCR的试剂盒
[0121] qPCR试剂盒组成如表4所示。
[0122] 表4 qPCR试剂盒组成
[0123]
[0124] 其中，2×病毒荧光PCRmix中含有染料；校准样品V为含有255bp阳性片段的甘油菌；校准样品D为非洲猪瘟病毒核酸。qPCR试剂和校准操作如表5所示。
[0125] 表5 qPCR试剂和校准
[0126]
[0127] 注：DNase I行中“+”表示添加DNase I，“-”表示未添加DNase I。qPCR行中“+”表示阳性，“-”表示阴性。qPCR结果如表5所示，即校准成功。
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