技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，特别是涉及一种抗原多肽及其应用。
背景技术
[0002] 禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科，甲型流感病毒属，一般为球形，直径为80-120nm，其基因组为分8个节段的负链单股RNA，编码11个已知蛋白。其中，病毒包膜上的糖蛋白血凝素(HA)和神经
氨酸酶(NA)是血清学区分多种病毒亚型的依据，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。
[0003] 禽流感病毒可感染几乎所有野禽及
家禽，根据致病
力的不同，可将其分为高致病性、低致病性和无致病性AIV。近年来，禽流感在世界范围流行，给养禽业造成巨大的经济损失。由于是单链RNA病毒，所以禽流感病毒极易变异，除感染禽类外，还可感染人、猪、
马、
水貂和海洋
哺乳动物。1997年香港、2003年荷兰、2004年以来东南亚都出现了人感染高致病性禽流感而死亡的病例。高致病性禽流感(Hihgly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告疫病，我国也将其列为一类动物疫病。
[0004] 2013年3月，我国首次出现H7N9禽流感
病毒感染人类，随后各地持续性出现感染病例的报道，引起世界的广泛关注。一些研究认为这种新型禽流感病毒亚型H7N9可能是一种来自数种禽流感病毒的变异和重配病毒，从而赋予其跨越物种感染的能力。流感病毒血凝素蛋白在病毒
吸附、穿膜和决定病毒的致病性方面起着关键作用。血凝素变异性很强，近年来已报道多起由禽流感病毒亚型H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7引起的禽流感爆发流行事件，直接导致人类感染禽流感病毒数量的增加。
[0005] 研制快速诊断H7亚型禽流感的检测方法，对于制定
治疗和用药方案；控制传染病流行具有重要的意义。通常情况下，高致病性禽流感的诊断可以根据临床症状、大体剖检等作出初步诊断，具体可参考国家颁布的《高致病性禽流感防治技术规范》。确诊和分型则需要进行实验室诊断，包括：病原的分离与鉴定、血清学诊断。实验室诊断H7亚型禽流感患者以反转录
聚合酶链反应技术(RT-PCR)为主，但是高致病性禽流感病毒需要在生物安全3级实验室才能操作，操作人员必须经过专业的训练，而且分离鉴定需要较长的时间，因此该方法的应用受到极大的限制。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种能够与人抗H7亚型禽流感病毒血凝素
抗体特异性结合的抗原多肽，利用该抗原多肽制得的
试剂盒可以快速、简便诊断人感染H7亚型禽流感病毒。
[0007] 一种抗原多肽，为如下(a)或(b)的
蛋白质：
[0008] (a)氨基酸序列为QMTKSYKNTRKS的蛋白质；
[0009] (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸能够与人抗H7亚型禽流感病毒血凝素抗体特异性结合的蛋白质。
[0010] 所述抗原多肽是根据已报道的感染人的禽流感病毒A/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013(H7N9)株的血凝素蛋白(GenBank序列号AGJ51953.1)氨基酸序列，利用生物信息学和免疫学技术预测并筛选出具有良好的特异性和较强的免疫原性的线性B细胞抗原表位。
[0011] 本发明还提供了所述抗原多肽在制备诊断人感染H7亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。
[0012] 由于本发明抗原多肽可以与抗H7亚型禽流感病毒血凝素抗体特异性结合，因此可以利用免疫反应制得相应的试剂盒，如本发明
实施例公开的多肽酶联
免疫吸附试剂盒等，当然也可以是
试纸条。
[0013] 本发明又提供了一种诊断人感染H7亚型禽流感病毒的多肽酶联免疫吸附试剂盒，包括预包酶标板，所述预包酶标板包被所述的抗原多肽。
[0014] 优选的，所述抗原多肽使用浓度为10μg/mL，96孔酶标板每孔用量为1μg。抗原多肽可以从公司购买人工合成的，也可以使用转基因技术由
微生物细胞进行
发酵获得。优选的，抗原多肽为人工合成。
[0015] 除了上述预包酶标板外，该多肽酶联免疫吸附试剂盒还包括样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、TMB显色液和终止液。
[0016] 所述样品稀释液为
牛血清
白蛋白(BSA)浓度为5～50g/L的缓冲液；所述阴性对照血清为未被H7N9感染的正常人血清；所述阳性对照血清为感染H7N9禽流感病毒的患者血清；所述酶标二抗为辣根过
氧化酶标记的羊抗人IgG抗体；所述浓缩洗涤液为25×含Tween 20的缓冲液，使用时用纯净水稀释25倍，现配现用。
[0017] 本发明还提供所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0018] (1)样品收集、准备；(2)加样孵育；(3)洗板；(4)加二抗孵育；(5)洗板；(6)显色；(7)终止显色；(8)读板；(9)结果分析。
[0019] 本发明结果分析的方法为：Cutoff＝2.1×阴性对照孔平均值OD450，当待测样本OD450≥Cutoff值为阳性；样品OD450＜Cutoff值为阴性。：
[0020] 本发明试剂盒检测灵敏度高、特异性强、成本低、方法简便、快速、重复性好，适用于人感染H7亚型禽流感病毒的快速检测和流行病学研究，特别是能够适合于
基层单位使用。
附图说明
[0021] 图1为H7N9禽流感病毒血凝素蛋白线性抗原表位的预测结果图，其中A、B、C和D为预测所得的4个抗原表位位点；
[0022] 图2为预测的4段抗原多肽分别与流感病毒亚型H1～H16的HA蛋白氨基酸序列比对图；
[0023] 图3为预测的4个抗原表位位点在H7N9HA蛋白中的分布情况图；
[0024] 图4为使用本发明试剂盒检测H7N9患者血清中血凝素特异性抗体的结果分析图。
具体实施方式
[0025] 实施例1
[0026] 通过DNAStar Lasergene’s Protean系统分析人感染H7N9禽流感病毒血凝素蛋白氨基酸序列(GenBank序列号AGJ51953.1)的抗原性、亲水性、柔韧性和表面可及性。选择抗原性指数≥0、亲水性指数≥0、蛋白质表面可及性指数≥1和其内部或附近具有柔韧性结构的氨基酸区段(图1)，综合分析以上结果，选取四种因素都符合的多肽区段判定为潜在的线性B细胞抗原表位，共获得4段多肽，各预测位点分别位于其N端的第172-183(A)、363-380(B)、452-472(C)和491-506(D)四个区段(表1)。
[0027] 表1 预测人感染H7N9禽流感病毒HA蛋白线性B细胞抗原表位
[0028]
[0029] *是多肽序列每个氨基酸对应指数的加权平均值。
[0030] 实施例2
[0031] 利用ClustalX2.1
软件将实施例1中预测得到的四种抗原多肽分别同流感病毒亚型H1～H16血凝素蛋白氨基酸序列进行多重序列比对，结果多肽A具有更好的H7亚型特异性(图2)。所以，将抗原多肽A作为本发明试剂盒的首选。
[0032] 实施例3
[0033] 利用Cn3D 4.3.1软件分析H7N9禽流感病毒血凝素蛋白的三维结构(PDB ID：4N5J)，发现预测的四个B细胞抗原表位均位于HA蛋白表面，与抗原表位位于蛋白表面的特点相符(图3)。
[0034] 实施例4
[0035] 1、预包酶标板的制备：人工合成抗原多肽A(氨基酸序列为QMTKSYKNTRKS)，用包被缓冲液将多肽溶解并稀释至10μg/mL；96孔酶标板每孔加入100μL多肽溶液，4℃反应12h 后，用缓冲液洗板3次；每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h后洗板3次，
冷冻干燥后，
封口膜封好，4℃保存。
[0036] 2、试剂的配制：
[0037] (1)包被缓冲液(pH 9.6)：为含有1.59g/L Na2CO3和2.93g/L NaHCO3的水溶液。
[0038] (2)PBS缓冲液(pH 7.4)：8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4.12H2O和0.2g KCl，溶解在1000mL蒸馏水。
[0039] (3)封闭液、样本稀释液和酶稀释液：1g牛血清白蛋白溶解在100mL PBS缓冲液中。
[0040] (4)工作浓度的酶标抗体：1μL市售辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG抗体溶解在5000μL酶稀释液中。
[0041] (5)25倍浓缩洗涤液：6g/L KH2PO4、5g/L KCl、36g/L Na2HPO4、200g/L NaCl和体积分数1.25％的Tween 20的水溶液，临用前用纯净水稀释25倍，得到洗涤缓冲液，现配现用。
[0042] (6)阳性对照血清：获取感染H7N9禽流感病毒的患者的血液，分离获得血清，稀释100倍。
[0043] (7)阴性对照血清：获取未感染H7N9禽流感病毒的正常人的血液，分离获得血清，稀释100倍。
[0044] (8)TMB显色液和终止液采用市售试剂。
[0045] 实施例5
[0046] 样品收集后，分离血清，如果不是马上进行检测，则可以置于-20℃保存，检测前于室温下解冻。
[0047] (1)从
冰箱取出各试剂，恢复至室温。
[0048] (2)用样本稀释液将待检血清做1:100稀释。
[0049] (3)设置2个阳性对照孔，各加100μL阳性对照血清。
[0050] (4)设置2个阴性对照孔，各加100μL阴性对照血清。
[0051] (5)设置2个空白对照孔，各加100μL样本稀释液。
[0052] (6)每个待检测样设置2个重复孔，每孔加100μL稀释好的血清样品。
[0053] (7)封口膜封好后，将酶标板置于37℃孵育1h。
[0054] (8)洗板：浓缩洗涤液稀释后，每孔加入300μL洗涤液，反复洗涤3～5次，最后一次在吸水纸上拍干。
[0055] (9)向包被酶标板中加入100μL工作浓度的酶标抗体，37℃孵育30～60min。
[0056] (10)洗板：同步骤(8)。
[0057] (11)显色：每孔加入100μL TMB显色液，37℃反应15min。
[0058] (12)每孔加入50μL终止液终止反应。
[0059] (13)将酶标板置于酶标仪上，读取450nm
波长下的OD值。
[0060] (14)待测样本的阳性判断标准：Cutoff＝2.1×阴性对照孔平均值OD450，当待测样本OD450≥Cutoff值为阳性；样品OD450＜Cutoff值为阴性。
[0061] 实施例6
[0062] 获取3例感染H7N9禽流感病毒的患者血清和1例正常人血清，患者血清1、2、3获取时间分别为2013年10月15日、2013年11月1日和2013年12月8日。使用本发明的检测试剂盒，按实施例5中记载方法进行检测，所有结果均以均值±标准差表示，所得结果如图4所示，正常人的阴性血清OD450＜Cutoff值，而三组患者的血清检测值OD450＞Cutoff值。
