一种同时定量检测SAA/PCT/CRP 的方法
技术领域
背景技术
[0002] 血清
淀粉样蛋白A(SAA)是一种高度异质性的急性相反应蛋白,主要由
肝细胞产生，其相对分子量约为12 000。SAA这种急性反应物在
炎症反应中的浓度会比其在正常时升高1000倍,升幅高于CRP,此时它经由其N端与高
密度脂蛋白(HDL)结合可以置换与HDL结合的载脂蛋白A-I(ApoA-I)从而形成急性相时的SAA/HDL
复合体，其
半衰期仅为50分钟左右。研究表明，在炎症严重的情况下，SAA表达量的高低与
坏死细胞和组织的数量密切相关。SAA的表达量在炎症发生的第3天出现高峰，第7天回到基线。
[0003] 降
钙素原(PCT)是一种
蛋白质，当严重细菌、
真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在
血浆中的
水平升高。自身免疫、过敏和
病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。PCT在人体内的半衰期为25-30h，
稳定性好，在正常人血清中含量极低。在导致全身炎症反应综合症(SIRS)的许多情况下,诸如细菌性感染、胰腺炎、烧伤、多发伤，血中CT前肽物质的所剪切产物异常升高，其中PCT是最主要的产物,而CT无明显变化。血PCT水平与感染及损伤的严重程度呈正相关，且已成为用于脓毒症，严重脓毒症，脓毒症休克的诊断和疗效监测的有效指标。
[0004] PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。另外，PCT只 是在少数患者的大型外科术后1-4d可以测到。
[0005] C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，1930年Tillet和Francis因在急性大叶性
肺炎患者血清中发现能在钙离子存在时与肺炎球菌C多糖起沉淀反应而得名，是人类重要的急性期反应蛋白，急性期浓度可升高上千倍，循环中的CRP半衰期为19小时。人类CRP是由肝脏产生，由五个相同的亚基依靠非共价键形成的环状五聚体，这一特征性结构使其归类于五聚素(一组具有免疫防御特性的钙结合蛋白)家族。
[0006] 与C反应蛋白(CRP)类似,血清淀粉样蛋白A的含量浓度是反映感染性
疾病早期炎症的敏感指标,有助于诊断炎症,评估其活性，监控其活动及
治疗。但是，SAA检测在诊断肾移植排斥反应伴发病毒感染的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质
激素治疗的囊性
纤维化患者方面,比PCT更能够准确判断炎症的活动状态
[0007] PCT对严重细菌感染诊断有较高的诊断效能,并具有较高的灵敏度和特异度。优于CRP和SAA等感染标志物，PCT对病毒感染与细菌感染的
鉴别诊断有一定的应用价值。但是，在自身免疫疾病的炎症性疾病活动期间，PCT含量无升高，但CRP含量升高。在小儿感染性疾病早期,很难鉴别是细菌感染还是病毒感染CRP即对病毒感染缺乏敏感性,而SAA在细菌和病毒感染早期均可升高。另有研究表明CRP和SAA均可预示较差的
预后，比如复发或死亡,而监测感染急性期反应,SAA是比CRP即更敏感的指标
[0008] 研究表明在诊断炎症相关疾病,单独使用一种指标CRP、PCT或SAA不能有效准确诊断，临床上可将SAA,PCT和CRP等感染相关指标与临床资料相结合，对感染性疾病的诊断具有重要意义。
发明内容
[0009] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种同时定量检测SAA/PCT/CRP的方法。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0011] 一种同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，包括人血清淀粉样蛋白A(SAA)检测
试纸、人降钙素原(PCT)检测试纸和C-反应蛋白(CRP)检测试纸，其中，
[0012] 所述人血清淀粉样蛋白A检测试纸由包被SAA
抗体(T线)和平行包被羊抗鼠IgG(C线)的
硝酸纤维素膜、含有胶体金标记的
配对的抗人SAA抗体的胶体金垫、吸样垫、样品垫和塑料
底板组成；
[0013] 所述人降钙素原(PCT)检测试纸由包被PCT抗体(T线)和平行包被抗鼠IgG(C线)的硝酸纤维素膜、含有胶体金标记的配对抗人PCT抗体的胶体金垫、吸样垫、样品垫和塑料底板组成；
[0014] 所述C-反应蛋白检测试纸由包被CRP抗体(T线)和平行包被羊抗鼠IgG(C线)的硝酸纤维素膜、含有胶体金标记的配对的抗人CRP抗体的胶体金垫、吸样垫、样品垫和塑料底板组成；
[0015] 上述各试纸(人血清淀粉样蛋白A检测试纸、人降钙素原检测试纸和C-反应蛋白检测试纸)中吸样垫、硝酸纤维素膜、胶体金垫和样品垫从塑料底板的一端依次排列至另一端。
[0016] 优选的，上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，所述人血清淀粉样蛋白A(SAA)检测试纸和C-反应蛋白(CRP)检测试纸的样品垫是由处理液处理的
无纺布于室温
相对湿度不高于30％(一般在湿度为15-30％)的条件下干燥，密封保存而得到的，其中，所述处理液包括50mM Tris、0.5％Tween-20、0.1％
牛血清
白蛋白(BSA)、0.5％Trtion-100；所述人降钙素原(PCT)检测试纸的样品垫由滤血
滤纸和经红细胞单抗处理后的纤维玻纤膜组成，其中，上层为纤维玻纤膜、下层为滤血滤纸，纤维玻纤膜和滤血滤纸的边缘有1-2mm重叠，于室温相对湿度不高于30％(一般在湿度为15-30％)的条件下干燥，密封保存而得到的。
[0017] 优选的，上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，所述各试纸(人血清淀粉样蛋白A检测试纸、人降钙素原检测试纸和C-反应蛋白检测试纸)的吸样垫为吸水滤纸。
[0018] 优选的，上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，所述各试纸的硝酸纤维素膜(NC膜)是由下述方法制备得到的：
[0019] 人血清淀粉样蛋白A(SAA)检测试纸的硝酸纤维素膜：将SAA抗体用含1％的0.01M pH 7.4
磷酸盐缓冲液(PBS)配制成0.8-1.5mg/ml的抗体溶液，在NC膜上以1.2-1.4ul/cm的参数用喷膜仪进行划线，包被试纸条的SAA抗体作为T线，同时将羊抗鼠IgG用含1％的0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)配制成1-2mg/ml的抗体溶液，在NC膜上以1.2-1.4ul/cm的参数用喷膜仪进行划线，包被试纸条的羊抗鼠IgG作为C线，于室温相对湿度不高于30％(一般在湿度为15-30％)的条件下干燥，密封保存备用；
[0020] 人降钙素原(PCT)检测试纸的硝酸纤维素膜：将PCT抗体用含1％的0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)配制成0.8-1.5mg/ml的抗体溶液，在NC膜上以1.2-1.4ul/cm的参数用喷膜仪进行划线，包被试纸条的PCT抗体作为T线，同时将羊抗鼠IgG用含1％的0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)配制成1-2mg/ml的抗体溶液，在NC膜上以1.2-1.4ul/cm的参数用喷膜仪进行划线，包被试纸条的羊抗鼠IgG作为C线，于室温相对湿度不高于30％(一般在湿度为15-30％)的条件下干燥，密封保存备用；
[0021] C-反应蛋白(CRP)检测试纸的硝酸纤维素膜：将CRP抗体用含1％的0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)配制成0.8-1.5mg/ml的抗体溶液，在NC膜上以1.2-1.4ul/cm的参数用喷膜仪进行划线，包被试纸条的CRP抗体作为T线，同时将羊抗鼠IgG用含1％的0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)配制成1-2mg/ml的抗体溶液，在NC膜上以1.2-1.4ul/cm的参数用喷膜仪进行划线，包被各自试纸条的羊抗鼠IgG作为C线，于室温相对湿度不高于30％(一般在 湿度为15-30％)的条件下干燥，密封保存备用。
[0022] 优选的，上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，所述各试纸(人血清淀粉样蛋白A检测试纸、人降钙素原检测试纸和C-反应蛋白检测试纸)的宽度为3-4mm，长度为7cm，所述各试纸的T线(检测线)和C线(质控线)的间距为0.7cm。
[0023] 优选的，上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，所述各试纸的胶体金垫是由下述方法制备得到的：
[0024] 人血清淀粉样蛋白A(SAA)检测试纸的胶体金垫：取每100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH6.5-8.0，再加入0.5-2mg标记用SAA抗体，室温搅拌1小时，用
酪蛋白或者BSA封闭，13000r/min离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至70ml，然后用喷金机均匀地
喷涂在无纺布上，于室温相对湿度不高于30％(一般在湿度为15-30％)的条件下干燥，密封保存备用；
[0025] 人降钙素原(PCT)检测试纸的胶体金垫：取每100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH6.5-8.0，再加入0.5-2mg标记用PCT抗体，室温搅拌1小时，用酪蛋白或者BSA封闭，13000r/min离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至70ml，然后用喷金机均匀地喷涂在无纺布上，于室温相对湿度不高于30％(一般在湿度为15-30％)的条件下干燥，密封保存备用；
[0026] C-反应蛋白(CRP)检测试纸的胶体金垫：取每100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2CO3调至pH6.5-8.0，再加入0.5-2mg标记用CRP抗体，室温搅拌1小时，用酪蛋白或者BSA封闭，13000r/min离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至70ml，然后用喷金机均匀地喷涂在无纺布上，于室温相对湿度不高于30％(一般在湿度为15-30％)的条件下干燥，密封保存备用。
[0027] 优选的，上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，所述胶体金液为采用氯金酸－
柠檬酸三钠法制备的直径40±5nm的胶体金溶液。
[0028] 优选的，上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，所述胶体金工作 液pH7.8,包括1％牛血清白蛋白、0.1MTris-HCl缓冲液、5％
蔗糖、1％Tween-20和0.5％Trtion-100。
[0029] 优选的，上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，还包括相互配合使用的三联卡壳和
免疫层析判读结果记录仪，所述三联卡壳由上盖和下盖两个部分配合组装形成封闭盒体，所述下盖内部平行放置有人血清淀粉样蛋白A(SAA)检测试纸、人降钙素原(PCT)检测试纸和C-反应蛋白(CRP)检测试纸，上盖于各试纸硝酸纤维素膜中部的正上方对应处分别设有SAA视窗口、PCT视窗口和CRP视窗口，用于观察硝酸纤维素膜上的C、T线，显示判定结果；所述上盖上位于SAA视窗口下方对应SAA样品垫部分设有第一样品孔，用于加入稀释后的样本液，所述上盖上位于PCT视窗口下方对应PCT样品垫部分设有第二样品孔和稀释液孔，用于加入样本和稀释液，所述上盖上位于CRP视窗口下方对应CRP样品垫部分设有第三样品孔，用于加入稀释后的样本液。
[0030] 使用过程中，三联卡壳插入免疫层析判读结果记录仪中，免疫层析判读结果记录仪通过拍照方式读取数据，在15-20分钟内，用免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。
[0031] 优选的，上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置，所述免疫层析判读结果记录仪是一种光学检测系统，内置有对人血清淀粉样蛋白A、人降钙素原和C-反应蛋白的标准曲线和判定方法，用于对各对应试纸检测结果进行定量判定，所述人血清淀粉样蛋白A、人降钙素原和C-反应蛋白的试纸检测范围分别为5-100mg/L，0.5-20mg/L和1-200mg/L。
[0032] 上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置的制备方法，具体步骤如下：在相对湿度不高于30％(一般在湿度为15-30％)的条件下，取各自的塑料底板，将已包被SAA、PCT和CRP的硝酸纤维素膜(NC膜)分别粘贴在划好下划线的各自对应的塑料底板的中部，在NC膜T线一侧粘贴对应的胶体金垫，在胶体金垫另一侧粘贴对应的样品垫；在NC膜C线一侧粘贴吸样垫；各粘贴组 分
接口相互叠压1-2mm，粘贴好的大板切成3-4mm宽的试纸条，然后将所得的三种试纸条分别放置于卡壳下盖的槽中，然后盖上上盖，压紧，完成装配。
[0033] 上述同时定量检测SAA/PCT/CRP的检测装置在同时检测SAA/PCT/CRP过程中，具体应用方法如下：
[0034] 检测SAA：将5ul的被检样本如血清、血浆或者10ul
全血加入到1mL稀释液中，然后在稀释液孔中加入100ul稀释好的样本；
[0035] 检测CRP：将5ul的被检样本如血清、血浆或者10ul全血加入到1mL稀释液中，然后在稀释液孔中加入100ul稀释好的样本；
[0036] 检测PCT：将10ul的被检样本如血清、血浆或者20ul的全血加入到样本孔中，然后在稀释液孔加入80ul稀释液。
[0037] 上述稀释液为50mM Tris，PH7.6。
[0038] 本发明的有益效果是：
[0039] 本发明提供了同时定量检测SAA/PCT/CRP的方法，利用免疫层析及免疫双抗体夹心的原理配合免疫层析判读仪可实现同时对SAA/PCT/CRP三项目进行快速检测，检测灵敏度高；所利用的检测装置成本低廉、检测方法简便稳定，适合现场检测，且不需要专业人员操作，
试剂卡性能准确、稳定，灵敏度高并能同时快速定量检测SAA/PCT/CRP三项炎症指标，适用于细菌与病毒感染的快速鉴别诊断，微创取样的特点特别适用于婴幼儿的检测，并且不需
抽取大量
血液样本，降低了医疗
费用。
附图说明
[0040] 图1为本发明所述检测试纸的结构示意图；
[0041] 图2为本发明所述三联卡壳结构图的结构示意图。
[0042] 图中，Ⅰ-吸样垫 Ⅱ-硝酸纤维素膜 Ⅲ-T线 Ⅳ-C线
[0043] Ⅴ-胶体金垫 Ⅵ-样品垫
[0044] 1-SAA视窗口 2-PCT视窗口 3-CRP视窗口
[0045] 4-第一样品孔 5-第二样品孔 6-第三样品孔 7-稀释液孔
具体实施方式
[0046] 下面结合具体
实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0047] 实施例1：
[0048] 1主要材料
[0049] 1.1
生物原料SAA、PCT和CRP配对抗体，从芬兰HYTEST公司购买；羊抗鼠IgG：自制；氯金酸：Sigma公司产品；NC膜：Sartorius公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
[0050] 1.2临床样本由公司在相关医院获得，共120份，其中确诊为炎症感染型病人血清样本60份，SAA检测值为5-200mg/L，PCT检测值为0.5-20mg/L和1-200mg/L。正常人血清样本60份，SAA、PCT和CRP值未检测。
[0051] 1.3三联测试卡：由本公司设计，相关公司按要求生产、提供。
[0052] 1.4免疫层析结果结判读记录仪：型号：NS3001，天津中新科炬生物制药有限公司产品。
[0053] 2方法
[0054] 2.1SAA、PCT和CRP抗体胶体金标记采用氯金酸－柠檬酸三钠法制备直径为40±5nm的胶体金溶液，取三份胶体金溶液，分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH6.5、pH7.0和pH8.0，然后将胶体金缓慢搅拌，按每ml溶液加入5ug、10ug、20ug将SAA标记抗体加入到溶液中，继续搅拌30分钟，再加入到终浓度为0.5％的PEG2000和0.5％的牛血清蛋白(BSA)进行封闭，标记结束后以13000r/min离心，弃上清，沉淀按70％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(pH7.8，包括1％牛血清白蛋白、0.1MTris-HCl缓冲液、5％蔗糖、1％Tween-20和
0.5％Trtion-100)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于无纺布上，在
温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥3-5 小时，制成胶体金垫。PCT或者CRP抗体标记方法和SAA一致，只是加入的抗体为PCT或者CRP抗体。
[0055] 2.2NC膜包被用0.01M pH7.4PBS将配对的SAA抗体配制成0.8，1.0和1.5mg/mL，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.4ul/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜在在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥3-5小时。PCT和CRP抗体包被方法和SAA一致，只是配制的为PCT或者CRP抗体。
[0056] 2.3在相对湿度小于30％的条件下，取塑料底板，将已包被SAA或PCT或CRP的NC膜粘贴在底板的中部，在NC膜T线一侧粘贴胶体金垫，在胶体金垫另一侧粘贴样品垫；在NC膜C线一侧粘贴吸样垫(吸水滤纸)；各粘贴组分接口相互叠压1-2mm，粘贴好的大板切成3-4mm宽的试纸条。然后将三种试纸条分别放置于卡壳下盖的槽中，然后盖上上盖，压紧，完成装配。
[0057] 所述SAA检测试纸和CRP检测试纸的样品垫是由处理液处理的无纺布于室温相对湿度18-25％的条件下干燥，密封保存而得到的，该处理液包括50mM Tris、0.5％Tween-20、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％Trtion-100；所述PCT检测试纸的样品垫是滤血滤纸和经红细胞单抗处理后的纤维玻纤膜于室温相对湿度18-25％的条件下干燥，密封保存而得到的，其中，上层为纤维玻纤膜、下层为滤血滤纸，纤维玻纤膜和滤血滤纸的边缘有1-2mm重叠。
[0058] 如图1和图2所示，所得到的检测试纸中吸样垫Ⅰ、硝酸纤维素膜Ⅱ、胶体金垫Ⅴ和样品垫Ⅵ从塑料底板的一端依次排列至另一端，检测试纸宽度为3-4mm，长度为7cm，T线(检测线)Ⅲ和C线(质控线)Ⅳ的间距为0.7cm。装配后的三联卡壳由上盖和下盖两个部分配合组装形成封闭盒体，所述下盖内部平行放置有人血清淀粉样蛋白A(SAA)检测试纸、人降钙素原(PCT)检测试纸和C-反应蛋白(CRP)检测试纸，上盖于各试纸硝酸纤维素膜中部的正上方对应处分别设有SAA视窗口1、PCT视窗口2和CRP视窗口3，用于观察硝 酸纤维素膜上的C、T线，显示判定结果；所述上盖上位于SAA视窗口下方对应SAA样品垫部分设有第一样品孔4，用于加入稀释后的SAA样本液，所述上盖上位于PCT视窗口下方对应PCT样品垫部分设有第二样品孔5和稀释液孔7，用于加入PCT样本和稀释液，所述上盖上位于CRP视窗口下方对应CRP样品垫部分设有第三样品孔6，用于加入稀释后的CRP样本液。
[0059] 2.4检测卡工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用质控品对试剂进行测试，寻找最佳组合。
[0060] 2.5内置标准曲线曲线和参数设置确定好试纸工艺参数后，分别用0，5，10，50、100、200mg/L的SAA标准品对试剂进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带数字化后，计算出标准曲线，并输入免疫层析结果判读记录仪中，完成SAA标准曲线参数设置；分别用0，0.5，2，5、10、20mg/L的PCT标准品对试剂进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带数字化后，计算出标准曲线，并输入免疫层析结果判读记录仪中，完成PCT标准曲线参数设置。分别用0，1，3，10、20、50，200mg/L的CRP标准品对试剂进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带数字化后，计算出标准曲线，并输入免疫层析结果判读记录仪中，完成CRP标准曲线参数设置。将SAA的Cutoff值设为
10mg/L，PCT的Cutoff值设为0.5mg/L，CRP的Cutoff值设为10mg/L，若三种检测均为阴性，综合结果判定为阴性，若三种结果检测为阳性，综合结果判定为阳性。若三种结果检测为不一致，则需结合临床，给予炎症类别的判定。
[0061] 2.6检测方法1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2)检测SAA和CRP时分别精确吸取5ul的被检样本如血清、血浆或者10ul全血加入到各自配有1mL稀释液(50mM Tris、PH7.6)中，混匀，然后在样 本孔中加入100ul稀释好的样本，检测PCT时将10ul的被检样本如血清、血浆或者20ul的全血加入到样本孔中，立即在稀释液孔加入80ul样本稀释液(50mM Tris、PH7.6)，15-20分钟内用免疫层析结果判读记录定量判定结果；3)设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示分别出SAA、PCT和CRP样品浓度的定量测定结果；以及对炎症的综合检测结果。
[0062] 2.7临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。
[0063] 3结果
[0064] 3.1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了SAA和CRP抗体标记pH值为7.0-8.0，无明显差异,确定了PCT抗体标记pH值为6.5-7.0；SAA和CRP抗体最佳标记量为5-10ug/ml胶体金溶液，PCT抗体最佳标记量为10-20ug/ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为
0.1MTris.HCl缓冲液，pH7.8，含0.2％牛血清白蛋白、6％蔗糖，0.5％Tween 20，0.2％F68；
最佳包
抗原的浓度为SAA为1.0mg/mL,PCT为1.5mg/mL,CRP为0.8mg/mL。检测结果的最佳判定时间为15-20分钟。但以上参数在制备不同批次产品时因生物原料活性变化可能需要适当调整。
[0065] 3.2临床样本检测对120份临床样本进行检测，三种检测均为阳性的为57例，均为阴性的为58例，和临床相比，阳性、阴性预期值均为100％。别5例为可疑结果。综合结果的一致率为95.8％。和单独检测相比，一致率相当，但阳性、阴性预期值明显上升。在定量检测方面，相关系数r均大于0.95，t检验P>0.05，不一致的检测离群值<2％。定量检测效果较好。通过以上结果可以判定检测装置的性能良好，具有操作简便、反应快速、结果准确、可信、适合现场检测等优点，适合临床对更为准确、简便检测的需要。
[0066] 实施例2：
[0067] 一种同时快速定量检测SAA/PCT/CRP的检测试纸条是由下述方法制备得 到的,具体步骤为：
[0068] (1)SAA、PCT和CRP抗体胶体金标记采用氯金酸－柠檬酸三钠法制备直径为40±5nm的胶体金溶液，取三份胶体金溶液，分别用0.2M K2CO3将溶液调到将SAA的pH调到7.5、PCT的pH调到6.5和CRP的pH调到8.0，然后将胶体金缓慢搅拌，SAA：按每ml溶液加入10ug将SAA标记抗体加入到溶液中；PCT：按每ml溶液加入15ug将PCT标记抗体加入到溶液中；CRP:
按每ml溶液加入5ug将CRP标记抗体加入到溶液中，继续搅拌30分钟，再加入到终浓度为
0.5％的PEG2000和0.5％的牛血清蛋白(BSA)进行封闭，标记结束后以13000r/min离心，弃上清，沉淀按70％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(0.1MTris.HCl缓冲液，pH7.8，含0.2％牛血清白蛋白、6％蔗糖，0.5％Tween 20，0.2％F68)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥3-5小时，制成胶体金垫。
[0069] (2)NC膜包被，同实施例1。
[0070] (3)试纸卡组装，同实施例1。
[0071] 实施例3：
[0072] (1)SAA、PCT和CRP抗体胶体金标记采用氯金酸－柠檬酸三钠法制备直径为40±5nm的胶体金溶液，取三份胶体金溶液，分别用0.2M K2CO3将溶液调到将SAA的pH调到7.0、PCT的pH调到7.0和CRP的pH调到7.0，然后将胶体金缓慢搅拌，SAA：按每ml溶液加入8ug将SAA标记抗体加入到溶液中；PCT：按每ml溶液加入18ug将PCT标记抗体加入到溶液中；CRP:
按每ml溶液加入8ug将CRP标记抗体加入到溶液中，继续搅拌30分钟，再加入到终浓度为
0.5％的PEG2000和0.5％的牛血清蛋白(BSA)进行封闭，标记结束后以13000r/min离心，弃上清，沉淀按70％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(0.1MTris.HCl缓冲液，pH7.8，含0.2％牛血清白蛋白、6％蔗糖，0.5％ Tween 20，0.2％F68)。然后将标记胶体金溶液按
2
1ml溶液铺20cm的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥
3-5小时，制成胶体金垫。
[0073] (2)NC膜包被，同实施例1。
[0074] (3)试纸卡组装，同实施例1。
[0075] 实施例4：
[0076] (1)SAA、PCT和CRP抗体胶体金标记采用氯金酸－柠檬酸三钠法制备直径为40±5nm的胶体金溶液，取三份胶体金溶液，分别用0.2M K2CO3将溶液调到将SAA的pH调到7.5、PCT的pH调到6.8和CRP的pH调到7.8，然后将胶体金缓慢搅拌，SAA：按每ml溶液加入6ug将SAA标记抗体加入到溶液中；PCT：按每ml溶液加入14ug将PCT标记抗体加入到溶液中；CRP:
按每ml溶液加入5ug将CRP标记抗体加入到溶液中，继续搅拌30分钟，再加入到终浓度为
0.5％的PEG2000和0.5％的牛血清蛋白(BSA)进行封闭，标记结束后以13000r/min离心，弃上清，沉淀按70％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(0.1MTris.HCl缓冲液，pH7.8，含0.2％牛血清白蛋白、6％蔗糖，0.5％Tween 20，0.2％F68)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥3-5小时，制成胶体金垫。
[0077] (2)NC膜包被，同实施例1。
[0078] (3)试纸卡组装，同实施例1。
[0079] 上述参照实施例对该一种同时定量检测SAA/PCT/CRP的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和
修改，应属本发明的保护范围之内。
