一种诊断冠心病的分子标志物
阅读：100发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种诊断冠心病的分子标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了FAM174B基因可以作为冠心病早期诊断的分子标志物。本发明发现FAM174B基因在正常人和冠心病患者的血液中的表达存在显著差异，即可以通过检测血液中FAM174B基因表达情况来判断受试者是否患有冠心病。根据两者的相关性，本发明开发了一种诊断冠心病的 试剂 盒 ，该试剂盒通过检测FAM174B的表达从而进行冠心病的诊断。本发明的 诊断试剂盒 可用于 疾病 的早期诊断，在临床上具有广泛的应用前景。，下面是一种诊断冠心病的分子标志物专利的具体信息内容。
1.检测FAM174B基因或FAM174B蛋白的产品在制备诊断冠心病或预测冠心病预后的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测FAM174B基因或FAM174B蛋白的产品包括检测FAM174B基因或FAM174B蛋白的表达水平的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测受试者样本中的FAM174B基因或FAM174B蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的FAM174B基因或FAM174B蛋白的表达水平降低，则诊断该受试者为冠心病患者或该受试者的预后差。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者样本的来源是血液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合FAM174B基因的核酸或者能够结合FAM174B蛋白的物质；所述核酸能够检测FAM174B基因的表达水平；所述物质能够检测FAM174B蛋白的表达水平。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增FAM174B基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
7.一种诊断冠心病或预测冠心病预后的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测受试者样本中的FAM174B基因或FAM174B蛋白的表达水平的工具。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合FAM174B基因的核酸或者能够结合FAM174B蛋白的物质；所述核酸能够检测FAM174B基因的表达水平；所述物质能够检测FAM174B蛋白的表达水平。
9.根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增FAM174B基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述受试者样本的来源是血液。
一种诊断冠心病的分子标志物
技术领域
背景技术
[0002] 冠心病以极高的致死率及致残率成为影响人类健康的主要疾病之一，占所有致命性事件的40％。并且每年全世界范围内因心血管疾病死亡的人数逐年增高。据统计，发达国家心血管病死亡人数将从2000年的500万至2030年将增至6000万。在我国随着经济飞速发展，人民生活水平极大改善，居民生活方式改变，心血管疾病的发病率与死亡率也逐年增高。根据《中国心血管病报告2013》调查结果显示，中国城乡居民心血管病患病率呈上升趋势,死亡率居高不下，全国每年约有350万人死于心血管病。因此，对以冠心病为首的心血管疾病的早期筛查、系统诊治及相关基础研究成为目前我国面临的重大公共卫生问题。
[0003] 多年来人们研究发现冠心病是多种因素作用于不同环节所致的一种复杂疾病。除了早期发现的年龄、性别、血脂异常、肥胖、高血压、糖尿病、不良生活方式等传统危险因素，遗传因素也是导致冠心病发病的主要因素。存在冠心病、糖尿病、高血压、血脂异常家族史的人群冠心病发病率明显增加。近年来已克隆出与冠心病危险因素相关的易感或突变基因200种以上。
发明内容
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种通过检测FAM174B基因或蛋白表达差异来诊断冠心病的方法。
[0005] 本发明的目的之二在于提供一种通过检测FAM174B基因或蛋白表达差异来预测冠心病预后的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供了检测FAM174B基因或FAM174B蛋白的产品在制备冠心病诊断工具中的用途。
[0008] 本发明还提供了检测FAM174B基因或FAM174B蛋白的产品在制备预测冠心病预后工具中的用途。
[0009] 进一步，所述检测FAM174B基因或FAM174B蛋白的产品包括检测FAM174B基因或FAM174B蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合FAM174B基因的核酸或者能够结合FAM174B蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测FAM174B基因的表达水平；所述物质能够检测FAM174B蛋白的表达水平。
[0010] 本发明的检测FAM174B基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0011] 包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0012] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification Refractory Mutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
[0013] 上面所述的核酸包括扩增FAM174B基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
[0014] 在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
[0015] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
[0016] 本发明的检测FAM174B蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
[0017] 本发明的检测FAM174B蛋白的产品包括特异性结合FAM174B蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测FAM174B蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
[0018] 抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的FAM174B蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对FAM174B蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
[0019] 标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)
555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(InvitrogenCorporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(InvitrogenCorporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
[0020] 在本发明中，“预后”是指冠心病患者在通过手术处理等抑制或缓解冠心病后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解冠心病后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即FAM174B蛋白或编码FAM174B蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
[0021] 在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解冠心病之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。
[0022] 在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解冠心病后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。
[0023] 预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中FAM174B基因或FAM174B蛋白的水平升高或降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
[0024] 进一步，所述检测FAM174B基因或FAM174B蛋白的产品可以是检测FAM174B基因或FAM174B蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
[0025] 利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的FAM174B基因或FAM174B蛋白的表达水平，与正常人相比，受试者样本中的FAM174B基因或FAM174B蛋白的表达水平降低，则诊断该受试者为冠心病患者或该受试者的预后差。
[0026] 作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
[0027] 在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
[0028] 本发明还提供了一种诊断冠心病的工具，所述工具能够检测受试者样本中FAM174B基因或FAM174B蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合FAM174B基因的核酸或者能够结合FAM174B蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测FAM174B基因的表达水平；所述物质能够检测FAM174B蛋白的表达水平。
[0029] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0030] 进一步，所述诊断冠心病的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断冠心病的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知FAM174B基因的异常与冠心病相关也属于FAM174B基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0031] 本发明还提供了一种预测冠心病预后的工具，所述工具能够检测受试者样本中FAM174B基因或FAM174B蛋白的表达水平，所述预测冠心病预后工具包括能够结合FAM174B基因的核酸或者能够结合FAM174B蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测FAM174B基因的mRNA水平；所述物质能够检测FAM174B蛋白的表达水平。
[0032] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0033] 进一步，所述预测冠心病预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断冠心病的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知FAM174B基因的异常与冠心病相关也属于FAM174B基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0034] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗FAM174B抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合FAM174B即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制FAM174B功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。
[0035] 进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。
[0036] 本发明还提供了一种诊断冠心病或预测冠心病预后的方法，所述方法包括如下步骤：
[0037] (1)获取受试者的样品；
[0038] (2)检测受试者样品中FAM174B基因或蛋白的表达水平；
[0039] (3)将测得的FAM174B基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
[0040] (4)与对照相比，FAM174B基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为冠心病，或该受试者被确定为预后不良。
[0042] 本发明的优点和有益效果：
[0043] 本发明的发现了一种诊断冠心病的分子标志物，使用该分子标志物可以在冠心病发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
[0045] 图1显示利用基因芯片检测FAM174B基因在冠心病患者与正常人中的表达情况；
[0046] 图2显示利用QPCR检测FAM174B基因在冠心病患者与正常人中的表达情况；
[0047] 图3显示利用Western blot检测FAM174B蛋白在冠心病患者与正常人中的表达情况。
[0048] 具体的实施方式
[0049] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0050] 实施例1 FAM174B基因的差异表达
[0051] 1、研究对象：
[0052] 收集冠心病患者5例，正常人5例。
[0053] 冠心病组的纳入标准：按照世界卫生组织制定的缺血性心脏病的诊断标准，选择经冠状动脉造影证实有一支或多支血管狭窄程度≥50％的冠心病患者。对照组的入选标准为：1)在流行病学调查时筛选年龄、性别、民族均与CAD组相匹配，经过问卷调查、体格检查、心脏超声检查及心电图检查及相关实验室检查没有冠心病的临床表现及主要危险因素的体检者；2)住院行健康体检并行冠状动脉造影检查排除冠心病并年龄、性别、民族与CAD组匹配者；符合以上任何一条者入选为对照组。两组在纳入研究前签署知情同意书。
[0054] 剔除标准：CAD组-临床资料不全者及同时合并以下疾病之一者予以剔除。
[0056] 2、血液中总RNA的提取
[0057] (1)匀浆处理(Homogenization)
[0058] 要求研究对象空腹至少12h，于次日清晨7：00～8：00室温下，抽取10ml静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol。
[0059] (2)分层(Phase Separation)
[0060] a.样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。
[0061] b.每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。
[0062] (3)RNA沉淀(RNA Precipitation)
[0063] a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。
[0064] b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。
[0065] (4)RNA漂洗(RNA Wash)
[0066] a.RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75％乙醇。
[0067] b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。
[0068] (5)溶解RNA(Redissolving the RNA)
[0069] 沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。
[0070] 3、RNA质量和纯度检测
[0071] RNA质量：通过RNA完整性来表示，可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。
[0072] RNA纯度：OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值(10mM Tris,pH7.5)在2.0左右。
[0073] 4、测序：将上述RNA送交上海伯豪生物技术有限公司采用Solexa测序技术对样品进行测序。
[0074] 5、数据分析
[0076] 测序仪产生的原始图像数据经Base Calling转化为序列数据，我们称之为原始序列数据，结果以FASTQ文件格式存储。由于原始序列数据可能包含低质量序列、接头序列等杂质序列数据，不能直接用于生物信息分析，所以原始序列数据必需经过数据处理转换为高质量序列数据，利用Tophat(version：2.0.6)软件的spliced mapping算法对高质量序列数据进行基因组比对，采用基因组版本为Sscrofa10.2。
[0077] 5.2差异基因的筛选
[0078] 基因表达量的计算使FPKM法。根据基因的表达量(FPKM值)计算该基因在不同样本间的差异表达倍数。差异表达基因定义为FDR≤0.01且倍数差异在2倍及以上的基因。
[0079] 6、结果
[0080] 结果显示(如图1所示)，与正常人相比，冠心病患者血液中FAM174B基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0081] 实施例2 QPCR实验验证冠心病患者和正常人中差异表达的基因
[0082] 1、研究对象：
[0083] 筛选标准同实施例1，冠心病患者和正常人各50例。
[0084] 2、血液中总RNA的提取
[0085] 步骤同实施例1。
[0086] 3、逆转录
[0087] 用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育
1h，72℃10min，短暂离心。
1h，72℃10min，短暂离心。
[0088] 4、QPCR
[0089] (1)引物设计
[0090] 根据Genbank中FAM174B基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0091] FAM174B基因：
[0092] 正向引物为5’-AGACACGCAAGTATGATA-3’(SEQ ID NO.3)；
[0093] 反向引物为5’-GAGTCCTCATCTTCATCA-3’(SEQ ID NO.4)，
[0094] GAPDH基因：
[0095] 正向引物为5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’(SEQ ID NO.5)；
[0096] 反向引物为5’-CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3’(SEQ ID NO.6)。
[0097] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0098] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0099] 表1 PCR反应体系
[0100]试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
[0101] (3)PCR反应条件：95℃5min，(95℃10s，60℃40s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
[0102] 5、统计学方法
[0103] 结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0104] 6、结果
[0105] 结果如图2所示，与正常人相比，冠心病患者血液中FAM174B基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果同基因芯片实验。
[0106] 实施例3 FAM174B蛋白差异表达检测
[0107] 1、研究对象
[0108] 同实施例2。
[0109] 2、单核细胞分离
[0110] 无菌采集静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的HBSS(NaCl 8.0g，Na2HPO4 0.132g，KH2PO4 0.06g，KCl 0.4g，酚红1ml，NaHCO3 0.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2 000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的HBSS洗涤2次，依次以2 000r/min、1 500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％NaCl溶液，2 000r/min离心，去上清，经细胞计数后用HBSS溶液调整细胞至1×106个/ml备用。
[0111] 3、单核细胞总蛋白质提取
[0112] 将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×106个/ml)室温1 000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12 000r/min离心1h；取上清用Brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。
[0113] 4、Western blot检测
[0114] 将提取的蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。
[0115] 5、统计学处理
[0116] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0117] 6、结果
[0118] 结果如图3所示，与正常人相比，冠心病患者血液中FAM174B蛋白含量低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0119] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
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