技术领域
[0001] 本
发明属于
生物检验检疫技术领域，具体地说涉及一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒。
背景技术
[0002] 弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)入侵动物的有核细胞而引起的一种全球性的人兽共患寄生虫病。弓形虫是一种机会致病性寄生虫，在正常人体内不会产生明显症状，对于免疫系统
缺陷的群体或者在免疫抑制的患者(如
艾滋病患者、
恶性肿瘤患者及刚接受器官移植的人)危害比较大，常引起严重的器官损害，是其常见的致死病因之一。弓形虫的发育过程需要两个宿主，猫是唯一的终末宿主；中间宿主分布十分广泛，几乎包括人类在内的所有温血动物、部分变温动物和一些
节肢动物。两个宿主在弓形虫的传播与感染中都起着重要作用。目前弓形虫尚无特效药对其
治疗，也无有效的
疫苗进行
预防，因此动物弓形虫感染的监测对于
疾病的防控具有重要意义。
[0003] 目前常用的弓形虫诊断方法主要包括病原学、分子生物学和免疫学等方法。其中病原学方法费时费
力，准确性较低；分子生物学包括PCR、DNA探针和
基因芯片等技术，该方法虽然敏感性和特异性高，但其操作过程复杂且仪器设备昂贵；免疫学方法有间接血凝试验(IHA)、萨宾-费尔德曼
染色试验(DT)、乳胶凝集试验(LAT)、酶联
免疫吸附试验(ELISA)等。IHA操作简单，对感染时间较长的血清具有较好的敏感性，但对急性感染早期的血清敏感性差，且致敏红细胞不稳定，重复性差。DT是弓形虫病特有的血清学诊断方法，该方法特异性强且敏感性高，适用于弓形虫感染的早期诊断。但诊断所用的
抗原必须为活虫，安全性差，因此在我国较少应用。LAT最大的问题是特异性差，经LAT诊断的阳性血清还需做进一步的血清学试验，延长诊断时间，抑制了此方法的推广与应用。ELISA是上世纪70年代出现的一种标记免疫检测技术，经过多年来不断的完善和改进，该技术已十分成熟。ELISA操作简便，不需特殊仪器设备，样品用量少，且具有高敏感性和高特异性，判断结果容易，适合于大量样本的检测。
[0004] 目前市场上存在多种诊断弓形虫的ELISA
诊断试剂盒，
质量参差不齐难以选择。进口弓形虫ELISA诊断试剂盒质量虽好，但是却受到运输条件和价格的限制，很难大量推广应用。因此制备一种特异、敏感、简便且适合华南本地区的弓形虫诊断试剂盒是有一定必要的。
[0005] 目前弓形虫ELISA检测所用的抗原多是虫体可溶性抗原，其成分不确定，抗原制备批次间差别较大，不易标准化。随着分子生物学技术的不断发展，重组抗原以其成分确定、易标准化、特异性强等优势，在选择弓形虫诊断抗原方面应用越来越广泛。弓形虫隶属于顶复
门原虫，其前端都具有棒状体(Rhoptry)、微粒体(Microsone)和致密颗粒(Dense granule)3种不同尖端
复合体，可分泌三种不同的蛋白。棒状体分泌的棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)与弓形虫入侵宿主细胞有密切的关系。ROP5是弓形虫入侵宿主细胞重要的
毒力因子，在弓形虫强毒株入侵宿主之前将ROP5基因敲除，结果发现弓形虫的毒力完全消失，因此得出ROP5是弓形虫感染宿主的必需毒力因子。不仅如此，ROP5还具有良好的免疫原性和免疫保护性，是一种潜在的疫苗制备、诊断候选抗原分子。
发明内容
[0006] 本发明的目的是克服现有弓形虫ELISA检测技术的不足，提供一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，本检测试剂盒利用弓形虫ROP5重组蛋白作为包被抗原，为进一步开发与研究弓形虫ELISA诊断试剂盒奠定
基础。
[0007] 本发明的目的通过下述的技术方案实现：一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，所述的检测试剂盒中所用的检测抗原为弓形虫ROP5重组蛋白。
[0008] 所述的弓形虫ROP5重组蛋白是通过以下方法制备而成：
[0009] (1)提取RH株弓形虫的DNA；
[0010] (2)根据GenBank中已发表的基因序列设计引物，PCR扩增出弓形虫ROP5基因，引物序列如下：
[0011] RH株ROP5F：5’-TATAGGATCCATGGCGACGAAGCTCG-3’；(SEQ ID NO 1)；
[0012] RH株ROP5R：5’-TATACTCGAGCTCAAGCGACTGAGGGCG-3’；(SEQ ID NO 2)。
[0013] 其中，粗体部分序列为酶切位点序列；
[0014] (3)扩增的PCR产物的回收与纯化；
[0015] (4)PCR产物与PMD-18T克隆载体连接，连接产物转入DH5α感受态细胞，经过BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，筛选阳性克隆进行测序；
[0016] (5)经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的ROP5基因
片段插入表达载体pET32a中构建重组表达质粒pET32a-ROP5；
[0017] (6)将重组表达质粒pET32a-ROP5转入BL21(DE3)感受态细胞中，培养后挑取阳性质粒，酶切鉴定；
[0018] (7)将鉴定为阳性的克隆菌放入细菌到
密度增殖培养基(MDG)中培养，待菌液轻微混浊时，将菌液接种于自动诱导表达培养基(ZYM-5052)中诱导表达；用镍柱纯化重组蛋白，得重组融合蛋白TgROP5。
[0019] 步骤(2)所述的PCR扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性1min，61℃复性1min，72℃延伸2min，进行30个循环，最后72℃终延伸7min。
[0020] 上述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，还包括：
[0021] 1)辣根过
氧化物酶标记的兔抗犬IgG；
[0022] 2)
磷酸盐缓冲液为15mM PBS：具体为NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KCl 0.2g，加蒸馏
水定容至1000mL，调节溶液的pH值至7.4；
[0023] 3)抗原包被液为50mM Tris
盐酸缓冲液(50mM TBS)：具体为Tris 0.60g，NaCl0.88g，加去离子水90mL，完全溶解后用盐酸调节pH至7.6，加去离子水定容至100ml；
[0024] 4)洗涤液为15mM PBST：具体为含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；
[0025] 5)样品稀释液为1％BSA-PBST：具体为BSA 1g加入100mL PBST；
[0026] 6)封闭液为5％
脱脂奶粉：具体为5g脱脂奶粉加入100mL PBS；
[0027] 7)酶标二抗稀释液为10％胎
牛血清-PBST：具体为胎牛血清10mL加入90mL PBST；
[0028] 8)底物缓冲液为磷酸盐-
柠檬酸缓冲液(pH5.0)：具体为柠檬酸2.553g Na2HPO4·12H2O 9.2g用去离子水定容至500mL，4℃保存；
[0029] 9)TMB贮存液(10mg/mL)：具体为TMB 1g，DMSO 99mL，溶解后分装，4℃避光保存；
[0030] 10)TMB底物显色液：具体为底物缓冲液99mL，TMB贮存液1mL，30％H2O2100μL，现配现用；
[0031] 11)终止液(2M H2SO4)：具体为浓
硫酸21.7mL，去离子水178.3mL，将浓硫酸缓慢加入去离子水中，边加边搅拌。
[0032] 应用上述试剂盒进行犬弓形虫抗体间接ELISA检测的方法，包括以下步骤：包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止。
[0033] 上述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测的方法，最佳的工作条件为：抗原稀释320倍(浓度为1-25μg/mL)，样品稀释50倍，酶标二抗稀释浓度为1:2000，抗原包被时间1.5h，抗原包被液是50mM Tris盐酸缓冲液，封闭时间是1h，封闭液为5％脱脂奶粉，样品稀释液为1％BSA-PBST，样品孵育时间是2.5h，酶标二抗稀释液为10％胎牛血清-PBST，酶标二抗孵育时间是30min，底物显色时间10min，阴阳临界值为0.484。
[0034] 上述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测的方法，具体包括以下步骤：
[0035] a.包被：用50mM Tris盐酸缓冲液将TgROP5重组蛋白稀释成1-25μg/mL，包被ELISA酶标板，100μL/孔，37℃孵育1.5h，甩干包被液，用洗涤液PBST洗涤3次，2min/次；
[0036] b.封闭：将每孔加300μL封闭液5％脱脂奶粉，37℃孵育1h，甩干封闭液，用PBST洗涤3次，2min/次；
[0037] c.加检测血清：将血清用1％BSA-PBST按1:50的比例稀释，设阴性和阳性对照，每孔加入100μL，37℃孵育2.5h，甩干，洗涤3次；
[0038] d.加二抗：用10％胎牛血清-PBST将兔抗犬IgG-HRP作1:2000稀释，100μL/孔，37℃孵育30min，甩干，同上洗涤3次；
[0039] e.加底物：每孔加入100μL新鲜配制的TMB底物溶液，于37℃避光显色10min；
[0040] f.终止：每孔50μL加入终止液，终止反应；
[0041] g.结果判定：用酶标仪测450nm处的OD值；OD值≥0.484为阳性，OD值＜0.484为阴性。
[0042] 上述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测原理图如图7所示。
[0043] 本发明相对于
现有技术具有如下的优点及效果：
[0044] 1.本发明中所述的检测抗原是重组蛋白ROP5-PET32a。弓形虫棒状体分泌的棒状体蛋白与弓形虫入侵宿主细胞有密切的关系。研究发现，ROP5是弓形虫入侵宿主细胞重要的毒力因子，ROP5还具有良好的免疫原性和免疫保护性。因此用重组蛋白ROP5-PET32a作为包被抗原检测弓形虫抗体，具有很强的特异性和敏感性。
[0045] 2.本发明通过优化反应体系和反应条件，建立了一种新的犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法，该方法包被抗原可规模化标准化生产，且方法特异性、敏感性和可重复性强，结果判定客观，操作过程简单，可以进行大批量检测。该方法可实现对犬弓形虫病的流行病学调查、犬弓形虫感染的检测和临床诊断，为犬弓形虫的诊断和防治技术等进一步研究奠定了基础。
附图说明
[0046] 图1:RH株弓形虫ROP5基因的PCR扩增结果图。其中，M为DL2000DNA Marker；1为ROP5PCR扩增产物；2为阴性对照。
[0047] 图2:PET32a-ROP5重组质粒的酶切鉴定结果图。其中，M为DL5000DNA Marker；1为ROP5PCR扩增产物；2-4为重组质粒pMD18-ROP5双酶切产物；5-6为重组质粒pMD18-ROP5。
[0048] 图3:弓形虫重组蛋白ROP5表达的SDS-PAGE
电泳结果图。其中，M为170kDa蛋白marker；1为诱导12h PET32a空载体菌；2为PET32a-ROP5诱导12h；3为PET32a-ROP5诱导13h；4为PET32a-ROP5诱导15h；5为PET32a-ROP5诱导17h；6为PET32a-ROP5诱导19h。
[0049] 图4:重组蛋白表达形式的结果图。其中，M为170kDa蛋白marker；1为PET32a-ROP5诱导全菌；2-3为PET32a-ROP5诱导上清；4-5为PET32a-ROP5诱导沉淀。
[0050] 图5:弓形虫重组蛋白ROP5纯化结果。其中，M为170kDa蛋白marker；1为上样前样品；2为样品流穿液；3为杂蛋白洗涤液；4为80mM咪唑洗脱液；5为160mM咪唑洗脱液；6为200mM咪唑洗脱液；7为320mM咪唑洗脱液；8为500mM咪唑洗脱液。
[0051] 图6:ROP5纯化蛋白的western-blot分析。其中，M为170kDa蛋白marker；1为160mM咪唑洗脱液；2为200mM咪唑洗脱液；3为PET32a空载体诱导菌
[0052] 图7：间接ELISA检测原理图。
具体实施方式
[0053] 下面结合
实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0054] 实施例1表达载体ROP5-PET32a的构建
[0055] 1、引物的设计与合成
[0056] 根据GenBank中已发表的基因序列，设计扩增弓形虫ROP5基因序列的引物。据克隆所需，在引物ROP5F的5’端引入BamHⅠ酶切位点，在ROP5R的5’端引入XhoⅠ酶切位点。引物由英潍捷基公司合成，其核苷酸序列组成如下：
[0057] RH株ROP5F：5’-TATAGGATCCATGGCGACGAAGCTCG-3’
[0058] RH株ROP5R：5’-TATACTCGAGCTCAAGCGACTGAGGGCG-3’
[0059] 2、ROP5目的基因的扩增
[0060] 将本实验室液氮罐中保存的RH株弓形虫速殖子在BALB/c小鼠体内复苏，收集小鼠腹水提取RH株弓形虫全组DNA。以提取的弓形虫虫体DNA为
模版，使用F和R两条引物，进行ROP5基因的PCR扩增，PCR反应采用25μL的反应体系。反应体系如下：
[0061]
[0062]
[0063] 扩增条件为：
[0064]
[0065] 将上述PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，
电压120V，时间30min，置于紫外透射仪中观察，结果见附图1。
[0066] 3、构建ROP5-PMD-18T克隆载体质粒
[0067] 采用切胶纯化法对扩增的PCR产物进行切胶回收，将回收的ROP5基因片段连接到克隆载体PMD-18T上，用BamHI和Xho I双酶切鉴定，酶切体系如下：
[0068]
[0069] 酶切结果见附图2，将酶切鉴定为阳性的PMD-18T质粒送到上海生工公司测序，其ROP5酶切测序的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0070] 4、构建ROP5-PET32a表达载体质粒
[0071] 将测序鉴定正确的ROP5-PMD-18T质粒和PET32a空载体用BamHI和Xho I双酶切，酶切后的ROP5基因片段和线性化的PET32a连接，构建ROP5-PET32a重组质粒，连接体系为：
[0072]
[0073] 混匀后短暂离心，于4℃连接过夜。将连接产物转化到DH5α感受态细胞培养，使重组载体质粒大量克隆，提取ROP5-PET32a载体质粒。
[0074] 实施例2 ROP5目的蛋白诱导表达与纯化
[0075] 1、目的基因ROP5在大肠杆菌中的诱导表达
[0076] 将重组表达质粒ROP5-PET32a转化到表达菌BL21(DE3)中，涂板，培养12～14h。从培养的平板上挑取单个白色菌落，接种于细菌高密度增殖培养基(MDG)中，37℃，200rpm+
培养6～8h，当细菌出现轻微混浊时，将菌液以1:1000的比例接种于含100μg/mL Amp自动诱导表达培养基(ZYM-5052)中，28℃，200rpm震摇培养，分别在诱导不同的时间取样，设置诱导的空载体菌作为对照，进行SDS-PAGE电泳检测表达产物，电泳结果见附图3。
[0077] 2、表达产物存在形式的检测
[0078] 将细菌高密度增殖培养基中的菌液以1:1000的比例接种于自动诱导表达培养基中诱导表达，至蛋白表达量最高的时间停止诱导。将诱导后的菌液置于
冰上5min，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。用样品缓冲液重旋菌体，用
超声波细胞
粉碎机超声裂解菌体，功率200w，超声3s，间隔5s，超声次数120次。4℃，8000rpm，离心10min，分别取上清和沉淀，进行SDS-PAG电泳，检测重组蛋白是存在于上清液中还是包涵体中，结果见附图4。
[0079] 3、目的蛋白的纯化
[0080] 经SDS-PAG电泳鉴定选择上清液，用北京全世金公司的Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶型蛋白)进行纯化目的蛋白。
[0081] (1)装柱：重旋蛋白纯化镍柱填料，将1mL填料加入层析柱，静置待填料与酒精保存液分离，打开层析柱下面的
盖子使液体流出。
[0082] (2)平衡：用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡柱子，为了提高特异性结合，平衡缓冲液中可加入低浓度咪唑(10-20mM)。
[0083] (3)上样：超声
破碎的上清液与样品缓冲液1:1稀释，用0.45μm的
过滤器过滤样品。将样品缓慢加入层析柱，堵住柱子出口，样品和填料孵育30min，缓慢流出，收集样品流穿液。
[0084] (4)洗涤：上样完毕后，用5-10倍柱体积平衡缓冲液洗涤柱子，收集洗涤液。
[0085] (5)洗脱：5倍柱体积的80mM咪唑洗脱柱子1遍，收集洗脱液；5倍柱体积的120mM咪唑洗脱柱子一遍，收集洗脱液；5倍柱体积的160mM咪唑洗脱柱子一遍，收集洗脱液；5倍柱体积的200mM咪唑洗脱柱子一遍，收集洗脱液；5倍柱体积的320mM咪唑洗脱柱子一遍，收集洗脱液；5倍柱体积的500mM咪唑洗脱柱子一遍，收集洗脱液。
[0086] (6)SDS-PAGE：分别取适量上样前样品、样品流穿液、洗涤液和不同浓度的咪唑洗脱液加5×SDS-PAGE上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化结果，结果见附图5。
[0087] 4、纯化蛋白Western blot检测
[0088] 将纯化后的目的蛋白和PET32a空载体诱导菌进行SDS-PAGE电泳，参照常规Western blot方法进行操作，经一抗小鼠抗His抗体和二抗羊抗小鼠HRP-IgG孵育后，用ECL发光液处理后于
化学发光图像分析系统(Tanon Fine-do X6)发光显色，拍照观察，结果表明纯化蛋白在81kD左右出现条带，PET32a空载体诱导菌在20kD左右出现条带，结果如附图6。
[0089] 实施例3间接ELISA检测犬弓形虫抗体方法的建立
[0090] 用纯化后的表达蛋白ROP5作包被抗原建立间接ELISA方法，采用棋盘法摸索最佳抗原包被浓度、最佳血清稀释倍数，以及ELISA方法的最佳反应条件。最终确定条件如下：
[0091] (1)包被：将纯化蛋白用Tris-HCl缓冲液(50mM pH7.6，TBS)按1:320的比例(即蛋白包被浓度为2.06μg/mL)稀释，加入96孔酶标板，100μL/孔，37℃孵育1.5h。甩干，用洗涤液PBST洗涤3次，2min/次。
[0092] (2)封闭：封闭液采用5％脱脂奶粉-PBST，300μL/孔，37℃孵育1h，甩干封闭液，用PBST洗涤3次。
[0093] (3)加血清：将血清用1％BSA-PBST按照1:50的倍数稀释，每孔加100μL，37℃孵育2.5h，甩干，用PBST洗涤3次。
[0094] (4)加二抗：用10％胎牛血清-PBST将兔抗犬IgG-HRP作1:2000稀释，100μL/孔，37℃孵育30min，甩干，洗涤3次。
[0095] (5)加底物：每孔加入新鲜配制的TMB底物溶液，100μL/孔，避光显色10min。
[0096] (6)终止：加入终止液，50μL/孔，终止反应。
[0097] (7)测OD450值：在450nm处，用自动酶标仪测定各孔OD值。
[0098] 上述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测原理图如图7所示。
[0099] 实施例4临界值的确定：
[0100] 用已建立的间接ELISA方法对15份弓形虫阴性的犬血清进行检测，计算出血清的OD450nm的平均值(X)为0.326，标准偏差(SD)为0.079，按照公式：阴阳性临界值＝X+2SD得出本试验的临界值为0.484。当血清OD450nm≥0.484时，结果判定为阳性；当血清OD450nm＜0.484时，结果判定为阴性。
[0101] 实施例5敏感性试验
[0102] 用建立的间接ELISA检测方法检测37份犬弓形虫的阳性血清和15份犬弓形虫的阳性血清，检出阳性血清36份，阴性血清15份，根据公式：敏感性＝(检出份数/总份数)×100％，可以得出该方法的敏感性为98.08％。
[0103] 实施例6特异性试验
[0104] 用已建立的间接ELISA最佳条件分别检测犬细小、犬瘟热、犬腺病毒病和犬副流感病毒病的阳性血清，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，每种重复4孔，用酶标仪测定OD450nm值，结果表1所示：
[0105] 表1 酶标仪OD值检测结果
[0106]
[0107] 结果显示，除犬弓形虫阳性血清OD450值为阳性外，其余血清全为阴性。说明该重组蛋白抗原与犬细小、犬瘟热、犬腺病毒病和犬副流感病毒病的阳性血清均没有交叉反应，建立的此间接ELISA方法具有良好的特异性。
[0108] 实施例7与其他ELISA试剂盒检测结果比较
[0109] 将37份犬弓形虫阳性血清样品分别用本研究组装的间接ELISA试剂盒、珠海海泰生物科技有限公司购买的ELISA试剂盒以及兰州兽医研究所直接血凝试验试剂盒进行检测，比较它们间的相关性和符合情况，结果如表2所示：
[0110] 表2 不同ELISA试剂盒的检测结果
[0111]
[0112]
[0113] 由结果可知，37份阳性血清，用本研究建立的间接ELISA检测方法检测结果有35份呈阳性，阳性符合率为94.59％；珠海海泰生物科技有限公司购买的ELISA试剂盒检测有36份呈阳性，阳性符合率为97.3％；兰州兽医研究所HIA试剂盒检测结果有35份呈阳性，阳性符合率为94.59％。可以看出本发明ELISA检测试剂盒的检测结果与其他公司的试剂盒检测结果相差不大，甚至比一些公司的检测结果要好一些。
[0114] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
