[0002] 不适用。
技术领域
[0003] 本
发明大体上涉及医学应用中的
纳米技术领域。具体而言，本发明涉及用于病状的诊断和治疗的靶向纳米颗粒。
背景技术
[0004] 在数种病状的诊断和治疗中，监测有效
载荷并将其递送至活化的免疫细胞是至关重要的过程。例如，在动脉粥样硬化斑
块中，已知活化的巨噬细胞的高的广泛性与斑块成熟度和易感性潜能有关。靶向此类巨噬细胞的显像纳米颗粒被认为是识别斑块的方法。对斑块中的其它免疫细胞进行显像将大大提高该方法的灵敏度和潜在的特异性。
[0005] 公认的是
肿瘤转移了肿瘤相关免疫细胞的功能以使肿瘤细胞能够逃逸。
癌症免疫疗法领域的关键目标是监测肿瘤内免疫细胞广泛性(以此作为治疗功效的标准)的能
力。
[0006] 持续需要开发有效的靶向方法和系统，以用于各种
疾病的改善的诊断和治疗。
发明内容
[0007] 本文描述了具有下式的化合物或整合素靶向剂，所述化合物或整合素靶向剂包括其光学异构体和药学上可接受的盐：
[0008]
[0009] 其中，在每次出现时，R1独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷
氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基
氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、-N(C1-C3烷基)SO2(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)SO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧
醛(carboxaldehyde)、羧胺(carboxamide)、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基
甲酸酯、芳氧基烷基、OCF2、OCH2CF3、脂肪族酰基、O(环烷基烷基)、O(芳烷基)、-SO2(1-吡咯烷基)、SO2(1-哌啶基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；Z为N或CR2；当存在时，R2和R3各自独立地选自于由以下所组成的组：氢、卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基和-C(O)NH(苄基)基团；并且其中，当存在时，R2可与R3一起形成环；在每次出现时，R4独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、羟基烷氧基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3烷基)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、O(卤代烷基)、O(环烷基)、O(环烷基烷基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；R1、R2、R3和R4独立地未被取代或被至少一个供
电子基团或吸电子基团取代；在每次出现时，R5独立地选自于由烷基或烯基基团所组成的C7-C21链；在每次出现时，m和p独立地为0-5的整数；L1为3-14个
原子的链，所述链包含-CH2-、-C(O)-、-NH-、-S-、-S(O)-、-O-、-C(O)O-或-S(O)2-的任何组合；X选自于由以下所组成的组：s为1-2的整数；L2为-(CH2CH2O)n-链，其中n为7-
115的整数；以及Y为(CH2)q，其中q为0-2的整数；其中，所述化合物具有2000-7000的平均分子量。
[0010] 在一个实施方式中，所述化合物具有下式：
[0011]
[0012] 其中，在每次出现时，R1独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、烷氧基、硫代烷氧基，羟烷基、-CF3、-CN、-NO2、-NH2、-OH、-NHSO2(C1-C3烷基)、烷氧基烷基、烷基氨基、环烷基、芳烷基，-SO2(烷基)、-OCF2、脂肪族酰基、-OCH2CF3、烷氧基烷氧基、-O(环烷基烷基)、-O(芳烷基)、-SO2(1-吡咯烷基)、-SO2(1-哌啶基)、哌啶基和吡咯烷基基团，其中R1各自独立地未被取代或被至少一个供电子基或吸电子基团取代；Z为N或CR2；当存在时，R2和R3各自独立地选自于由氢、卤素和低级烷基基团所组成的组；并且其中，当存在时，R2可与R3一起形成环，并且其中，当存在时，R2和R3各自独立地未被取代或被至少一个供电子基团或吸电子基团取代；在每次出现时，R4独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、烷氧基、硫代烷氧基、羟烷基、羟基烷氧基、-CF3、-NH2、-OH、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、二(C1-C3烷基)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、环烷基、芳基、磺酰氨基、O(卤代烷基)、O(环烷基)、O(环烷基烷基)、哌啶基和吡咯烷基基团，其中，R4各自独立地未被取代或被至少一个供电5
子基团或吸电子基团取代；在每次出现时，R独立地选自于由烷基或烯基基团所组成的C7-C21链；在每次出现时，m和p独立地为0-5的整数；L1为3-14个原子的链，所述链包含-CH2-、-C(O)-、-NH-、-S-、-S(O)-、-O-、-C(O)O-或-S(O)2-的任何组合；X选自于由以下所组成的组：
2
s为1-2的整数；L为-(CH2CH2O)n-链，其中n为38-115的整数；以及Y为(CH2)q，其中q为0-2的整数。在一个实施方式中，R5各自为(CH2)rCH3，其中，r为10-20。
[0013] 在一个实施方式中，所述化合物具有下式：
[0014]
[0015] 其中，n为38-115的整数。
[0016] 在一个实施方式中，L1为1,8-(3,6-二氧杂)辛-二-基基团、1,5-(3-氧杂)戊-二-基基团或C3-C12烷-二-基基团。
[0017] 在一个实施方式中，所述化合物具有下式：
[0018]
[0019] 其中，R6各自独立地选自于由氢、低级烷基和羟烷基所组成的组；其中，m和p各自独立地为0-4的整数。
[0020] 在一个实施方式中，所述化合物具有如下结构：
[0021]
[0022] 在一个实施方式中，所述化合物具有如下结构：
[0023]
[0024] 在一个实施方式中，所述化合物具有下式：
[0025]
[0026] 在一个实施方式中，本公开的化合物使得MRI图像能够生成。在一些情况下，此类MRI图像是在临床上相关的场强(例如1特斯拉场强)下生成的。
[0027] 本文还公开了一种组合物，所述组合物包含平均直径小于400纳米的多个脂质体，其中，所述多个脂质体包含：第一脂质或磷脂；用
聚合物衍生的第二脂质或磷脂；能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂(sterically bulky excipient)；用由整合素靶向成分封端的聚合物衍生的第三脂质或磷脂；以及任选地，用结合对比增强剂的基团衍生的第四脂质或磷脂或DSPE，其中，所述多个脂质体任选地包封由一种或多种
生物活性剂所组成的有效载荷成分。在其中第四脂质或磷脂不存在的实施方式(例如阿霉素制剂)中，余量为DPPC，其与第一脂质或磷脂相同。本文使用的对比增强剂为使得能够获得图像或生成图像或增强在临床环境中获得的图像的
质量的对比增强剂。
[0028] 在一个实施方式中，组合物包含多个脂质体，所述脂质体包含：第一脂质或磷脂；用聚合物衍生的第二脂质或磷脂；能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂；用由整合素靶向成分封端的聚合物衍生的第三脂质或磷脂；用结合对比增强剂的基团衍生的第四脂质或磷脂或DSPE，其中，所述多个脂质体任选地包封由一种或多种生物活性剂、罗丹明、DHPE或碘对比剂所组成的有效载荷成分；其中，所述多个脂质体平均直径小于400纳米。
[0029] 在一个实施方式中，所述第一脂质或磷脂包含DPPC或HSPC。HSPC表示氢化大豆磷脂酰胆
碱。在一个实施方式中，所述用聚合物衍生的第二脂质或磷脂包含mPEG(2000)-DSPE。在一个实施方式中，所述用由整合素靶向成分封端的聚合物衍生的第三脂质或磷脂为本文讨论的化合物。
[0030] 在一个实施方式中，由用结合非
放射性对比增强剂的基团衍生的任选的第四脂质或磷脂为双硬脂酰胺-DTPA-Gd。在一个实施方式中，由结合非放射性对比增强剂的基团衍生的可选的第四脂质或磷脂为Gd-DOTA-DSPE。DOTA表示1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。DSPE代表1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰
乙醇胺。在一个实施方式中，所述第一脂质或磷脂、所述用聚合物衍生的第二脂质或磷脂、所述能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂、以及所述用结合非放射性对比增强剂的基团衍生的第四脂质或磷脂以约
30-32:3:40:25的摩尔比存在。
[0031] 在一个实施方式中，所述用由整合素靶向成分封端的聚合物衍生的脂质或磷脂由0.05％-2.0％(摩尔百分比)的本文所讨论的化合物组成。在一个实施方式中，将能够结合非放射性钆盐的任选的第四脂质取代为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。在一个实施方式中，所述生物活性剂选自包括以下的组：阿霉素、紫杉醇、道诺霉素、长春新碱、维甲酸、
顺铂、安那霉素(annamycin)、长春瑞滨、
盐酸伊立替康(irinotecan HCl)或氟尿苷。在一个实施方式中，所述脂质体的平均直径为约150nm。在一个实施方式中，所述脂质体的平均直径小于250nm。在一个实施方式中，所述生物活性剂包括选自于由以下所组成的组的至少一种：
化学治疗剂、基因、
蛋白质、小分子和肽。
[0032] 在一个实施方式中，能够使用选自于由以下所组成的组的至少一种来检测所述组合物：CT、微CT、乳房X线照相术(mammography)、
X射线、MRI、磁共振波谱学、生物发光显像、超声、光学显像、
光谱学、
荧光光谱学、荧光显像、
近红外光谱学和近红外显像。在各种实施方式中，将所述组合物用于显像模式中或用于药物递送。在一个实施方式中，本公开的组合物使得MRI图像能够生成。在一个实施方式中，本公开的组合物使得MRI图像能够在临床相关的场强(例如1特斯拉场强)下生成。
[0033] 本文还公开了生产脂质体的方法，所述方法包括将第一脂质或磷脂与用聚合物衍生的第二脂质或磷脂、用于稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂、用由整合素靶向成分封端的聚合物衍生的第三脂质或磷脂以及能够结合非放射性对比剂的第四脂质或磷脂或DSPE组合，以及挤出，以形成小于400nm的颗粒。
[0034] 在一个实施方式中，所述脂质体包含对比增强剂。在一个实施方式中，所述脂质体包封了由一种或多种生物活性剂组成的有效载荷成分。
[0035] 在一个实施方式中，所述整合素靶向成分具有2000-7000的分子量，包括其光学异构体和药学上可接受的盐，并且具有下式：
[0036]
[0037] 其中，在每次出现时，R1独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、-N(C1-C3烷基)SO2(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)SO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、OCF2、OCH2CF3、脂肪族酰基、O(环烷基烷基)、O(芳烷基)、-SO2(1-吡咯烷基)、SO2(1-哌啶基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；Z为N或CR2；当存在时，R2和R3各自独立地选自于由以下所组成的组：氢、卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基和-C(O)NH(苄2 3 4
基)基团；并且其中，当存在时，R可与R一起形成环；在每次出现时，R独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3烷基)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、O(卤代烷基)、O(环烷基)、O(环烷基烷基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；R1、R2、R3和R4独立地未被取代或被至少一个供电子基团或吸电子基团取代；在每次出现时，R5独立地选自于由烷基或烯基基团所组成的C7-C21链；在每次出现时，m和p独立地为0-5的整数；L1为3-14个原子的链，所述链包含-CH2-、-C(O)-、-NH-、-S-、-S(O)-、-O-、-C(O)O-或-S(O)2-的任何组合；
[0038] X选自于由以下所组成的组：
[0039] s为1-2的整数；L2为-(CH2CH2O)n-链，其中n为38-115的整数；以及Y为(CH2)q，其中q为0-2的整数。
[0040] 在一个实施方式中，所述整合素靶向成分具有下式：
[0041]
[0042] 其中，在每次出现时，R1独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、烷氧基、硫代烷氧基、羟烷基、-CF3、-CN、-NO2、-NH2、-OH、-NHSO2(C1-C3烷基)、烷氧基烷基、烷基氨基、环烷基、芳烷基，-SO2(烷基)、-OCF2、脂肪族酰基、-OCH2CF3、烷氧基烷氧基、-O(环烷基烷基)、-O(芳烷基)、-SO2(1-吡咯烷基)、-SO2(1-哌啶基)、哌啶基和吡咯烷基基团，其中，R1各自独立地未被取代或被至少一个供电子基或吸电子基团取代；Z为N或CR2；当存在时，R2和R3各自独立地选自于由氢、卤素和低级烷基基团所组成的组；并且其中，当存在时，R2可与R3一起形成环，并且其中，当存在时，R2和R3各自独立地未被取代或被至少一个供电子基团或吸电子基团取代；在每次出现时，R4独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、烷氧基、硫代烷氧基、羟烷基、羟基烷氧基、-CF3、-NH2、-OH、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基，二(C1-C3烷基)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、环烷基、芳基、磺酰氨基、O(卤代烷基)、O(环烷基)、O(环烷基烷基)、哌啶基和吡咯烷基基团，其中，R4各自独立地未被取代或被至少一个供电子基团或吸电子基团取代；在每次出现时，R5独立地选自于由烷基或烯基基团所组成的C7-C21链；在每次出现时，m和p独立地为0-5的整数；L1为3-14个原子的链，所述链包含-CH2-、-C(O)-、-NH-、-S-、-S(O)-、-O-、-C(O)O-或-S(O)2-的任何组合；
[0043] X选自于由以下所组成的组：s为1-2的整数；L2为-
(CH2CH2O)n-链，其中n为38-115的整数；以及Y为(CH2)q，其中q为0-2的整数。
[0044] 在一个实施方式中，R5各自为(CH2)rCH3，其中，r为10-20。
[0045] 在一个实施方式中，所述整合素靶向成分具有下式：
[0046]
[0047] 其中，n为38-115的整数。
[0048] 在一个实施方式中，所述L1为1,8-(3,6-二氧杂)辛-二-基基团、1,5-(3-氧杂)戊-二-基基团或C3-C12烷-二-基基团。
[0049] 在一个实施方式中，所述整合素靶向成分具有下式：
[0050]
[0051] 其中，R6各自独立地选自于由氢、低级烷基和羟烷基所组成的组。
[0052] 在一个实施方式中，所述整合素靶向成分具有如下结构：
[0053]
[0054] 在一个实施方式中，所述整合素靶向成分具有如下结构：
[0055]
[0056] 在一个实施方式中，所述整合素靶向成分具有下式：
[0057]
[0058] 在一个实施方式中，所述脂质体使得MRI图像能够生成。在一个实施方式中，脂质体使得MRI图像能够在临床相关强度(例如1特斯拉场强)下生成。
[0059] 进一步公开了生产整合素靶向剂的方法，所述方法包括形成下述结构的功能上受保护的VLA-4拮抗剂，所述结构包括光学异构体：
[0060]
[0061] 其中，在每次出现时，R1独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、-N(C1-C3烷基)SO2(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)SO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、OCF2、OCH2CF3、脂肪族酰基、O(环烷基烷基)、O(芳烷基)、-SO2(1-吡咯烷基)、SO2(1-哌啶基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；Z为N或CR2；当存在时，R2和R3各自独立地选自于由以下所组成的组：氢、卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基和-C(O)NH(苄基)基团；并且其中，当存在时，R2可与R3一起形成环；在每次出现时，R4独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3烷基)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、O(卤代烷基)、O(环烷基)、O(环烷基烷基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；R1、R2、R3和R4独立地未被取代或被至少一个供电子基团或吸电子基团取代；所述方法包括：通过用官能化的3-17个原子的连接基团在吡啶
酮羟基上进行烷基化来合成磷脂；
[0062] 任选地修饰末端官能基团；以及
[0063] 通过酰胺偶联、氨基甲酸酯形成或三唑形成和官能团的去保护的方式，连接至适合于脂质体形成的聚合物基团。
[0064] 在一个实施方式中，所述整合素靶向剂的平均分子量为2000-7000。在一个实施方式中，所述整合素靶向剂使得MRI图像能够生成。在一个实施方式中，整合素靶向剂使得MRI图像能够在临床相关的场强(例如1特斯拉场强)下生成。在一个实施方式中，将所述整合素靶向剂并入用于药物递送或诊断学的递送载体中。
[0065] 本文讨论的是药物递送方法，所述方法包括形成平均直径小于400纳米的多个脂质体，所述脂质体包含：第一脂质或磷脂、用聚合物衍生的第二脂质或磷脂、能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂、用聚合物衍生的第三脂质或磷脂(所述聚合物用平均分子量为2000-7000的整合素靶向成分封端)、任选的DSPE；使用所述多个脂质体包封至少一种生物活性剂；将所述多个脂质体给予患者。在一个实施方式中，使用DPPC而非DSPE。
[0066] 在一个实施方式中，所述生物活性剂包括阿霉素、紫杉醇、道诺霉素、长春新碱、维甲酸、顺铂、安那霉素、长春瑞滨、盐酸伊立替康或氟尿苷。在一个实施方式中，所述整合素靶向成分具有下式，所述整合素靶向成分包括其光学异构体和药学上可接受的盐：
[0067]
[0068] 其中，在每次出现时，R1独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、-N(C1-C3烷基)SO2(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)SO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、OCF2、OCH2CF3、脂肪族酰基、O(环烷基烷基)、O(芳烷基)、-SO2(1-吡咯烷基)、SO2(1-哌啶基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；Z为N或CR2；当存在时，R2和R3各自独立地选自于由以下所组成的组：氢、卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基和-C(O)NH(苄基)基团；并且其中，当存在时，R2可与R3一起形成环；在每次出现时，R4独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3烷基)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、O(卤代烷基)、O(环烷基)、O(环烷基烷基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；R1、R2、R3和R4独立地未被取代或被至少一个供电子基团或吸电子基团取代；在每次出现时，R5独立地选自于由烷基或烯基基团所组成的C7-C21链；在每次出现时，m和p独立地为0-5的整数；L1为3-14个原子的链，所述链包含-CH2-、-C(O)-、-NH-、-S-、-S(O)-、-O-、-C(O)O-或-S(O)2-的任何组合；
[0069] X选自于由以下所组成的组：s为1-2的整数 ；L2为-
(CH2CH2O)n-链，其中n为38-115的整数；以及Y为(CH2)q，其中q为0-2的整数。
[0070] 本文公开了显像方法，所述方法包括形成平均直径小于400纳米的多个脂质体，所述脂质体包含：第一脂质或磷脂、用聚合物衍生的第二脂质或磷脂、能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂、用聚合物衍生的第三脂质或磷脂(所述聚合物用平均分子量为2000-7000的整合素靶向成分封端)、第四脂质或磷脂；将对比增强剂并入所述多个脂质体中；以及使用选自于由以下所组成的组的显像模式：CT、微CT、乳房X线照相术、X射线、MRI、磁共振波谱学、生物发光显像、超声、光学显像、光谱学、荧光光谱学、荧光显像、近红外光谱学和近红外显像。在一个实施方式中，在1特斯拉的场强下生成MRI图像。在一个实施方式中，在大于1特斯拉的场强下生成MRI图像。
[0071] 在一个实施方式中，所述整合素靶向成分具有下式，所述整合素靶向成分包括其光学异构体和药学上可接受的盐：
[0072]
[0073] 其中，在每次出现时，R1独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、-N(C1-C3烷基)SO2(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)SO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、OCF2、OCH2CF3、脂肪族酰基、O(环烷基烷基)、O(芳烷基)、-SO2(1-吡咯烷基)、SO2(1-哌啶基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；Z为N或CR2；当存在时，R2和R3各自独立地选自于由以下所组成的组：氢、卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基和-C(O)NH(苄基)基团；并且其中，当存在时，R2可与R3一起形成环；在每次出现时，R4独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3烷基)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、O(卤代烷基)、O(环烷基)、O(环烷基烷基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；R1、R2、R3和R4独立地未被取代或被至少一个供电子基团或吸电子基团取代；
[0074] 在每次出现时，R5独立地选自于由烷基或烯基基团所组成的C7-C21链；在每次出现时，m和p独立地为0-5的整数；L1为3-14个原子的链，所述链包含-CH2-、-C(O)-、-NH-、-S-、-S(O)-、-O-、-C(O)O-或-S(O)2-的任何组合；
[0075] X选自于由以下所组成的组：
[0076] s为1-2的整数；L2为-(CH2CH2O)n-链，其中n为38-115的整数；以及Y为(CH2)q，其中q为0-2的整数。
[0077] 本文公开了包含多个脂质体的组合物，其中，所述多个脂质体包含整合素靶向分子，其中，所述整合素靶向分子包含聚合物衍生的脂质或磷脂部分以及整合素靶向部分。在一个实施方式中，所述整合素靶向部分具有以下结构之一：
[0078]其中，R为聚合物衍生的脂质或磷脂部分的连接点。在
一个实施方式中，所述整合素靶向分子为本公开的化合物。在一个实施方式中，所述多个脂质体的平均直径为150nm-175nm。在一个实施方式中，所述整合素靶向分子包含约
0.05mol％-2mol％的所述多个脂质体。在一个实施方式中，所述多个脂质体进一步包含生物活性剂。在一个实施方式中，所述生物活性剂被包封在所述多个脂质体内。
[0079] 在一个实施方式中，所述多个脂质体进一步包含用结合对比增强剂的基团衍生的脂质或磷脂。在一个实施方式中，所述用结合对比增强剂的基团衍生的脂质或磷脂包含DTPA-Gd或DOTA-Gd部分。在一个实施方式中，所述脂质体包含30mol％-45mol％DPPC、15mol％-45mol％胆固醇、1mol％-6mol％DSPE-MPEG-2000、20mol％-30mol％Gd-DOTA-DSPE和0.05mol％-2mol％THI-567。
[0080] 本文讨论的是将生物活性剂递送至患者中的靶细胞的方法，所述方法包括向患者给予本发明所述的组合物。在一个实施方式中，将所述生物活性剂选择性地递送至表达α4β1整合素的细胞。在一个实施方式中，所述表达α4β1整合素的细胞包括一种或多种以下类型的细胞：CD11b+单核细胞、CD3+T细胞、CD19+B细胞和Ly-6G+多形核白细胞。
[0081] 本文进一步公开了对受试者中的生物结构进行显像的方法，所述方法包括向受试者给予本公开的组合物并且用显像器检测所述对比增强剂。在一个实施方式中，所述组合物中的脂质体在所述生物结构中变得富集。在一个实施方式中，所述显像器进行以下技术中的一种：CT、微CT、乳房X线照相术、X射线、MRI、磁共振波谱学、生物发光显像、超声、光学显像、光谱学、荧光光谱学、荧光显像、近红外光谱学和近红外显像。
[0082] 在一个实施方式中，所述显像器为具有不超过3T或不超过1T的场强的MRI
扫描仪。在一个实施方式中，所述生物结构为动脉粥样硬化斑块、表达α4β1整合素的多个细胞、或肿瘤。
[0083] 本文进一步公开了对处于急性缺血事件的
风险中的患者进行识别的方法，所述方法包括：(a)给予受试者本公开的组合物；(b)用MRI扫描仪检测所述对比增强剂以生成图像；(c)评价所述图像中动脉粥样硬化斑块的存在；以及(d)如果检测到动脉粥样硬化斑块，则将所述患者识别为处于急性缺血事件的风险中。
[0084] 前面已相当广泛地概述了本发明的特征和技术优势，以便能够更好地理解以下本发明的详细描述。下文将描述形成本发明的
权利要求的主题的本发明的其它特征和优势。本领域技术人员应理解，所公开的概念和特定实施方式可容易地用作
修改或设计用于实现与本发明相同目的的其它结构的
基础。本领域技术人员还应认识到，这样的等同构造不脱离所附权利要求书中阐述的本发明的精神和范围。
附图说明
[0085] 为详细描述本发明的优选实施方式，现在将对附图进行参考，其中：
[0086] 图1说明了整合素拮抗剂靶向的脂质体的结构。示出了THI567(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-羧基亚甲基-聚乙二醇3400–THI565(DSPE-PEG3400-THI565))。THI567以1％的
水平并入，并且脂质体大小为150nm。
[0087] 图2说明了THI565的结构以及用于脂质体发展的脂质锚定物THI567和接头的连接。图2A示出了THI565的结构，并且图2B示出了THI567的结构。图2C说明了THI565和THI0567对α4β1-K562细胞粘附至VCAM-1(Mn++)的抑制。
[0088] 图3示出了THI565对THI567靶向的脂质体(150nm；1.0％)结合至α4β1-K562细胞的抑制。THI567靶向的脂质体(150nm；1.0％)以2×10-10pM的浓度使用，并且THI565以
指定的浓度使用。通过流式细胞术检测罗丹明荧光。图3A说明了THI565的结构；图3B展示了最大
信号的抑制百分数。
[0089] 图4说明了结合至整合素α4β1的THI567靶向的脂质体的特异性结合。A部分示出了THI567靶向的脂质体或非靶向脂质体的结合。在B部分中，使用抗α4整合素mAb PS/2以抑制THI567靶向的脂质体(150nm；1.0％)结合至α4β1-K562细胞。THI567靶向的脂质体(150nm；1.0％)以2×10-10pM的浓度使用，并且PS/2或同种型对照
抗体大鼠IgG2b以10μg/ml的浓度使用。罗丹明荧光通过流式细胞术检测，并且在两子图中表示为几何平均荧光强度(gMFI)。
[0090] 图5说明了THI567靶向的脂质体(150nm；1.0％)结合至经工程化以差异表达整合素α4β1的Jurkat和K562细胞。THI567靶向的脂质体(150nm；1.0％)以2×10-10pM的浓度使用。通过流式细胞术检测罗丹明荧光。图5A示出了结合至Jurkat细胞。图5B代表结合至K562。数据表示为几何平均荧光强度(gMFI)。
[0091] 图6说明了THI567靶向的脂质体(250nm；0.25％)结合至表达整合素α4β1的Jurkat细胞。以指定浓度使用THI567靶向的脂质体(250nm；0.25％)，并在THI567靶向的脂质体和20mM EDTA存在下测定背景荧光(Bkgd)。罗丹明荧光通过流式细胞术检测，并且表示为几何平均荧光强度(gMFI)。
[0092] 图7说明了结合至表达整合素α4β1的Jurkat细胞的THI567靶向的脂质体的靶向配体浓度和不同大小的基质。以指定浓度使用THI567靶向的脂质体(250nm；0.25％)，并在THI567靶向的脂质体和20mM EDTA存在下测定背景荧光(Bkgd)。罗丹明荧光通过流式细胞术检测，并且表示为几何平均荧光强度(gMFI)。
[0093] 图8说明了特异性的THI567靶向的脂质体结合至淋巴细胞亚群。在通过心脏穿刺收集
全血前2小时注射(股静脉)THI567靶向的脂质体和非靶向脂质体。用FITC-CD11b(单核细胞)、FITC-Ly-6G(嗜中性粒细胞)、Cy5-CD19(B细胞)和Cy5-CD3(T细胞)识别外周血亚群，并且通过流式细胞术对每个亚群中的脂质体荧光(罗丹明B)进行定量。示出了3个独立实验的平均值±SEM。
[0094] 图9说明了用共聚焦
显微镜显像的淋巴细胞亚群中的THI567靶向的脂质体和非靶向脂质体的摄取。在通过心脏穿刺收集全血前2小时将脂质体注射至C57BL/6小鼠(股静脉)中。根据FITC-Ly-6G(嗜中性粒细胞)、Cy5-CD19(B细胞)和Cy5-CD3(T细胞)对外周血亚群进行分类，并通过共聚焦显微镜检查对脂质体荧光(罗丹明B)进行显像。进行Hoechst 33342
染色以识别细胞核。示出了3个代表性实验之一。
[0095] 图10说明了在脂质体构建体注射后3天，对高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠主动脉中增强的THI567靶向的脂质体的积累的定量评估。(A)对非靶向组(n＝7)和THI0567靶向组(n＝9)小鼠中动脉粥样硬化斑块的标准化增强率(NER)的比较。数据表示为平均值±SEM。(B)小鼠主动脉的容积呈现3D图像显示了所检查的不同主动脉节段。(C)在非靶向组(n＝7)和靶向组(n＝6-8)小鼠的主动脉的不同节段中，对动脉粥样硬化斑块中的NER的比较。数据表示为平均值±SEM。(D、E)来自未经处理的小鼠、THI0567靶向的脂质体-Gd注射的小鼠或非靶向脂质体-Gd注射的小鼠的升主动脉(D)和主动脉弓(E)区的油红染色(上子图)和罗丹明B荧光(下子图)的代表性部分。
[0096] 图11说明了ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块中THI0567靶向的脂质体聚集。(A)来自用THI0567靶向的脂质体(罗丹明B荧光)注射的小鼠的主动脉根部
组织切片的共聚焦荧光显像。主动脉根部的低放大倍数(10×)图像(左上子图)表示对照IgG染色。其它代表性切片用抗CD31(右上)、抗F4/80(右下)或抗CD11b(左下)染色。细胞核用Hoechst 33342染色。(B)通过抗CD11b和Hoechst 33342染色的主动脉弓(包括头臂动脉)的部分切片。(C)用THI0567靶向的脂质体处理的动物的主动脉弓切片的共聚焦荧光显像(来自n＝8动物的代表性切片)。荧光：THI0567靶向的脂质体(罗丹明B)；CD11b(绿色)；CD31(紫色)；细胞核(Hoechst 33342；蓝色)。
具体实施方式
[0097] 定义
[0098] 除非术语“烷基”之前有Cx-Cy命名，本文单独或组合使用的术语“烷基”是指通过一个氢原子的去除衍生自饱和
烃的C1-C22直链或支链、取代或未取代的饱和链基。烷基基团的代表性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基和硬脂基等。
[0099] 本文单独或组合使用的术语“烯基”是指含有2-22个
碳原子的取代或未取代的直链或取代或未取代的支链不饱和烃基。本文使用的术语“烯基”可理解为含有一个或多个不
饱和度的链。此类基团的实例包括但不限于乙烯基、E-戊烯基和Z-戊烯基、癸烯基、二十二碳-3,6,9,12,15,18-己烯基(docosa-3,6,9,12,15,18-hexaenyl)等。
[0100] 本文单独或组合使用的术语“炔基”是指含有2-10个碳原子和一个或多个碳-碳三键的取代或未取代的直链不饱和烃基或取代或未取代的支链不饱和烃基。此类基团的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、炔丙基、丁炔基、己炔基、癸炔基等。
[0101] 修饰“烷基”、“烯基”、“炔基”或“烷氧基”的术语“低级”是指特定官能度的C1-C6单元。例如，低级烷基意为C1-C6烷基。
[0102] 本文单独或组合使用的术语“脂肪族酰基”是指衍生自烷烃
羧酸、烯烃羧酸或炔烃羧酸的式烷基-C(O)-、烯基-C(O)-和炔基-C(O)-的基团，其中，术语“烷基”、“烯基”和“炔基”如上所定义。此类脂肪族酰基基团的实例包括但不限于乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、4-甲基戊酰基、丙烯酰基、巴豆酰基、丙酰基和甲基丙酰基等。
[0103] 本文使用的术语“环烷基”是指具有3-10个碳原子和1-3个环的脂肪族环系统，包括但不限于环丙基、环戊基、环己基、降
冰片基(norbornyl)和金刚烷基等。环烷基基团可以是未被取代的或被1个、2个或3个取代基取代的，所述取代基独立地选自低级烷基、卤代烷基、烷氧基、硫代烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、卤素、巯基、硝基、羧醛、羧基、烷氧羰基和羧胺。
[0104] 取代的“环烷基”包括顺式或反式形式。此外，取代基可在桥接的双环系统中的内或外
位置。
[0105] 本文单独或组合使用的术语“环烯基”是指含有4-8个碳原子以及一个或多个双键的环状碳环。此类环烯基基团的实例包括但不限于环戊烯基、环己烯基、环戊二烯基等。
[0106] 本文使用的术语“环烷基烷基”是指附加至低级烷基基团的环烷基基团，包括但不限于环己基甲基。
[0107] 本文使用的术语“卤素(halo/halogen)”是指I、Br、Cl或F。
[0108] 本文使用的术语“卤代烷基”是指至少一个卤素取代基附加至其的低级烷基，例如氯甲基、氟乙基、三氟甲基和五氟乙基等。
[0109] 本文单独或组合使用的术语“烷氧基”是指烷基醚基团，其中，术语“烷基”如上所定义。合适的烷基醚基团的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。
[0110] 本文使用的术语“烷氧基烷基”是指RY-O-RZ，其中，RY为如上所定义的低级烷基，并且RZ为亚烷基(-(CH2)w-)，其中，w为1-6的整数。代表性实例包括甲氧基甲基、甲氧基乙基和乙氧基乙基等。
[0111] 本文单独或组合使用的术语“烯氧基”是指式烯基-O-的基团，条件是所述基团不是烯醇醚，其中，术语“烯基”如上所定义。合适的烯氧基基团的实例包括但不限于烯丙氧基、E-3-甲基-2-丙烯氧基和Z-3-甲基-2-丙烯氧基等。
[0112] 本文单独或组合使用的术语“炔氧基”是指式炔基-O的基团，条件是所述基团不是炔醇醚。合适的炔氧基的实例包括但不限于炔丙氧基、2-丁炔氧基等。
[0113] 本文使用的术语“羧基”是指C(O)OH。
[0114] 术语“硫代烷氧基”是指式烷基-S-的硫醚基团，其中，“烷基”如上所定义。
[0115] 本文使用的术语“磺酰氨基”是指-SO2NH2。
[0116] 本文使用的术语“羧醛”是指-C(O)R，其中，R为氢。
[0117] 本文使用的术语“羧胺”或“酰胺”是指C(O)NRaRb，其中，Ra和Rb的各自独立地为氢、烷基或任何其它合适的取代基。
[0118] 本文使用的术语“烷氧基烷氧基”是指RcO-RdO-，其中，Rc为如上所定义的低级烷基，并且Rd为亚烷基，其中，亚烷基为-(CH2)n-，其中，n为1-6的整数。烷氧基烷氧基基团的代表性实例包括甲氧基甲氧基、乙氧基甲氧基、叔丁氧基甲氧基等。
[0119] 本文使用的术语“烷基氨基”是指ReNH-(其中，Re为低级烷基基团)，例如乙基氨基、丁基氨基等。
[0120] 本文单独或组合使用的术语“烯基氨基”是指式烯基-NH-或(烯基)2N-的基团，其中，术语“烯基”如上所定义，条件是所述基团不是烯胺。此类烯基氨基基团的实例为烯丙基氨基基团。
[0121] 本文单独或组合使用的术语“炔基氨基”是指式炔基-NH-或(炔基)2N-的基团，其中，术语“炔基”如上所定义，条件是所述基团不是-C≡C-NH2或-C≡C-NH。本文使用的此类炔基氨基基团的实例为炔丙基氨基基团HC≡C-CH2NH-。
[0122] 本文使用的术语“二烷基氨基”是指(Rf)(Rg)N-(其中，Rf和Rg独立地选自低级烷基)，例如二乙基氨基和甲基丙基氨基等。
[0123] 本文使用的术语“烷氧羰基”是指通过羰基基团附加至母体分子部分的如前所定义的烷氧基基团。烷氧羰基的实例包括甲氧羰基、乙氧羰基和异丙氧羰基等。
[0124] 本文单独或组合使用的术语“芳基”或“芳族”是指具有约6-12个碳原子的取代或未取代的碳环芳族基团，例如苯基、
萘基、茚基、二氢茚基、薁基、芴基和蒽基；或含有至少一个内环N、O或S原子的杂环芳族基团，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、异噁唑基、异噻唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,3-三唑基、1,3,4-噻二唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基、吲哚嗪基(indolizinyl)、吲哚基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚啉基、苯并[b]呋喃基、2,3-二氢苯并呋喃基、苯并[b]噻吩基、1H-吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、4H-喹啉基、异喹啉基、噌啉基(cinnolinyl)、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、1,8-萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、苯氧嗪基(phenoxyazinyl)、吡唑并[1,5-c]三嗪基等。“芳烷基”和“烷基芳基”采用如上所定义的术语“烷基”。环可被多重取代。
[0125] 本文单独或组合使用的术语“芳烷基”是指芳基取代的烷基基团，其中，术语“烷基”和“芳基”如上所定义。合适的芳烷基基团的实例包括但不限于苯甲基、苯基乙基、苯己基、二苯甲基、吡啶基甲基、四唑基甲基、呋喃基甲基、咪唑基甲基、吲哚基甲基、噻吩基丙基等。
[0126] 本文单独或组合使用的术语“芳烯基”是指芳基取代的烯基基团，其中，术语“芳基”和“烯基”如上所定义。
[0127] 本文单独或组合使用的术语“芳基氨基”是指式芳基-NH-的基团，其中，“芳基”如上所定义。芳基氨基基团的实例包括但不限于苯氨基(苯胺基)、萘基氨基、2-吡啶基氨基、3-吡啶基氨基和4-吡啶基氨基等。
[0128] 本文使用的术语“苄基”是指C6H5-CH2-。
[0129] 本文单独或组合使用的术语“联芳基”是指式芳基-芳基的基团，其中，术语“芳基”如上所定义。
[0130] 本文单独或组合使用的术语“硫代芳基”是指式芳基-S-的基团，其中，术语“芳基”如上所定义。硫代芳基基团的实例为苯硫基基团。
[0131] 本文单独或组合使用的术语“芳酰基”是指式芳基-CO-的基团，其中，术语“芳基”如上所定义。合适的芳族酰基的实例包括但不限于苯甲酰基、4-卤代苯甲酰基、4-羧基苯甲酰基、萘甲酰基、吡啶基羰基等。
[0132] 本文单独或组合使用的术语“杂环基”是指包含至少一个内环N、O或S原子的非芳族3-10元环。任选地，杂环可为芳基稠合的。任选地，杂环还可被独立地选自于由以下所组成的组的至少一个取代基取代：氢、卤素、羟基、氨基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、芳基、氰基、羧基、烷氧羰基、羧基烷基、氧代、芳基磺酰基和芳烷基氨基羰基等。
[0133] 本文使用的术语“烷基杂环基”是指通过杂环基基团附加至母体分子部分上的如前所定义的烷基基团，包括但不限于4-甲基哌嗪-1-基。
[0134] 本文使用的术语“杂环基烷基”是指通过烷基基团附加至母体分子部分上的如前所定义的杂环基基团，包括但不限于2-(1-哌啶基)乙基。
[0135] 本文使用的术语“杂环基”是指式杂环基-C(O)-的基团，其中，术语“杂环基”如上所定义。
[0136] 本文使用的术语“缩醛胺”是指结构RhC(NRiRj)(NRkRl)-的半缩醛，其中，Rh、Ri、Rj、Rk和Rl各自独立地为氢、烷基或任何其它合适的取代基。
[0137] 本文使用的术语“酯”是指-CO2Rm，其中，Rm为烷基或任何其它合适的取代基。
[0138] 本文使用的术语“氨基甲酸酯”是指基于氨基甲酸NXC(O)OR的化合物，其中，例如X为氢、烷基、芳基或芳烷基，并且R独立地为烷基、芳基或芳烷基。
[0139] 本文使用的术语“光学异构体”是指仅在至少一个原子的立体化学上不同的化合物，包括对映异构体、非对映异构体和外消旋体。
[0140] 在本公开中，THI0567和THI567可互换使用；THI0565和THI565可互换使用。
[0141] 以上术语的使用意在涵盖取代和未取代的部分。可被以下一个或多个基团取代：例如醇、醚、酯、酰胺、砜、硫化物、羟基、硝基、氰基、羧基、胺、杂原子、低级烷基、低级烷氧基、低级烷氧羰基、烷氧基烷氧基、酰氧基、卤素、三氟甲氧基、三氟甲基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、芳基、氰基、羧基、羧基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、烷基杂环基、杂环基烷基、氧代、芳基磺酰基和芳烷基氨基羰基或前述段落的任何取代基或与直接连接或通过合适的接头连接的任何此类取代基。接头通常为包含-C-、-C(O)-、-NH-、-S-、-S(O)-、-O-、-C(O)O-或-S(O)2-的任何组合的1-3个原子的短链。环可被多重取代。
[0142] 术语“吸电子”或“供电子”是指如果氢在分子中占据相同位置，取代基相对于氢而言的吸电子或供电子的能力。这些术语为本领域技术人员熟知的，并在高等
有机化学，J.March，1985，pp.16-18(通过引用的方式并入本文)中讨论。吸电子基团包括卤素、硝基、羧基、低级烯基、低级炔基、羧醛、羧基酰胺基(carboxyamido)、芳基、季铵、三氟甲基、磺酰基和芳基低级烷酰基等。供电子基团包括诸如羟基、低级烷基、氨基、低级烷基氨基、二(低级烷基)氨基、芳氧基、巯基、低级烷硫基、低级烷基巯基和二硫化物等的基团。本领域技术人员将理解，上述取代基在不同化学条件下可具有供电子或吸电子性质。此外，本发明考虑了选自以上指定的基团的取代基的任何组合。
[0143] 最优选的供电子或吸电子取代基为卤素、硝基、烷酰基、羧醛、芳基烷酰基、芳氧基、羧基、羧胺、氰基、磺酰基、亚砜、杂环基、胍、季铵、低级烯基、低级炔基、锍盐、羟基、低级烷氧基、低级烷基、氨基、低级烷基氨基、二(低级烷基)氨基、胺级低级烷基巯基、巯基烷基、烷硫基、羧基低级烷基、芳基烷氧基、烷酰基氨基、烷酰基(低级烷基)氨基、低级烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烷基磺酰基(低级烷基)氨基、芳基磺酰基(低级烷基)氨基、低级烷基羧胺、二(低级烷基)羧胺、磺酰胺、低级烷基磺酰胺、二(低级烷基)磺酰胺、低级烷基磺酰基、芳基磺酰基和烷基二硫基。
[0144]
脂肪酸酯旨在被本领域技术人员理解为由长的烃链形成的酯，所述长的烃链可为饱和的或具有不同程度的不饱和度，其以羧酸官能基团封端。不限制
发明人意图的范围，仅作为示例的脂肪酸可包括：棕榈酸、
硬脂酸或油酸、十二烷酸、十四烷酸、
十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸、顺-9-十六碳烯酸、顺-6-十八碳烯酸、顺-9-十八碳烯酸、顺-11-十八碳烯酸、顺-13-二十二碳烯酸、顺-15-二十四碳烯酸、9,12-十八碳二烯酸、6,9,12-十八碳三烯酸、9,12,15-十八碳三烯酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸或4,7,
10,13,16,19-二十二碳六烯酸。
[0145] 同样，本公开涉及使用由聚乙二醇组成或可替代地表示为-(CH2CH2O)n-单元的聚合物接头，其固有地包含构成平均值的分子量分布。结果，分子量表示为平均分子量，其反映了目前的单个质量分布或整个分布的平均值。在一个实施方式中，THI567中-(CH2CH2O)-
单体单元的数目为7-115。在一个实施方式中，THI567中-(CH2CH2O)-单体单元的数目为38-115。在一个实施方式中，THI567中-(CH2CH2O)-单体单元的数目为38-100。在一个实施方式中，THI567为具有38-115个-(CH2CH2O)-单体单元的分子的混合物。因此，作为示例，THI567为分子的混合物并且具有76个-(CH2CH2O)-单体单元的目标平均值，并且在一个实例中具有
70-71个-(CH2CH2O)-单元实际平均值。
[0146] 在其一个实例中，通过质谱法测得分布包含+/-约1500质量单位的分子量。本发明意在涵盖构成有助于平均分子量的化合物的分布的全部单个成分。因此，要求保护的平均值在其定义内包括至多约+/-38个-(CH2CH2O)-单体单元的范围。术语聚乙二醇用于表示L2接头二价基团。术语分子量用于表示遍及此段落中表示的可能产品的分布的平均值。本领域技术人员将认识到批次之间分子质量分布的变化。例如，
试剂DSPE-PEG3400-NH2应理解为包括批次之间的变化，但仍在该分子量范围的报告规范内。
[0147] 药学上可接受的盐为本领域熟知的。例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences，66：1-19(1977)中详细描述了药学上可接受的盐。如下文大致描述的，盐可在本文教导的化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或通过使游离碱或游离酸官能团与合适的试剂反应而单独制备。例如，游离碱官能团可与合适的酸反应。此外，在本文教导的化合物具有酸性部分的情况下，其合适的药学上可接受的盐在不限制本发明的范围的情况下可包括金属盐，例如碱金属盐，例如钠盐或
钾盐；以及碱土金属盐，例如
钙盐或镁盐。本领域技术人员将认识到第二脂质可被较短的聚合物链长度取代(例如DSPE-mPEG(1000))，并且仍然赋予隐藏性能(stealth properties)。本领域技术人员将进一步认识到，将第二脂质取代为较短的链长度使得第三脂质的取代能够并入较短的聚合物长度(例如，DSPE-PEG2000-THI565)，其维持长于第二脂质的链长。
[0148] 整合素靶向剂意为被设计以识别位于细胞表面的整合素的分子，并且具有将脂质体引导至所述细胞的视线的作用。本文预期的整合素为整合素α4β1、α4β7和α9β1家族的整合素。整合素靶向剂(例如THI567)被设计用于并入诸如脂质体的递送机制中，并且各自独立地彼此需要以用于完整的功能，例如使特定组织(例如动脉粥样硬化斑块)显像。该术语可与术语“缀合物”、例如“THI-565缀合物”(即THI567)互换使用。
[0149] 在一个实施方式中，整合素靶向剂的平均分子量(MW)为2000-7000。在一个实施方式中，整合素靶向剂的平均分子量(MW)为3150-6850。在一个实施方式中，整合素靶向剂的平均分子量(MW)为3300-6700。在一个实施方式中，整合素靶向剂的平均分子量(MW)为3450-6550。
[0150] 仅作为示例且不进行限制，术语“生物活性剂”意为化学治疗剂，例如阿霉素、紫杉醇、道诺霉素、长春新碱、维甲酸、顺铂、安那霉素、长春瑞滨、盐酸伊立替康、氟尿苷、抗炎剂、免疫调节剂(例如环孢霉素)，其中，生物活性剂可递送至表达整合素的特定组织。
[0151] 在一个实施方式中，通过形成具有以下结构的功能上受保护的VLA-4拮抗剂来生产整合素靶向剂：
[0152]
[0153] 其中，在每次出现时，R1独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、-N(C1-C3烷基)SO2(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)SO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、OCF2、OCH2CF3、脂肪族酰基、O(环烷基烷基)、O(芳烷基)、-SO2(1-吡咯烷基)、SO2(1-哌啶基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；
[0154] Z为N或CR2；
[0155] 当存在时，R2和R3各自独立地选自于由以下所组成的组：氢、卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)、-C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3)烷基、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基和-C(O)NH(苄2 3
基)基团；并且其中，当存在时，R可与R一起形成环；
[0156] 在每次出现时，R4独立地选自于由以下所组成的组：卤素、低级烷基、低级烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、硫代烷氧基、羟烷基、脂肪族酰基、-CF3、-CO2H、-SH、-CN、-NO2、-NH2、-OH、炔基氨基、烷氧羰基、杂环基、羧基、-N(C1-C3烷基)-C(O)(C1-C3烷基)、-NHC(O)N(C1-C3烷基)C(O)NH(C1-C3烷基)、-NHC(O)NH(C1-C6烷基)、-NHSO2(C1-C3烷基)、-NHSO2(芳基)、烷氧基烷基、烷基氨基、烯基氨基、二(C1-C3烷基)氨基、-C(O)O-(C1-C3)烷基、-C(O)NH-(C1-C3烷基)、-C(O)N(C1-C3烷基)2、-CH＝NOH、-PO3H2、-OPO3H2、卤代烷基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、羧醛、羧胺、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳基氨基、联芳基、硫代芳基、二芳基氨基、杂环基、烷基芳基、芳烯基、芳烷基、烷基杂环基、杂环基烷基、磺酰基、-SO2-(C1-C3烷基)、-SO3-(C1-C3烷基)、磺酰氨基、氨基甲酸酯、芳氧基烷基、O(卤代烷基)、O(环烷基)、O(环烷基烷基)、哌啶基、吡咯烷基和-C(O)NH(苄基)基团；
[0157] R1、R2、R3和R4独立地未被取代或被至少一个供电子基团或吸电子基团取代；
[0158] 通过用官能化的3-17个原子的连接基团在吡啶酮羟基上进行烷基化来合成磷脂；任选地修饰末端官能基团；通过酰胺偶联、氨基甲酸酯形成或三唑形成以及官能团的去保护的方式，连接至适合于脂质体形成的聚合物基团。
[0159] 在一个实施方式中，通过将预先稀释的成分的总量的0.05％-1.0％或0.05％-2.0％的量的DSPE-PEG3400-VLA-4靶向剂(例如DSPE-PEG3400-THI565)与以下结合来生产根据本公开的脂质体：胆固醇、DSPE-Peg2000、任选地Gd-DTPA-BSA、Gd-DOTA-DSPE或DSPE，以及可变数量的DPPC；任选地添加一定量的罗丹明DHPE或药物活性成分；用乙醇稀释；在
150mM盐水/10mM Histine溶液中水化；挤出以形成小于400nm的粒径；并且任选地，通过本领域已知的各种方法，例如通过渗析进行纯化。
[0160] 在一个实施方式中，通过以下方法生产根据本公开的脂质体：
[0161] 步骤1：基于期望的表面靶向配体表达，分别以下表中示出的摩尔比例构建DPPC、胆固醇、DSPE-MPEG2000、Gd-DTPA-BSA和DSPE-PEG3400-THI565：
[0162]
[0163] 步骤二：向此类脂质组合物的每种中添加罗丹明DHPE(1.0mg-2.5mg)以及之前在Ghaghada KB，Ravoori M，Sabapathy D，Bankson J，Kundra V，Annapragada A，New Dual Mode Gadolinium Nanoparticle Contrast Agent for Magnetic Resonance Imaging.Yang S，editor.PLoS ONE.2009Oct 29；4(10)：e7628.中所述的颗粒制剂。简而言之，将脂质(467.4mg)溶于乙醇(1.0mL-1.2mL)中，然后在63℃-65℃下在150mM盐水/10mM组氨酸(9mL)中水化40分钟以达到50mM的脂质浓度。然后使用400nm聚碳酸酯径迹蚀刻
过滤器(track-etch filter)将混合物在10ml Lipex
挤出机(Northern Lipids Inc.，Burnaby，Canada)中挤出(5次)，以获得平均直径～250nm的颗粒。对于平均直径～150nm的颗粒，将随后的制剂进一步通过200nm聚碳酸酯过滤器挤出(8次)，对于平均直径～100nm的颗粒，将制剂进一步通过100nm过滤器挤出(5次)。然后将所得溶液用150mM盐水/10mM组氨酸渗析。通过动态光散射(DLS)测定最终制剂中的平均脂质体大小，并且使用电感耦合
等离子体发射光谱法(ICP-OES)量化制剂中的钆和磷脂(等量的磷)浓度。基于制剂中的粒径和最终脂质浓度计算颗粒数/mL。
[0164] 在一个实施方式中，本公开的组合物包含多个脂质体，其中，所述多个脂质体包含整合素靶向分子，其中，所述整合素靶向分子包含聚合物衍生的脂质或磷脂部分以及整合素靶向部分。在一个实施方式中，整合素靶向部分具有如下结构之一：
[0165]其中，R为聚合物衍生的脂质或磷脂部分的连接点。
[0166] 在一个实施方式中，所述整合素靶向分子为本文讨论的本公开的化合物。在一个实施方式中，所述多个脂质体的平均直径为150nm-175nm。在一个实施方式中，所述整合素靶向分子包含约0.05mol％-2mol％的所述多个脂质体。
[0167] 在一个实施方式中，所述多个脂质体进一步包含生物活性剂。在一个实施方式中，所述生物活性剂被包封在所述多个脂质体内。
[0168] 在一个实施方式中，所述多个脂质体进一步包含用结合对比增强剂的基团衍生的脂质或磷脂。在一个实施方式中，所述用结合对比增强剂的基团衍生的脂质或磷脂包含DTPA-Gd或DOTA-Gd部分。在一个实施方式中，所述脂质体包含30mol％-45mol％DPPC、15mol％-45mol％胆固醇、1mol％-6mol％DSPE-MPEG-2000、20mol％-30mol％Gd-DOTA-DSPE和0.05mol％-2mol％THI-567。
[0169] 在一个实施方式中，将生物活性剂递送至患者中的靶细胞的方法包括向患者给予本公开的组合物。在一个实施方式中，将所述生物活性剂选择性地递送至表达α4β1整合素的细胞。在一个实施方式中，所述表达α4β1整合素的细胞包括一种或多种以下类型的细胞：CD11b+单核细胞、CD3+T细胞、CD19+B细胞和Ly-6G+多形核白细胞。
[0170] 在一个实施方式中，对受试者中的生物结构进行显像的方法包括向受试者给予本公开的组合物，并且用显像器检测所述对比增强剂。在一个实施方式中，所述组合物中的脂质体在所述生物结构中变得富集。在一个实施方式中，显像器执行以下技术之一：CT、微CT、乳房X线照相、X射线、MRI、磁共振波谱、生物发光显像、超声、光学显像、光谱、荧光光谱、荧光显像、近-红外光谱和近红外显像。
[0171] 在一个实施方式中，所述显像器为具有不超过3T的场强的MRI扫描仪。在一个实施方式中，所述显像器为具有不超过1T的场强的MRI扫描仪。在一个实施方式中，所述生物结构为动脉粥样硬化斑块、表达α4β1整合素的多个细胞、或肿瘤。
[0172] 在一个实施方式中，对处于急性缺血事件的风险中的患者进行识别的方法包括：(a)给予所述受试者如权利要求11-23、55或56中任一项所述的组合物；(b)用MRI扫描仪检测所述对比增强剂以生成图像；(c)评价所述图像中动脉粥样硬化斑块的存在；以及(d)如果检测到动脉粥样硬化斑块，则将所述患者识别为处于急性缺血事件的风险中。
[0173] 优势.不希望受到理论限制，令人惊讶地发现了本公开的整合素靶向剂使得MRI图像能够在临床相关的场强(例如1特斯拉)下获得，如Scientific Reports(2018)8：3733(以引用的形式将其公开内容并入本文)中所示。不希望受到理论限制，令人惊讶地发现了本公开的脂质体使得MRI图像能够在临床相关的场强(例如1特斯拉)下获得，如Scientific Reports(2018)8：3733(以引用的形式将其公开并入本文)中所示。
[0175] 以下旨在作为本发明的代表，其决不被示出的特定实施例限制。本领域技术人员将认识到不脱离本发明的精神和范围而进行其它实施例的一般适用性。后续实施例中使用的所有试剂获得自商业来源，并且无进一步纯化即使用。DSPE-PEG3400-NH2从Laysan Bio，Inc.获得。
[0176] 实施例1
[0177]
[0178] 步骤一：向0℃、氩气下的乙二醇单叔丁基醚(3.44mL，3.096g，26.2mmol)的无水四氢呋喃(26.2mL)溶液中分批添加氢化钠(在矿物油中的60％分散液，655mg，16.4mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，并添加2-氯-6-氟苄腈(2.028g，13.1mmol)。使反应混合物缓慢升温至室温，并且搅拌过夜。将混合物用己烷:乙酸乙酯的1:1混合物稀释，并用水(两次)和盐水洗涤。有机层经
硫酸镁干燥、过滤、并在减压下浓缩。将残余物通过自动
硅胶色谱法(SNAP 50KP-Sil，处于己烷中的0％-50％的乙酸乙酯)纯化，作为无色油状物得到1(3.22g)。
[0179] 步骤二：用
注射器向在氩气下冷却至0℃的1(3.21g，12.7mmol)的无水四氢呋喃(94mL)溶液中滴加氢化
铝锂溶液(在四氢呋喃中2.0M，12.7mL，25.4mmol)。使混合物逐渐升温至室温，并搅拌过夜。将混合物重新冷却至0℃，然后用注射器滴加水(0.97mL)。将混合物剧烈搅拌10分钟，然后滴加氢氧化钠溶液(在水中20wt％，0.71mL)，并且继续搅拌10分钟。最后，添加水(3.53mL)和 助滤剂。将混合物用二乙醚稀释，剧烈搅拌30分钟，然后通过另外的 过滤，用乙醚洗涤。在减压下浓缩滤液，作为浅黄色油状物得到2(3.27g)。
该物质不经纯化使用。
[0180] 该程序也用于从12制备(2-(叔丁氧基)-6-氯苯基)甲胺。
[0181] 步骤三：连同甲醇冲洗液(14mL)，将2(3.26g，12.7mmol)的甲醇(50mL)溶液添加至含有3(2.11g，13.3mmol，根据US 6972296中实施例25的步骤1所述的程序制备)的烧瓶中。将所得混合物加热至45℃过夜，然后回流24小时。将混合物冷却至室温，并在减压下浓缩。
将残余物溶于乙酸乙酯中并浓缩(两次)。然后将残余物悬浮在乙酸乙酯(30mL)中，搅拌30分钟，然后过滤，用乙酸乙酯洗涤。将固体在
真空下干燥，作为浅黄色粉末得到4(1.47g)。
[0182] 该程序也用于从(2-(叔丁氧基)6-氯苯基)甲胺制备1-(2-(叔丁氧基)-6-氯苄基)-4-羟基-5-甲基吡啶-2(1H)-酮。
[0183] 步骤四：(参考：D Koley，OC Colón，SN Savinov.Org.Lett.2009，11，4172-75.)。向在室温下对空气敞开的4(1.789g，4.89mmol)的四氢呋喃(25mL)悬浮液中添加亚
硝酸叔丁酯(1.74mL，14.7mmol)。将所得混合物搅拌过夜，然后用甲醇(10mL)稀释并在减压下浓缩，作为深黄色油状物得到5。该物质不经纯化使用。
[0184] 该程序也用于由1-(2-(叔丁氧基)-6-氯苄基)-4-羟基-5-甲基吡啶-2(1H)-酮制备(1-(2-(叔丁氧基)-6-氯苄基)-4-羟基-5-甲基-3-硝基吡啶-2(1H)-酮。
[0185] 步骤五：向粗品5(来自步骤4，理论上为4.89mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(16.3mL)溶液中添加锌粉(1.44g，22.0mmol)和三乙胺盐酸盐(3.702g，26.9mmol)。将混合物加热至55℃3小时，冷却至室温，并且一次性添加1,1′-羰二咪唑(2.379g，14.7mmol)。将混合物加热至80℃1.5小时，然后冷却至室温。将粗品反应混合物过滤至含有水(200mL)的烧瓶中，用少量DMF洗涤。过滤所得悬浮液，用水洗涤收集的固体。然后将固体在二氯甲烷和HCl水溶液(2N)之间分配。将水层用二氯甲烷萃取两次，并将合并的有机层用水洗涤，然后经
硫酸镁干燥，过滤并浓缩，作为橙褐色固体得到6(1.91g)。该物质不经纯化使用。
[0186] 该程序也用于从1-(2-(叔丁氧基)-6-氯苄基)-4-羟基-5-甲基-3-硝基吡啶-2(1H)-酮制备5-(2-(叔丁氧基)-6-氯苄基)-7-甲基噁唑并[4,5-c]吡啶-2,4(3H,5H)-二酮。
[0187] 步骤六：(参考：B List等，Adv.Synth.Catal.2005，347，1558-60.)。向氩气、室温下的N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)(200mg，1.64mmol)的DMF(41mL)溶液中添加
丙二酸单叔丁酯(3.94g，24.6mmol)和3-羟基
苯甲醛(2.00g，16.4mmol)。添加哌嗪(0.16mL，1.64mmol)，并将混合物在室温下搅拌3天。薄层色谱法(TLC)表明剩余了显著量的起始原料，因此将混合物加热至55℃过夜，然后冷却至室温。将混合物用水(200mL)稀释，并且用4:1己烷:乙酸乙酯萃取。有机层用饱和的水性
氯化铵、水(两次)和盐水洗涤，然后经硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓缩，作为白色固体得到7(3.73g)。该物质含有痕量残留
溶剂，但不经纯化使用。
[0188] 该程序还用于从13制备(E)-叔丁基3-(3-(叔丁氧基)苯基)
丙烯酸酯。
[0189] 步骤七：用注射器向0℃、氩气下的7(2.04g，9.26mmol)的二氯甲烷(46mL)溶液添加乙二醇单叔丁基醚(1.58mL，12.04mmol)，然后添加三苯基膦(3.65g，13.9mmol)。将混合物搅拌10分钟，然后添加偶氮二甲酸二乙酯的溶液(在
甲苯中40wt％，6.33mL，13.9mmol)。在室温下搅拌过夜后，TLC指示部分转化。添加另外部分的乙二醇单叔丁基醚(0.79mL，
6.0mmol)、三苯基膦(1.82g，7.0mmol)和偶氮二甲酸二乙酯(3.2mL，7.0mmol)，并将混合物另外搅拌24小时，然后在减压下浓缩。将残余物溶于3:1的己烷:乙酸乙酯中，并将溶液用水(两次)和盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓缩。将残余物在加热下在9:1己烷:二氯甲烷中溶于以得到澄清的溶液，使其冷却至室温并放置过夜。粘附在烧瓶侧面的一些晶体为来自反应的副产物。将溶液倒出并直接施加于5英寸的硅胶塞上，依次用9:1己烷:二氯甲烷、19:1己烷:乙酸乙酯、9:1己烷:乙酸乙酯以及最终3:1己烷:乙酸乙酯洗脱，作为浅黄色油状物得到8(2.029g)。还分离出少量未反应的起始原料(0.39g)。
[0190] 步骤八：在10分钟内，向在氩气下的冷却至-78℃的(R)-(+)-N-苄基-α-甲基苄基胺(1.77g，8.40mmol)的四氢呋喃(28mL)溶液中滴加正丁基锂(在己烷中1.6M，4.88mL，7.80mmol)。在-78℃下将亮红色溶液搅拌30分钟，连同THF(2mL)冲洗液，通过注射器滴加8(2.029g，6.33mmol)的四氢呋喃(8mL)溶液。将所得溶液在-78℃下搅拌4小时，添加无水乙醇(3mL)，然后添加饱和水性氯化铵(25mL)。使所得混合物升温至冰完全融化，然后用3:1己烷:乙酸乙酯萃取。有机层用水(两次)、饱和水性
碳酸氢钠:水的1:1混合物以及盐水洗涤，经硫酸镁(无水)干燥，过滤并在减压下浓缩。将残余物在硅胶上通过自动色谱法(SNAP100 KP-Sil，用处于己烷中的5％-20％的乙酸乙酯洗脱)纯化，作为无色粘
性油状物得到9(2.98g)。
[0191] 该程序还用于从(E)-叔丁基3-(3-(叔丁氧基)苯基)丙烯酸酯制备(S)-叔丁基3-(苄基((R)-1-苯基乙基)氨基)-3-(3-(叔丁氧基)苯基)丙酸酯以及从26制备(S)-叔丁基3-(苄基((R)-1-苯基乙基)氨基)-3-(3-乙氧基苯基)丙酸酯。
[0192] 步骤九：向氩气、室温下的9(2.97g，5.80mmol)的无水乙醇(39mL)溶液中添加冰
醋酸(0.5mL)和处于碳上的钯金属(Degussa型E101NE/W，50％H2O，10％Pd干重基，0.98g，0.46mmol Pd)。将气氛替换为氢气(在真空和来自气球的氢气之间切换数次)，并使反应搅拌过夜。通过 过滤混合物，用乙醇洗涤，并将滤液在减压下浓缩。将残余物从乙醚和己烷中重结晶，作为白色结晶固体得到10(1.373g)。未进行从母液中分离其它物质的进一步尝试。
[0193] 该程序也用于从(S)-叔丁基3-(苯基-((R)-1-苯基乙基)氨基)-3-(3-(叔丁氧基)苯基)丙酸酯制备(S)-叔丁基3-氨基-3-(3-(叔丁氧基)苯基)丙酸酯乙酸盐以及从(S)-叔丁基3-(苯基((R)-1-苯基乙基)氨基)-3-(3-乙氧基苯基)丙酸酯制备(S)-叔丁基3-氨基3-(3-乙氧基苯基)丙酸酯乙酸盐。
[0194] 步骤十：将氩气下的6(1.003g，2.46mmol)和10(890mg，2.24mmol)的DMF(12.3mL)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(0.59mL，3.36mmol)溶液加热至55℃8小时。小试样指示未反应的10，因此添加另外的6(100mg，0.25mmol)，并将混合物加热至55℃过夜，冷却至室温，然后用1:1己烷:乙酸乙酯和HCl(2N)稀释。有机层用水(3次)和盐水洗涤，经MgSO4干燥并过滤。在减压下浓缩滤液，并将所得残余物在硅胶上用自动色谱法( SNAP100 KP-Sil，用处于己烷中的25％-50％的乙酸乙酯洗脱)纯化。含有期望的产物的一些组分也含有杂质。将组分浓缩并重新纯化( SNAP10 Ultra，用处于己烷中的30％-50％的乙酸乙酯洗脱)。合并来自两次分离的仅含有期望的产物的组分并浓缩，作为浅黄色
泡沫得到11(1.25g)。该物质包含约4wt％的乙酸乙酯，但按原样使用。
[0195] 该程序也用于从5-(2-(叔丁氧基)-6-氯苄基)-7-甲基噁唑并[4,5-c]吡啶-2,4(3H,5H)-二酮和(S)-叔丁基3-氨基-3-(3-(叔丁氧基)苯基)丙酸酯乙酸盐制备(S)-叔丁基3-(3-(1-(2-(叔丁氧基)-6-氯苄基)-4-羟基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶基-3-基)脲基)-3-(3-(叔丁氧基)苯基)丙酸酯(15)，以及从5-(2-乙氧基-6-氯苄基)-7-甲基噁唑并[4,5-c]吡啶-2,4(3H,5H)-二酮(US 6972296，实施例36中的化合物151)和(S)-叔丁基3-氨基-3-(3-乙氧基苯基)丙酸酯乙酸盐制备(S)-叔丁基3-(3-(1-(2-氯-6-乙氧基苄基)-4-羟基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)脲基)-3-(3-乙氧基苯基)丙酸酯。
[0196] 实施例2
[0197]
[0198] 步骤一：向室温、氩气下的2-氯-6-氟苄腈(1.31g，8.4mmol)的无水四氢呋喃(16.8mL)溶液中添加叔丁醇钾(1.04g，9.24mmol)。将混合物加热至回流过夜，然后用己烷:乙酸乙酯的3:1混合物稀释，并用水(两次)和盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩，作为浅黄色油状物得到12(1.655g)。该物质不经纯化使用。
[0199] 步骤二：向室温下的3-羟基苯甲醛(2.059g，16.9mmol)的二氯甲烷(26mL)溶液中添加高氯酸镁(379mg，1.7mmol)。将混合物搅拌10分钟，然后添加二叔丁基二碳酸酯(8.48g，38.9mmol)。将所得混合物加热至回流14小时，冷却至室温，用己烷:乙酸乙酯的4:1混合物稀释，并用水(两次)和盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物在硅胶上通过自动色谱法( SNAP100KP-Sil，用0-10％的处于己烷中乙酸乙酯洗脱)纯化，作为无色油状物得到13(1.64g)。
[0200] 实施例3
[0201]
[0202] 步骤一：向室温、氩气下的双-1,2-(2-碘乙氧基)乙烷(7.37g，19.9mmol)的DMF(133mL)溶液中添加叠氮化钠(1.29g，19.9mmol)和碘化四乙铵(257mg，1.00mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，用水(400mL)稀释，并用9:1己烷:乙酸乙酯萃取(100mL 3次)。合并有机层，用水和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓缩。由此得到起始原料、期望的产物和双叠氮化物的大致的统计混合物。将该混合物在硅胶上通过自动色谱法(SNAP100 KP-Sil，用处于己烷中的10％-15％的乙酸乙酯洗脱)纯化，得到黄色油状物14(1.95g)。浓缩包含起始原料和14的组分，作为黄色油状物得到约1:1的混合物(1.15g)。未进行从该混合物中分离另外的14的尝试。
[0203] 步骤二：向氩气、室温下的11(1.25g，96wt％的14，1.61mmol)和14(918mg，3.22mmol)的DMF(8mL)溶液中添加碳酸钾(668mg，4.83mmol)。将所得混合物加热至80℃过夜，冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，并用水(3次)和盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物在硅胶上通过自动色谱法( SNAP100KP-Sil，用处于己烷中的50％-100％的乙酸乙酯洗脱)纯化，作为浅黄色粘性油状物得到16(1.16g)。
[0204] 该程序也用于从15制备17，从(S)-叔丁基3-(3-(1-(2-氯-6-乙氧基苄基)-4-羟基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶基-3-基)脲基)-3-(3-乙氧基苯基)丙酸酯(根据US 6972296中实施例34，步骤1-2，实施例36，步骤1-3和实施例37，步骤1中所述的程序由(S)-叔丁基3-氨基-3-(3-乙氧基苯基)丙酸酯制备)和叔丁基N-(6-溴己基)氨基甲酸酯制备27。
[0205] 步骤三：向室温、氩气下的16(1.16g，1.29mmol)的THF(12.9mL)溶液中添加三苯基膦(508mg，1.94mmol)。将混合物搅拌1.5小时，添加水(0.26mL)，并继续搅拌过夜。浓缩混合物，将残余物在硅胶上通过自动色谱法( SNAP25 KP-Sil，用处于己烷中的75％-100％的乙酸乙酯洗脱，然后用处于乙酸乙酯中的添加有2％三乙胺的0％-10％甲醇洗脱，然后用处于二氯甲烷中的添加有2％三乙胺的10％-20％甲醇洗脱)纯化，作为褐色粘性油状物得到18(1.101g)。
[0206] 该程序也用于从17制备19。
[0207] 步骤四：向室温、氩气下的18(1.10g，1.26mmol)的DMF(6.3mL)溶液中添加DIPEA(0.66mL，3.78mmol)和二乙醇酸酐(439mg，3.78mmol)。将混合物在室温搅拌过夜，用乙酸乙酯稀释，用HCl水溶液(2N)、水(3次)和盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤并在减压下浓缩。将残余物用自动反相色谱法( SNAP30 C18，用处于水中的50％-100％乙腈洗脱)纯化。合并含有20的组分，并通过旋转
蒸发除去乙腈直至得到浑浊的溶液。添加足够的乙腈以得到澄清溶液，将其在
干冰/丙酮浴中冷冻并冻干，作为蓬松白色粉末得到20(1.00g)。
[0208] 该程序还用于从19制备21，由28制备29。
[0209] 步骤五：向室温、氩气下的20(580mg，0.585mmol)的DMF(5.9mL)溶液中添加DIPEA(0.38mL，2.19mmol)和N,N,N',N'-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟
硼酸盐(TSTU)(283mg，0.73mmol)。将所得混合物搅拌1.5小时，然后在室温、氩气下连同DMF(0.5mL)冲洗液，将其经
导管加入到DSPE-PEG3400-NH2(616mg，约0.146mmol)的DMF(14.6mmol)溶液中。将所得混合物搅拌2.5天，然后在减压下浓缩。将残余物溶于甲苯并浓缩数次，然后溶于乙腈和水。通过
旋转蒸发除去乙腈直至略微浑浊，然后滴加乙腈直至得到澄清溶液。将混合物在干冰/丙酮浴中冷冻并冻干。将所得粉末分四批通过尺寸排阻色谱法(Sephadex LH-20)纯化，用甲醇洗脱。将单独组分在TLC板(用UV指示器)上点样，并通过UV光以及磷钼酸(PMA)染色剂(10％，处于乙醇中)
可视化。同时具有UV活性和PMA活性的物质以两个谱带从柱上离开。对于第一谱带，TLC板上的点非常紧凑，有很少的扩散超过微量移液管点样仪的尖端。对于第二谱带，点更分散，一直扩展至点样溶剂前沿的边缘。第一谱带含有期望的产物，将来自该谱带的组分合并，并在减压下浓缩，得到棕黄色玻璃状物得到22(690mg)。
[0210] 该程序也用于从21制备23，从29制备30。
[0211] 步骤六：向22(680mg，约0.13mmol)的二氯甲烷(9mL)溶液中添加三氟乙酸(9mL)。将混合物在室温搅拌4小时，然后浓缩。将残余物溶于二氯甲烷中并浓缩(5次)。然后将残余物溶于乙腈和水(30mL)的1:1混合物中，并使其放置过夜。用水(60mL)稀释所得混合物，然后将所得混合物在干冰/丙酮浴中冷冻并冻干。将所得粉末分两批通过尺寸排阻色谱法(Sephadex LH-20)纯化，用甲醇洗脱。如上所述将组分进行点样，将含有同时具有UV活性和PMA活性的物质的组分合并，并浓缩。将残余物溶于水(50mL)和乙腈(15mL)中，将所得混合物在干冰/丙酮浴中冷冻并冻干，作为灰白色固体得到24(572mg)。
[0212] 该程序还用于从23制备25，从30制备31。
[0213] 实施例4
[0214]
[0215] 步骤一：向室温、氩气下的3-乙氧基
肉桂酸(2.028g，10.6mmol)的甲苯(13.3mL)悬浮液中添加叔丁基-2,2,2-三氯乙酰亚胺酯(2.37mL，13.3mmol)。将混合物加热至50℃过夜，此时TLC分析显示了部分转化。添加另外的叔丁基2,2,2-三氯乙酰亚胺酯(1.2mL)，并继续加热24小时。反应仍未完成，因此添加更多的叔丁基2,2,2-三氯乙酰亚胺酯(1.2mL)，并继续加热另外24小时。将所得混合物过滤，用甲苯洗涤，并将滤液在减压下浓缩。将残余物在硅胶上通过色谱法纯化(用处于己烷中的10％乙酸乙酯洗脱)，作为无色油状物得到26(2.22g)。
[0216] 实施例5
[0217]
[0218] 步骤一：向室温下的乙酸乙酯(4.0mL)中的27(200mg，0.25mmol)的乙酸乙酯溶液中添加氯化氢溶液(在二噁烷中4.0M，1.3mL，5.2mmol)。将反应搅拌2小时，然后通过用氩气鼓泡30分钟除去过量的氯化氢。将反应混合物浓缩，溶于水并冻干以得到白色粉末。通过反相HPLC(Symmetry Shield RP18，7μm，30×250mm，含0.1％三氟乙酸的处于水中的30％-80％乙腈)纯化该物质。将含有所需物质的组分合并，用水和乙酸乙酯稀释，用水性氢氧化钠调成碱性，在分液漏斗中振荡，并使相分离。将有机层用水(3次)和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩，作为无色油状物得到28(88mg)。
[0219] 步骤二-步骤四：按照实施例3的步骤四-步骤六，从28制备化合物31。
[0220] 实施例6
[0221] 代表性脂质体制剂：1,2-双十六酰基-sn-甘油-3-
磷酸胆碱(DPPC)和胆固醇购自Lipoid Inc.，Newark NJ，USA。二乙烯三胺五乙酸-双(硬脂酰胺)钆盐(Gd-DTPA-BSA)购自Avanti Polar Lipids，Alabaster AL，USA。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-MPEG2000)购自Corden Pharma，Liestahl，Switzerland。LissamineTM罗丹明B1,2-双十六酰基-sn-甘油3-磷脂酰乙醇胺、三乙铵盐(罗丹明DHPE)购自ThermoFisher Scientific，USA。所有购买的试剂不经进一步纯化使用。如以上合成方案中所述对DSPE-PEG3400-THI565缀合物进行制备。
[0222] 步骤一：基于期望的表面靶向配体表达，分别以下表中示出的摩尔比例构建DPPC、胆固醇、DSPE-MPEG2000、Gd-DTPA-BSA和DSPE-PEG3400-THI565：
[0223]
[0224] *当GD-DTPA-BSA(或Gd-DOTA-DSPE)不存在时，可用25％1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)、DPPC(二棕榈酰基磷脂酰胆碱)或HSPC/DPPC(氢化大豆磷脂酰胆碱/二棕榈酰基磷脂酰胆碱)进行平衡，来保持THI567成分恒定。
[0225] 在各种实施方式中，其它合适的Gd螯合剂包括在本公开中，并且还考虑了其它合适的Gd螯合剂的使用。
[0226] 步骤二：任选地，向此类脂质组合物的任一种中添加罗丹明DHPE(1.0mg-2.5mg)、碘对比剂(例如碘克沙醇)或生物活性剂以及之前在Ghaghada KB，Ravoori M，Sabapathy D，Bankson J，Kundra V，Annapragada A，New Dual Mode Gadolinium Nanoparticle Contrast Agent for Magnetic Resonance Imaging.Yang S，editor.PLoS ONE.2009Oct 29；4(10)：e7628.中所述的颗粒制剂。简而言之，将脂质(467.4mg)溶于乙醇(1.0mL-1.2mL)中，然后在63℃-65℃下在150mM盐水/10mM组氨酸(9mL)中水化40分钟以达到50mM的脂质浓度。然后使用400nm聚碳酸酯径迹蚀刻过滤器将混合物在10ml Lipex挤出机(Northern Lipids Inc.，Burnaby，Canada)中挤出(5次)，以获得平均直径～250nm的颗粒。对于平均直径～150nm的颗粒，将随后的制剂进一步通过200nm聚碳酸酯过滤器挤出(8次)，并且对于平均直径～100nm的颗粒，将制剂进一步通过100nm过滤器挤出(5次)。然后将所得溶液用
150mM盐水/10mM组氨酸渗析。通过动态光散射(DLS)测定最终制剂中的平均脂质体大小，并且使用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)量化制剂中的钆和磷脂(等量的磷)浓度。
基于制剂中的粒径和最终脂质浓度计算颗粒数/mL的数目。
[0227] 在本公开中，示出了并入了整合素靶向分子(THI567)的脂质体特异性地结合T细胞、B细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。在各种实施方式中，由本公开的靶向剂(例如THI567)修饰的脂质体既能够结合至未活化的细胞也能够结合至活化的细胞。此外，该分子(THI567)具有脂质锚定物，其使得该分子能够被插入脂质体的脂质双层中。此外，该分子(THI567)具有独特的亲水特性，防止其破坏脂质双层。因此，该分子特别适合将脂质体特异性地递送至靶细胞。用/由该分子修饰或在表面上携带该分子的脂质体可带有
显像剂，以用于显像/
跟踪细胞的目的，并且还可带有可被高度特异性地递送至靶细胞的治疗剂。
[0228] 含碘的VLA-4靶向CT对比增强剂的制备。通过将脂质(HSPC/DPPC、Chol、DSPE-mPEG2000、DSPE-PEG3400-THI0565)溶解在乙醇中来制备另一靶向脂质体。用碘克沙醇溶液对乙醇脂质溶液进行水化，然后依次通过Nuclepore膜挤出，以产生期望粒径的纳米颗粒。将所得纳米颗粒溶液渗滤以除去未包封的碘克沙醇。对于荧
光标记的
纳米探针的制备而言，能够以0.2mol％包含罗丹明-DHPE。我们制备了含有0.25mol％-1.5mol％靶向配体且粒径为100nm-300nm的靶颗粒。HSPC为代替DSPE的氢化大豆磷脂酰胆碱。
[0229] 代表性生物活性制剂：VLA-4靶向的脂质体-阿霉素的制备。将脂质(HSPC、Chol、DSPE-mPEG2000、DSPE-PEG3400-THI0565)以摩尔比56:40:3:1溶解在乙醇中。用350mM硫酸铵溶液对乙醇脂质溶液进行水化，然后依次通过Nuclepore膜挤出(通过400nm 5次，通过200nm 8次)。将所得脂质体溶液用150mM盐水/10mM组氨酸渗析。在60℃下将脂质体溶液与阿霉素溶液(5mg/mL)混合(1:1V/V)。1小时后，将溶液在冰浴中冷却，随后用150mM盐水/
10mM组氨酸渗析。
[0230] 在本公开中，讨论了偶联至脂质体的整合素α4β1靶向配体在对自身免疫细胞灶或炎性细胞灶进行显像中的用途。例如，该方法学可用于对动脉粥样硬化斑块、移植排斥、类风湿性关节炎中的关节
炎症、急性
肺损伤中的肺炎症、表达α4β1的肿瘤(例如在淋巴瘤中发现的肿瘤)以及实体瘤中的免疫细胞浸润进行显像。此外，还考虑了使用此递送方法学对这些疾病状态的药物治疗。
[0231] 本公开的靶向分子/部分与本领域的分子/部分不同并具有优势，这是因为它具有独特的亲水特性和脂质锚定物，使其适合并入脂质双层中，提供了能够特异性结合靶细胞的稳定的活性脂质体。
[0232]
[0233]
[0234] *结构代表遍及样品中所表示的化合物的分布的平均靶分子量。
[0235] 我们已基于整合素α4β1拮抗剂THI565(作为靶向配体)生成了靶向纳米颗粒(结构见表1)。在高亲和力(0.467±0.356nM；n＝13)和低亲和力(11.88±4.84nM；n＝3)细胞粘附测定条件下，该
抑制剂均为强有力的整合素α4β1拮抗剂，并且对于脂质体并入具有优于THI520的cLogP。用经设计用于并入脂质体中的接头(DSPE-PEG-3400-NH)修饰THI565不显著影响拮抗剂活性(THI567 IC50＝0.48±0.2nM；n＝5)。图2描述了这两种化合物。
[0236] THI567用于多种不同脂质体制剂的生成(参见表2)。
[0237]
[0238]
[0239] 如表2中所总结的，以0.05％总脂质浓度至至多1％总脂质浓度的浓度并入THI567。粒径为体内脂质体可接受的功能性和药代动力学的关键部分。在一个实施方式中，粒径为50nm-400nm。在一个实施方式中，粒径为85nm-200nm。在另一实施方式中，开发了不同的脂质体大小(250nm、150nm和100nm)。将丽丝胺(Lissamine)罗丹明B并入脂质体中以进行荧光检测，并且将Gd并入脂质体中以进行基于MRI的显像。脂质体被称为“Gd567”(大小nm；％靶向配体)。表2还描述了通过脂质体结合至表达α4β1的K562细胞而测量的脂质体结合常数(通过流式细胞术测量)。将结合常数表示为摩尔颗粒浓度。脂质体的结合特异性通过多种不同方法来确定。这些方法包括与自由靶向配体的竞争(图3)，其中过量的THI565用于Gd567(150nm；1.0％)脂质体与表达整合素α4β1的K562细胞的竞争结合。在最高剂量的THI0565下观察到Gd567(150nm；1.0％)结合的完全抑制(图3)。
[0240] 在另一组实验中，非靶向脂质体(其具有3％惰性DSPE-PEG-2000-OMe表面包被用于隐藏性能，而靶向脂质体具有3％DSPE-PEG-2000-OMe和1％DSPE-PEG-3400-THI565(称为THI567))在测试浓度下显示出了最小的结合，而THI567靶向脂质体显示出了剂量依赖性结合(图4)。同样，单克隆抗体用于抑制Gd567(150nm；1.0％)结合至鼠细胞系70Z/3。对于鼠α4整合素(mAb PS/2)特异的抗体完全抑制了Gd567(150nm；1.0％)与70Z/3细胞的结合，而同型对照mAb(大鼠IgG2b)不具有作用(图4)。这证明了Gd567(150nm；1.0％)与整合素α4β1的特异性结合。
[0241] 脂质体结合特异性的进一步测试利用了经工程化以表达整合素α4β1的细胞系、或者已突变并经选择以用于整合素α4β1表达的丧失的细胞系。野生型K562细胞几乎不表达整合素α4β1。当用于与Gd567(150nm；1.0％)的结合测定中时，与经工程化以过表达整合素α4β1的K562细胞相比，脂质体与该细胞的结合很少(图5)。Jurkat细胞表达整合素α4β1。对细胞进行突变并对整合素α4β1的丧失进行选择。检测到Gd567(150nm；1.0％)与表达α4β1的Jurkats的结合，未观察到结合至α4β1-Jurkat细胞(图5)。
[0242] 整合素细胞粘附受体需要二价阳离子，以用于其配体结合活性。因此，在设计用于证明脂质体结合特异性的另一实验中，在结合测定中使用EDTA以螯合阳离子并且抑制整合素功能。即使在高浓度的测试的脂质体下，EDTA也完全消除了Gd567(250nm；0.25％)结合至Jurkat T淋巴细胞(图6)。
[0243] 对表2中描述的所有不同脂质体制剂进行图6中的分析。如图所示，在20mM EDTA存在下测定背景荧光以抑制整合素功能。从总结合中减去背景荧光以确定特异性结合曲线，-12从其中确定表观Kd。Kd的范围为22.0-100.5×10 M(参见表2)。还观察到较低量(例如
0.05％)的靶向配体导致较高的结合至细胞的背景脂质体，因此表明脂质体中靶向配体的较高浓度对于特异性细胞结合将是最佳的(图7)。
[0244] 从表2中描述的脂质体基质中，基于观察到的Kd和降低的非特异性结合，选择Gd567(150nm；1.0％)用于进一步的体内分析。另外，作为结合特异性的另一测试，在无靶向配体情况下生成了具有与Gd567(150nm；1.0％)相同的物理化学参数的对照脂质体。这些非靶向颗粒(Gdcon(150nm；1.0％))具有3％惰性DSPE-PEG-2000-OMe表面包被用于隐藏性能，而靶向脂质体具有3％DSPE-PEG-2000-OMe和1％DSPE-PEG-3400-THI565(称为THI567)。示出了代表性结合测定(图4)。
[0245] 为分析体内结合，将Gd567(150nm；1.0％)或Gdcon(150nm；1.0％)注射至健康C57BL/6小鼠的股静脉中。2小时后，通过心脏穿刺收集全血，并分析脂质体与外周血单核细胞、嗜中性粒细胞、T细胞和B细胞的结合(图8)。
[0246] 类似于图4中描述的体外研究，检测了Gd567(150nm；1.0％)的结合，而在体内未观察到Gdcon的显著结合(图8)。图8示出了3个独立实验的总结(平均标准化荧光强度±SEM)。
[0247] 为了将图8中描述的这些细胞亚群的每个亚群中的脂质体荧光可视化，还对细胞亚群进行分选并将其固定在
载玻片上以进行共聚焦分析(图9)。示出了3个代表性实验之一。
[0248] 通过小鼠动脉粥样硬化斑块中的MR显像对THI567靶向脂质体摄取进行定量。对于MRI研究，用高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠(12-14周龄)约10周。然后用THI0567靶向脂质体(0.1mmol Gd/kg)或非靶向对照脂质体(0.1mmol Gd/kg)对小鼠进行静脉内注射。使用T1加权(T1w)3D梯度回波(GRE)序列在1T
永磁体上进行体内MR显像。所有小鼠接受对比前T1w显像，然后给予脂质体-Gd对比剂(THI0567靶向或非靶向)并且立即进行对比后扫描。为确保对比剂从循环中清除，我们在给予脂质体对比剂72小时后获得了延迟的对比后扫描。THI0567靶向的脂质体-Gd剂在沿主动脉的多个位置处的T1w图像上显示出显著更高的主动脉壁信号增强(图10)；非靶向剂未显示同等的信号增强。为量化MR图像中的信号增强，我们计算了标准化增强比(NER)。给予THI0567靶向脂质体-Gd剂的小鼠中的总NER显著高于给予非靶向脂质体-Gd的小鼠中的总NER(42.8±45.9vs.7.4±14.8，p＝0.04)(图6A)。为识别具有最大信号增强的区域，我们在多个主动脉区段中确定了NER：升主动脉、主动脉弓和降主动脉(图10)。在主动脉弓(66.8±44.0vs.12.3±25.4，p＝0.001)和降主动脉(28.7±
38.5vs.-12.2±22.3，p＝0.023)中，靶向脂质体-Gd处理的小鼠中的NER显著高于非靶向脂质体-Gd小鼠(图6C)。在升主动脉中，尽管靶向脂质体组中的平均NER更高，但两组之间的差异未达到统计学显著性。在延迟的对比后扫描后，
收获主动脉组织并切片以检查脂质体积聚模式。在升主动脉和主动脉弓的切片的检查中，脂质体积聚(如罗丹明B荧光所示)限于油红阳性斑块(图10)。在未处理的小鼠的斑块中未观察到罗丹明B荧光(图10)。
[0249] 通过免疫荧光检查主动脉斑的切片，以确定与单核细胞系细胞相关的标志物是否与THI0567靶向脂质体共
定位。主动脉根中的罗丹明B荧光(脂质体)限于斑块内的内皮下区域(图11)。脂质体荧光与CD11b和F4/80单核细胞/巨噬细胞标志物均共定位(图11)。分支动脉(例如头臂动脉)和主动脉弓区域含有密集的THI0567靶向脂质体积聚(图11)，脂质体在斑块区域中的CD11b+细胞内内化。
[0250] 尽管已示出和描述了本发明的实施方式，但本领域技术人员在不脱离本发明的精神和教导的情况下可对其进行修改。本文描述的实施方式和提供的实施例仅为示例性的，并不旨在进行限制。本文公开的发明的许多变化和修改是可能的，并且在本发明的范围内。因此，保护范围不限于上述说明，而仅受以下权利要求的限制，该范围包括权利要求的主题的所有等同形式。
[0251] 在相关技术的描述中对参考文献(特别是可能具有在本
申请的
优先权日期之后的公开日期的任何参考文献)的讨论并非对其为本发明的
现有技术的承认。本文引用的所有
专利、专利申请和出版物的公开以其对本文阐述的内容提供的示例性补充、程序上的补充或其它细节补充的程度，以引用的方式将其整体并入本文。
[0252] 尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数为近似值，尽可能精确地报道在具体实施例中阐述的数值。但是，任何数值固有地包含必定由其各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。
[0253] 应注意，术语“约”可意为至多并包括所述值的±10％。例如，“约10”可意为9-11。
[0254] 此外，尽管通过描述实施例对组合物、方法等进行了说明，并且尽管非常详细地描述了实施例，
申请人无意将所附权利要求的范围约束或以任何方式限制于此类细节。因此，本申请旨在涵盖落入所附权利要求范围内的变更、修改和变化。前面的描述不意味着限制本发明的范围。相反，本发明的范围由所附权利要求及其等同物确定。
